PHÂN LẬP VIRUS PRRS TỪ HUYẾT THANH HEO CON TRÊN MÔI TRƯỜNG TẾ BÀO MARC145 VÀ XÁC ĐỊNH VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RTPCR

TÓM TẮT Đề tài: “Phân lập virus PRRS từ huyết thanh heo con trên môi trường tế bào MARC-145 và xác định virus bằng kỹ thuật RT-PCR” được thực hiện từ tháng 4/2008 đến tháng 9/2008, tại B

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

  

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VIRUS PRRS TỪ HUYẾT THANH HEO CON TRÊN MÔI TRƯỜNG TẾ BÀO MARC-145 VÀ XÁC ĐỊNH

VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR

Niên khóa: 2004 - 2008 Sinh viên thực hiện: TRẦN ÁNH HỒNG

Tháng 9/2008

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC

  

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VIRUS PRRS TỪ HUYẾT THANH HEO CON TRÊN MƠI TRƯỜNG TẾ BÀO MARC-145 VÀ XÁC ĐỊNH

VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: ThS TRẦN THỊ BÍCH LIÊN TRẦN ÁNH HỒNG BSTY HỒNG THANH HẢI

Tháng 9/2008

ii

LỜI CẢM ƠN

 Với tất cả lòng kính trọng và yêu thương, con xin tri ân công ơn sinh thành,

dưỡng dục của Ba Mẹ _ những Người đã cho con được như hôm nay

 Em xin chân thành cảm ơn ThS Trần Thị Bích Liên và BSTY Hoàng Thanh

Hải đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt thời gian hoàn thành khóa luận

 Xin được gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm TP

Hồ Chí Minh, quý thầy cô Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học cùng các Khoa, Bộ môn khác đã tận tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt bốn năm đại học

 Xin cảm ơn cô Lê Thị Hà_Bộ môn Vi sinh – Truyền nhiễm, Khoa Chăn

nuôi-Thú y, anh Lương Quý Phương, chị Đặng Ngọc Thùy Dương, cùng các anh chị ở Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh, trường Đại học Nông Lâm

TP Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo nhiều điều kiện thuận lợi cho

em trong thời gian thực tập tốt nghiệp

 Xin cảm ơn các bạn lớp DH04SH, cùng các bạn thân thương nhóm A week –

holiday đã chia sẻ mọi khó khăn, động viên Hồng trong suốt bốn năm qua

TÓM TẮT

Đề tài: “Phân lập virus PRRS từ huyết thanh heo con trên môi trường tế bào MARC-145 và xác định virus bằng kỹ thuật RT-PCR” được thực hiện từ tháng 4/2008 đến tháng 9/2008, tại Bộ môn Vi sinh – Truyền nhiễm, Khoa Chăn nuôi – Thú y, và tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh, trường Đại học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh

Mục tiêu của đề tài là phát hiện virus PRRS trong huyết thanh heo cai sữa, nhằm nghiên cứu sâu hơn những đặc điểm của virus và góp phần giúp ích cho những nghiên cứu sau này

Nội dung thực hiện bao gồm:

- Phát hiện kháng thể kháng virus PRRS trong huyết thanh bằng kỹ thuật ELISA

- Phân lập virus PRRS từ những mẫu huyết thanh trên, bằng cách gây nhiễm 2 lần trên môi trường tế bào MARC-145

- Phát hiện virus từ dịch tế bào nuôi cấy sau khi gây nhiễm lần 2 bằng kỹ thuật RT-PCR

- Gây nhiễm lần 3 trên môi trường tế bào MARC-145 các chủng virus phân lập được, nhằm khảo sát đặc tính phát triển của virus trên tế bào MARC-

145

Sau thời gian thực hiện, chúng tôi thu được các kết quả sau:

- 83,33% mẫu huyết thanh có kết quả ELISA dương tính

- Qua 2 lần gây nhiễm trên tế bào MARC-145 và xác định virus bằng kỹ thuật RT-PCR, chúng tôi phân lập được virus PRRS từ 5 trên tổng số 12 mẫu huyết thanh, chiếm tỷ lệ 41,67%

- Bệnh tích tế bào do virus PRRS gây ra xuất hiện rõ và tăng dần qua 3 lần gây nhiễm Bệnh tích thường xuất hiện vào ngày thứ 2 sau gây nhiễm, rõ nhất vào ngày thứ 4, từ ngày thứ 5 đến ngày thứ 7, hầu hết tế bào chết và bong khỏi bề mặt nuôi cấy

iv

ABSTRACT

The graduating thesis “ Isolating PRRS virus from sera of piglets in

MARC-145 cells and identifying this virus by RT-PCR” was carried out from April to September, 2008, at Microbiology and Infectious Diseases Dept., Faculty of Animal Science Veterinary, and Center For Chemical And Biological Analysis And

Experiment of Nong Lam university, Ho Chi Minh city

The purpose of this study is isolating PRRS virus from serum samples of piglets to study deeply about some characteristics of PRRSV and to be the premise for later studies

The contents includes:

- To detect PRRSV antibody in serum by ELISA

- To isolate PRRSV from these serum samples by two consecutive incubations

in MARC-145 cells

- To detect PRRSV in cell suspension of the second passage

- To infect again MARC-145 cells with PRRSV from the cell suspension of the second passage, which are possitive to PRRSV, to study more about some characteristics of this virus

When finishing the study, we have found that:

- 83,33 percents of investigated sera samples show positive results by ELISA technique

- After two consecutive incubations of these samples in MARC-145 cells, then identifing the presence of PRRSV by RT-PCR, we have isolated PRRSV in 5 samples from 12 serum samples with the percentage of 41,67

- The CPEs induced by PRRSV is gradually become clear and increased through three passages The CPEs emerge in the second day post incubation and be clearest in the fourth day post incubation

v

MỤC LỤC

Lời cảm ơn iii

Tóm tắt iv

Abstract v

Mục lục vi

Danh sách các chữ viết tắt ix

Danh sách các hình, bảng, sơ đồ x

Chương 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích - Yêu cầu 2

Chương 2: TỔNG QUAN 3

2.1 Sơ lược về virus PRRS 3

2.1.1 Lịch sử bệnh và tên gọi 3

2.1.2 Phân loại 4

2.1.3 Một số đặc điểm về hình thái và cấu trúc 4

2.1.4 Chu trình nhân lên của virus PRRS trong tế bào 6

2.1.5 Sức đề kháng 9

2.1.6 Loài mắc bệnh 9

2.1.7 Chất chứa virus 9

2.1.8 Cơ chế sinh bệnh 10

2.1.9 Triệu chứng 10

2.2 Các phương pháp chẩn đoán 11

2.2.1 Chẩn đoán lâm sàng 11

2.2.2 Chẩn đoán phi lâm sàng 11

2.2.2.1.Phát hiện kháng thể 11

2.2.2.2.Phát hiện virus hoặc kháng nguyên virus PRRS 14

2.2.2.3.Phương pháp sinh học phân tử 20

vi

Chương 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 26

3.1 Thời gian và địa điểm 26

3.2 Đối tượng và số lượng mẫu 26

3.3 Nội dung nghiên cứu 26

3.4 Vật liệu và dụng cụ 27

3.4.1 Vật liệu và dụng cụ cho phản ứng ELISA 27

3.4.2 Thiết bị và dụng cụ nuôi cấy tế bào và phân lập virus PRRS 27

3.4.3 Vật liệu nuôi cấy tế bào MARC- 145 27

3.4.4 Vật liệu và hoá chất chiết tách RNA 27

3.4.5 Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng PCR 27

3.4.6 Kit sử dụng cho RT-PCR 28

3.4.7 Vật liệu và hoá chất điện di sản phẩm RT-PCR 28

3.5 Phương pháp tiến hành 29

3.5.1 Phương pháp lấy mẫu 29

3.5.2 Phương pháp xử lý và bảo quản mẫu 29

3.5.3 Phương pháp thực hiện phản ứng ELISA 29

3.5.4 Phương pháp nuôi cấy tế bào MARC- 145 30

3.5.4.1.Hồi phục tế bào 30

3.5.4.2.Cấy chuyển tế bào 30

3.5.5 Phương pháp phân lập virus 31

3.5.5.1.Phương pháp gây nhiễm tế bào lần thứ nhất 32

3.5.5.2.Phương pháp thu hoạch dịch tế bào 32

3.5.5.3.Phương pháp gây nhiễm lần hai và lần ba bằng dịch tế bào đã thu hoạch32 3.5.6 Phương pháp xác định sự hiện diện của virus bằng kỹ thuật RT-PCR 32

3.5.6.1 Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR 33

3.5.6.2 Điện di sản phẩm RT-PCR 33

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

4.1 Kết quả ELISA trên huyết thanh heo 34

4.2 Kết quả phân lập virus trên môi trường tế bào MARC-145 35

4.2.1 Kết quả gây nhiễm lần một trên môi trường tế bào MARC-145 35

vii

4.2.2 Kết quả gây nhiễm lần hai trên môi trường tế bào MARC-145 37

4.2.3 Kết quả RT-PCR từ mẫu dịch tế bào sau khi gây nhiễm (passage) lần 2 39 4.2.4 Kết quả gây nhiễm lần ba trên môi trường tế bào MARC-145 42

Chương 5: KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ ĐỀ NGHỊ 47

5.1 Kết luận 47

5.2 Tồn tại 47

5.3 Đề nghị 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC

viii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CPE : Cytopathic Effect

DNA: Deoxynucleotide Acid

dNTP: Deoxynucleotide Triphosphate

ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assay

EMEM: Eagle Minimum Essential Medium

FA: Florescent Antibody Staining

FBS : Fetal Bovine Serum

HRPO: Horseradish Peroxidase

IFA: Immuno Peroxidase Monolayer Assay

IHC: Immunohistochemistry Staining

IPMA: Immuno peroxidase Monolayer Assay

LAH: Lactalbumin Hydrolysate

MSD: Mystery Swine Disease

OIE : Office of International Epidemiology

ORF: Open Reading Frame

PAM: Porcine Alveolar Macrophage

PEARS : Porcine Epidemic Abortion and Respiratory Syndrome PBS: Phosphate Buffer Saline

PBSA: Phosphate Buffer Saline Solution A

PCR: Polymerase Chain Reaction

PRRS: Porcine Reproductive And Respiratory Syndrome

RNA: Ribonucleotide Acid

RT-PCR: Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction

SVN: Serum Virus Neutralization

SIRS : Swine Infertility and Respiratory Disease

TBE: Tris Borate EDTA

TMB : Tetramethylbenzidine

ix

DANH SÁCH CÁC HÌNH, BẢNG, SƠ ĐỒ

HÌNH TRANG

Hình 2.1 Virus PRRS 4

Hình 2.2 Mô hình bộ gen virus PRRS 5

Hình 2.3 Mô hình chu trình nhân lên của virus PRRS trong tế bào 8

Hình 2.4 Đại thực bào bình thường 10

Hình 2.5 Đại thực bào bị nhiễm virus PRRS 10

Hình 4.1 Hình sản phẩm RT-PCR từ mẫu DTB gây nhiễm lần 2 41

Hình 4.2 Đối chứng âm vào ngày thứ 5 43

Hình 4.3 Mẫu không có bệnh tích tế bào vào ngày thứ 5 sau khi gây nhiễm 43

Hình 4.4 Mẫu có bệnh tích tế bào nghi ngờ vào ngày thứ 5 sau gây nhiễm 44

Hình 4.5 Đối chứng dương ngày thứ 5 sau khi gây nhiễm 44

Hình 4.6 Bệnh tích tế bào ở mẫu 1.4 vào ngày thứ 5 sau khi gây nhiễm lần 1 45

Hình 4.7 Bệnh tích tế bào ở mẫu 2.4 vào ngày thứ 5 sau khi gây nhiễm lần 1 45

Hình 4.8 Bệnh tích tế bào ở mẫu 2.4 vào ngày thứ 5 sau khi gây nhiễm lần 2 46

Hình 4.9 Bệnh tích tế bào ở mẫu 1.4 vào ngày thứ 5 sau khi gây nhiễm lần 3 46

BẢNG TRANG Bảng 4.1 Kết quả ELISA 34

Bảng 4.2 Kết quả gây nhiễm lần một trên môi trường tế bào MARC-145 36

Bảng 4.3 Kết quả gây nhiễm lần hai trên môi trường tế bào MARC-145 38

Bảng 4.4 Kết quả CPE và RT-PCR từ mẫu dịch tế bào sau 2 lần gây nhiễm 39

Bảng 4.5 Kết quả gây nhiễm lần ba trên môi trường tế bào MARC-145 42

SƠ ĐỒ TRANG Sơ đồ 3.1 Sơ đồ phân lập và xác định virus PRRS 31

Sơ đồ 3.2 Sơ đồ thực hiện phản ứng RT-PCR 33

đó, chăn nuôi heo được xem là ngành tương đối ổn định, và ngày càng phát triển mạnh nhằm đáp ứng nhu cầu đang gia tăng của xã hội, nhất là sau khi dịch cúm gia cầm nổ ra đầu tiên vào năm 2003 và thỉnh thoảng vẫn tái phát

Để phát huy vị thế của ngành chăn nuôi heo, đảm bảo tạo ra nhiều con giống tốt cho chất lượng thịt cao, ngoài những yếu tố như chọn giống, quản lý, chăm sóc, dinh dưỡng, các nhà chăn nuôi còn phải đặc biệt lưu tâm đến việc phòng và trị bệnh trên heo, nhất là những bệnh truyền nhiễm gây ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất sinh sản và tăng trưởng, như: bệnh đóng dấu son, dịch tả heo, bệnh giả dại, gần đây nhất là hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (PRRS: porcine reproductive and respiratory syndrome)

Bệnh được phát hiện từ những năm cuối thập niên 1980, và đầu thập niên

1990 ở một số nước Châu Âu và Châu Mỹ, đến nay đã lan rộng ra nhiều nước trên thế giới Bệnh do virus PRRS gây ra, tiến triển phức tạp, khó kiểm soát, với các triệu chứng như: sẩy thai; heo con sinh ra yếu; hoặc chết trước khi sinh; hay còi cọc, chậm lớn;

Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện đầu tiên vào năm 1997, trên đàn heo nhập

từ Mỹ Gần đây, bệnh lại bùng phát ở nhiều tỉnh thành trong cả nước, gây ra thiệt hại kinh tế không nhỏ cho ngành chăn nuôi heo Ở ổ dịch cấp tính, ước tính giảm sản lượng 5-20%, giảm từ 1-3,8 heo con/nái/năm, thiệt hại từ 100-155 USD/nái/năm (dẫn liệu Hoàng Văn Năm, 2001) Thể mãn tính làm cho heo thịt chậm lớn, tăng chi phí thuốc để điều trị các bệnh kế phát Do đó, nhằm giảm thiểu tác hại, hạn chế

1

những thiệt hại về kinh tế do bệnh gây ra, việc phân lập virus PRRS trên tế bào là một phương pháp cần thiết, không chỉ phục vụ cho các nghiên cứu về virus PRRS,

mà còn góp phần làm nền tảng cho sự phát triển của nhiều biện pháp chẩn đoán và phòng bệnh sau này như: sản xuất vaccine, bộ kit xét nghiệm, …

Xuất phát từ thực tế trên, được sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, trường Đại Học Nông Lâm TP HCM, dưới sự hướng dẫn của ThS Trần Thị

Bích Liên và BSTY Hoàng Thanh Hải, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập virus PRRS từ huyết thanh heo con trên môi trường tế bào MARC-145 và xác định virus bằng kỹ thuật RT-PCR”

 Phát hiện kháng thể kháng virus PRRS bằng kỹ thuật ELISA

 Phân lập virus PRRS trên môi trường tế bào MARC-145

 Ghi nhận bệnh tích tế bào sau 7 ngày nuôi cấy và thời gian xuất hiện bệnh tích qua 3 lần gây nhiễm trên tế bào (passage)

 Dùng kỹ thuật RT- PCR để xác định sự hiện diện của virus PRRS từ dịch tế bào nuôi cấy

Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện đầu tiên vào năm 1997 bằng kiểm tra huyết thanh học trên đàn heo nhập từ Mỹ (10/51 con có huyết thanh dương tính) Năm

1999 một khảo sát của Cơ quan Thú Y Vùng 6 ở một số trại giống tại các tỉnh phía Nam cho thấy tỉ lệ heo có huyết thanh dương tính với bệnh rất khác nhau, từ 1,3% cho tới 68,29% Ngày 12/3/2007, đợt dịch đầu tiên bùng nổ tại Hải Dương, chỉ trong vòng 1 tháng, bệnh đã lây lan sang 6 tỉnh lân cận như Hưng Yên, Bắc Ninh, Bắc Giang, Thái Bình, Hải Phòng và Quảng Ninh (dẫn liệu Trần Thị Bích Liên, 2008) Theo đánh giá không chính thức, hiện nay hội chứng PRRS có thể đã chuyển sang dạng mãn tính tại hầu hết các trại có bệnh (Nguyễn Ngọc Hải và cs, 2008) Kết quả giải trình tự và gây bệnh thực nghiệm trên heo cho thấy chủng virus PRRS tại Việt Nam hiện nay có mức độ tương đồng cao về di truyền so với virus PRRS chủng độc lực cao của Trung Quốc (Tô Long Thành và cs, 2008)

3

Ba đặc tính quan trọng của giống Arterivirus nói chung và virus PRRS nói

riêng là: (1) Gây nhiễm trùng dai dẳng mà không thể hiện triệu chứng; (2) Nhân lên bên trong các đại thực bào; (3) Có khả năng biến đổi gen rất lớn

Dựa trên đặc điểm về kiểu gen, virus PRRS được phân biệt làm 2 genotype: các dòng virus Châu Âu (tiêu biểu là dòng Lelystad_LV) và các dòng virus Châu

Mỹ (tiêu biểu là dòng VR-2332)

2.1.3 Một số đặc điểm về hình thái và cấu trúc

Virus PRRS có bộ gen là RNA sợi đơn, hình cầu, kích thước 45-60 nm, nhân nucleocapsid hình khối với đường kính 25-35nm, có vỏ bọc Vỏ được cấu tạo bởi 2 lớp màng lipid lấy từ tế bào vật chủ, mang 2 loại protein chủ yếu (protein màng M

và protein vỏ E) và 4 loại protein thứ yếu GP2, GP3, GP4 và GP5 (G: glycosylate, P: protein)

Bộ gen của virus PRRS dài khoảng 15 kb, gồm 8 khung đọc mở (ORFs) mã hoá cho các thành phần khác nhau của virus: ORF 1a và 1b chiếm 80% của gen, mã hóa những protein không cấu trúc của virus; các ORF từ 2-7 chiếm 20% còn lại của

gen, mã hóa cho các protein cấu trúc (dẫn liệu Trần Thị Bích Liên, 2008) Trong đó,

3 khung ORFs: 7;6 và 5 có ý nghĩa quan trọng trong định danh virus vì protein mà chúng quy định là những protein cấu trúc quan trọng nhất, chiếm 90-95% lượng protein cấu trúc của virus Đến nay người ta đã xác định được 3 protein cấu trúc chính của virus PRRS:

* Protein nhân (N-nucleocapsid): là một loại protein nhỏ, trọng lượng

khoảng 15kDa, có tính kiềm và tính miễn dịch cao, được quy định bởi ORF 7 Kháng thể do protein này tạo ra ở heo nhiễm bệnh thường sớm hơn kháng thể chống lại bất cứ protein nào khác (dẫn liệu Trần Thị Bích Liên, 2008) Protein N hiện diện

ở mức độ cao trong những tế bào bị nhiễm virus PRRS và chiếm từ 20- 40% lượng protein của phân tử virus Hiện nay protein N được dùng như là một kháng nguyên

để phát hiện kháng thể trong huyết thanh của heo

* Protein màng (M-membrane): là một loại protein có tính kháng nguyên cao,

trọng lượng khoảng 19 kDa, được quy định bởi ORF 6 Protein này ít biến đổi nên không dùng trong việc xác định dòng virus (dẫn liệu Trần Thị Bích Liên, 2008)

* Protein vỏ glycoprotein (E-envelope): là protein có sự biến đổi nhiều nhất, trọng lượng khoảng 24-25 kDa, được quy định bởi ORF 5 Bằng kỹ thuật xác định trình tự gen của virus PRRS, Umthun và Mengeling (1999) đã khẳng định rằng protein E rất hữu dụng trong việc phân biệt các dòng virus PRRS Protein này cũng

là nguyên nhân gây ra hiện tượng apoptosis và đóng vai trò quan trọng trong việc nhận diện thụ thể trên tế bào đích (Nathalie và cs, 2003)

Hình 2.2 Mô hình bộ gen virus PRRS (dựa trên trình tự Lelystad virus)

(Nguồn: Delputte, 2004)

5

Hai dòng virus: Châu Âu và Châu Mỹ không những khác biệt về đặc tính gây bệnh mà khác nhau ở mức độ nhất định về kiểu gen Tùy theo ORF mà sự tương đồng về gen giữa 2 dòng này dao động từ 52% đến 81% Đây chính là cơ sở cho việc sử dụng kỹ thuật RT-PCR, RFLP… để chẩn đóan virus PRRS và phân biệt dòng PRRS châu Mỹ và Châu Âu Tuy nhiên, các chủng trong cùng một dòng lại rất gần gũi nhau về cấu trúc kháng nguyên (dẫn liệu Nguyễn Ngọc Hải, 2007)

Qua phân tích gen và theo dõi sự thay đổi trình tự nucleotide của các dòng PRRS, người ta đã xác định rằng ở dòng Châu Mỹ, các ORFs 7 và 6 có tính ổn định rất cao, chúng gần như không thay đổi trong suốt quá trình tiến hoá của dòng virus này Tuy nhiên, có sự khác biệt rất rõ giữa dòng virus Châu Âu và Châu Mỹ ở 2 khung đọc mở này, chẳng hạn sự tương đồng về trình tự axit amin của ORFs 7 giữa

2 dòng virus này chỉ vào khoảng 57-59% và của ORFs 6 là 70-81% Trong khi đó, khung đọc mở ORFs 5 lại biến đổi nhiều giữa các chủng trong cùng 1 dòng Châu

Mỹ và chỉ tương đồng với dòng Châu Âu khoảng 51-59% Sự tương đồng về trình

tự axit amin quy định do các khung đọc mở ORFs 2, 3 và 4 giữa các dòng Châu Mỹ

và Châu Âu tương ứng chỉ ở từ 63,58% và 68% (dẫn liệu Nguyễn Ngọc Hải, 2007)

2.1.4 Chu trình nhân lên của virus PRRS trong tế bào

Theo Delputte (2004), chu trình nhân lên của virus PRRS trong tế bào gồm những giai đoạn sau:

CD151 là các thụ thể có chức năng tương tự trên tế bào MARC-145 (Kim và cs, 2005; Shanmukhappa và cs, 2007)

Ngoài ra, Calvert và cs (2007) đã chứng minh rằng CD163_1 protein hiện diện trên PAM; tế bào ung thư mô bạch huyết ở người; dòng tế bào thận khỉ mặt xanh Châu Phi (MARC-145 và Vero); tế bào sơ cấp của màng bụng chuột; và tế bào DH82 ở chó, cũng được xem như 1 thụ thể của virus PRRS trên tế bào, đóng vai trò quan trọng đối với quá trình xâm nhập, cởi vỏ, và giải phóng RNA virus vào tế bào chất

 Sự nhân lên của bộ gen và dịch mã những RNA thông tin

Sau khi xâm nhập vào tế bào, bộ gen của virus được phóng thích ra ngoài tế bào chất của tế bào bị nhiễm Sau đó, nó được dịch mã thành phức hợp những men cần thiết cho sự nhân lên của virus và những protein không cấu trúc Những protein này kết hợp với lưới nội chất không hạt tạo ra những túi có màng kép Những túi này là nơi mà RNA của virus được tổng hợp, đồng thời sẽ mang phức hợp cần cho

sự nhân lên của virus Tiếp theo, các RNA thông tin của virus được tạo ra, trong đó những RNA thông tin phụ trợ sẽ được mã hóa thành những protein cấu trúc

 Sự lắp ráp và thoát ra ngoài tế bào của virus

Người ta cho rằng RNA được tạo ra ở những túi có màng kép sẽ kết hợp với protein N để tạo thành những nuccleocapsid Để tạo vỏ, những nuccleocapsid này sẽ

đi vào trong lưới nội chất không hạt Sau đó, chúng được chuyển qua bộ máy Golgi

vì một số protein cấu trúc được hoàn thiện tại đây Trong những tế bào bị nhiễm virus, những hạt virus tập trung tại bộ máy Golgi và lưới nội chất không hạt, sau đó chúng thoát ra ngoài bằng con đường xuất ngoại bào

7

Hình 2.3 Mô hình chu trình nhân lên của virus PRRS trong tế bào

(Nguồn : Delputte, 2004)

Sau khi nhân lên, hầu hết các chủng virus PRRS đều gây bệnh tích tế bào Tuy nhiên một số chủng virus ít gây bệnh tích hoặc chỉ gây bệnh tích tế bào sau khi cấy chuyển (passage) (OIE, 2000) Nhìn chung, biểu hiện bệnh tích chính là những tế bào bị nhiễm sẽ co tròn, tập trung lại, dày lên, nhân kết đặc và tách ra một lớp sau 2-4 ngày nuôi cấy Toàn bộ lớp tế bào bong ra và bị phá hủy sau 6 ngày (Benfield

và cs, 1992) Một số chủng virus tạo ra những mảng tế bào trên môi trường

MARC-145 và PAM Một nghiên cứu khác của Bloemraad và cs (1994) cho thấy sau 40 giờ nuôi cấy, gần 40% tế bào trên môi trường PAM có bệnh tích Tuy nhiên, kết quả này có thể khác nhau giữa các phòng thí nghiệm (dẫn liệu Trần Thị Bích Liên, 2008)

Sự nhân lên của virus ở các tế bào dòng CL 2621 hoặc MA-104 còn chưa được nghiên cứu chi tiết Trong những dòng tế bào này, bệnh tích tế bào phát triển chậm hơn, xuất hiện 2-6 ngày sau khi cấy truyền, đầu tiên tế bào tròn lại, tập trung thành cụm, sau đó dày lên, nhân co lại và cuối cung bong ra

2.1.5 Sức đề kháng

Virus PRRS không bền với nhiệt độ và pH Ở nhiệt độ cao virus bất hoạt rất nhanh: bất hoạt hoàn toàn ở 370C trong 48 giờ và 45 phúc ở 560C Benfield và ctv (1992) cũng chứng minh rằng virus PRRS chịu đựng được pH 6,5-7,5 nhưng khả năng gây nhiễm sẽ mất nhanh chóng ở pH <6 và pH>7

Ngoài ra, virus PRRS dễ bị hủy diệt bởi chất sát trùng và tia cực tím, dễ dàng

bị vô hoạt trong các dung môi lipid như chloroform, ether (dẫn liệu của Trần Thanh Phong, 1996) Nói chung, các dung dịch có tính tẩy sẽ dễ dàng phá vỡ lớp vỏ bọc và phóng thích phần lõi không thể gây nhiễm, vì vậy, làm giảm khả năng lây nhiễm của virus

Virus gây nhiễm bị bất hoạt rất nhanh trong điều kiện khô hạn ở môi trường bên ngoài, nhưng tồn tại 9 ngày trong nước giếng và 11 ngày trong nước máy (dẫn liệu Trần Thị Bích Liên, 2008)

9

phát hiện từ mẫu ngoáy mũi từ 9-21 ngày sau khi gây bệnh (Benfield 1994; Rossow, 1994)

2.1.8 Cơ chế sinh bệnh

Khoảng 12 giờ sau khi nhiễm qua bề mặt màng nhầy, virus PRRS có trong đại thực bào của niêm mạc mũi, phổi và bạch hầu Sự nhân lên đầu tiên xảy ra ở đây, sau đó, virus đi vào đường tuần hoàn (virus nhiễm huyết), nhân lên lần hai ở phổi, hạch lâm ba, tim, tuyến ức, lách và những nơi khác Đối với thú mang thai, virus đi qua nhau và gây nhiễm phôi (dẫn liệu Trần Thị Bích Liên, 2008)

Như vậy, nếu những đại thực bào bị phá hủy thì sẽ làm giảm khả năng của vật chủ chống lại vi khuẩn kế phát hoặc sự xâm nhập của các virus khác Hầu hết nhiễm

kế phát được quan sát sau ổ dịch PRRS là bệnh đường hô hấp (dẫn liệu Hoàng Văn Năm, 2001)

Hình 2.4 Đại thực bào bình thường Hình 2.5 Đại thực bào bị nhiễm

virus PRRS (Nguồn: http://www.animal-health-online.de )

2.1.9 Triệu chứng

Thời gian ủ bệnh thường từ 4-8 ngày, tuy nhiên trong thực tế một số ổ dịch có thời gian ủ bệnh dài hơn (có thể tới 37 ngày) (AHA, 2004) Sự khác nhau về thời gian ủ bệnh có thể phản ánh sự khác nhau về độc lực giữa các chủng virus, sự khác nhau về mật độ heo ở đàn bị bệnh, …

Triệu chứng bệnh khác nhau tùy theo từng nhóm heo, lứa tuổi nhiễm, độc lực của chủng virus nhiễm… Nhưng triệu chứng chung thường thấy là rối loạn sinh sản

10

trên heo nái và hô hấp trên heo con, biểu hiện tai xanh do tím tái, da xuất huyết, … Đặc biệt, heo cai sữa bị nhiễm virus PRRS thường biểu hiện các triệu chứng như : sốt trên 400C, tần suất hô hấp tăng cao, ho nhẹ, lông xác xơ, biếng ăn, … Ở thể mãn tính, heo còi cọc và giảm tăng trọng (dẫn liệu Trần Thị Bích Liên, 2008) Ngoài ra, trong trường hợp ghép với bệnh khác có thể thấy viêm phổi lan toả cấp tính, hình thành nhiều ổ áp-xe, thể trạng gầy yếu, da xanh, tiêu chảy, hắt hơi, chảy nước mắt, thở nhanh, tỷ lệ chết có thể tới 15% (dẫn liệu Hoàng Văn Năm, 2001)

2.2 Các phương pháp chẩn đoán

2.2.1 Chẩn đoán lâm sàng

Chẩn đoán lâm sàng được thực hiện qua việc quan sát triệu chứng lâm sàng

và bệnh tích trên heo bị bệnh đồng thời phân biệt với những bệnh khác về hô hấp và sinh sản ở heo

Tuy nhiên, do sự đa dạng về dấu hiệu lâm sàng của bệnh, cũng như sự giống nhau khi heo nhiễm virus PRRS và các nguyên nhân do virus, vi khuẩn gây bệnh khác nên heo bệnh đôi khi chưa thể hiện rõ những triệu chứng đặc trưng của PRRS

Vì vậy, việc chẩn đoán trong phòng thí nghiệm là rất cần thiết để xác định chính xác căn bệnh, đó cũng là cơ sở cho công tác kiểm soát và phòng chống hiệu quả

2.2.2 Chẩn đoán phi lâm sàng

11

 Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang gián tiếp (IFA: indirect fluorescent antibody)

Cũng sử dụng nuôi cấy tế bào, tùy theo dòng virus cần chẩn đoán mà sử dụng loại tế bào khác nhau Khi quan sát trên kính hiển vi huỳnh quang, sự hiện diện của màu huỳnh quang trong mẫu xét nghiệm chứng tỏ mẫu có kháng thể kháng virus, hiệu giá kháng thể tùy thuộc vào cường độ phát huỳnh quang của mẫu dương tính (dẫn liệu Nguyễn Ngọc Hải, 2007)

 Phương pháp miễn dịch hấp phụ gắn men (ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay)

Nguyên tắc: Sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể

Thông thường, sự kết hợp kháng nguyên - kháng thể không được phát hiện bằng mắt thường, kỹ thuật ELISA đã lợi dụng đặc tính hấp phụ tự nhiên của protein lên polyethylen để gắn kháng nguyên lên giá rồi cho huyết thanh vào ủ ở nhiệt độ

và thời gian thích hợp.Sau khi rửa để loại bỏ những thành phần không kết hợp, cho thể kết nối là kháng thể khác loài có gắn enzyme, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp Cuối cùng, rửa và cho vào dung dịch chất hiện màu

Nếu kháng thể có huyết thanh, sự kết hợp kháng nguyên - kháng thể sẽ xảy ra

và tiếp theo, thể kết nối sẽ kết hợp với phức hợp này Trong hỗn dịch sẽ có enzyme

để giải phóng [O] từ H2O2, [O] sẽ oxy hóa chất hiện màu làm thay đổi màu của hỗn dịch Ngược lại, nếu không có kháng thể trong huyết thanh thì màu của hỗn dịch sẽ không thay đổi

Như vậy, kỹ thuật ELISA gồm 3 thành phần tham gia phản ứng: kháng nguyên; kháng thể; chất hiện màu, và 2 bước:

- Phản ứng miễn dịch học: sự kết hợp kháng nguyên - kháng thể

- Phản ứng hóa học: nhờ hoạt tính của enzyme để giải phóng [O], và chính [O] này sẽ oxy hóa chất chỉ thị màu Chất chỉ thị thay đổi màu có nghĩa là chứng minh sự kết hợp giữa kháng nguyên - kháng thể

12

- Thực hiện đơn giản hơn so với IFA và IPMA

- Có thể tự động hóa và thực hiện một cách kinh tế cho việc kiểm tra với quy mô lớn

- ELISA thương mại có thể phát hiện được các dòng virus của cả hai chủng châu Âu và châu Mỹ

- Không phân biệt được kháng thể mẹ truyền qua sữa đầu hay kháng thể

do nhiễm virus, vì kháng thể mẹ truyền có thể được phát hiện tới khi heo được 5-6 tuần tuổi, nên không thể dễ xác định bệnh PRRS trên heo con nhỏ hơn 6 tuần tuổi nếu những heo con này đã bú sữa từ heo nái nhiễm hoặc đã bị nhiễm từ trước sớm (dẫn liệu Trần Thị Bích Liên, 2008)

 Phản ứng trung hòa virus (SVN: serum virus neutralization)

Được sử dụng để phát hiện và định hiệu giá kháng thể kháng virus Kết quả của phản ứng với hiệu giá > 4 được xem là dương tính

13

Hạn chế :

- Ít nhạy hơn so với IFA và ELISA (dẫn liệu Trần Thị Bích Liên, 2008),

do ảnh hưởng của sự hình thành kháng thể chống lại virus PRRS trễ, phải tới 1-2 tháng sau khi nhiễm (dẫn liệu Trần Thị Bích Liên, 2008)

- Đắt tiền

- Khó thực hiện và tốn thời gian vì kháng thể trung hoà xuất hiện chậm (1-2 tháng sau khi nhiễm)

- Thường được dùng trong nghiên cứu hơn là dùng trong chẩn đoán

2.2.2.2 Phát hiện virus hoặc kháng nguyên virus PRRS

 Phương pháp phân lập virus trên môi trường tế bào

 Tổng quan về nuôi cấy tế bào

Thuyết tế bào của Schleiden và Schwan đã mở ra khả năng nuôi cấy tế bào ở thực và động vật: tế bào là đơn vị cấu trúc cơ bản, là đơn vị chức năng của sự sống, các tế bào sẽ có được bằng sự phân chia từ các tế bào có trước

Năm 1855, Roux đã chứng minh được khả năng giữ toàn vẹn đặc tính sinh học của tế bào phôi gà trong dung dịch nước muối sinh lý Điều này có ý nghĩa rất lớn trong việc nhận thức sự sống của tế bào bên ngoài cơ thể, đồng thời, mở ra khả năng phát triển sự sống bên ngoài cơ thể đa bào

Năm 1907, Harrison lần đầu tiên tiến hành kỹ thuật nuôi cấy tế bào với tế bào thần kinh ếch

Năm 1913, Carrel đặt nền tảng cho công nghệ nuôi cấy tế bào động vật : tế bào động vật hoàn toàn có thể sống trong một khoảng thời gian dài trong điều kiện

in vitro nếu ta thường xuyên cung cấp các chất dinh dưỡng vô trùng cần thiết

Năm 1948, Earle tiến hành phân lập các tế bào và nuôi chúng trong những điều kiện môi trường đặc biệt, tác giả đã thu nhận được những dòng tế bào biệt lập

Kỹ thuật này mở ra khả năng tách tế bào của từng loại mô và phát triển chúng trong những môi trường nhân tạo

14

Như vậy, nuôi cấy tế bào là kỹ thuật duy trì và phát triển các tế bào được tách

từ mô hay tách trực tiếp từ cơ quan động vật ở ngoài cơ thể sống, nhưng vẫn đảm bảo trong điều kiện phòng thí nghiệm, khi được cung cấp các chất dinh dưỡng hoặc một số yếu tố tăng trưởng, các tế bào vẫn tự phân chia, thực hiện đầy đủ các chức năng biến dưỡng và những chức năng chuyên biệt của tế bào (dẫn liệu Nguyễn Ngọc Hải, 2007)

Do thuận lợi nổi bật là tăng nhanh số lượng tế bào theo ý muốn, nên ngày nay

kỹ thuật nuôi cấy tế bào đã được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực thú y, nhân y, sinh học để nghiên cứu tác động của các chất lên tế bào hay nghiên cứu virus để phân lập, giám định, chuẩn độ virus, xác định tính chất huyết thanh học, quan sát hình thái siêu cấu trúc của virus, đặc biệt là sản xuất vaccine, sản xuất kháng thể đơn dòng, chẩn đoán và điều trị ung thư, chẩn đoán các tác nhân gây bệnh, chẩn đoán biến đổi gen và sản xuất các sản phẩm sinh học

 Một số đặc điểm của tế bào động vật

 Sự điều hòa trao đổi chất Quá trình trao đổi chất của cơ thể tập trung chủ yếu trong từng tế bào, và quyết định sự tồn tại của cơ thể sống, bao gồm: sự điều khiển của enzyme, hệ dịch bao quanh tế bào, và sự điều khiển của hệ thần kinh

 Tính cơ học yếu

Tế bào động vật không vách, chỉ được bao bọc bởi một màng tế bào - thành phần duy nhất ngăn cách giữa tế bào với tế bào trong mô Kích thước tế bào động vật lại khá lớn (trung bình khoảng 10 µm) Kích thước lớn, lại không có vách nên tính bền cơ học yếu Do đó, khi nuôi cấy, tế bào động vật rất dễ vỡ do các lực tác động khi thao tác trên tế bào như khuấy trộn để tách tế bào, di chuyển mẫu tế bào, thời gian thao tác kéo dài

 Tăng trưởng và phân chia chậm Chu kỳ sinh sản của một tế bào động vật trung bình khoảng 20-30 giờ sau khi nuôi cấy Trong khi đó thời gian này của vi khuẩn chỉ khoảng 20-30 phút Do đó, tế

15

bào rất dễ bị nhiễm khuẩn, khi đó, vi khuẩn sẽ phân chia nhanh và tiết chất làm chết

tế bào

 Tính cần giá đỡ Hầu hết tế bào động vật cần bám vào giá đỡ để có thể sống và phát triển Thông thường, tế bào phát triển tốt khi gắn vào bề mặt rắn và sẽ ngừng phân chia khi đã hình thành một lớp đơn liên tục trên bề mặt dụng cụ nuôi

feed_back)

Cơ chế này làm tế bào tiết ra ngoài môi trường những chất gây tổn thương tế bào : làm tế bào ngưng phát triển hoặc bị chết hàng loạt, gây trở ngại đáng kể đến hiệu quả thu hồi sản phẩm, làm phức tạp hóa việc tách sản phẩm khỏi môi trường nuôi và tinh sạch chế phẩm Do đó, cần phải thay mới môi trường sau một thời gian nuôi cấy nhất định

Tuy nhiên, ở tế bào động vật, quá trình tổng hợp sản phẩm thừa ít xảy ra và thường thì các sản phẩm trao đổi chất thoát ra khỏi tế bào rất chậm

 Khả năng bảo quản trong điều kiện nhân tạo Người ta thường sử dụng nitrogen lỏng để bảo quản tế bào động vật ở -1960C trong thời gian vô định để giúp tế bào giữ được khả năng sống không hạn định và duy trì được đặc tính trong một thời gian dài

Khi sử dụng, tế bào phải được giải đông và hoạt hóa để phục hồi khả năng tăng trưởng và phân chia như ban đầu

 Khả năng tiếp nhận gen lạ

Xét về cấu trúc, do chỉ được bao bọc bởi một lớp màng, tế bào động vật được xem như một loại tế bào trần tự nhiên Vì vậy, khi tồn tại ở trạng thái tự do, chúng

có thể nhận dòng thông tin di truyền lạ (thông tin di truyền từ virus), hoặc khi cho các tế bào động vật có nhân khác nhau ở gần, sẽ xảy ra hiện tượng trao đổi vật chất

di truyền tạo ra các dòng tế bào lai (hybridoma)

16

Ngoài ra, tế bào còn có các đặc tính khác như: kém thích nghi với môi trường, nhạy cảm với các ion kim loại và đa số tế bào động vật cần huyết thanh, hormone

tăng trưởng để phát triển trong môi trường nhân tạo

 Thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy tế bào có thể được cung cấp dưới dạng dung dịch để sử dụng ngay hay dưới dạng dung dịch đậm đặc hoặc dạng bột Dạng dung dịch đậm đặc có thể sử dụng sau khi pha loãng với nước cất tiệt trùng, trong khi dạng bột phải được hoà tan trong nước và tiệt trùng bằng cách lọc qua lưới lọc 0,22µm

 Carbonhydrate: glucose (5-10mM): Cung cấp năng lượng cũng như tiền chất cho tổng hợp sinh học, có trong hầu hết môi trường là nguồn ly giải tạo pyruvate vào chu trình acid citric và sinh ra CO2

 Amino acid (0,1-0,2mM): Được dùng như là nguồn tiền chất cho tổng hợp protein, thường được sử dụng là glutamine

 Muối: Làm cho môi trường có tính đẳng trương, duy trì sự cân bằng với phần bên trong tế bào

 Bicarbonate (NaHCO3): Đóng vai trò như hệ thống đệm trong

sự kết hợp với 5-10% CO2 được cung cấp bởi tủ ủ Hệ thống này giúp ổn định pH

trong môi trường (7,2-7,4) để tế bào sẽ phát triển tốt

 Vitamin và hormone: Hiện diện ở nồng độ tương đối thấp và được dùng để kích thích sinh trưởng, nhưng nhu cầu vitamin của các dòng tế bào là khác nhau

 Huyết thanh: Được bổ sung vào môi trường nuôi cấy để cải

thiện sự sinh trưởng của tế bào, giúp tế bào dễ bám vào bề mặt thủy tinh và phát triển mạnh hơn, nhờ các protein trong huyết thanh như albumin, fibronectin, globulin Huyết thanh thai bò (Fetal Bovine Serum- FBS) được sử dụng bổ sung vào cho môi trường nuôi cấy, với nồng độ thường dùng từ 5- 20%

 Kháng sinh: Được cho vào môi trường nuôi cấy trong thời gian ngắn nhằm làm giảm nguy cơ tạp nhiễm, thường được dùng dưới dạng hỗn hợp,

17

 Phenol red (chất chỉ thị pH môi trường): Giúp nhận biết xem

pH môi trường có thay đổi không, trung tính  hơi kiềm: đỏ, axít: vàng Khi thấy

có sự đổi màu của phenol red, phải lập tức cấy chuyển để thay đổi môi trường

 Điều kiện nuôi cấy Hầu hết tế bào trong môi trường nuôi cấy sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 370C và

pH 7,4 Nếu ở nhiệt độ thấp hơn một chút so với 370C thì tốc độ sinh trưởng sẽ giảm xuống nhưng tế bào không bị phá hủy Tuy nhiên nhiệt độ cao hơn, từ 39-

400C sẽ phá huỷ tế bào Do vậy, việc đảm bảo rằng nhiệt độ không tăng trong tủ cấy

là rất quan trọng (dẫn liệu Hoàng Thanh Hải, 2005)

 Ứng dụng của phương pháp phân lập virus trên môi trường tế bào Virus PRRS rất khó phân lập, chỉ có thể phát triển rất hạn chế trên 1 số dòng

tế bào (PAMs, CL 2621, MA-104) Các chủng PRRSV của Bắc Mỹ phát triển khá tốt trên MARC-145 trong khi các chủng PRRSV của Châu Âu phát triển nhanh hơn trên PAM Tuy nhiên, giá thành của PAM thường cao do khó thu nhận, lại mang nguy cơ tạp nhiễm từ những vi sinh vật khác cũng định vị trong phổi heo, nên dòng

tế bào MA-104 có nhiều thuận lợi để dùng trong chẩn đoán thông thường, và hiện đang được sử dụng rộng rãi để phân lập virus khi chẩn đoán, đặc biệt là một dòng tế bào đã xác định như MARC-145 (Kim và cs, 1993)

Ngoài ra, sự thành công trong phân lập hoặc phát hiện virus trong các mẫu bệnh phụ thuộc rất nhiều vào việc lấy mẫu và bảo quản mẫu Nhìn chung việc thu thập mẫu thực hiện càng sớm càng tốt trong khi bệnh xảy ra (trong vòng 7-10 ngày sau khi bệnh nổ ra) Mẫu thu thập trễ trong ổ dịch thường tốn nhiều thời gian trong phòng thí nghiệm hoặc kết quả âm tính Điều này quan trọng để chọn không chỉ mẫu chính xác mà còn chọn đủ mẫu để kiểm tra virus Không đủ số lượng mẫu là một nguyên nhân tiềm tàng của chẩn đoán không đi đến kết luận hoặc kết quả âm tính giả (dẫn liệu Trần Thị Bích Liên, 2008)

18

Virus PRRS có thể được phân lập từ nhiều loại mẫu bệnh khác nhau như huyết thanh, huyết tương, các tế bào đơn nhân máu ngoại vi, tủy xương, hạch amidan, phổi, hạch lâm ba, tuyến thymus, lách, tim, não, gan, tuyến sinh dục đực, vết nạo vùng miệng hầu, dịch mũi, nhau, nước miếng, nước tiểu, phân và tinh dịch (dẫn liệu Trần Thị Bích Liên, 2008) Trong số đó thì huyết thanh đã được chứng minh là loại mẫu tốt nhất để phân lập virus, vì những lý do sau: (i) không ảnh hưởng đáng kể đến sức sống của virus trong những điều kiện nhiệt độ và thời gian không thuận lợi (Van Alstine và cs, 1993); (ii) dễ dàng lấy mẫu trên thú sống, không cần phải giết thú; (iii) Đối với heo nhỏ, giai đoạn virus nhiễm huyết (viremia) kéo dài khoảng 2-6 tuần nên virus trong huyết thanh thường ổn định hơn trong mẫu

mô (dẫn liệu Trần Thị Bích Liên, 2008) Ở heo lớn, thời gian nhiễm huyết ngắn và virus tồn tại trong mẫu mô lâu hơn trong mẫu huyết thanh (Christopher và cs, 2001) nên mẫu phổi, hạch amidan và hạch lâm ba nên được chọn để phân lập virus (Joo và

cs, 1993)

Việc chọn mẫu cũng phụ thuộc vào giai đoạn tiến triển của bệnh như cấp tính, phục hồi hoặc nhiễm dai dẳng Huyết thanh, phổi và dịch rửa phế quản thường được lấy từ những heo nhiễm cấp tính (dẫn liệu Trần Thị Bích Liên, 2008) Các mẫu như hạch amidan, vết nạo ở vùng miệng-hầu, dịch rửa phế quản-phế nang thường được lấy từ những heo nhiễm bệnh dai dẳng (dẫn liệu Trần Thị Bích Liên, 2008) Trong các trường hợp heo sẩy thai ở giai đoạn cuối và đẻ sớm nên chọn mẫu từ những heo con sinh ra yếu ngay trước khi bú hơn là mẫu được lấy từ những thai chết sau khi sinh, chết khô hoặc thai sẩy (dẫn liệu Trần Thị Bích Liên, 2008)

Mẫu bệnh còn tươi phải được giữ vô trùng và vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm, được bảo quản ở nhiệt độ 40C không quá 2 ngày Nếu bảo quản trong thời gian dài hơn cần giữ mẫu ở -700C

Ưu điểm: Gia tăng số lượng virus để có thể chẩn đoán xác nhận tốt hơn bằng những kỹ thuật sinh học phân tử

Hạn chế: Phổ tế bào vật chủ giới hạn của virus; chẩn đoán có thể gặp khó khăn khi sử dụng vắc xin sống nhược độc bởi vì những heo đã tiêm phòng có thể có

19

virus trong máu đến vài tuần sau khi tiêm và có thể truyền lây virus vắc xin cho những con cùng đàn (Benfield và cs, 2002)

 Phương pháp kháng thể huỳnh quang (FA: fluorescent antibody staining)

Nên sử dụng loại mẫu tươi hoặc mẫu bảo quản lạnh Mẫu phổi hoặc lách của heo nhiễm bệnh được gắn lên phiến kính và được ủ với kháng huyết thanh gắn huỳnh quang (fluorescein isothiocyanate : FITC) (dẫn liệu Trần Thị Bích Liên, 2008)

Hạn chế : Độ nhạy và độ đặc hiệu không cao, mô bệnh phải giữ lạnh nhanh không để mô tự hủy, nếu không, chất lượng mẫu có thể ảnh hưởng tới kết quả

 Phương pháp hóa mô miễn dịch (IHC: Immunohistochemistry staining) Các loại mô bệnh có thể sử dụng bao gồm : Tim, thận, phổi, hạch lâm ba, lách, tuyến thymus và hạch amidan Kháng nguyên virus PRRS cũng có thể được phát hiện trong tuyến thượng thận ruột, gan và đôi khi trong não (dẫn liệu Trần Thị Bích Liên, 2008)

Hạn chế: Mất nhiều thời gian; giá thành cao hơn phương pháp FA; việc kéo dài sự cố định mô bệnh trong formol có thể ảnh hưởng đến kết quả phát hiện kháng nguyên virus, khắc phục bằng cách đặt mô bệnh trong cồn sau khi cố định bằng formol (dẫn liệu Trần Thị Bích Liên, 2008)

2.2.2.3 Phương pháp sinh học phân tử

20

 Nguyên tắc

Sự bắt cặp bổ sung chuyên biệt giữa mồi (primer) và đoạn gen

Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài để hình thành mạch mới Phương pháp PCR đã được hình thành dựa vào đặc tính đó của các DNA polymerase Khi cần khuyếch đại một trình tự DNA xác định ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự đó

đủ để tạo các mồi bổ sung chuyên biệt, gồm một mồi xuôi (sens primer) và một mồi ngược (antisens primer)

Đối với virus PRRS, các loại mồi đặc hiệu theo trình tự của ORF7, ORF6 hoặc ORF1b thường được dùng để phát hiện vật liệu gen của virus trong các mẫu lâm sàng (dẫn liệu Trần Thị Bích Liên, 2008)

Để phát hiện 1 phổ lớn các thể phân lập virus PRRS, người ta sẽ chọn các primer trên nhiều vùng của toàn bộ bộ gen virus Những khác biệt trong việc phát hiện là do sự biến chủng, hoặc sự biến đổi tính kháng nguyên của những thể phân lập

 Giai đoạn 2: giai đoạn bắt cặp (annealation) Mồi tiến hành gắn kết với DNA mẫu ở 400C- 700C trong 30-60 giây, nhiệt độ

và thời gian tuỳ thuộc vào mồi sử dụng cho phản ứng Việc xác định nhiệt độ lai này là rất quan trọng, nó quyết định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR Nếu nhiệt độ lai trong giai đoạn này quá thấp sẽ dẫn đến sự bắt cặp không đặc hiệu, dẫn đến kết quả khuếch đại bị sai Nếu nhiệt độ lai quá cao sẽ dẫn đến độ nhạy của phản

21

ứng kém vì mồi sẽ không bắt cặp được Nhiệt độ này có thể được tính thông qua

Tm.( Tm : nhiệt độ nóng chảy của mồi) Thông thường nhiệt độ lai được sử dụng thấp hơn

 Giai đoạn 3: giai đoạn kéo dài (elongation) Enzyme Tag polymerase hoạt động và tổng hợp sợi DNA ở nhiệt độ 720C-

740C trong 30 giây đến vài phút tuỳ thuộc vào chiều dài đoạn DNA cần tổng hợp (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 1998)

 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR

Phản ứng khuếch đại tối ưu phải xảy ra trên DNA thật tinh sạch

Đoạn gen cần khuếch đại không nên lớn hơn 3kb, chiều dài lý tưởng là nhỏ hơn 1kb

 Enzyme Taq polymerase chịu nhiệt được tách chiết từ vi khuẩn sống ở các suối nước

nóng Thermus aquaticus Enzyme này không bị phá vỡ ở nhiệt độ biến tính

 Mồi và nhiệt độ lai Mồi là chỉ tiêu quan trọng để khuyếch đại DNA được thành công và có hiệu quả cao Việc lựa chọn mồi cần tuân thủ theo một số nguyên tắc sau:

- Độ dài của đoạn mồi khoảng từ 17-30 nucleotide Các đoạn mồi không nên chứa hơn 3 nucleotide giống nhau xếp liên tiếp

- Tỷ lệ G:C lý tưởng trong đoạn mồi vào khoảng 50% để nhiệt độ bắt cặp của đoạn mồi là không quá thấp

- Hai đoạn mồi không được có trình tự nucleotide bổ sung lẫn nhau

- Tránh sử dụng các đoạn mồi có thể nhân lên các đoạn gen phụ

- Nhiệt độ lúc bắt đầu phản ứng, nghĩa là lúc đã cho enzyme tổng hợp DNA vào, không nên thấp hơn nhiệt độ bắt cặp cặp của đoạn mồi

22