Áp dụng phương pháp hoá mô miễn dịch immunohistchemistry trong chẩn đoán hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp PRRS) ở lợn phân lập virus PRRS trên môi trường tế bào marc 145

Tổng hợp tình hình dịch PRRS tại các tỉnh miền Trung Lợn con Lợn thịt Tổng số Lợn nái Lợn con Lợn thịt So với ựợt dịch ngoài Bắc, lợn nhiễm bệnh tại các tỉnh miền Trung có tốc ựộ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-

TRẦN QUANG HƯNG

ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP HÓA MÔ MIỄN DỊCH

(Immunohistochemistry) TRONG CHẨN ðOÁN HỘI

CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP (PRRS) Ở LỢN PHÂN LẬP VIRUS PRRS TRÊN MÔI TRƯỜNG TẾ BÀO

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này

là trung thực và chưa từng ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc hoàn thành luận văn này

ñã ñược cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn ñã ñược ghi rõ nguồn gốc

Hà Nội, tháng 08 năm 2011

Tác giả luận văn

Trần Quang Hưng

LỜI CẢM ƠN

Nhân dịp hoàn thành luận văn này, cho phép tôi ựược bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất ựến TS Nguyễn Thị Lan, người hướng dẫn khoa học ựã tận tình giúp ựỡ và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện ựề tài và hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong bộ môn bệnh lý, Khoa Thú

y, Viện đào tạo sau ựại học Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội, ựã tạo mọi ựiều kiện thuận lợi và giúp ựỡ tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành ựến lãnh ựạo, các anh chị và các bạn trong khoa Nông nghiệp trường đại học Hải Phòng, các ựồng nghiệp tại các Chi cục Thú y, các tập thể và cá nhân ựã tạo ựiều kiện thuận lợi và giúp ựỡ tôi trong việc thực hiện luận văn này

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ựến gia ựình và bạn bè ựã giúp ựỡ, ựộng viên tôi trong suốt thời gian qua

Hà Nôi, tháng 08 năm 2011 Tác giả luận văn

Trần Quang Hưng

3.5.1 Phương pháp lấy mẫu, bảo quản mẫu và làm tiêu bản 27

3.5.3 Phương pháp phân lập virus 31

4.3 Bệnh tích vi thể trên một số cơ quan của lợn nghi mắc PRRS 44 4.4 Sử dụng phương pháp hố mơ miễn dịch để chẩn đốn hội chứng

4.5 Kết quả phân lập PRRSv trên mơi trường tế bào Marc 145 57 4.6 Mối tương quan giữa bệnh tích đại thể, vi thể với kết quả nhuộm

4.7 So sách kết quả nhuộm IHC với kết quả phân lập virus trên mơi

3.1 Quy trình hoạt ñộng của hệ thống máy chuyển ñúc mẫu tự ñộng 28

4.3 Bệnh tích ñại thể trên một số cơ quan của lợn nghi mắc PRRS 384.4 Bệnh tích vi thể tại các cơ quan của lợn nghi mắc PRRS 45

4.6 Kết quả phân lập PRRSV trên môi trường tế bào Marc 145 584.7 Mối tương quan giữa biến ñổi ñại thể, vi thể và hóa mô miễn dịch

DANH MỤC CÁC ẢNH

Ảnh 16 Nang Lâm ba hoại tử, thâm nhiễm tế bào viêm (HEx20) 51

Ảnh 29 Tế bào Marc 145 chưa gây nhiễm virus 59

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

PRRS : Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome

PRRSV : Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

DMEM : Dulbessco Modifiel Eagle Medium

FBS : Fetal Bovin Serum

DMSO : Dimethyl Sulfoxide

EDTA : Ethidium Tetra Acetat

PBS : Photphat Buffer Salin

TBE : Tris Borate

CPE : Cell Pathology Effect

KD : KiloDalton

DAB : 3,3 – Di Amino Benzidine tetrahydrochloride

PHẦN I

MỞ ðẦU

Trong thời gian vừa qua tại nước ta chăn nuôi là một trong những ngành

có những bước phát triển mạnh mẽ hàng ñầu, nhằm phục vụ cho nhu cầu của nhân dân trong nước cũng như xuất khẩu, góp một phần rất lớn vào việc cải thiện ñời sống nhân dân Ngoài ra nó còn là một ngành ngày càng chiếm vị trí quan trọng trong sự chuyển dịch kinh tế, xoá ñói giảm nghèo và làm giàu cho người dân

Tuy nhiên trên bước ñường phát triển ñó ngành chăn nuôi ñã gặp phải không ít khó khăn ðặc biệt bệnh và dịch bệnh là một trong những trở ngại lớn nhất của ngành chăn nuôi Trong thời gian gần ñây bệnh “tai xanh” hay hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome – PRRS) ñã trở thành nỗi kinh hoàng ñối với người chăn nuôi

Thời gian ñầu khi mới xuất hiện, virus gây bệnh còn chưa thể hiện những tác ñộng to lớn, nhưng sang những năm ñầu thế kỷ 21, hàng loạt các nước có báo cáo ghi nhận những thiệt hại do PRRS gây ra Dịch ñã diễn ra tại rất nhiều nước và trở thành dịch ñịa phương tại rất nhiều nơi trên thế giới, gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi

Dịch PRRS ở lợn tuy không thiệt hại về người nhưng lại gây những thiệt hại không nhỏ về kinh tế cho ngành chăn nuôi Riêng tại Mỹ, nước có ngành công nghiệp chăn nuôi phát triển và công nghệ hiện ñại nhưng dịch PRRS mỗi năm cũng làm thiệt hại 560 triệu USD (Neumann và cs, 2005) Những báo cáo ñầu tiên về PRRS ñã ñược thấy tại Hoa Kỳ vào cuối những năm 80 của thế kỷ trước tuy nhiên lúc ñó chưa rõ căn nguyên gây bệnh Năm 1991 các nhà khoa học ñã phân lập ñược căn nguyên gây bệnh là do một loại virus ARN chuỗi ñơn dương, có vỏ bọc ngoài và ñược gọi là virus gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome Virus – PRRSV) Tiếp theo các báo cáo ở Mỹ, nhiều báo cáo khác cũng diễn ra tại nhiều nơi trên thế giới: tại ðức năm 1990, Hà Lan năm 1991, các nước châu Á vào

đầu những năm 90 Tại Việt Nam, theo yêu cầu phân tích các mẫu huyết thanh của các trại chăn nuơi khu vực Thành phố Hồ Chí Minh, trung tâm Thú y vùng Thành phố Hồ Chí Minh nay là Cơ quan Thú y vùng VI đã phân tích và cho biết

cĩ rất nhiều mẫu huyết thanh dương tính với PRRS (Cục thú y, 2008) Tuy nhiên PRRS đã được biết cĩ tại Việt Nam lần đầu tiên vào năm 1997 trên đàn lợn nhập từ Mỹ vào các tỉnh miền Nam

Dịch PRRS thực sự bùng phát ở nhiều nơi trên thế giới bắt đầu từ năm

2005, tại Việt Nam vào năm 2007 Trước tình hình bùng phát của dịch đã thơi thúc các nhà khoa học đi sâu nghiên cứu và tìm biện pháp khống chế và dập tắt dịch

Việc chẩn đốn bệnh chính xác, hiệu quả cĩ một ý nghĩa rất quan trọng trong việc xử lý và thanh tốn bệnh Cĩ rất nhiều phương pháp chẩn đốn PRRS

đã được các nhà khoa học tìm ra: phương pháp ELISA, RT-PCR, phản ứng kháng thể huỳnh quang gián tiếp – IFA, … Phương pháp chẩn đốn bằng kỹ thuật hĩa mơ miễn dịch là một phương pháp mới đang được áp dụng hứa hẹn sẽ mang lại hiệu quả tích cực trong chẩn đốn PRRS

Trong nghiên cứu này chúng tơi thực hiện đề tài “ Áp dụng phương pháp hĩa mơ miễn dịch (Immunohistochemistry) trong chẩn đốn hội chứng rối loạn sinh sản và hơ hấp (PRRS) ở lợn Phân lập virus PRRS trên mơi trường

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 LỊCH SỬ VÀ TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp của lợn (Porcine reproductive and respiratory syndrome – PRRS) còn ñược gọi với cái tên “bệnh Tai xanh”- do ñặc ñiểm ñặc trưng trên gia súc mắc bệnh là da vùng tai có màu xanh - ñược ghi nhận lần ñầu tiên ở Mỹ tại vùng bắc của bang California, bang Iowa và Minnesota (1987) Rất nhanh chóng, năm 1988 bệnh lan sang Canada Sau ñó, các nước vùng châu Âu cũng xuất hiện bệnh Ở ðức năm 1990, Hà Lan, Tây Ban Nha, Bỉ,

hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine respiratory and reproductive syndrome_

PRRS) (Nguyễn Bá Hiên và Huỳnh Thị Mỹ Lệ, 2007)

2.1.1 Tình hình dịch PRRS trên thế giới

Theo Cục Thú y 2008, từ năm 2005 trở lại ñây, 25 nước và vùng lãnh thổ thuộc tất cả các châu lục trên thế giới ñều có dịch PRRS lưu hành (trừ châu Úc

và Newzeland) Có thể khẳng ñịnh rằng PRRS là nguyên nhân gây tổn thất kinh

tế cho ngành chăn nuôi lợn ở nhiều quốc gia trên thế giới

Bảng 2.1 Các nước ñã xác ñịnh có PRRS xuất hiện

PRRS ở lợn tại Trung Quốc

• Từ những năm 95 trở lại đây Trung Quốc cũng ghi nhận xảy ra các trường hợp lợn chết hàng loạt do PRRS ghép với các bệnh khác

• Năm 2006 dịch xảy ra ở hơn 10 tỉnh Trong vịng 3 tháng, tổng số lợn mắc bệnh là trên 2 triệu con, số chết là trên 400 nghìn con (tỷ lệ chết khoảng 20%)

• Bệnh cĩ tốc độ lây lan nhanh, trong vịng 3-5 ngày cả đàn cĩ thể bị nhiễm bệnh ðộ dài của bệnh khoảng 5-20 ngày tuỳ theo sức khoẻ của lợn Lợn mắc bệnh sốt cao 40-420C - bệnh sốt cao

• Năm 2007, dịch bệnh đã xảy ra ở trên 26 tỉnh/33 tỉnh, vùng lãnh thổ, với

trên 257.000 lợn mắc bệnh, chết hơn 68.000 con và tiêu huỷ 175.000 con

• Hiện đang cĩ 2 chủng virus PRRS lưu hành tại Trung Quốc: Chủng cổ điển độc lực thấp và chủng độc lực cao gây mắc bệnh, chết nhiều lợn

• Các chủng virus PRRS ở Trung Quốc thuộc dịng Bắc Mỹ

Tại Hồng Kơng: lợn đã được xác định nhiễm đồng thời cả hai chủng

dịng Châu Âu và chủng dịng Bắc Mỹ

Tại Thái Lan: cĩ cả hai chủng Bắc Mỹ (chiếm 33,58%) và Châu Âu

(chiếm 66,42%) lưu hành Tỷ lệ lưu hành trung bình của PRRS là 17%

Tại Philippines: từ đầu năm 2007 đến nay, cĩ 18 ổ dịch làm 13.542 lợn

mắc bệnh, chết1.743 con Dịch bệnh xuất hiện rải rác ở hầu hết các địa phương trong cả nước Tỷ lệ lợn mắc bệnh, chết cũng tập trung ở lợn nái

và lợn con theo mẹ

Tại Lào, Cam-Pu-Chia và Myanmar: mặc dù cũng đã xuất hiện nhiều

lợn mắc bệnh ở những địa phương giáp Trung Quốc nhưng cả hai nước hiện nay vẫn chưa chẩn đốn được PRRS

Một số nhận xét về tình hình dịch trên thế giới

 PRRS đã trở thành dịch địa phương ở nhiều nước trên thế giới, kể cả các nước cĩ ngành chăn nuơi lợn phát triển

 PRRS cĩ thể gây ra những tổn thất rất lớn về kinh tế cho người chăn nuơi

Ví dụ, tại Mỹ những tổn thất do PRRS gây ra hàng năm khoảng 560 triệu USD

 Xự xuất hiện PRRS độc lực cao là mối nguy hiểm nghiêm trọng cho ngành chăn nuơi lợn của các nước

 Hiện nay, chưa cĩ bất kỳ nước nào trên thế giới cĩ thể thanh tốn được PRRS Các nước đành xác định “sống chung với PRRS”

2.1.2 Tình hình dịch PRRS tại Việt Nam

Lần đầu tiên trong lịch sử vào năm 1997, PRRS được phát hiện trên đàn lợn nhập từ Mỹ vào các tỉnh miền Nam Kết quả kiểm tra thấy 10/51 lợn giống nhập khẩu cĩ huyết thanh dương tính với PRRS Tồn bộ số lợn này đã được xử

lý vào thời gian đĩ Tuy nhiên, trong những năm tiếp theo, các nghiên cứu về bệnh trên những trại lợn giống tại các tỉnh phía Nam cho thấy tỷ lệ lợn cĩ huyết thanh dương tính với bệnh rất khác nhau, từ 1,3% cho tới 68,29%

Như vậy cĩ thể thấy virus PRRS đã xuất hiện và lưu hành tại nước ta trong một thời gian dài Tuy nhiên, kể từ khi xác định được lợn cĩ kháng thể kháng virus PRRS ở đàn lợn giống nhập từ Mỹ, tại Việt Nam chưa từng cĩ vụ dịch PRRS nào xảy ra

 Năm 2007

Dấu ấn quan trọng của dịch PRRS tại Việt Nam được bắt đầu từ ngày 12/3/2007 khi hàng loạt đàn lợn tại Hải Dương cĩ những biểu hiện ốm khác thường Ngày 23/3/2007, cơ quan thú y tại tỉnh này đã báo cáo cho Cục Thú y, ngay sau đĩ ngày 26/3/2007, Trung tâm Chẩn đốn Thú y Trung ương - Cục Thú y đã tiến hành lấy mẫu xét nghiệm và cho kết quả dương tính với virus PRRS Do lần đầu tiên dịch PRRS xuất hiện tại Việt Nam và do khơng quản lý được việc buơn bán, vận chuyển lợn ốm, dịch PRRS đã lây lan nhanh và phát triển mạnh tại 6 tỉnh thành khác nhau thuộc ðồng bằng Sơng Hồng gồm: Hưng Yên, Bắc Ninh, Quảng Ninh, Thái Bình, Bắc Giang và Hải Phịng làm hàng ngàn con lợn mắc bệnh (bảng 2.2)

Lợn con

Lợn thịt

Tổng

số

Lợn nái

Lợn con

Lợn thịt

Ngồi các tỉnh được xác định là cĩ dịch tại bảng 2.2, Cục thú y cũng đã cĩ kết quả chẩn đốn dương tính với PRRS tại một số đàn lợn thuộc các tỉnh, thành: Thanh Hố, Hà Nội, Sơn La và Lào Cai Tuy nhiên, do chỉ xuất hiện ở các đàn riêng lẻ cùng với các biện pháp xử lý triệt để nên đã khơng cĩ dịch PRRS phát triển tại các địa phương này

Do thực hiện kiên quyết các biện pháp phịng chống dịch nên sau hơn một tháng dịch PRRS đã được khống chế (Bộ nơng nghiệp và phát triển nơng thơn, 2007)

+ đợt dịch thứ 2

Ngày 25/6/2007, dịch lại xuất hiện tại tỉnh Quảng Nam rồi lan sang một

số tỉnh khác như: Thừa Thiên Huế, đà Nẵng và Quảng Ngãi làm trên 30 ngàn lợn mắc bệnh, hàng ngàn lợn chết và phải tiêu hủy như tổng hợp ở bảng 2.3

Bảng 2.3 Tổng hợp tình hình dịch PRRS tại các tỉnh miền Trung

Lợn con

Lợn thịt

Tổng

số

Lợn nái

Lợn con

Lợn thịt

So với ựợt dịch ngoài Bắc, lợn nhiễm bệnh tại các tỉnh miền Trung có tốc

ựộ lây lan, chết nhanh hơn, ựặc biệt là tỉnh Quảng Nam do phát hiện và chẩn ựoán bệnh chậm, không kiểm soát ựược việc vận chuyển lợn ốm ra khỏi vùng dịch nên mức ựộ lây lan và thiệt hại nặng nề hơn so với các tỉnh khác

Như vậy chỉ trong 4 tháng dịch PRRS ựã xuất hiện ở cả 3 miền Bắc, Trung, Nam với 324 xã thuộc 65 huyện của 19 tỉnh với số lợn chết và phải tiêu hủy là trên 20.000 con Tình hình dịch PRRS vẫn ựang diễn biến phức tạp và không có chiều hướng lắng xuống

 Năm 2008

Cũng theo báo cáo của Cục Thú y (2/2009), năm 2008, bệnh tai xanh ñã xảy

ra tại 956 xã, phường thuộc 103 huyện 26 tỉnh và thành phố trong cả nước với tổng số gia súc mắc bệnh phải tiêu huỷ là 309.586 con và ñược chia thành 2 ñợt dịch chính:

ðợt 1: Từ tháng 1 ñến hết tháng 4 năm 2008 Tổng số tỉnh có dịch là 10 tỉnh, thành phố, tổng số gia súc mắc bệnh là 270.608 con Trong ñó tỉnh có dịch nặng nhất ñợt này là Thanh Hóa với gần 200.000 gia súc bị tiêu huỷ

ðợt dịch thứ 2 diễn ra từ tháng 5 năm 2008 ñến tháng 9 năm 2008 với tổng

số gia súc mắc bệnh là 30.298 con Tình hình dịch bệnh tai xanh năm 2008 ñược thể hiện trong bảng 2.4 và 2.5

Bảng 2.4 Tình hình dịch PRRS ñợt 1 năm 2008

Stt Tỉnh/Thành phố Số

Số mắc bệnh (con)

Số huỷ (con)

Thời ñiểm phát dịch

Bảng 2.5 Tình hình dịch PRRS ñợt 2 năm 2008

Stt Tỉnh/Thành phố Số

huyện Số xã

Số mắc bệnh (con)

Số huỷ (con)

Thời ñiểm phát dịch

Bảng 2.6 Tình hình dịch PRRS năm 2009

(con)

Số lợn tiêu huỷ (con)

và Sơn La Tổng số lợn mắc bệnh là 146.051 con, trong ñó số tiêu hủy là 65.911 con

đợt 2: dịch xảy ra tại miền Trung và miền Nam

Theo kết quả ựiều tra, ựợt dịch này bắt ựầu từ ngày 01/6/2010 tại Sóc Trăng Sau ựó dịch xuất hiện tại Tiền Giang (ngày 19/6), Bình Dương (ngày 27/6), Long An (ngày 15/7), Quảng Trị (ngày 01/7)

Trong ựợt dịch thứ hai của năm 2010 toàn quốc ghi nhận các ổ dịch lợn tai xanh tại 38.115 hộ chăn nuôi của 1.443 xã, phường, thị trấn thuộc 195 huyện, quận của 34 tỉnh thành phố: Sóc Trăng, Quảng Trị, Tiền Giang, Long An, Bình Dương, Bạc Liêu, Quảng Nam, đồng Nai, Bình Phước, đà Nẵng, Vĩnh Long, Khánh Hòa, đắk Lắc, Hậu Giang, Bà Rịa Ờ Vũng Tàu, Lâm đồng, Tây Ninh,

An Giang, đồng Tháp, Cần Thơ, Bến Tre, Kiên Giang, Kon Tum, Cà Mau, đắc Nông, Gia Lai, Trà Vinh, Bình Thuận, Ninh Thuận, Phú Yên, Lào Cai, Nghệ

An, Cao Bằng và Quảng Ninh

Tổng số lợn trong ựàn mắc bệnh là 926.337 con, số mắc bệnh là 621.086 con, trong ựó số chết và tiêu hủy là 336.975 con

 Năm 2011: từ ựầu năm 2011 ựến ngày 23/5/2011

Lợn con

Lợn thịt

Tổng số chết, tiêu hủy

Lợn nái

Lợn con

Lợn thịt

kê mức ựộ lưu hành của bệnh trong nửa ựầu năm 2011 thì bệnh xảy ra với quy

mô nhỏ hẹp và mức ựộ thiệt hại thấp hơn so với các năm khác, nhưng trừ trường hợp của tỉnh Nghệ An Theo thống kê của cục thú y riêng tỉnh Nghệ An có

11858 con mắc bệnh chiếm tỷ lệ 80.64% so với cả nước Tổng số con chết và tiêu hủy là 11816 con chiếm tỷ lệ 99.64% so với tổng số con mắc của tỉnh và chiếm tỷ lệ 85.43% tổng số lợn tiêu hủy của cả nước tắnh ựến cùng thời ựiểm

2.2 CĂN NGUYÊN GÂY BỆNH

Khi dịch bệnh xảy ra, lúc ựầu người ta cho rằng 1 số virus như: Parvo virus, virus giả dại (Pseudorabies), virus cúm lợn (Porcine entero virus), ựặc biệt virus gây viêm cơ tim (Encephalomyo carditis) gây nên Tuy nhiên, mọi sự nhầm lẫn xung quanh vấn ựề bệnh nguyên học của PRRS ựã ựược giải quyết vào tháng 6 năm 1991, Wensvoort và cộng sự ở Viện Thú y Trung ương Hà Lan ựã phân lập ựược 1 virus trước ựây chưa công nhận từ những con bệnh mắc PRRS ở thành phố nơi ựặt Viện thú y Họ ựặt tên virus mới này là ỘLelystadỢ Virus ựược phân lâp ở 16 trong số 20 lợn con bị bệnh, 41 trong số 63 lợn nái bị bệnh, phát hiện thấy 75% trong số 165 lợn nái mắc bệnh có huyết thanh dương tắnh, có biểu hiện triệu chứng lâm sàng, ngoài ra còn phát hiện trong bào thai của lợn nái ựang chửa và ở lợn ựang phát triển Tất cả những bằng chứng ựó liên quan ựến virus Lelystad như là nguyên nhân gây PRRS (Nguyễn Bá Hiên và Huỳnh Thị Mỹ Lệ (2007); Phạm Sỹ Lăng và Văn đăng Kỳ (2007); đàm Văn Phải (2008))

Nguyên nhân gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản của lợn là một virus

thuộc họ Arteriviridae giống Nidovirales Các thành viên trong họ Arteriviridae có

cấu trúc và sự nhân lên giống với virus họ Coronaviridae Sự khác biệt giữa hai họ virus này chắnh là bộ gen của Arteriviridae chỉ bằng 1/2 bộ gen của Coronaviridae

và nét giống nhau ựặc trưng của chúng là bản sao mã giống nhau ựặc trưng của lớp Nidoviral Theo Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ (2007), họ Arteriviridae chỉ

có 1 giống duy nhất Arterivirus chứa tất cả 4 thành viên dưới ựây:

Bảng 2.8 Arterivirus gây bệnh trên ñộng vật

Equine virus (EAV) Ngựa Bệnh toàn thân, viêm ñộng mạch, sảy

thai, thai chết, viêm phổi ở ngựa con

Porcine respiratory and

reproductive syndrome virus

(PRRSV)

Lợn

Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản của lợn, bệnh toàn thân; ñặc trưng bởi hiện tượng sảy thai, thai chết yểu và bệnh ñường hô hấp

Lactate dehydrogenase -

elevating virus (LDHV) Chuột Bệnh gây cô ñặc sữa ở chuột

Simian hemorrhagic fever

virus (SHFV)

Khỉ (linh trưởng)

Bệnh sốt xuất huyết khỉ, có bệnh lý toàn thân, thường giết chết con vật

2.2.1 ðặc tính hạt virus

Hạt virus có ñường kính 50 – 70 nm, chứa nucleocapsid cùng kích thước có cấu trúc ñối xứng 20 mặt, ñường kính 35 nm, ñược bao bọc bên ngoài bởi một lớp vỏ bọc dính chặt với cấu trúc bề mặt giống như tổ ong Bộ gen bao gồm 1 phân tử ñơn chuỗi dương là 1 ARN kích thước từ 13- 15 kb Sợi ARN virus có 1 cổng 5’ và 1 dải cổng ñầu 3’ Gen ARN polymeraza chiếm khoảng 75% ñầu 5’ của bộ gen, gen mã hoá cho các protein cấu trúc của virus nằm ở ñầu 3’

Hạt virus bao gồm 1 protein nucleocapsid N với khối lượng phân tử 1.200

D, 1 protein màng nonglycosylate hình cầu M với khối lượng phân tử 16.000 D,

2 protein peplomer N – glycosylate là GS có khối lượng phân tử 25.000 D và GL

có khối lượng phân tử 42.000 D

Arterivirus nhân lên trong tế bào chất của tế bào vật chủ mà luôn là ñại thực bào Virus gây viêm ñộng mạch ngựa nhân lên với hiệu giá cao trong các tế bào của ngựa; virus gây cô ñặc sữa trên chuột có hiệu giá cao trong tế bào của

chuột, có thể ñạt tới hiệu giá 1011 ID50/ml huyết tương trong những ngày ñầu nhiễm bệnh

Năm 1991, Viện Thú y Lelystad (Hà Lan) ñã phân lập thành công virus gây

ra hội chứng PRRS, sau ñó là Mỹ và ðức Ngày nay, virus ñược gọi là Lelystad

ñể ghi nhớ sự kiện nơi ñầu tiên virus này ñược phân lập Tuy nhiên, PRRSV vẫn

là tên gọi phổ biến

PRRSV có 2 chủng nguyên mẫu (Prototype), chủng Bắc Mỹ là virus VR2332 và chủng châu Âu là Lelystad (LV) Các chủng virus này gây bệnh trên ñộng vật cảm thụ với bệnh cảnh giống nhau, nhưng chúng lại ñại diện cho 2 genotype khác biệt mà sự khác biệt ñó vào khoảng 40%, do ñó tạo ra một lớp màng bí mật về nguồn gốc của loại virus này Những nghiên cứu gần ñây còn cho thấy có sự khác biệt về tính di truyền trong các virus phân lập ñược từ các vùng ñịa lý khác nhau Bản thân các virus trong cùng một nhóm cũng có sự thay ñổi về chuỗi nucleotit khá cao ñến 20%, ñặc biệt là các chủng virus thuộc dòng Bắc Mỹ Chính sự khác biệt và sự ña dạng về tính kháng nguyên, khả năng biến ñổi cấu trúc kháng nguyên của virus ñã làm tăng thêm những khó khăn trong việc sản xuất vacxin chống lại nó Vấn ñề miễn dịch bảo hộ chéo giữa chủng dòng Châu Âu và chủng dòng Bắc Mỹ là một câu hỏi lớn cho các chương trình tiêm chủng vắc xin phòng PRRS

Những nghiên cứu gần ñây ở Trung Quốc cho thấy, virus PRRS tồn tại dưới hai dạng, dạng cổ ñiển ñộc lực thấp và dạng biến thể ñộc lực cao, gây nhiễm và chết nhiều lợn Trong khi ñó, ở Việt Nam, các ñợt dịch xảy ra trong các năm cho thấy chủng virus PRRS mới xuất hiện ở nước ta ñã làm chết nhiều

và chết nhanh lợn nhiễm bệnh, ñặc biệt là lợn nái và lợn con theo mẹ cho dù trước ñó một vài kết quả nghiên cứu cũng ñã cho thấy virus PRRS ñã xuất hiện nhưng không gây ra ổ dịch nào trong phạm vi toàn quốc

Virus có ñặc ñiểm là rất thích hợp với ñại thực bào ñặc biệt là ñại thực bào hoạt ñộng ở vùng phổi Virus nhân lên ngay bên trong ñại thực bào, sau ñó

ñại thực bào bị phá huỷ nên sức ñề kháng của lợn nhiễm bệnh bị giảm sút nghiêm trọng, do ñó lợn nhiễm virus PRRS thường bị bội nhiễm các loại mầm bệnh khác ðiều này có thể thấy rõ ở những ñàn vỗ béo hoặc chuẩn bị giết thịt

có sự tăng ñột biến về tỷ lệ viêm phổi

2.2.2 Cấu trúc của virus

Theo Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ (2007), PRRSV là một virus có hình cầu, có vỏ bọc ngoài với ñường kính của virion vào khoảng 45 – 55nm, nucleocapsid có ñường kính từ 30 – 35 nm, là ARN virus với bộ gen là một phân tử ARN sợi ñơn dương, có những ñặc ñiểm chung của nhóm Arterivirus Sợi ARN này có kích thước khoảng 15 kilobase, có 9 ORF (open reading frame)

mã hoá cho 9 protein cấu trúc

Tuy nhiên, có 6 phân tử protein chính có khả năng trung hoà kháng thể bao gồm 4 phân tử glycoprotein, 1 phân tử protein màng (M) và 1 protein vỏ nhân virus (N) Nhưng hoạt ñộng trung hoà xảy ra mạnh với các protein có khối lượng phân tử 45, 31 và 25 KD (bảng 2.9)

Bảng 2.9: Protein cấu trúc của PRRSV

45-55 nm

2.2.3 Khả năng gây bệnh

PRRSV chỉ gây bệnh cho lợn Lợn ở tất cả các lứa tuổi ñều cảm nhiễm, nhưng lợn con và lợn nái mang thai thường mẫn cảm hơn cả Loài lợn rừng cũng mắc bệnh, ñây có thể coi là nguồn dịch thiên nhiên

Về mặt ñộc lực, người ta thấy PRRSV tồn tại dưới 2 dạng:

Dạng cổ ñiển: có ñộc lực thấp, ở dạng này khi lợn mắc bệnh thì có tỷ lệ chết thấp, chỉ từ 1 – 5% trong tổng ñàn

Dạng biến thể ñộc lực cao: gây nhiễm và chết nhiều lợn

Thông thường virus PRRS chỉ gây bệnh cho lợn, không gây bệnh cho người và các ñộng vật khác Tuy nhiên, một số loài thủy cầm chân màng, vịt trời (mallard duck) ñã ñược chứng minh là rất mẫn cảm với virus PRRS, và virus có thể nhân lên ở loài vịt này, do ñó vấn ñề phát tán virus ra diện rộng là khó trách khỏi (Zimmerman và cs 1997)

2.2.4 Cơ chế sinh bệnh và phương thức truyền lây

* Cơ chế sinh bệnh

Virus có trong dịch mũi, nước bọt, phân và nước tiểu của lợn mắc bệnh hoặc lợn mang trùng và phát tán ra môi trường; tinh dịch của lợn ñực giống nhiễm virus cũng là nguồn lây lan bệnh Ở lợn nái mang thai, virus có thể từ mẹ xâm nhiễm sang bào thai và gây bệnh Lợn con nhiễm bệnh và lợn mang trùng có thể bài thải virus trong vòng 6 tháng (Bùi Quang Anh và cs, 2008)

Bệnh có thể lây trực tiếp thông qua sự tiếp xúc giữa lợn mắc bệnh, lợn mang trùng với lợn khoẻ và có thể lây gián tiếp qua các nhân tố trung gian bị ô nhiễm virus

Sau khi xâm nhập, ñích tấn công của virus là các ñại thực bào ðây là tế bào duy nhất có receptor phù hợp với cấu trúc hạt virus, vì thế virus hấp thụ và thực hiện quá trình nhân lên chỉ trong tế bào này và phá huỷ nó Một tỷ lệ lớn tế bào ñại thực bào trong nang phổi bị virus xâm nhiễm rất sớm

Lúc ñầu, PRRSV có thể kích thích các tế bào này, nhưng sau 2 hoặc 3 ngày virus sẽ giết chết chúng, các virion ñược giải phóng và ồ ạt xâm nhiễm sang các

tế bào khác Ở giai ñoạn ñầu của quá trình xâm nhiễm của PRRSV, dường như hiệu giá kháng thể chống lại các loại virus và vi khuẩn không liên quan khác trong cơ thể của lợn tăng cao do sự kích hoạt của ñại thực bào trong hệ thống miễn dịch ðiều này rất dễ gây ra sự nhầm lẫn trong việc ñánh giá mức ñộ miễn dịch ñối với các bệnh truyền nhiễm ở cơ thể lợn

Cần phải thấy rằng, trong hệ thống miễn dịch của cơ thể, ñại thực bào ñóng vai trò vô cùng quan trọng trong ñáp ứng miễn dịch cả không ñặc hiệu và ñặc hiệu, ñây là loại tế bào trình diện kháng nguyên thiết yếu, mở ñầu cho quá trình ñáp ứng miễn dịch ñặc hiệu Khi tế bào ñại thực bào bị virus phá huỷ, các phản ứng miễn dịch không xảy ra ñược, lợn nhiễm bệnh rơi vào trạng thái suy giảm miễn dịch và

dễ dàng mắc các bệnh nhiễm trùng thứ phát, ñiều này có thể thấy rõ ở những ñàn

lợn vỗ béo chuẩn bị giết thịt, khi bị nhiễm PRRSV sẽ có sự tăng ñột biến về tỷ lệ viêm phổi kế phát do những vi khuẩn vốn sẵn có trong ñường hô hấp

PRRSV xâm nhập và phá hủy ñại thực bào, làm giảm khả năng phòng vệ của phổi, tạo ñiều kiện ñể các vi khuẩn, virus khác tấn công vào hệ thống bảo vệ của phổi, (Nguyễn Bá Hiên và Huỳnh Thị Mỹ Lệ (2007))

Những vi khuẩn hay gây bệnh kế phát ở phổi và nguyên nhân có triệu chứng tai xanh:

Nguyễn Hữu Nam, Nguyễn Thị Lan (2007) trong nghiên cứu về PRRS cho rằng, phổi chắc ñặc chính là nguyên nhân gây khó thở dẫn ñến thiếu oxy tại máu và các mô bào Chính nguyên nhân suy giảm sự trao ñổi khí tại phổi làm máu của gia súc bệnh có màu sẫm, màu này có thể nhìn ñược từ bên ngoài tại các vùng da mỏng, các vùng da có nhiều mạch quản như vùng tai, bẹn, bụng,

Vì vậy mà có triệu chứng tai xanh Chúng ta thường gọi nôm na bệnh do PRRSV gây ra là bệnh "tai xanh" cũng là vì có triệu chứng này

Chính do cơ chế tác ñộng là tấn công vào hệ thống miễn dịch, gây suy giảm miễn dịch ñã mở cửa cho các loại vi sinh vật gây bệnh khác xâm nhập và gây bệnh Cơ chế gây bệnh này ta ñã gặp ở bệnh AIDS ở người và Gumboro ở

gà Việc sử dụng vắc xin PRRS phòng bệnh ngay từ ñầu ít có tác dụng bởi virus PRRS gồm 2 chủng là chủng Châu Âu (virus Lelystad) và chủng Bắc Mỹ (virus VR2332) Hai chủng này có ñộ lệch kháng nguyên lên tới 40%, ngoài ra ngay trong cùng một chủng, cũng có sự sai khác về kháng nguyên lên tới 20% (Nguyễn Bá Hiên và Huỳnh Thị Mỹ Lệ (2007)) Chính vì ñiều ñó làm cho việc

sử dụng vắc xin có mức ñộ bảo hộ thấp, dù ñã tiêm vắc xin nhưng gia súc vẫn có khả năng mắc bệnh Khi gia súc bị PRRS, hệ thống miễn dịch bị suy giảm rõ rệt

và dễ dàng bị nhiễm các loại vi sinh vật gây bệnh có sẵn trong cơ thể hoặc từ ngoài môi trường

Có nhiều báo cáo về nhiễm trùng kế phát ở ñàn lợn trong ổ dịch PRRS, ñặc biệt ở chuồng nuôi lợn sơ sinh Tác nhân chủ yếu liên quan ñến nhiễm trùng kế

phát là vi khuẩn: Haemophilus parasuis, Streptococcus suis, Salmonella cholerasuis, Pasteurella multocida và Actinobacillus, Pneuropneumoniae, Mycoplasma hyopneumoniae Nhiễm kế phát gồm SIV, EMCV, virus giả dại (PRV), Porcine cytomegalovirus , Porcine respiratory coronavius và Porcine paramyxovirus (Nguyễn Bá Hiên và Huỳnh Thị Mỹ Lệ 2007)

Những thống kê gần ñây cho thấy, trong hầu hết các ổ dịch PRRS luôn có sự

tham gia của các loại vi sinh vật gây bệnh khác như Streptococcus suis, Swine fever và Salmonella cholera suis Những xét nghiệm tại nhiều cơ sở chăn nuôi

ngoài xét nghiệm PRRSV còn xét nghiệm thêm các loại vi sinh vật trên Như vậy, với sự hiện diện của PRRSV cùng với một trong các loại vi sinh vật gây bệnh trên sẽ làm cho lợn bị bệnh với các triệu chứng rất nặng, con vật dễ chết

* ðường lây truyền

Con ñường lây nhiễm chủ yếu qua ñường hô hấp, qua thụ tinh nhân tạo, tiếp xúc trực tiếp Virus nhân lên ở phế nang phá hủy tế bào nội mạc mạch máu, giảm sản sinh tế bào trong hạch Lâm ba làm cho lợn giảm sức ñề kháng dễ nhiễm những bệnh kế phát khác Virus có trong dịch mũi, nước bọt, tinh dịch, phân, nước tiểu và phát tán ra môi trường bên ngoài Theo Nguyễn Văn Thanh (2007), con ñường lây truyền qua thụ tinh nhân tạo là quan trọng nhất và cần

ñược kiểm soát chặt chẽ hơn Ở lợn mẹ mang trùng virus có thể lây nhiễm cho bào thai ở giai ñoạn kỳ giữa trở ñi và virus cũng ñược bài xuất qua nước bọt và sữa Lợn trưởng thành có thể bài xuất virus trong vòng 14 ngày trong khi ñó lợn con và lợn choai bài xuất virus trong thời gian 1-2 tháng Virus có thể ñược phát tán thông qua con ñường vận chuyển lợn mang trùng theo gió có thể ñi xa tới 3km, bụi, bọt nước, dụng cụ chăn nuôi, dụng cụ bảo hộ lao ñộng nhiễm trùng, thụ tinh nhân tạo và có thể phát tán nhờ một số loài chim hoang dã

Nhiều nghiên cứu ñã nhận ñịnh rằng, chính khả năng tồn tại của virus trong một số loài chim hoang dã ñặc biệt là vịt trời ñã làm cho virus phát tán mạnh và khó kiểm soát Cùng với sự di chuyển trong quá trình kiếm ăn và di trú của các loài chim hoang dã, virus ñược phát tán ñi khắp nơi Tô Long Thành (2007)

Ngoài ra, một nguyên nhân quan trọng khác làm cho virus phát tán mạnh, làm lây lan dịch bệnh nhanh chóng ra các ñịa phương chính là do sự vận chuyển gia súc không ñược kiểm dịch, vận chuyển gia súc bệnh ñi tiêu thụ ñã làm cho dịch lan rộng Cục Thú y (2008)

2.2.5 Loài mắc bệnh

Lợn ở các lứa tuổi ñều có thể cảm nhiễm virus Các cơ sở chăn nuôi công nghiệp với quy mô lớn, bệnh thường lây lan rộng tồn tại lâu dài trong ñàn nái, rất khó thanh toán Lợn nái thường truyền mầm bệnh cho bào thai Lợn rừng ở các lứa tuổi khác nhau ñều có thể cảm nhiễm virus, có thể phát bệnh, nhưng thường không có triệu chứng lâm sàng và trở thành nguồn tàng trữ mầm bệnh trong tự nhiên Cho ñến nay kết quả nghiên cứu ở một số nước châu Âu ñều cho thấy virus PRRS không cảm nhiễm cho các loại thú khác và người

Thông thường virus PRRS chỉ gây bệnh cho lợn nhưng không gây bệnh cho người và các ñộng vật khác Tuy nhiên, một số loại gia cầm như vịt trời (mallard duck) ñã chứng minh là rất mẫn cảm với virus PRRS và virus có thể nhân lên ở loài vịt này Do ñó, vấn ñề phát tán virus này ra diện rộng là khó tránh khỏi (Nguyễn Bá Hiên và Huỳnh Thị Mỹ Lệ, 2007)

- Ở lợn nái:

Trong tháng ñầu tiên khi bị nhiễm bệnh lợn biếng ăn, sốt 40-410C, một số con tai chuyển màu xanh trong thời gian ngắn, tím ñuôi, tím âm hộ, sảy thai ở giai ñoạn ñầu Lợn nái trong giai ñoạn nuôi con thường biếng ăn, lười uống nước, viêm vú, mất sữa, ñộng dục lẫn lộn (5-10 ngày sau khi sinh) nái chậm lên giống nếu bệnh kéo dài sẽ kế phát nhiều bệnh ghép và dẫn ñến tử vong ðỉnh cao của bệnh là hiện tượng sảy thai, ñẻ non, thai chết lưu, thai gỗ hàng loạt Lợn con ñẻ ra yếu ớt tỷ lệ tử vong cao có thể lên tới 70%

- Lợn ñực giống:

Khi bị nhiễm bệnh lợn thường bỏ ăn, sốt cao, ñờ ñẫn hoặc hôn mê, một số con có hiện tượng tai chuyển thành màu xanh ðặc biệt xuất hiện hiện tượng viêm dịch hoàn, giảm hưng phấn hoặc mất tính dục, lượng tinh dịch ít, chất lượng tinh kém Lợn ñực giống rất lâu mới hồi phục ñược khả năng sinh sản

- Lợn con cai sữa và lợn choai:

Lợn chán ăn, lông xơ xác, có biểu hiện ho nhẹ Trong những trường hợp ghép với bệnh khác có thể thấy viêm phổi cấp tính, hình thành nhiều ổ áp xe, thể trạng gầy yếu, da xanh, tiêu chảy, hắt hơi, thở nhanh, chảy nước mắt, tỷ lệ chết khoảng 15%

* Bệnh tích của lợn mắc PRRS

- Lợn nái chửa:

Trường hợp ñẻ non thì thấy có nhiều thai ñã chết, trên cơ thể chúng có nhiều ñám thối rữa (thai chết lưu) Trường hợp ñẻ muộn thì số thai chết lưu ít hơn nhiều so với ñẻ non song số lợn con sinh ra rất yếu, nhiều con chết trong lúc

ñẻ do thời gian ñẻ kéo dài

Mổ khám thấy bệnh tích tập trung ở phổi, phổi bị phù nề, viêm hoại tử và tích nước, cắt miếng phổi bỏ vào bát nước thấy phổi chìm

- Lợn nái nuôi con, lợn choai và lợn vỗ béo:

Bệnh tích tập trung ở phổi Các ổ viêm thường gặp ở thuỳ ñỉnh, song cũng thấy ở các thuỳ khác nhưng hầu như không xuất hiện ñối xứng Các ổ viêm, áp

xe thường có màu xám ñỏ, rắn, chắc Mô phổi lồi ra và có màu ñỏ xám loang lổ như tuyến ức hay như ñá granito Cắt miếng phổi nhỏ bỏ vào nước thấy miếng phổi chìm, chứng tỏ phổi ñã bị phù nề tích nước nặng

Tim, gan, lách có màu thẫm hơn so với bình thường, bệnh tích không ñặc trưng tuỳ thuộc vào sự kế phát các bệnh khác

Những lợn bị táo bón thì ruột chứa nhiều phân cục rắn chắc, niêm mạc ruột bị viêm nhưng ở những lợn bị tiêu chảy thì thành ruột mỏng trên bề mặt có phủ một lớp nhầy màu nâu

- Lợn con theo mẹ:

Thể xác gầy, ướt Các biến ñổi ở phổi giống như các loại lợn khác Ruột chứa nhiều nước, thành ruột mỏng và ñôi khi thấy có một số cục sữa vón không tiêu

PHẦN III ðỐI TƯỢNG, ðỊA ðIỂM, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ðỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu được tiến hành trên đối tượng là lợn mắc và nghi mắc PRRS

ở các ổ dịch tại Hải Phịng và Thái Bình, trong đĩ các đối tượng lợn chúng tơi tiến hành nghiên cứu là:

- Lợn con theo mẹ

- Lợn sau cai sữa

- Lợn nái mang thai

- Lợn nái nuơi con

3.2 ðỊA ðIỂM THỰC HIỆN ðỀ TÀI

ðề tài được thực hiện tại phịng thí nghiệm trung tâm khoa Thú y, phịng Thí nghiệm bộ mơn Bệnh lý khoa Thú y, trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội

- Chẩn đốn hội chứng PRRS bằng phương pháp hố mơ miễn dịch

- Nghiên cứu các biến đổi bệnh lý của tế bào khi nuơi cấy phân lập virus trên mơi trường Marc 145

3.4 NGUYÊN LIỆU

* Các mẫu bệnh phẩm

- Mẫu bệnh phẩm gồm các loại mẫu được lấy từ lợn nhiễm hoặc nghi nhiễm PRRS bao gồm: mẫu máu, phổi, hạch, gan, thận, ruột, lách, não, tim Mẫu bệnh phẩm được thu tại các ổ dịch PRRS tại Hải Phịng và Thái Bình

* Các dụng cụ, hoá chất trong phòng thí nghiệm gồm:

3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.5.1 Phương pháp lấy mẫu, bảo quản mẫu và làm tiêu bản

* Phương pháp lấy mẫu :

Các mẫu này ñược lấy theo quy ñịnh tiêu chuẩn của ngành:

ðể xác ñịnh ñược các biến ñổi ñại thể của một số cơ quan, tổ chức của lợn nghi mắc PRRS cần tiến hành mổ khám những lợn có biểu hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh Lợn bệnh ñược cố ñịnh cẩn thận, tiến hành lấy máu từ vịnh tĩnh mạch cổ ñể ñông rồi chắt lấy huyết thanh

Lột da và bộc lộ xoang ngực, xoang bụng, tách các cơ quan nội tạng khỏi

cơ thể quan sát và chụp ảnh Tiến hành thu mẫu các cơ quan như: phổi, hạch phổi, tim, gan, lách, thận… làm hai bộ Một bộ ngâm trong formol 10% ñể làm tiêu bản

vi thể, một bộ mẫu tươi bảo quản ñông lạnh – 700C ñể phân lập virus

Yêu cầu của việc lấy mẫu: cần lấy ñúng, lấy ñủ:

+ Lấy ñúng: lấy ñúng cơ quan, ñúng vùng tổn thương ñiển hình

+ Lấy ñủ: lấy ñủ thành phần cấu tạo cần nghiên cứu và ñủ lượng cần thiết.

* Phương pháp làm tiêu bản bệnh lý

Từ những mẫu bệnh phẩm có các biến ñổi ñại thể cần tiến hành làm tiêu bản ñể xác ñịnh bệnh tích vi thể chủ yếu của bệnh Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo quy trình tẩm ñúc bằng parafin, nhuộm Haematoxilin – Eosin (HE) Các bước của quá trình làm tiêu bản vi thể như sau:

Cố ñịnh bệnh phẩm

Ngâm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10%

Vùi bệnh phẩm

Tiến hành lần lượt các bước sau:

- Rửa focmol: Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ trong 24h

- ðưa mẫu vào hệ thống máy chuyển ñúc mẫu tự ñộng

Bảng 3.1 Quy trình hoạt ñộng của hệ thống máy chuyển ñúc mẫu tự ñộng

đúc tiêu bản

đúc mẫu bệnh phẩm trong parafin

Cắt dán mảnh và cố ựịnh tiêu bản

Cắt mảnh: bằng máy microtom mỗi lát cắt từ 2-3 ộm

Tãi mảnh: Dàn lát cắt bằng phẳng trên phiến kắnh trong nước ấm 480C Sau ựó ựể tủ ấm 370C ựến khi bệnh phẩm khô là có thể ựem nhuộm ựược

Nhuộm tiêu bản

Các bước tiến hành:

+ Khử parafin: Cho tiêu bản qua hệ thống xylen gồm 3 lọ:

Xylen I: 10 phút Xylen II: 10 phút Xylen III: 10 phút + Khử xylen: Cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 4 lọ:

Cồn 1000: 2 lần (mỗi lần 1 phút) Cồn 950: 1 lần

Cồn 700: 1 lần Cồn 500: 1 lần + Khử cồn: Cho dưới vòi nước chảy 15 phút

+ Nhuộm Haematoxylin (nhuộm nhân)

Nhỏ haematoxilin ngập tiêu bản trong 5 phút, rửa nước

Sau ựó cho tiêu bản qua hệ thống cồn:

Nhỏ Eosin ngập tiêu bản khoảng 5-10 phút, rửa nước

Cho tiêu bản qua hai lọ cồn 1000 mỗi lọ 1 phút

+ Tẩy cồn, làm trong tiêu bản: Cho tiêu bản ựi qua xylen

Gắn Baume canada

Nhỏ một giọt Baume canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn cịn xylen trên tiêu bản Kiểm tra tiêu bản trên kính hiển vi quang học

3.5.2 Phương pháp hĩa mơ miễn dịch chẩn đốn PRRS

Nhuộm hố miễn dịch được tiến hành trên tiêu bản cắt parafin Sau khi cắt tiêu bản được đưa lên phiến kính và khử parafin, các cơng đoạn của quá trình khử parafin giống như nhuộm hố tổ chức

- Sau khi khử parafin, tiêu bản được ngâm trong cốc đựng dung dịch PBS

và được hấp ướt ở 1210C trong 5 phút

- Ngâm tiêu bản trong dung dịch gồm 9 phần Methanol và 1 phần H2O2trong 5-10 phút

Hình ảnh minh họa kết quả nhuộm hĩa mơ miễn dịch dương tính, âm tính