QUY TRÌNH sản XUẤT VITAMIN b12 BẰNG PHƯƠNG PHÁP lên MEN propionibacterium shermanii

1.2 Đặc điểm của Vitamin B12: - Vitamin B 12 còn gọi là cobalamin , là một vitamin tan trong nước có vai trò chính trong hoạt động bình thường của hệ thống thần kinh thông qua sự tổng hợ

QUY TRÌNH SẢN XUẤT VITAMIN B12 BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN Propionibacterium shermanii

I. GIỚI THIỆU CHUNG

1.1 Lịch sử phát hiện

- Năm 1924, Murphy rút máu ở các con chó ra làm cho chúng bị bệnh thiếu máu, sau đó ông nuôi chúng bằng nhiều chất khác nhau, và đo sự cải thiện bệnh thiếu máu của chúng Ông phát hiện ra là việc ăn một lượng lớn gan dường như đã chữa lành bệnh này

- Năm 1926, Murphy và Minot đã chữa lành cho những bệnh nhân bị chứng thiếu máu trầm trọng bằng cách tiêm một chất chiết xuất từ gan động vật Sau đó Minot

và Whipple bắt đầu tách chất chữa lành bệnh ra về mặt hóa học và cuối cùng đã

có thể tách vitamin B12 ra từ gan.

- Năm 1948, Rickes đã phân lập từ gan lợn ra một chất kết tinh có màu đỏ và đạt tên cho chất đó là vitamin B12, sau đó đã có tới giải Nobel đã được trao tặng cho các công trình nghiên cứu có liên quan tới vitamin B12 Có thể nói vitamin B12 được tìm ra từ rất sớm và được nhiều người quan tâm

- Vitamin B12 chỉ có nhiều trong các thực phẩm đi từ nguyên liệu động vật, thực vật chứa rất ít vitamin B12 Vì thế nhu cầu tổng hợp viatmin B12 trên quy mô công nghiệp là thiết yếu, để bổ sung vitamin B12 cho những người ăn chay trường và chữa các loại bệnh do thiếu vitamin B12.

1.2 Đặc điểm của Vitamin B12:

- Vitamin B 12 còn gọi là cobalamin , là một vitamin tan trong nước có vai trò chính trong hoạt động bình thường của hệ thống thần kinh thông qua sự tổng hợp myelin ( myelinogenesis ) và trong sự phát triển của máu đỏ tế bào trong tủy xương

- Vitamin B12 liên quan đến sự trao đổi chất của mọi tế bào trong cơ thể con người:

- Là một đồng kết hợp trong quá trình tổng hợp ADN , chuyển hóa axit béo ,

và sự chuyển hóa axit amin

1.3 Cấu tạo của vitamin B12

- Tên quốc tế: cyanocobalamin và hydroxo-cobanamin

- Công thức hóa học: C63H90N14O14PCo

- Phân tử vitamin B12 (Vitamin B12 chứa cobalt và vì vậy được gọi là cobalamin),có dạng coenzym liên kết với amino acid, bao gồm hai phần chính: phần Corin (còn gọi là nhân tố B) và phần nucleotid chứa nito là 5,6 dimethylbenzimidazol, đường ribose và phân tử H3PO4 Nhân Corin phức hợp với phân tử cobalt, cobalt gắn với một gốc R gọi chung là cobalamin Tùy theo gốc R mà ta có các vitamin B12 và có các tác dụng sinh học

- Các dạng tổng hợp của vitamin B12 là hydroxycobalamin và cyanocobalamin 2 dạng coenzym của vitamin B12 là methylcobalamin và 5-deoxyadenosylcobalamin

Vitamin B12 là những hợp chất hữu cơ có nguyên tử cobalt ở trung tâm, với tên gọi là những cobalamin và có hoạt tính sinh học trên cơ thể người

1.5 1.4.1 Tính chất vật lý:

Thường ở dạng kết tinh, có kích thước rất nhỏ, màu sẫm đỏ, không có mùi và vị

Phân tử lượng khoảng 1490 ±150 dalton

1.4.2 Tính chất hóa học:

- Tan tốt trong nước, trong các dung dịch trung tính và trong cồn

- Không hoà tan trong este, aceton, benzen, clorofoc

- Bền ở nhiệt độ cao ở dạng cyamit Bền trong bóng tối và ở nhiệt độ thường

- Dễ bị phân huỷ bởi ánh sáng.Khi tiếp xúc với kim loại năng rất dễ mất hoạt tính Chúng không bền trong môi trường ph kiềm

- Vitamin B12 trong thức ăn đều ở dạng phức hợp với protein Trong chế biến, vitamin B12 khá bền vững với nhiệt độ, trừ khi trong môi trường kiềm và nhiệt độ quá 100oC Thịt luộc ở 170oC trong 45 phút mất 30% B12 Sữa nấu sôi 2-5 phút mất 30% B12

- Khi có sự hiện diện của vitamin C, B12 trở nên ít bền vững với nhiệt độ hơn

và có thể bị phá hủy những lượng đáng kể vv́ới 0,5g vitamin C

- Vitamin B12 chuyển vào cơ thể với một chất glucoprotid của dạ dày để tạo nên một phức hợp dễ hấp thụ cho cơ thể

- Sự hấp thu vitamin B12 cần có yếu tố nội tại (một protein do tế bào thành của niêm mạc dạ dày tiết ra) và enzyme phân hủy protein của tụy

- Vitamin B12 được hấp thu bởi đoạn cuối ruột non

II. VAI TRÒ CỦA VITAMIN B12 ĐỐI VỚI CƠ THỂ

2.1 Vai trò

1. Bảo đảm hình dạng DNA:

- Trong quá trình phân bào, vitamin B12 cũng đóng một vai trò rất quan trọng, giúp đảm bảo hình dạng của DNA

Sự thiếu hụt vitamin này có thể dẫn tới các tế bào bất thường (megaloblasts)

và có thể gây triệu chứng thiếu máu nếu không được phát hiện kịp thời

- Hoạt động của của Vitamin B12 luôn gắn kết chặt chẽ với hoạt động của Vitamin B9 trong quá trình tổng hợp amino acid methionin, tổng hợp nucleic acid (DNA, RNA), giúp chuyển hóa acid béo và amino acid Bảo vệ

và giúp cho sự tăng trưởng của tế bào thần kinh, hỗ trợ hoạt động tạo xương

2. Duy trì sự phát triển của các tế bào:

- Vitamin B12 cần thiết cho tất cả các mô có tốc độ sinh trưởng tế bào mạnh (mô tạo máu, ruột non, tử cung )

- Vitamin này hỗ trợ chức năng của các tế bào thần kinh, giúp sản xuất myelin tăng cường hoạt động của tế bào thần kinh

- Vittamin B12 tham gia phản ứng tổng hợp thymiddylate, một thành phần trong phân tử DNA, góp phần phân chia tế bào và trưởng thành tế bào trong

cơ thể

3. Giảm mệt mỏi:

- Vitamin B12 tạo ra DNA vật liệu di truyền trong tế bào, giúp duy trì tình trạng khỏe mạnh của tế bào thần kinh và hồng cầu, giữ vai trò then chốt trong sự phát triển hồng cầu

- Vitamin B12 phối hợp với vitamin B1, B6 dùng điều trị viêm dây thần kinh gây đau khớp, liệt chân, tay rất hiệu quả

Nồng độ cholesterol có ảnh hướng rất lớn tới sức khoẻ của mỗi chúng ta Một chế độ ăn giàu vitamin B12 sẽ giúp kiểm soát cholesterol ở mức cân bằng, đồng thời cũng giúp duy trì nồng độ triglycerides, nhờ đó bảo vệ sức khoẻ tim mạch

- Vitamin B12 tạo DNA vật liệu di truyền trong tế bào, duy trì tình trạng khỏe mạnh của tế bào thần kinh và hồng cầu, giữ vai trò then chốt trong phát triển hồng cầu.

- Vitamin B12 là thành phần đóng quan trò quan trọng trong điều trị các vấn

đề nghiêm trọng liên quan tới bệnh thiếu máu hồng cầu hình lưỡi liềm, giúp hạn chế các tổn thương nội mô ở bệnh nhân

6 Giảm nguy cơ mắc bệnh Alzheimer:

- Vitamin này hỗ trợ chức năng của các tế bào thần kinh, giúp sản xuất myelin tăng cường hoạt động của tế bào thần kinh

- Alzheimer là bệnh phổ biến ở người cao tuổi và những năm gần đây, bệnh đang có xu hướng trẻ hoá Theo các chuyên gia y tế thì xét nghiệm cho thấy bệnh nhân Alzheimer bị thiếu vitamin B12 trầm trọng

7 Phòng ngừa thiếu máu:

- Vitamin B12 là một trong những vitamin thiết yếu cho việc sản xuất hồng cầu cho cơ thể

- Vitamin B12 có tác dụng giúp duy trì lượng máu bình thường trong cơ thể, đồng thời hỗ trợ điều trị các vấn đề liên quan tới bệnh thiếu máu

- Vitamin B12 là một vitamin quan trọng để chữa bệnh thiếu máu nguy hiểm và bệnh viêm dây thần kinh ngoại biên, đồng thời nó cũng là một vitamin quan trọng cần bổ sung trong khẩu phần ăn động vật và cả con người

2.2 Triệu chứng và bệnh lý của cơ thể thiếu hoặc thừa vitamin B12

a Thiếu Vitamin B12:

• Thiếu máu do thiếu vitamin B12 là thiếu máu nguyên bào khổng lồ Người bệnh xanh xao, yếu, dễ mệt, ăn mất ngon, hồi hộp đánh trống ngực, đau đầu, khó thở, ngất xỉu

• Thiếu vitamin B12 gây suy thoái chất myelin, một chất béo và là thành phần quan trọng của tế bào thần kinh, gây ra những triệu chứng thần kinh

- Người cao tuổi khi thiếu vitamin B12 dễ bị teo não và suy giảm trí nhớ và trầm cảm

- Thiếu vitamin B12 cũng là một trong số những nguyên nhân dẫn đến chậm phát triển khả năng ngôn ngữ, rối loạn ngôn ngữ, tự kỷ, bại não và các vấn

đề về thần kinh

- Các biểu hiện: cảm giác rung, tê rần, nhột nhạt như kiến bò,đi đứng xiêu vẹo,hoang tưởng, trí óc giảm sút

• Quá trình sao chép tế bào bị suy yếu dẫn đến teo và viêm niêm mạc trong miệng và toàn bộ đường tiêu hóa; đau lưỡi, giảm hấp thu chất dinh dưỡng, táo bón, chán ăn và sụt cân

b. Thừa vitamin B12:

- Có thể gây tăng sản tuyến giáp

- Làm tăng hồng cầu quá mức, bệnh cơ tim

- Có khi xảy ra tác dụng thứ phát gây nôn nao, choáng váng, nổi mày đay

2.3 Nguồn cung cấp Vitamin B12

+ Cơ thể chỉ chứa lượng vitamin B12 rất nhỏ (khoảng 2-5mg), 50-90% trong số đó dự trữ tại gan

+ Vitamin B12 có trong sữa và cá:

Hai loại thức ăn chứa nhiều vitamin B12 này rất tốt cho cơ thể, đặc biệt đối với phụ

nữ sau khi sinh

Sau sinh phụ nữa cần bổ sung một lượng máu đã mất đi nên có thể bổ sung vitamin B12 thông qua cá và sữa

+ Hệ vi khuẩn ruột người khỏe mạnh cũng sản sinh ra một lượng nhỏ vitamin B12 đủ dùng cho cơ thể Nhu cầu vitamin B12 của người trưởng thành bình thường là 2mcg/ngày

+ Vitamin B12 có trong nội tạng động vật

Vitamin B12 có nhiều trong nội tạng động vật như gan, thạn, tim, cật, sò ốc…

+ Các thực phẩm từ thực vật không chứa vitamin B12

2.4 Ứng dụng

•Trong y tế: dùng làm thuốc

•Trong chăn nuôi:bổ xung vào thành phần thúc ăn chăn nuôi làm tăng khả năng tiêu hoá thức ăn, tăng trong nhanh ví dụ cứ 1kg vitamin B12 bổ xung vào thức ăn cho lợn thì thu thêm được 860 kg thịt

•Trong công nghệ nuôi cấy mô và tế bào: dùng làm thành phần môi trường nuôi cấy

III. QUY TRÌNH SẢN XUẤT VITAMIN B12 BẰNG PHƯƠNG PHÁP

LÊN MEN SINH TỔNG HỢP VI KHUẨN Propionibacterium

shermanii

3.1 Vi sinh vật tham gia tổng hợp vitamin B12

3.1.1 Vi khuẩn Propionibacterium

- Giống Propionibacterium sermanii là giống có nhiều ưu điểm nhất và có thể đưa vào sản xuất vitamin B12 theo quy mô công nghiệp

- Một số đặc điểm của Propionibacterium sermanii

+ Là trực khuẩn có kích thước nhỏ, trong thiên nhiên chúng thường xếp thành từng đôi hoặc từng chuỗi ngắn

+ Chúng thuộc loại hiếu khí tuỳ tiện

+ Có khả năng lên men acid lactic, glycerol, glucose, fructose, lactose

+ Khoảng pH hoạt động là 4,5-7,5, pH tối ưu cho việc tổng hợp B12 là 5,8-7,5

+ Nhiệt độ thích hợp cho sinh tổng hợp vitamin B12 là 28- 30oC

+ Các chất dinh dưỡng cho sự phát triển:

muối amon, nước amoniac, CoCl2 hoặc Co(NO3)2, Các kim loại thường làm giảm khả năng sinh tổng hơp B12 (Fe, Cu, Zn, Mn )

3.1.2 Xạ khuẩn actinomyces

- Trong các giống thuộc actinomyces có giống actinomyces olimacens có khả năng tổng hợp vitamin B12 cao hơn cả và được sử dụng để sản xuất vitamin B12 theo quy mô công nghiệp

- Một số đặc điểm của actinomyces olimacens:

+ Xạ khuẩn actinomyces olimacens thuộc lại hiếu khí

+ Chúng phát triển mạnh và sinh nhiều vitamin B12 trong môi trường chứa glucose, tinh bột, mật rỉ, bã rượu Trong thành phần môi trường này cần cho các muối amon, coban và CaCO3

+ Sinh tổng hợp vitamin B12 chỉ xảy ra mạnh sau 24h nuôi cấy

+ pH ban đầu của môi trường nên điều chỉnh khoảng 7 ở pha thứ nhất pH giảm xuống khoảng 6,5 và pha thứ 2 pH sẽ tăng lên 8,2-8,7

+ Trong quá trình lên men phải thông khí

+ Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển và sinh tổng hợp vitamin B12 là

12-30 oC.

+ Thời gian lên men là 60-120 giờ

3.1.3 Vi khuẩn sinh metan

- Trong thiên nhiên có rất nhiều loại vi sinh vật tham gia lần lược nhiều phản ứng sinh metan Cùng với sự tạo thành khí metan vi sinh vật còn tổng hợp được số lượng vitamin B12 lớn

- Đặc điểm chung của vi khuẩn sinh metan:

+ Chúng thuộc vi khuẩn gram âm

+ Chúng không chuyển động

+ Không tạo bào tử

3.2 Quy trình sản xuất Vitamin B12 bằng phương pháp lên men snh tổng hợp

vi khuẩn

3.2.1 Quá trình nhân giống

- Mục đích: Quá trình nhân giống giúp gia tăng số lượng tế bào vi sinh vật, tích lũy đủ số lượng tế bào cần thiết để cấy giống vào môi trường lên men

- Cách thực hiện:

+ Giống Propionibacterium shermanii được cấy trong môi trường thạch nghiêng với glucose, KH2PO4, (NH4)2PO4, cao ngô hoặc nước chiết trái cây

+ Nuôi vi khuẩn ở nhiệt độ t0 = 28 – 32 0C trong 7 – 8 ngày

+ Sau đó bảo quản lạnh, cấy truyền mỗi tháng 1 lần

+ Nhân giống cho sản xuất thường được thực hiện trong điều kiện kị khí

- Chuẩn bị môi trường:

Trong môi trường,người ta còn cho thêm muối amon, nước amoniac, CoCl2 hoặc Co(NO3)2

Vi khuẩn Propionibacterium shermanii sử dụng cơ chất trong môi trường để tăng sinh khối Hàm lượng cơ chất trong môi trường giảm theo thời gian, sinh khối tăng dần

• Môi trường nhân giống gồm:

Glucose : 0,5 – 1 %

Cao ngô : 1–2%

Clorua coban : 1,5 – 2 ppm

Pepton: 0,1 – 2 %

Dầu đậu nành : 0,1 – 2 %

 pH : 6,9 - 7

3.2.2 Lên men

- Mục đích: Làm tăng hàm lượng vitamin trong tế bào vi sinh vật

- Thành phần môi trường lên men bao gồm: Nguồn carbon, nguồn nitơ, yếu tố tăng trưởng, muối dinh dưỡng, coban, glycine và sodium cyanide + Nguồn carbon là carbohydrate (dextrose, maltosse, xylose, syrup

bắp, sucrose, mật rỉ), acid hữu cơ là acid lactic Chiếm 0.5 – 10% khối lượng môi trường nuôi cấy

+ Nguồn Nitơ là các protein trong đậu nành, yến mạch, bắp, bột mì,

dịch chiết nấm men, nước Whey … Khối lượng chiếm 1 – 5% khối lượng môi trường nuôi cấy

+ Yếu tố tăng trưởng cho vi sinh vật là dịch chiết nấm men, dịch khoai tây, bắp

+ Muối: ammonium sulfat, magnesium sulfat, potasseum photphate

dibasic, potassium photphate monbasic Hợp chất coban: cobalt

chloride, sulfate, nitrate

* Thành phần môi trường lên men

Mật rỉ : 4%

Glucose : 0.5 - 1%

CaCO3 : 0.1%

Clorua coban : 1.5 - 10 ppm

 Thêm glycine vào môi trường lên men giúp hàm lượng vitamin B12 sẽ

 Trong sản xuất người ta bổ sung thêm 5,6 – dimetylbenzinaldazol làm tăng sự tổng hợp vitamin B12

 Ngoài ra, muối coban thêm vào với nồng độ 3 -5 µg/lít

- Điều kiện của quá trình lên men:

 Nhiệt độ: 121 C

 Thời gian tiệt trùng: 30 phút

pH = 6.5 – 7

 Các giai đoạn của quá trình lên men:

+ Giai đoạn đầu kị khí

+ Giai đoạn sau hiếu khí

 Thời gian cho mỗi giai đoạn là 72 – 88 giờ

 Nồng độ vitamin B12 sẽ làm tăng nhanh trong giai đoạn hiếu khí, khoảng 35 – 40

mg vitamin B12 /lít

 pH tối ưu = 7 - 7.5

3.2.3 Quy trình thu nhận và tinh chế vitamn B12:

- Sau khi kết thúc lên men, dịch lên men được đem lọc hoặc ly tâm thu lấy sinh khối, loại dịch trong Tiến hành chiết xuất bằng dung môi hữu cơ.

- Hòa sinh khối vào nước tạo hỗn dịch và chỉnh pH về 4,5 bằng HCl 10% và thêm chất ổn định

- Đun nóng hỗn hợp trong 80 0 C trong 30 phút để giải phóng vitamin B 12 vào dịch lọc Lọc lấy dịch lọc, bỏ bã hoặc tận thu làm thức ăn chăn nuôi

- Vitamin B 12 từ dung dịch nước sang pha hữu cơ bằng hỗn hợp dung môi phenol: n-butanol (1:1) với tỉ lệ V pha hữu cơ: V pha nước là 1:10

- Dịch chiết hữu cơ này được pha loãng băng tricrezol và carbon tetraclorid (CCl 4 ) –sau đó chiết vitamin B 12 trở lại pha nước nhiều lần bằng nước.

- Chỉnh pH pha dung dịch nước về 8,0-8,5 và tiến hành cyanid hóa Sử dụng KCN để chuyển dạng vitamin B 12 coenzym thành Cyanocobalamin trong 3 giờ Chỉnh pH về trung tính, cô chân không ở =< 60 0 C đến nồng độ vitamin

B 12 đạt khoảng 10.000 mcg/ml.

- Quá trình tinh chế được tiến hành trên cột oxyd nhôm

+ Hấp phụ dung dịch vitamin B 12 lên cột trong dung dịch aceton-nước 75%.sau đó phản hấp thụ thu lấy phân đoạn đậm đặc nhất.pha loãng dịch đậm đặc bằng aceton, khuấy nhẹ và để kết tinh 12 giờ ở 4 0 C.

+ Lọc thu tinh thể hình kim màu đỏ đậm, rửa bằng aceton nguyên chất

và sấy khô ở nhiệt độ 50 o C.

 Vitamin B12 tinh chế phải có hàm lượng >_ 95%

 Định lượng Vitamin B12 bằng quang phổ tử ngoại ở bước sóng 3611nm,

IV TÀI LIỆU THAM KHẢO

1.Từ Minh Koóng, Kỹ thuật sản xuất dược phẩm, Tập II – Kỹ thuật sản xuất thuốc bằng phương pháp sinh tổng hợp

2 http://bsdao.blogspot.com/2007/11/vitamin-b12-hay-cobalamin.html

3 https://text.123doc.org/document/1477647-vitamin-b12-va-vai-tro.htm

4 http://naturalshop.com.vn

5 https://www.bachhoaxanh.com/kinh-nghiem-hay/vitamin-b12-hay-cobalamin-la-gi-995834