PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN ORF5 VÀ ORF7 CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP (PRRSV) Ở MỘT SỐ TỈNH MIỀN NAM VIỆT NAM

Do đó, đề tài “phân tích trình tự gen ORF5 và ORF7 của virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp PRRSV ở một số tỉnh miền nam việt nam” được thực hiện từ tháng 03/2009 đến tháng 07

Tháng 8/2009

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN ORF5 VÀ ORF7 CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP (PRRSV)

Ở MỘT SỐ TỈNH MIỀN NAM VIỆT NAM

iii

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên con xin gửi lời cám ơn đến ba mẹ đã luôn yêu thương và tạo mọi điều kiện cho con học tập Em cảm ơn anh hai đã luôn động viên và chỉ dạy em mọi điều

Em xin chân thành cảm ơn:

Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ Sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã dạy những kiến thức hay và phong cách làm việc tốt cho em trong suốt 4 năm học

Tập thể cán bộ và quý Thầy - Cô Viện công nghệ sinh học và môi trường, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực tập

Em xin trân trọng biết ơn Thầy PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải hết lòng hướng dẫn

và tạo điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp Chị Thuỳ Dương, cùng nhóm nghiên cứu, đã tận tình giúp đỡ và chỉ dẫn em trong lúc khó khăn Các bạn cùng nhóm nghiên cứu đã chia sẽ và động viên tôi trong quá trình làm

việc chung Các bạn lớp DN05SH đã cùng nhau học tập suốt thời gian học

Tp Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2009

Võ Khánh Hưng

iv

TÓM TẮT

Việc xây dựng cây di truyền virus PRRS có ý nghĩa quan trọng trong dịch tễ học Từ cây di truyền ta có thể nhận biết được nguồn gốc phát sinh dịch bệnh, từ đó có những biện pháp hữu hiệu để phòng chống và ngăn ngừa sự lây lan bệnh ở một số tỉnh miền Nam Việt Nam Do đó, đề tài “phân tích trình tự gen ORF5 và ORF7 của virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRSV) ở một số tỉnh miền nam việt nam” được thực hiện từ tháng 03/2009 đến tháng 07/2009 tại Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi Trường với kết quả đạt được như sau:

Ly trích và giải trình tự hai khung đọc mở ORF5 và ORF7 trên các chủng virus tại Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu, Tp.HCM và chủng virus vaccine BSL-PS100

Trên cây di truyền dựa trên khung đọc mở ORF5 (phần mềm phân tích trình tự MEGA4.1, nhóm virus PRRS tại Đồng Nai và Tp.HCM thuộc nhóm châu Mỹ, phân nhóm 2.2, cùng nhóm với chủng virus PRRS độc lực cao của Trung Quốc (99%) Virus vaccine BSL-PL100 thuộc nhóm châu Mỹ, phân nhóm 2.1 Độ tương đồng giữa virus tại Đồng Nai và Tp.HCM với virus vaccine BSL-PS100 là 87,9 – 88,6 %

Trên cây di truyền dựa trên khung đọc mở ORF7 (bằng phần mềm phân tích trình tự MEGA4.1), nhóm virus PRRS tại Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu và Tp.HCM thuộc nhóm châu Mỹ, phân nhóm 2.1 và 2.2 Trong đó có hai chủng phân lập từ Bà Rịa – Vũng Tàu có sự biến đổi lớn so với các chủng thực địa khác (89,5 – 90,3 %) và chủng vaccine BSL-PS 100 (91,1 %)

Có sự khác biệt về trình tự amino acid trên hai protein, Glycoprotein 5 (ORF5 qui định) và Nucleocapsid protein (ORF7 qui định), giữa virus PRRS ở Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu và Tp.HCM so với chủng virus vaccine BSL-PS100

v

SUMMARY

A phylogenetic tree of porcine reproduction and respiratory virus is very important to epidemiology From phylogenetic tree, the origin of epidemic could be known so that the effective policies established to control and protect the widespread

of reproduction and respiratory virus in Ho Chi Minh City So, The study “genetic analysis of porcine reproduction and respiratory virus in South Viet Nam” was carried out from March 1st 2009 to August 15th 2009 at Research Institute for Biotechnology and Environment, Nong Lam University Results obtained from the study:

Isolating and sequencing two open reading frames (ORF) 5 and ORF7 of

porcine reproduction and respiatory virus isolated in Dong Nai, Ba Ria – Vung Tau,

Ho Chi Minh City and virus of vaccine BSL-PS100

Groups of porcine reproduction and respiratory virus isolated in Dong Nai and

Ho Chi Minh city belong to subgroup 2.2 of North American group and separate from others in ORF5 phylogenetic tree (use MEGA4.1 software package)

Groups of porcine reproduction and repiratory virus isolated in Dong Nai, Ba Ria – Vung Tau and Ho Chi Minh city belong to subgroup 2.1, 2.2 of North American group and separate from others in ORF7 phylogenetic tree (use MEGA4.1)

On Glycoprotein 5 (ORF5) and Nucleocapside protein (ORF7) regions, there were differences between PRRSV isolated in Dong Nai, Ba Ria – Vung Tau, Ho Chi Minh city and PRRSV in BSL-PS100 vaccine

vi

MỤC LỤC

Lời cảm ơn iii

Tóm tắt iv

Summary v

Danh sách các chữ viết tắt viii

Danh sách các bảng ix

Danh sách các hình x

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu và yêu cầu 2

1.2.1 Mục tiêu 2

1.2.2 Yêu cầu 2

1.2.3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn 3

2.2 Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (prrsv) 3

2.2.1 Các chủng virus PRRS và sự phân bố của chúng 3

2.2.2 Cấu trúc phân tử của virus PRRS 5

2.2.2.1 Cấu trúc virion 5

2.2.2.2 Tổ chức bộ gen của virus PRRS 6

2.2.2.3 Protein không cấu trúc 7

2.2.2.4 Protein cấu trúc 8

2.3 Một sồ phương pháp chẩn đoán trong phòng thí nghiệm 11

2.4 Sơ lược các nghiên cứu có liên quan 11

2.4.1 Trên thế giới 11

2.4.2 Trong nước 13

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

3.1 Thời gian và địa diểm 14

3.2 Vật liệu và hóa chất 14

3.2.1 Vật liệu nghiên cứu 14

vii

3.2.2 Hóa chất 14

3.3 Phương pháp tiến hành 15

3.3.1 Thu nhận mẫu 15

3.3.2 Ly trích RNA từ huyết thanh 15

3.3.3 Thực hiện phản ứng RT-PCR 16

3.3.4 Điện di sản phẩm PCR 18

3.3.5 Giải và phân tích trình tự 19

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

4.1 Ly trích RNA và RT-PCR từ vaccine BSL-PS100 23

4.2 Thiết lập cây di truyền của virus PRRS dựa trên khung đọc mở ORF5 24

4.3 Thiết lập cây di truyền của virus PRRS dựa trên khung đọc mở ORF7 29

4.4 Sự khác biệt về trình tự aa trên GP5 giữa các chủng virus PRRS 34

4.5 Sự khác biệt về trình tự aa trên N protein giữa các chủng virus PRRS 39

4.6 Nhận định chung về dịch tễ PRRSV theo phân tích di truyền trên virus PRRS ở Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu và Tp.HCM 43

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 45

5.1 Kết luận 45

5.2 Đề nghị 46

5.3 Tài liệu tham khảo 47 PHỤ LỤC

LDHV : Lactate Dehydrogenase Elevating Virus

M protein : Membrane protein

MLV : Modified Live Virus

mRNA : messenger RNA

N protein : Nucleocapside protein

NA : North American

NLS : Nuclear Localization Signal

Nsp : Non-structural protein

nt : nucleotide

ORF : Open Reading Frame

PCP : Papain like Cystein Protease

PRRS : Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome PRRSV : Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome Virus

QN : Quảng Nam

RNA : Ribonucleic acid

RT-PCR : Reverse transcriptase – polymerase chain reaction

sg mRNAs : subgenomic mRNAs

SHFV : Simian Hemorrhagic Fever Virus

ix

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Tỉ lệ tương đồng về trình tự gen của một số chủng PRRSV 4

Bảng 3.1 Thành phần hóa chất phản ứng RT-PCR 17

Bảng 3.2 Các chủng virus trong bệnh phẩm được giải trình tự 20

Bảng 3.3 Chủng Virus tham chiếu từ Việt Nam 20

Bảng 3.4 Các chủng virus tham khảo trên thế giới 21

Bảng 4.1 Phần trăm tương đồng giữa các chủng PRRSV trên ORF5 và ORF7 34

DANH SÁCH CÁC HÌNH TRANG Hình 2.1 Cây phân bố giống, loài của một số chủng PRRSV 4

Hình 2.2 Cấu trúc virus PRRS 5

Hình 2.3 Tổ chức genome và mô hình nhân bản của virus PRRS 7

Hình 2.4 Vùng chức năng và vị trí cắt trên ORF1a và ORF1b 8

Hình 3.1 Sản phẩm sau điện di của phản ứng RT-PCR 18

Hình 4.1 Kết quả RT-PCR 2 đoạn gen ORF5 và ORF7 23

Hình 4.2 Cây di truyền vùng ORF5 dạng không gốc 25

Hình 4.3 Cây di truyền vùng ORF5 dạng cây 26

Hình 4.4 Cây di truyền vùng ORF7 dạng không gốc 30

Hình 4.5 Cây di truyền vùng ORF7 dạng cây 31

Hình 4.6 Bảng sắp gióng hàng trình tự amino acid GP5 36

Hình 4.7 Sự đa dạng của các acid amin trong vùng GP5 37

Hình 4.8 Bảng Sắp gióng hàng trình tự aa N protein của các chủng PRRSV 40

Hình 4.9 Đồ thị biểu hiện tính hiếu nước của các aa trên vùng N protein 40

Hình 4.10 Sự đa dạng của các acid amin trong vùng N Protein 42

Hình 4.11 Tình hình bệnh PRRS tại Việt Nam 2007-2008 44

Dịch bệnh hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (PRRSV) (hay còn gọi là bệnh heo tai xanh) ảnh hưởng nghiêm trọng đến ngành chăn nuôi, vì đối tượng mắc bệnh PRRS tập trung nhiều vào heo nái (NguyễnThanh Sơn - phó cục trưởng Cục Chăn nuôi) (Nguồn: VietNamNet.vn 17/04/08) Trong năm 2009, dịch bệnh bùng phát trở lại ở cả 3 miền với không dưới 10 địa phương, trong đó phía Nam có 5 tỉnh: Bạc Liêu, Vĩnh Long, Sóc Trăng, Bà Rịa – Vũng Tàu, Bình Phước Trong bối cảnh phần lớn các sản phẩm động vật tiêu thụ tại TPHCM là từ các tỉnh lân cận nên nguy cơ dịch bệnh xảy ra trên địa bàn TP HCM và các tỉnh lân cận hiện tại là rất cao và khó kiểm soát (Huỳnh Hữu Lợi, Chi cục trưởng Chi cục Thú y TPHCM) (Nguồn: SGGP, 17/07/2008)

Việc phân tích di truyền giúp hiều rõ hơn về nguồn gốc căn bệnh, các yếu tố nguy cơ dẫn đến sự phát sinh và lan truyền của dịch bệnh (Nguyễn Ngọc Hải, 2007) Qua đó, quan sát sự biến đổi và phân loại các chủng virus PRRS và giúp đánh giá được hiệu quả sử dụng vaccine và công tác phòng chống bệnh

Do tầm quan trọng của việc đánh giá sự biến đổi của virus PRRS, chúng tôi thực hiện đề tài “phân tích trình tự gen ORF5 và ORF7 cỦa virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRSV) ở một số tỉnh miền nam việt nam” tạo tiền đề cho các nghiên cứu sâu về dịch tễ học phân tử virus PRRS, đóng góp vào chiến lược phòng

và trừ bệnh

1.2 Mục tiêu và yêu cầu

Nắm vững các nguyên lý, quy tắc ly trích RNA, phản ứng RT-PCR

Xử lý số liệu trình tự khung đọc mở ORF5 và ORF7 bằng phần mềm tin sinh học, đưa

ra ý kiến nhận xét về các số liệu trên

1.2.3 Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu trình tự khung đọc mở ORF5 và ORF7 của virus PRRS phân lập tại Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu, Tp.HCM và vaccine PRRS, BSL-PS100

Phân tích di truyền của các chủng virus trên dựa vào khung đọc mở ORF5 và

ORF7 và so với virus trong vaccine BSL-PS100

Phân tích trình tự amino acid, vùng chức năng, đặc tính kháng nguyên của các protein, do 2 khung đọc mở ORF5 và ORF7 qui định, của virus PRRS thực địa và so với chủng virus vaccine BSL-PS100

Chương 2 TỔNG QUAN

2.1 Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRS) là bệnh xảy ra trên lợn với đặc điểm gây sảy thai ở lợn nái và rối loạn đường hô hấp trên lợn sơ sinh và lợn choai (Christianson và ctv, 1992) Bệnh được phát hiện lần đầu tiên ở Bắc Mỹ vào khoảng năm 1987, sau này được tìm thấy ở Châu Âu (Albina, 1997), Pháp, Tây Ban Nha, Canada và ở Châu Á vào đầu những năm 1990 (Murakami và ctv, 1994; Shimizu và ctv, 1994) Cho đến nay, PRRS đã lan rộng trên các vùng khắp thế giới với những đặc trưng của từng chủng khác nhau trên từng vùng, gây ra những thiệt hại kinh tế nặng nề hàng năm (Albina, 1997; Blaha, 2000; Gao, 2004) Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện vào năm 1997 trên đàn lợn nhập từ Mỹ (10/51 con có huyết thanh dương tính) Các nghiên cứu về bệnh trên những trại lợn giống tại các tỉnh phía Nam cho thấy

tỷ lệ lợn có huyết thanh dương tính với bệnh rất khác nhau, từ 1,3% cho tới 68,29% Ở các nước khác, tỷ lệ đàn trong vùng bệnh có huyết thanh dương tính rất cao, như ở Anh là 60-75%, Mỹ là 36% (Phòng Dịch Tễ – Cục Thú y, 2007)

2.2 Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRSV)

PRRS do Arterivirus gây nên – loại virus này được phân lập và định loại vào năm 1991, được xếp vào loài Nidovirales, họ Arteriviridae, giống Arterivirus, gần với equine arteritis virus (EAV), Lactic Dehydrogenase virus (LDHV) và simian hemorrhagic fever virus (SHFV) (Dea và ctv, 2000), có kích thước vào khoảng 50-

70nm, chịu được nhiệt độ thấp (tồn tại 4 tháng dưới nhiệt độ -70oC)

2.2.1 Các chủng virus PRRS và sự phân bố của chúng

Hiện nay, virus PRRS đã được xác lập với 2 kiểu gen chính là kiểu gen có nguồn gốc từ châu Âu (EU) và kiểu gen có nguồn gốc từ châu Mỹ (NA) (Meulenberg

và ctv, 1993) Việc so sánh trình tự gen đã cho thấy sự khác biệt di truyền quan trọng giữa hai nhóm này Ở Bắc Mỹ chỉ tìm thấy kiểu gen NA, mặc dù cũng có một số báo cáo đã cô lập được kiểu gen EU (Ropp, 2004) Ở Châu Âu thì kiểu gen EU trội hơn và cho đến năm 1998 vẫn chưa có chủng nào thuộc kiểu gen NA được xác lập ở phía Tây Châu Âu (Madsen và ctv, 1998) Ở Châu Á và Nam Mỹ cả hai kiểu gen trên đã được

xác lập Tuy nhiên bên trong mỗi kiểu gen lại có sự khác nhau giữa các chủng Sự

khác nhau giữa các chủng được cho thấy trong Bảng 2.1 và Hình 2.1 bên dưới

Bảng 2.1 Tỉ lệ tương đồng về trình tự gen của các chủng virus PRRS

Hình 2.1 mô tả cây phân bố giống, loài của PRRSV theo số liệu trong bảng 2.1

trên Trong đó có hai kiểu gen dòng châu Mỹ (với chủng VR2332 phân lập tại Mỹ,

chủng 807/ 94 Canada và Taiwan Đài Loan) và kiểu gen châu Âu (với chủng I10 ở

Hàlan và chủng Olot Tây ban nha) Sự khác nhau giữa các chủng phụ thuộc vào sự

khác nhau trong chuỗi trình tự nuceotide hay chuỗi hợp chất hữu cơ của protein trong

từng chủng virus

2.2.2 Cấu trúc phân tử của virus PRRS

2.2.2.1 Cấu trúc virion

PRRSV là virus có vỏ bao, đường kính khoảng 50-70 nm Virion của PRRSV

gồm 3 cấu phần, khác nhau về hình thái Thứ nhất, bộ gen là RNA sợi đơn (+) nằm

trong nhân Thứ hai là vỏ capsid bao bọc bộ gen của virus Cấu trúc thứ ba là vỏ bao ngoài, đây là màng lipid chứa glycoprotein virus và phức hợp protein (Conzelmann, 1993) gồm: protein xuyên màng M (integral membrane protein) tạo phức hợp với glycoprotein virus chính - GP5 (major viral glycoprotein- GP5) xung quanh nhân Hai glycoprotein virus khác (GP2 và GP4) cũng đựơc gắn với màng và hiện diện ít hơn so với GP5 (Nelson và ctv, 1995) Một glycoprotein virus thứ tư (GP3) được mô tả như

một phần của cấu trúc virion trên dòng virus PRRS dòng châu Âu Lelytad (Nieuwstadt

và ctv, 1996) trong khi chủng virus PRRS dòng châu Mỹ tại Quebec người ta cho rằng GP3 được biểu hiện như protein không cấu trúc hoà tan (Mardassi và ctv, 1998)

Hình 2.2 Cấu trúc virus PRRS (LEE, KANG MI, 2007)

2.2.2.2 Tổ chức bộ gen của virus PRRS

Chuỗi hệ gen đầy đủ của virus PRRS được xác lập vào năm 1993, nó có kích thước khoảng 15,1 đến 15,5 kb và chứa 8 khung đọc mở nằm bên sườn hai vùng không dịch mã (untranslate region - UTR) 5’UTR và 3’UTR, và có cấu trúc mũ methyl tại đầu 5’ và đuôi poly (A) tại đuôi 3’ (hình 2.2) Ngoài ra, một khung đọc mở bên trong (internal ORF) được tìm thấy trên ORF2 của virus PRRS (Snijder và ctv, 1999) ORF 1a và 1b định vị xuôi dòng từ đầu 5’-UTR, nó chiếm giữ khoảng 75% của bộ gene và ghi mã protein không cấu trúc, liên quan đến sự nhân bản của virus (Meulenberg và ctv., 1997; Dinten và ctv., 1999) ORF1a được dịch mã trực tiếp trong khi ORF1b được dịch bởi khung dịch chuyển ribosomal Chuỗi protein ORF1ab liên quan đến sự sao chép virus và bộ phận bản sao (Allende và ctv, 1999) ORF 2-7

định vị ngược dòng từ 3'-UTR, mã hóa một loạt các protein cấu trúc của virus như: protein vỏ ngoài (E) và protein vỏ nhân capsid (N) (Nucleocapside protein) (Nelson và ctv, 1995) Các protein này đều được dịch mã từ một 3’ UTR được định vị cố định trên các đoạn subgenomic mRNAs (sg mRNAs) (Eric và Janneke, 1998) Các sg mRNAs đựơc sản xuất thông qua sự sao mã mRNA không liên tục Trình tự “leader” chung thu được từ đầu 5’ của genomic mRNA được gắn với trình tự thân 3’ (3' terminal body sequence), đây là trình tự không liên tục trong bộ gen (Meulenberg và ctv., 1993) Sự liên kết giữa “leader” và vùng thân của sg mRNA được hình thành nhờ “trình tự điều hoà dịch mã” liên ứng (consensus “transcriptional regulatory sequence” - TRS) đây là yếu tố điều khiển quan trọng cho biểu hiện gen cấu trúc Sg mRNA chia sẻ đuôi 3’ của

nó, nhưng chỉ ORF đầu tiên tại đầu 5’ của mỗi bản sao được dịch mã bằng việc dùng TRS như một promoter (Yuan và ctv., 2004)

Hình 2.3 Tổ chức bộ gen và mô hình nhân bản của virus PRRS

(Nguồn: Snijder, 1998) (a) Bộ cấu trúc lồng vào nhau của RNA arterivirus; (b) sự sao mã không liên tục xảy ra trong quá trình tổng hợp RNA sợi (+); (c) mô hình khác kết hợp chặt chẽ với sự tổng hợp RNA sợi (-) không liên tục (+) sợi dương; (-) sợi âm

2.2.2.3 Protein không cấu trúc

Sản phẩm của ORF1 được phát hiện trong tế bào nhiễm virus nhưng không tìm thấy trong virion, vì vậy chúng được xem là những protein không cấu trúc ORF1a và ORF1b chiếm 75 % vùng 5’ terminal của bộ gen, ghi mã protein không cấu trúc, trong khi những ORF còn lại ghi mã protein cấu trúc ORF1a và ORF1b được dịch mã thành

2 polyprotein lớn như mô hình của EAV (Dinten và ctv, 1999), những polyprotein này

lần lượt bị cắt tại 10 vị trí và sau cùng tạo thành 12 sản phẩm, gồm nsp1-nsp8 và nsp12 Những nsp này có hoạt tính protease (Snijder và Meulenberg, 1998; Ziebuhr

nsp9-và ctv., 2000) nsp9-và những hoạt tính liên quan đến sự sao chép Những vùng protease nằm trên Nsp1, Nsp2 và Nsp4 và vị trí cắt của nó đựơc bảo tồn giữa những chủng thuộc họ

Arteriviruses (Allende và ctv., 1999)

Nsp1 protease đuợc xếp như cystein protease giống papain (papain like cystein protease - PCP) Nsp2 protease tương tự như nhóm protease giống papain (papain like protease) nhưng nó có những đặc tính riêng biệt như hoạt tính protease systeine tự phân cắt (Snijder, 1998) nên được xếp vào nhóm “chymotrypsin-like (3C-like) cysteine protease” (Snijder và ctv, 1995) Theo Pedersen và ctv (1999) nsp2 và nsp3 liên quan đến sự cảm ứng hình thành những túi màng kép (double-membrane vesicle) Hơn nữa, theo Oleksiewicz và ctv, (2001) nsp2 và nsp3 mang tính kháng nguyên cao Gene nsp2 cho thấy sự đa dạng di truyền cao nhất trong bộ gen virus, cũng như tính đa hình về kích thuớc đáng kể, gồm sự xen vào 108 base và sự mất 3-333 base (Fang và ctv, 2004) Điển hình, theo Tian và ctv (2007) những chủng Trung Quốc mang mầm bệnh cao, có sự mất không liên tục 90 base được báo cáo như là một chỉ thị phân tử (marker) di truyền dịch tễ Theo Gorbalenya và Snijder (1996), báo cáo Nsp4 có những đặc điểm giống “3C-like serine protease” (SP)

Hình 2.4 Vùng chức năng và vị trí cắt trên ORF1a và ORF1b dòng PRRSV

1624B ( Nguồn: Snijder, 1998) ( ) Vị trí cắt dự đoán bên trong ORF; (Nsp1) Papain-like protein; (C) Chymotrypsin-like serine protease; (Zf) Zinc finger; (H) Helicase; (*) Codon kết thúc

2.2.2.4 Protein cấu trúc

Hạt virus của PRRSV đuợc cấu thành từ 7 protein gồm 4 protein vỏ (envelope glycoprotein) là GP2a (ghi mã bởi ORF2a); GP3 (ORF3); GP4 (ORF4) và GP5 (ORF5); protein màng, M (ORF6); protein vỏ nucleocapsid, N (ORF7); và protein vỏ ngoài, E (ORF2b) (Hình 2.2) Thành phần protein cấu trúc chính trong hạt virus là protein N (14-15 kDa), M (18-19 kDa) và GP5 (24-26 kDa) (Dea S và ctv, 2000; Rowland, 2003)

Protein vỏ nucleocapsid, N (14–15 kDa) của PRRSV, được qui định bởi ORF7,

là non-glycosylated protein, không chứa peptide tín hiệu (signal peptide), có 123 hay

128 aa tương ứng với 2 chủng của PRRSV: VR2332 hay Lelystad (Mardassi và ctv, 1996) Protein N của virus PRRS dòng châu Mỹ và dòng châu Âu chỉ giống nhau khoảng 63 % về mặt aa, nhưng chúng có vùng kháng nguyên chung giữa aa vị trí 52

và 69 (Meulenberg và ctv, 1998; Wootton và ctv, 1998) Protein N mang tính kháng nguyên cao và là protein đa dạng nhất trong hạt virus, và đựơc dùng trong chuẩn đoán (Casal và ctv., 1998; Yang và ctv., 2000) Protein N mang vùng chức năng gắn RNA đuợc xem là giữ vai trò quan trọng trong sự sao chép (Rowland, 2003) Phân tích tình

tự N protein của các chủng dòng châu Mỹ xác định 2 trình tự tín hiệu định vị nhân (nuclear localization signal - NLS) nằm tại vị trí aa 10-13 và 41-42, đựơc đánh dấu theo thứ tự là NLS-1 và LNS-2 Sự thay thế aa lysine quan trọng với những aa không mang điện tích trong NLS-2 dẫn đến khoá sự định vị nhân hay hạch nhân Vùng aa

E51KPHFP LA58 được xem là mang tính trội miễn dịch cao, và bảo tồn giữa các chủng dòng châu Mỹ và dòng châu Âu

Protein GP5 (~ 26 kDa), do ORF5 qui định, là protein biến đổi nhiều nhất giữa các chủng PRRSV Dù có sự biến đổi giữa các chủng, nhưng dữ liệu tính kị nước của protein GP5 giống nhau (Andreyev, 1997) Vùng N-terminus của GP5 dự đoán chứa peptide tín hiệu, theo sau vùng hiếu nước Vùng chức năng này nằm trên bề mặt ngoài của virion và gồm 40 aa đầu tiên Ostrowski và ctv (2002) xác định vùng chức năng trung hoà (neutralizing epitope) và không trung hoà (non-neutralizing epitope) nằm trên vùng bề mặt (ectodomain) thuộc GP5 của virus PRRS Vùng chức năng không trung hoà được xem như là một vùng chức năng bẫy (decoy epitope) (aa vị trí 27 đến 30), gây ra đáp ứng miễn dịch không phòng vệ sớm và mạnh, ảnh hưởng đến đáp ứng với vùng chức năng trung hoà (aa vị trí 37 đến 45) Vùng ectodomain, theo sau bởi

vùng kị nước, chứa 2 đến 4 vị trí N-linked glycosylation Sự N-linked glycosylation của protein màng có chức năng khác nhau trong glycoprotein virus như sự gắn với receptor (receptor binding), dung hợp màng (membrane fusion), sự xâm nhập vào tế bào, và sự sinh sôi của virus ( Braakman, 2000; Doms, 1993) Cụ thể, theo Wissink và ctv (2004) nghiên cứu 2 vị trí N-linked glycosylation (N46 và N53) trên GP5 của virus PRRS dòng châu Âu, Lelystad, tương đương với vị trí N44 và N51 trên các chủng thuộc dòng châu Mỹ, sự glycoside hoá của aa vị trí N46 được yêu cầu mạnh mẽ cho việc sản xuất hạt virus Cụ thể, những đột biến trong đó những codon cho mỗi aa asparagine tương ứng được thay thế bởi codon cho aa glutamine: GP5-N46Q, GP5-N53Q và GP5 - đột biến với cả hai vị trí trên Kết quả là, đột biến GP5-N46Q giảm sự hình thành hay phóng thích những hạt virus Số lượng virus giảm khoảng 100 lần nếu đột biến tại vị trí N46 Cụ thể, thể đột biến GP5-N53Q cho thấy giảm nhẹ số đại thực bào dương tính (tương đương 70% so với thể PRRSV không đột biến) Trong khi đó, thể đột biến GP5-N46Q và thể đột biến ở cả hai vị trí (N46Q và N53Q) giảm đáng kể

số đại thực bào dương tính (tương đương 1 – 2 % so với thể PRRSV không đột biến) cho thấy những đột biến này ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của virus gây nhiễm

Protein GP5 và M (18–19 kDa) kết hợp chặt chẽ với nhau và tạo ra phức hợp

“heterodimeric” được liên kết bằng cầu nối disulfide trong hạt virion (Mardassi, 1996) Người ta cho rằng sự hình thành “heterodimer” này cần thiết cho sự lắp ráp của virus PRRS, vì khi không có sự tạo thành phức hợp này do sự vắng mặt hoặc là protein GP5 hoặc là protein M thì không có những hạt virus được giải phóng Tuy nhiên, sự phá vỡ cấu trúc “dimer” giữa protein GP5 và M không giảm tính gây nhiễm của virus giống như LDV và EAV (Lee C và ctv, 2005) Protein M được xem là có vai trò thiết yếu cho miễn dịch tế bào đối với virus PRRS vì nó gây ra đáp ứng mạnh nhất trong tất cả protein cấu trúc của virus PRRS trong đáp ứng kháng nguyên đặc hiệu (antigen-specific proliferation responses) (Bautista, 1999)

Qua phân tích gen và theo dõi sự thay đổi trình tự nucleotide của các dòng virus PRRS người ta đã xác định rằng ở virus PRRS dòng châu Mỹ, các khung đọc mở ORF7 và ORF6 có tính ổn định rất cao, chúng gần như không thay đổi trong suốt quá trình tiến hoá của các dòng virus này Tuy nhiên sự khác biệt giữa dòng virus PRRS châu Âu và Châu Mỹ ở 2 khung đọc mở này là rất rõ, cụ thể, sự tương đồng về trình tự

aa của ORF7 giữa 2 dòng virus này chỉ vào khoảng 57 đến 59% và của ORF6 là 70

đến 81% Trong khi đó khung đọc mở ORF5 lại biến đổi nhiều giữa các chủng trong cùng một dòng châu Mỹ (giống nhau chỉ từ 88 đến 97%) và chỉ tương đồng với dòng châu Âu khoảng từ 51 đến 59% (Nguyễn Ngọc Hải, 2007)

Thành phần protein cấu trúc khác trong hạt virion PRRSV là protein GP2 (29–

30 kDa), GP3 (41–50 kDa), và GP4 (31–35 kDa) và protein vỏ E (10 kDa) Protein GP2, GP3 và GP4 được nhận định là tương tác với những protein cấu trúc khác và được lắp ráp vào hạt virion như phức hợp “multimeric” (Lee và ctv., 2005) Cấu trúc phức hợp này mang chức năng xâm nhập của virus vì những hạt virus thiếu protein vỏ này không thể gây nhiễm (Wissink, 2005) Lee và ctv (2006) cho rằng protein E cùng với những protein vỏ thứ yếu khác hình thành một kênh làm cho việc cỡi áo của virus trở nên dễ dàng, giúp phóng thích bộ gen của virus vào tế bào chất vật chủ Protein GP3 của dòng châu Âu kết hợp chặt chẽ vào virion, trong khi protein GP3 của dòng Châu Mỹ là một protein ẩn và có thể hoà tan (Mardassi, 1998) Sự tương đồng về trình

tự aa qui định bởi các khung đọc mở ORF 2, 3 và 4 giữa các dòng châu Mỹ và châu Âu tương ứng chỉ ở mức độ từ 63, 58 và 68 % (Nguyễn Ngọc Hải, 2007)

2.3 Một số phương pháp chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

Chẩn đoán PRRSV trên môi trường nuôi cấy tế bào

Phương pháp kháng thể huỳnh quang (Fluorescent Antibody Staining - FA) và hoá mô miễn dịch (immunohistochemistry staining - IHC)

Kỹ thuật miễn dịch peroxidase một lớp(Immunoperoxidase Monolayer Asssay)

Kỹ thuật huỳnh quang gián tiếp (Indirect Immunoflourescence assay – IFA)

Kỹ thuật RT-PCR chẩn đoán PRRSV

Kỹ thuật RT-PCR có độ đặc hiệu và độ nhạy cao, thời gian cần thiết thực hiện xét nghiệm ngắn vì thế đựơc dùng rộng rãi trong chẩn đoán phát hiện PRRSV Để gia tăng độ nhạy trong chẩn đoán PRRSV có thể dùng kỹ thuật nestesd RT-PCR (RT-nPCR) RT-PCR được thực hiện với các cặp mồi khác nhau cho phép phát hiện gen của các ORF7, ORF6 hay ORF1b của PRRSV Virus PRRSV có 2 dòng: Châu Âu và Châu Mỹ Hai dòng này có độ tương đồng về gen khoảng 52 đến 81 % Dựa trên cở sở

đó nhiều cặp mồi đã được thiết kế đề phát hiện PRRSV nói chung và để phân biệt dòng virus PRRS châu Mỹ với châu Âu (Nguyễn Ngọc Hải, 2007)

2.4 Sơ lược các nghiên cứu có liên quan

2.4.1 Trên thế giới

Youjun và ctv (2007) xác định những chủng PRRSV phân lập từ vùng dịch ở Việt Nam và Trung Quốc năm 2007 Năm chủng PRRSV gồm một chủng từ Việt Nam (07QN) và bốn chủng phân lập từ Trung Quốc năm 2007 (07HEBTJ, 07BJ, 07HEN, 07NM) đã được giải trình tự toàn bộ bộ gen Phân tích quan hệ di truyền cho thấy chủng 07QN giống nhau 99% với PRRSV phân lập tại Trung Quốc về trình tự nucleotide Mối quan hệ di truyền dựa trên toàn bộ bộ gen của các chủng trên cho thấy rằng tất cả chủng virus phân lập này thuộc cùng nhóm trong nhóm 2 (dòng châu Mỹ)

và tương đồng với các chủng phân lập tại Trung Quốc trước đó

Năm 2002, Ostrowski và ctv xác định vùng chức năng trung hoà và không trung hoà trên vùng ectodomain GP5 của PRRSV Vùng chức năng không trung hoà được xem như là một vùng chức năng bẫy (decoy epitope) (aa vị trí 27 đến 30), gây ra đáp ứng miễn dịch không phòng vệ sớm và mạnh và giấu hay làm yếu đáp ứng với vùng chức năng trung hoà (aa vị trí 37 đến 45)

An và ctv (2007) phân tích và so sánh những trình tự aa trên GP5 của 42 chủng virus PRRS phân lập tại Trung Quốc năm 1996 và 2006 Đã phát hiện rằng tất cả các chủng phân lập tại Trung Quốc đều thuộc dòng châu Mỹ Giữa chúng có 2 phân nhóm

có sự thay đổi cao và phân biệt rõ trên cây di truyền của dòng châu Mỹ Tất cả phân nhóm 2 của dòng châu Mỹ đều đa dạng cao trên vùng chức năng trung hoà sơ cấp và những chủng virus này giới hạn trong phía Nam Trung Quốc Những chủng thuộc phân nhóm 1 của dòng châu Mỹ giống nhau cao với chủng vaccine RespPRRSV MLV

và chủng gốc của vaccine MLV, VR-2332

Wissink và ctv (2004) nghiên cứu vai trò của N-linked glycosylation trên protein GP2a và GP5 của chủng PRRSV LV Cả hai glycoprotein đều được dự đoán chứa vị trí N-glycosylation và bảo tồn cao giữa chủng Kết quả cho thấy oligosaccharide liên kết với N46 của protein GP5 cần cho sự sản xuất hạt virus và hoạt tính gây nhiễm Thiếu một hoặc cả hai oligosaccharide trên GP2a hay oligosaccharide gắn với N53 của GP5 không ảnh đáng kể đến hoạt tính gây nhiễm của virus

Nghiên cứu sự ảnh hưởng của N-Linked glycosylation trên GP5 của virus PRRS trên tính gây nhiễm, tính sinh kháng nguyên, và khả năng kích ứng tạo kháng thể trung hoà Ba vị trí N-linked glycosylation (N34, N44, và N51) nằm trên

ectodomain GP5 của những chủng dòng châu Mỹ Kết quả cho thấy N44 là aa thiết yếu nhất cho tính lây nhiễm Những virus mang đột biến tại N34, N51, và N34/N51 phát triển ở nồng độ thấp hơn so với chủng PRRSV không đột biến Trong phân tích trung hoà huyết thanh, virus đột biến nhạy với sự trung hoà bằng kháng thể đặc hiệu PRRSV hoang dại Việc mất những vị trí glycan này trên ectodomain của GP5 làm tăng độ nhạy của những virus này với sự trung hoà in vitro và tính sinh miễn dịch của vùng chức năng trung hoà gần đó (Israrul và ctv, 2006)

Nghiên cứu sự biến đổi về mặt phân tử trên protein vỏ capsid (ORF7) của virus PRRS cho thấy hai dòng virus PRRS, châu Âu và châu Mỹ khá giống nhau Các chủng thuộc dòng châu Âu bảo tồn cao giữa các chủng Phân tích sự thay thế aa và nt trên ORF7 của virus PRRS cho thấy có bốn vùng bảo tồn cao Không có đột biến cố định nào trên ORF7 được xác định (Gall và ctv, 1998)

Raymond và ctv (2003) phân tích trình tự aa N protein của các chủng dòng châu

Mỹ và xác định hai trình tự tín hiệu định vị nhân (nuclear localization signal (NLS) nằm trên vị trí aa 10-13 (NLS-1) và 41-72 (NLS-2) Đồng thời tiến hành thay thế vị trí

aa quan trọng lysine với aa không mang điện tích trong NLS-2 dẫn đến khoá sự định vị nhân và hạch nhân Trình tự bên trong NLS-2, KKNKK, hình thành vùng định vị lõi bên trong của NLS-2

2.4.2 Trong nước

Xác định tỷ lệ nhiễm virus PRRS tại một số cơ sở chăn nuôi heo miền Đông Nam Bộ Khảo sát tiến hành trên 1082 mẫu huyết thanh thu thập từ 21 trại chăn nuôi công nghiệp và hộ chăn nuôi của hai tỉnh/thành thuộc miền Đông Nam bộ trong các năm 2003 – 2005 Xác định tỷ lệ nhiễm và chủng PRRS dựa vào sự phát hiện kháng thể kháng vi rut PRRS bằng kỹ thuật ELISA (Trần Thị Dân và ctv, 2007)

Khảo sát bước đầu các biểu hiện lâm sàng và bệnh tích đại thể bệnh tai xanh ở lợn (PRRS) tại một số địa phương vùng đồng bằng Bắc bộ (Lê Văn Năm, 2007)

Nguyễn Ngọc Hải và ctv (2007 ) chẩn đoán virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (PRRS) bằng kỹ thuật RT – PCR, thực hiện với cặp mồi Rovira

1 và Rovira 2 (Rovira, 2000), và cặp mồi P1, P2 (Donadeau, 1999) nhằm phát hiện virut PRRS trong huyết thanh, tinh dịch, mô phổi, mô hạch

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm

Đề tài được thực hiện từ tháng 05/2009 đến tháng 08/2009 tại Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường Đại học Nông lâm Tp Hồ Chí Minh

3.2.3 Vật liệu và hóa chất

3.2.1 Vật liệu nghiên cứu

Mẫu huyết thanh từ những cá thể heo nghi ngờ bị nhiễm virus PRRS tại Tp.HCM Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu

Vaccine PRRSV BSL-PS 100 của hãng Besta, Singapor

3.2.2 Hóa chất

Hoá chất dùng trong ly trích RNA tổng số:

Bộ kit QIAamp Viral RNA Mini Kit gồm: Cột lọc RNA, ống thu nhận (2 ml), dung dịch đệm AVL, dung dịch đệm AW1, dung dịch đệm AW2, dung dịch đệm AVE, carrier RNA (poly A)

Hoá chất và dụng cụ trong điện di gel TBE:

Dung dịch đệm TBE 10X (Promega)

Agarose (Promega)

Dung dịch nạp mẫu (loading dye) 6X (Promega)

Dung dịch ethidium bromide (invitrogen)

Thang DNA chuẩn

Máy ly tâm (Mikro Z2K/ Sigma 3K30C)

Tủ -700C ( Sanyo Ultra Low)

Tủ mát 40C, tủ -20oC

Máy chụp gel (Biorad)

3.3.2 Ly trích RNA từ huyết thanh

Quy trình ly trích RNA theo bộ kit QIAamp Viral RNA Mini Kit

Ổn định mẫu ở điều kiện nhiệt độ phòng (15 – 250C)

Ổn định buffer ở nhiệt độ phòng

Kiểm tra buffer AW1 và AW2 đã pha và để ổn định ở nhiệt độ phòng

Hoà tan lại khối kết tủa Buffer AVL/Carrier RNA bằng nhiệt nếu cần thiết và giữ ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng

Tất cả các bước ly tâm đều thực hiện ở nhiệt độ phòng

Bước 1: Cho 560 µl Buffer AVL có chứa Carrier RNA vào một tube 1.5 ml

Bước 2: Cho 140 µl mẫu vào tube có chứa buffer ở trên Vortex nhẹ để trộn đều

trong 15 giây Nếu mẫu cần phải rã đông thì chỉ nên rã đông một lần

Bước 3: Ủ ở nhiệt độ phòng (15-250C) trong vòng 10 phút (thời gian hơi kéo dài hơn một chút)

Bước 7: Mở QIAamp spin column và lặp lại bước 6

Bước 8: Mở nắp QIAamp spin column một cách cẩn thận và thêm 500 µl Buffer AW1, đóng nắp lại và tiến hành ly tâm với tốc độ 6000 x g (8000 vòng) trong 1

phút Lấy QIAamp spin column và cho vào một tube 2 ml mới Bỏ tube có chứa dịch

đi

Bước 9: Mở nắp QIAamp spin column một cách cẩn thận, thêm 500 µl buffer AW2, đóng nắp lại và ly tâm với tốc độ 20000 x g (14000 vòng) trong 3 phút Có thể thực hiện ngay bước 10 hay thực hiện bước 9a

Bước 9a: Chuyển QIAamp spin column vào một tube 2 ml mới, loại bỏ tube cũ

có chứa dịch lọc Ly tâm với tốc độ 14000 vòng trong một phút

Bước 10: Chuyển QIAamp spin column vào một tube ly tâm 1,5 ml mới Loại

bỏ tube cũ có chứa dịch lọc Cẩn thận mở nắp QIAamp spin column và thêm 60 µl AVE Đóng nắp lại, giữ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút Sau đó ly tâm với tốc độ 6000

Mồi xuôi (F5): 5’-GGTGGGCAACKGTTTTAGCCTGTC-3’ nằm

ở vị trí 37bp bên ngoài của codon bắt đầu của ORF5

Mồi ngược (R5): 5’-GGTAATAGARAAYGCCAAAAGCACC-3’ nằm ở

vị trí 34bp bên ngoài của codon kết thúc của ORF5

Sản phẩm RT-PCR khuếch đại đoạn gen chừa toàn bộ ORF5 kích thước 723bp (Larochelle và Magar, 1997)

Cặp primer trong phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa ORF7

Mồi xuôi (F7): 5'-GTACATTCTGGCCCCTGCCC-3' (Suarez và ctv, (1996) nằm ở vị trí 14524 trên bộ gen của chủng VR2332

Mồi ngược (R7): 5’-TCGCCCTAATTGAATAGGTG-3’(Mardassi và ctv., 1994) nằm ở vị trí 15183 trên bộ gen của chủng VR2332

Trộn hỗn hợp hoá chất kỹ, phân bố lượng phù hợp vào các PCR tube

Thêm RNA khuôn: Tùy theo lượng RNA tổng số thu nhận được mà thể tích

RNA cho vào phản ứng là khác nhau, thông thường 5 µl (khoảng 1 pg đến 1

µg RNA)

Bảng 3.1 Thành phần và nộng độ hóa chất phản ứng RT-PCR

Thành phần Liều lượng phản ứng (l) Nồng độ đầu Nồng độ cuối

Qui trình nhiệt của phản ứng RT-PCR đoạn ORF5

Bước 1: 50 C - 30 phút, 1 chu kỳ; bước 2: 94 C – 15 phút, 1 chu kỳ; bước 3: 94oC - 1 phút, 53 C – 30 giây, 72 C - 1 phút, 35 chu kỳ; bước 3: 72 C - 7 phút, 1 chu kỳ

Qui trình nhiệt của phản ứng RT-PCR đoạn ORF7

Bước 1: 50 C - 30 phút, 1 chu kỳ; bước 2: 94 C – 15 phút, 1 chu kỳ; bước 3: 94oC - 1 phút, 55 C - 1 phút, 72 C - 1 phút, 35 chu kỳ; bước 3: 72 C - 7 phút, 1 chu kỳ

3.3.4 Điện di sản phẩm PCR

Cách tiến hành:

 Pha dung dịch TBE 0,5X

 Pha gel agarose với nồng độ 1% : cân 0,15 g agarose cho vào 15 ml dung dịch TBE 0,5X Đun sôi bằng lò vi ba ở 550W trong 3 phút để agarose tan đều

 Để nguội đến 50-550C Chuẩn bị khuôn Đổ agarose vào khuôn Chờ 30 phút để agarose đông

 Gỡ lược ra, để miếng gel vào bồn điện di Cho TBE 0,5X ngập miếng gel

 Đặt mẫu vào các giếng với tỉ lệ 1,5 µl loading dye và 4 µl sản phẩm PCR

 Điện di 75 V, 30 phút

 Nhuộm ethidium bromide trong 15 phút Sau đó rửa gel nhiều lần bằng nước

để loại bỏ bớt ethidium bromide dính bên ngoài miếng gel Chụp gel bằng tia UV

 Đọc kết quả điện di: kích thước vùng gene ORF5 723bp; ORF7 670 bp

Hình 3.1 Sản phẩm sau điện di của phản ứng RT-PCR (A) Sản phẩm sau điện di

của phản ứng RT-PCR đoạn ORF5 (723 nt); (B) Sản phẩm sau điện di của phản ứng

RT-PCR đoạn ORF5 (660 nt)

3.3.5 Giải và phân tích trình tự

Sản phẩm RT-PCR được giải trình tự trên ở công ty Nam Khoa, Tp.HCM để có trình tự khung đọc mở ORF5 và ORF7

Cơ sở dữ liệu và phần mềm được sử dụng để phân tích trình tự:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov

 BioEdit - dùng để đọc trình tự dưới dạng cột sang dạng chữ

 Clustal W – dùng để sắp gióng cột các mẫu nghiên cứu, và trình tự tham khảo trên thế giới được lấy từ ngân hàng gen NCBI

 DNAstar và MEGA 4.1 – tính độ tương đồng, khoảng cách di truyền và vẽ cây di truyền

 Treepuzzle 5.0 – dùng để tính tỷ lệ Ts/Tv Tỷ lệ này biểu diễn sự biến đổi qua lại giữa các nucleotide trong trình tự

 Bioedit:

- Sử dụng các ứng dụng mã hóa từ chuỗi trình tự nt sang chuỗi trình tự aa

- Tính tóan hệ số entropy Hệ số biểu hiện sự biến động của aa trong chuỗi trình tự, vị trí aa nào có hệ số entropy cao thì sự biến động aa chỗ đó cao

- Hydrophobicity (phương pháp Kyte và Doolittle): dự báo các vị trí kỵ nước

và ưa nước trên chuỗi aa

 Trang web http://hiv.lanl.gov/content/hiv-db/GLYCOSITE/glycosite.html giúp dự đóan các vị trí N-glycosite hóa Các vị trí này có ảnh hưởng đến

cấu trúc của protein bằng cách gắn kết với các loại đường

Bảng 3.2 Các chủng virus trong bệnh phẩm được giải trình tự

Trình tự STT Kí hiệu mẫu thu thập Nơi lấy mẫu phân Năm

Bảng 3.3 Chủng virus tham chiếu từ Việt Nam

Trình tự Chủng virus Vùng phân lập Năm phân lập

ORF5 ORF7

Mã số trong Genebank 07QN/VN Quảng Nam 2007 X X FJ394029.1

Bảng 3.4 Các chủng virus tham khảo trên thế giới (từ ngân hàng gene NCBI)

Mã số trong Genbank Chủng virus Nơi phân lập Năm phân

Bảng 3.5 Các chủng virus tham khảo trên thế giới (tt) (từ ngân hàng gene NCBI)

Mã số trong Genbank Chủng virus Nơi phân lập Năm

phân lập

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Ly trích RNA và RT-PCR từ vaccine BSL-PS100 của Besta

Việc ly trích và tiến hành phản ứng RT-PCR khuếch đại 2 đoạn gene chứa ORF5 và ORF7 từ vaccine BSL-PS100 của Besta-Singapor (vaccine đang được khuyến cáo sử dụng tại Việt Nam và chưa được công bố trình tự cũng như dòng virus dùng sản xuất vaccine) không gặp nhiều khó khăn (hình 4.1)

723bp

660 bp

Hình 4.1 Kết quả RT-PCR 2 đoạn gen ORF5 và ORF7

(A) Kết quả PCR đoạn gen ORF5; (B) Kết quả PCR đoạn gen ORF7; (-) mẫu đối chứng âm; T2 (+) mẫu đối chứng dương; BSLPS100: vaccine BSL-PS100.

RT-Ở hình 4.1A, có sản phẩm RT-PCR trên vùng gen ORF5 của virus vaccine BSL-PS100 xuất hiện ngang hàng với đối chứng dương của virus thực địa (T2/HCM/VN) mà chúng tôi lấy mẫu Điều này chứng tỏ virus vaccine BSL-PS100 có vùng gen ORF5 trên bộ gen Sau khi giải trình tự vùng gen này, chúng tôi nhận thấy virus của vaccine này nằm trong nhóm châu Mỹ, phân nhóm 2.1 Các loại vaccine dòng châu Mỹ chủ yếu có nguồn gốc từ nhóm này, và có mối quan hệ gần với chủng gốc châu Mỹ, VR2332 (99.3%) (phụ lục 1)

Ở hình 4.1B, có sản phẩm RT-PCR trên vùng gen ORF7 của virus vaccine BSL-PS100 xuất hiện ngang hàng với đối chứng dương của virus thực địa mà chúng tôi lấy mẫu (T2/HCM/VN) Điều này chứng tỏ virus vaccine BSL-PS100 có vùng gen ORF7 trên bộ gen Sau khi giải trình tự vùng gen này, chúng tôi nhận thấy virus của

vaccine này nằm trong nhóm châu Mỹ, phân nhóm 2.1, gần với chủng gốc châu Mỹ (99.7%) (phụ lục 2)

4.2 Thiết lập cây di truyền của virus PRRS dựa trên khung đọc mở ORF5

Cây di truyền virus PRRS dựa trên khung đọc mở ORF5 600 nt được xây dựng sau khi ứng dụng chương trình sinh tin học MEGA 4.1 (Hình 4.2 và Hình 4.3)

Cây di truyền trên được thiết lập từ 6 chủng virus PRRS thực địa lấy từ các trang trại khác nhau, trong đó: 4 chủng virus PRRS ở Tp.HCM và 2 chủng ở Đồng Nai (các chủng có ký hiệu cuối là HCM/VN và DN/VN), 1 chủng virus PRRS tham khảo

từ Quảng Nam, Việt Nam năm 2007, 07QN/VN (chủng có ký hiệu cuối là QN/VN) và

6 chủng virus của vaccine, trong đó, 2 chủng vaccine dòng Châu Âu Porcilis PRRS của Intervet-Hà Lan (Porcilis PRRS), Amervac PRRS của Hipra-Tây Ban Nha (Amervac-PRRS), 4 chủng vaccine dòng Châu Mỹ, PrimePac (Schering-Plough Animal Health), RespPRRS MLV, Ingelvac PRRSV MLV (Ingelvac PRRS), BSL-PS

100 của Besta-Singapore (BSL-PS100), và 25 chủng virus PRRS từ ngân hàng gen (Bảng 3.5) Cây di truyền đựơc xây dựng trên phần mềm phân tích trình tự MEGA4.1, phương pháp neighbor-joining, tỷ số Ts/Tv 2.236, giá trị boottrap lập lại 1000 lần

PRRSV gồm 2 dòng, dòng Châu Âu và dòng châu Mỹ (Nelsen và ctv, 1999) GP5 (do ORF5 qui định) là kháng nguyên trung hoà quan trọng nhất của virus PRRS

và có sự đa dạng di truyền cao nhất giữa các chủng Vài nghiên cứu về sự đa dạng di truyền trên ORF5 từ những nước và vùng khác nhau (Cha và ctv, 2006; Stadejek và ctv, 2006; Mateu và ctv, 2006; Forsberg và ctv, 2002) cho thấy rằng sự phân bố theo địa lý có thể ảnh hưởng đến sự tiến hoá phân tử của PRRSV

0 N 1 2

S

P 1 9

In g lv a P R S

JA 1 2

C -1a H

-2

G1

-1 h)

90/H

CM/VN

91/H

CM/VN

0 H N

0 B

0 H B T

Eu ro PR R

A m er

c P R S P o rc ili s

Nhóm

01NP1.2 BJ-4 S1 RespPRRS MLV BSL-100 VR2385 PA8 PL97-1 HN1 VR-2332 F1 Kitasato 93-1 PrimePac SP P129

Ingelvac PRRS JA142

CH-1a

HB-2 GD-1 HB-1(sh) 90/HCM/VN 91/HCM/VN T2/HCM/VN T5HCMVN 3428/DN/VN 82/DN/VN 07QN SY0608 07HEN 07BJ 07HEBTJ EuroPRRSV Amervac PRRSV Porcilis

LV B13 Lelystad 60

80 86 76 99

99

99

96 88 71

31

60 20 30

32 93

62 97

26

35 51

27

33

44 99

Hình 4.3 Cây di truyền virus PRRS dựa trên ORF5 dạng cây (phylogram)

Hình 4.2 và 4.3 là cây di truyền xây dựng dựa trên vùng khung đọc mở ORF5 của virus PRRS bằng phần mềm phân tích trình tự MEGA4.1 Qua cây di truyền trên

ta có thể chia các chủng PRRSV làm 2 nhóm chính: nhóm 1 (dòng Châu Âu) với sự