QUY TRÌNH sản XUẤT VITAMIN b12 BẰNG PHƯƠNG PHÁP lên MEN propionibacterium shermanii

QUY TRÌNH SẢN XUẤT VITAMIN B12 BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN Propionibacterium shermanii I GIỚI THIỆU CHUNG 1.1 Lịch sử phát - - - - Năm 1924, Murphy rút máu chó làm cho chúng bị bệnh thiếu máu, sau ơng ni chúng nhiều chất khác nhau, đo cải thiện bệnh thiếu máu chúng Ông phát việc ăn lượng lớn gan dường chữa lành bệnh Năm 1926, Murphy Minot chữa lành cho bệnh nhân bị chứng thiếu máu trầm trọng cách tiêm chất chiết xuất từ gan động vật Sau Minot Whipple bắt đầu tách chất chữa lành bệnh mặt hóa học cuối tách vitamin B12 từ gan Năm 1948, Rickes phân lập từ gan lợn chất kết tinh có màu đỏ đạt tên cho chất vitamin B12, sau có tới giải Nobel trao tặng cho công trình nghiên cứu có liên quan tới vitamin B12 Có thể nói vitamin B12 tìm từ sớm nhiều người quan tâm Vitamin B12 có nhiều thực phẩm từ nguyên liệu động vật, thực vật chứa vitamin B12 Vì nhu cầu tổng hợp viatmin B12 quy mô công nghiệp thiết yếu, để bổ sung vitamin B12 cho người ăn chay trường chữa loại bệnh thiếu vitamin B12 1.2 - Đặc điểm Vitamin B12: Vitamin B 12 gọi cobalamin , vitamin tan nước có vai trò hoạt động bình thường hệ thống thần kinh thơng qua tổng hợp myelin ( myelinogenesis ) phát triển máu đỏ tế bào - tủy xương Vitamin B12 liên quan đến trao đổi chất tế bào thể - người: Là đồng kết hợp trình tổng hợp ADN , chuyển hóa axit béo , chuyển hóa axit amin 1.3 Cấu tạo vitamin B12 - Tên quốc tế: cyanocobalamin hydroxo-cobanamin - Cơng thức hóa học: C63H90N14O14PCo - Phân tử vitamin B12 (Vitamin B12 chứa cobalt gọi cobalamin),có dạng coenzym liên kết với amino acid, bao gồm hai phần chính: phần Corin (còn gọi nhân tố B) phần nucleotid chứa nito 5,6 dimethylbenzimidazol, đường ribose phân tử H 3PO4 Nhân Corin phức hợp với phân tử cobalt, cobalt gắn với gốc R gọi chung cobalamin - Tùy theo gốc R mà ta có vitamin B12 có tác dụng sinh học Các dạng tổng hợp vitamin B12 hydroxycobalamin cyanocobalamin dạng coenzym vitamin B12 methylcobalamin 5deoxyadenosylcobalamin 1.4 Tính chất vitamin B12 Vitamin B12 hợp chất hữu có nguyên tử cobalt trung tâm, với tên gọi cobalamin có hoạt tính sinh học thể người 1.4.1 Tính chất vật lý: 1.5 - Thường dạng kết tinh, có kích thước nhỏ, màu sẫm đỏ, khơng có mùi vị - - Phân tử lượng khoảng 1490 ±150 dalton - Tính chất hóa học: Tan tốt nước, dung dịch trung tính cồn Khơng hồ tan este, aceton, benzen, clorofoc Bền nhiệt độ cao dạng cyamit Bền bóng tối nhiệt độ thường Dễ bị phân huỷ ánh sáng.Khi tiếp xúc với kim loại dễ hoạt - tính Chúng khơng bền môi trường ph kiềm Vitamin B12 thức ăn dạng phức hợp với protein Trong chế biến, 1.4.2 vitamin B12 bền vững với nhiệt độ, trừ môi trường kiềm nhiệt độ 100oC Thịt luộc 170oC 45 phút 30% B12 Sữa nấu - sôi 2-5 phút 30% B12 Khi có diện vitamin C, B12 trở nên bền vững với nhiệt độ - bị phá hủy lượng đáng kể vv́ới 0,5g vitamin C Vitamin B12 chuyển vào thể với chất glucoprotid dày để tạo - nên phức hợp dễ hấp thụ cho thể Sự hấp thu vitamin B12 cần có yếu tố nội (một protein tế bào thành - niêm mạc dày tiết ra) enzyme phân hủy protein tụy Vitamin B12 hấp thu đoạn cuối ruột non VAI TRÒ CỦA VITAMIN B12 ĐỐI VỚI CƠ THỂ II 2.1 Vai trò Bảo đảm hình dạng DNA: Trong q trình phân bào, vitamin B12 đóng vai trò quan - trọng, giúp đảm bảo hình dạng DNA Sự thiếu hụt vitamin dẫn tới tế bào bất thường (megaloblasts) - gây triệu chứng thiếu máu không phát kịp thời Hoạt động của Vitamin B12 gắn kết chặt chẽ với hoạt động Vitamin B9 trình tổng hợp amino acid methionin, tổng hợp nucleic acid (DNA, RNA), giúp chuyển hóa acid béo amino acid Bảo vệ giúp cho tăng trưởng tế bào thần kinh, hỗ trợ hoạt động tạo xương Duy trì phát triển tế bào: - Vitamin B12 cần thiết cho tất mơ có tốc độ sinh trưởng tế bào mạnh (mô tạo máu, ruột non, tử cung ) - Vitamin hỗ trợ chức tế bào thần kinh, giúp sản xuất - myelin tăng cường hoạt động tế bào thần kinh Vittamin B12 tham gia phản ứng tổng hợp thymiddylate, thành phần phân tử DNA, góp phần phân chia tế bào trưởng thành tế bào thể - Giảm mệt mỏi: Vitamin B12 tạo DNA vật liệu di truyền tế bào, giúp trì tình trạng khỏe mạnh tế bào thần kinh hồng cầu, giữ vai trò then chốt phát triển hồng cầu - Vitamin B12 phối hợp với vitamin B1, B6 dùng điều trị viêm dây thần kinh gây đau khớp, liệt chân, tay hiệu Kiểm soát cholesterol: Nồng độ cholesterol có ảnh hướng lớn tới sức khoẻ Một chế độ ăn giàu vitamin B12 giúp kiểm soát cholesterol mức cân bằng, đồng thời giúp trì nồng độ triglycerides, nhờ bảo vệ sức khoẻ tim mạch Chống lại bệnh thiếu máu hồng cầu lưỡi liềm: - Vitamin B12 tạo DNA vật liệu di truyền tế bào, trì tình trạng khỏe mạnh tế bào thần kinh hồng cầu, giữ vai trò then chốt phát triển hồng cầu - Vitamin B12 thành phần đóng quan trò quan trọng điều trị vấn đề nghiêm trọng liên quan tới bệnh thiếu máu hồng cầu hình lưỡi liềm, giúp hạn chế tổn thương nội mô bệnh nhân Giảm nguy mắc bệnh Alzheimer: - Vitamin hỗ trợ chức tế bào thần kinh, giúp sản xuất - myelin tăng cường hoạt động tế bào thần kinh Alzheimer bệnh phổ biến người cao tuổi năm gần đây, bệnh có xu hướng trẻ hố Theo chun gia y tế xét nghiệm cho thấy bệnh nhân Alzheimer bị thiếu vitamin B12 trầm trọng - Phòng ngừa thiếu máu: Vitamin B12 vitamin thiết yếu cho việc sản xuất hồng - cầu cho thể Vitamin B12 có tác dụng giúp trì lượng máu bình thường thể, đồng thời hỗ trợ điều trị vấn đề liên quan tới bệnh thiếu máu - Vitamin B12 vitamin quan trọng để chữa bệnh thiếu máu nguy hiểm bệnh viêm dây thần kinh ngoại biên, đồng thời vitamin quan trọng cần bổ sung phần ăn động vật người Triệu chứng bệnh lý thể thiếu thừa vitamin B12 2.2 a Thiếu Vitamin B12: • Thiếu máu thiếu vitamin B12 thiếu máu nguyên bào khổng lồ Người bệnh xanh xao, yếu, dễ mệt, ăn ngon, hồi hộp đánh trống • ngực, đau đầu, khó thở, ngất xỉu Thiếu vitamin B12 gây suy thoái chất myelin, chất béo thành phần quan trọng tế bào thần kinh, gây triệu chứng - thần kinh Người cao tuổi thiếu vitamin B12 dễ bị teo não suy giảm trí nhớ trầm cảm - Thiếu vitamin B12 số nguyên nhân dẫn đến chậm phát triển khả ngôn ngữ, rối loạn ngôn ngữ, tự kỷ, bại não vấn đề thần kinh - Các biểu hiện: cảm giác rung, tê rần, nhột nhạt kiến bò,đi đứng xiêu vẹo,hoang tưởng, trí óc giảm sút • Q trình chép tế bào bị suy yếu dẫn đến teo viêm niêm mạc miệng tồn đường tiêu hóa; đau lưỡi, giảm hấp thu chất dinh dưỡng, táo bón, chán ăn sụt cân Thừa vitamin B12: Có thể gây tăng sản tuyến giáp Làm tăng hồng cầu mức, bệnh tim Có xảy tác dụng thứ phát gây nơn nao, chống váng, mày đay 2.3 Nguồn cung cấp Vitamin B12 b - Nguồn thực phẩm chứa vitamin B12 dồi Bảng thực phẩm giàu vitamin B12 Thực phẩm Khẩu phần μg Gan bê 100g 60 Con trai 100g Cá hồi 100g Thịt bò (phi lê) 100g Trứng quả, kích cỡ vừa Phô mai cứng 30g 0,6 Sữa ly lớn 0,4 + Cơ thể chứa lượng vitamin B 12 nhỏ (khoảng 2-5mg), 50-90% số dự trữ gan + Vitamin B12 có sữa cá: Hai loại thức ăn chứa nhiều vitamin B12 tốt cho thể, đặc biệt phụ nữ sau sinh Sau sinh phụ cần bổ sung lượng máu nên bổ sung vitamin B12 thơng qua cá sữa + Hệ vi khuẩn ruột người khỏe mạnh sản sinh lượng nhỏ vitamin B12 đủ dùng cho thể Nhu cầu vitamin B12 người trưởng thành bình thường 2mcg/ngày + Vitamin B12 có nội tạng động vật Vitamin B12 có nhiều nội tạng động vật gan, thạn, tim, cật, sò ốc… + Các thực phẩm từ thực vật không chứa vitamin B12 2.4 Ứng dụng •Trong y tế: dùng làm thuốc •Trong chăn nuôi:bổ xung vào thành phần thúc ăn chăn ni làm tăng khả tiêu hố thức ăn, tăng nhanh ví dụ 1kg vitamin B12 bổ xung vào thức ăn cho lợn thu thêm 860 kg thịt •Trong cơng nghệ ni cấy mơ tế bào: dùng làm thành phần môi trường nuôi cấy III QUY TRÌNH SẢN XUẤT VITAMIN B12 BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN SINH TỔNG HỢP VI KHUẨN Propionibacterium shermanii 3.1 Vi sinh vật tham gia tổng hợp vitamin B12 3.1.1 Vi khuẩn Propionibacterium - Giống Propionibacterium sermanii giống có nhiều ưu điểm đưa vào sản xuất vitamin B12 theo quy mô công nghiệp - Một số đặc điểm Propionibacterium sermanii + Là trực khuẩn có kích thước nhỏ, thiên nhiên chúng thường xếp thành đôi chuỗi ngắn + Chúng thuộc loại hiếu khí tuỳ tiện + Có khả lên men acid lactic, glycerol, glucose, fructose, lactose + Khoảng pH hoạt động 4,5-7,5, pH tối ưu cho việc tổng hợp B12 5,87,5 + Nhiệt độ thích hợp cho sinh tổng hợp vitamin B12 28- 30oC + Các chất dinh dưỡng cho phát triển: muối amon, nước amoniac, CoCl2 Co(NO3)2, Các kim loại thường làm giảm khả sinh tổng hơp B12 (Fe, Cu, Zn, Mn ) 3.1.2 Xạ khuẩn actinomyces - Trong giống thuộc actinomyces có giống actinomyces olimacens có khả tổng hợp vitamin B12 cao sử dụng để sản xuất vitamin B12 theo quy mô công nghiệp - Một số đặc điểm actinomyces olimacens: + Xạ khuẩn actinomyces olimacens thuộc lại hiếu khí + Chúng phát triển mạnh sinh nhiều vitamin B12 môi trường chứa glucose, tinh bột, mật rỉ, bã rượu Trong thành phần môi trường cần cho muối amon, coban CaCO3 + Sinh tổng hợp vitamin B12 xảy mạnh sau 24h nuôi cấy + pH ban đầu môi trường nên điều chỉnh khoảng pha thứ pH giảm xuống khoảng 6,5 pha thứ pH tăng lên 8,2-8,7 + Trong trình lên men phải thơng khí + Nhiệt độ thích hợp cho phát triển sinh tổng hợp vitamin B12 12- 30 oC + Thời gian lên men 60-120 3.1.3 Vi khuẩn sinh metan - Trong thiên nhiên có nhiều loại vi sinh vật tham gia lần lược nhiều phản ứng sinh metan Cùng với tạo thành khí metan vi sinh vật tổng hợp số lượng vitamin B12 lớn - Đặc điểm chung vi khuẩn sinh metan: + Chúng thuộc vi khuẩn gram âm + Chúng không chuyển động + Không tạo bào tử 3.2 Quy trình sản xuất Vitamin B12 phương pháp lên men snh tổng hợp vi khuẩn 3.2.1 Q trình nhân giống - Mục đích: Q trình nhân giống giúp gia tăng số lượng tế bào vi sinh vật, tích lũy đủ số lượng tế bào cần thiết để cấy giống vào môi trường lên men - Cách thực hiện: + Giống Propionibacterium shermanii cấy môi trường thạch nghiêng với glucose, KH2PO4, (NH4)2PO4, cao ngô nước chiết trái + Nuôi vi khuẩn nhiệt độ t0 = 28 – 32 0C – ngày + Sau bảo quản lạnh, cấy truyền tháng lần + Nhân giống cho sản xuất thường thực điều kiện kị khí - Chuẩn bị mơi trường: Trong mơi trường,người ta cho thêm muối amon, nước amoniac, CoCl2 Co(NO3)2 Vi khuẩn Propionibacterium shermanii sử dụng chất môi trường để tăng sinh khối Hàm lượng chất môi trường giảm theo thời gian, sinh khối tăng dần • Môi trường nhân giống gồm: 10 Glucose : 0,5 – % Cao ngô : 1–2% Clorua coban : 1,5 – ppm Pepton: 0,1 – % Dầu đậu nành : 0,1 – %  pH : 6,9 - 3.2.2 Lên men - Mục đích: Làm tăng hàm lượng vitamin tế bào vi sinh vật Thành phần môi trường lên men bao gồm: Nguồn carbon, nguồn nitơ, yếu tố tăng trưởng, muối dinh dưỡng, coban, glycine sodium cyanide + Nguồn carbon carbohydrate (dextrose, maltosse, xylose, syrup bắp, sucrose, mật rỉ), acid hữu acid lactic Chiếm 0.5 – 10% khối lượng môi trường nuôi cấy + Nguồn Nitơ protein đậu nành, yến mạch, bắp, bột mì, dịch chiết nấm men, nước Whey … Khối lượng chiếm – 5% khối lượng môi trường nuôi cấy + Yếu tố tăng trưởng cho vi sinh vật dịch chiết nấm men, dịch khoai tây, bắp + Muối: ammonium sulfat, magnesium sulfat, potasseum photphate dibasic, potassium photphate monbasic Hợp chất coban: cobalt chloride, sulfate, nitrate * Thành phần môi trường lên men Mật rỉ : 4% Glucose : 0.5 - 1% CaCO3 : 0.1% Clorua coban : 1.5 - 10 ppm  Thêm glycine vào môi trường lên men giúp hàm lượng vitamin B12 tăng lên 11  Trong sản xuất người ta bổ sung thêm 5,6 – dimetylbenzinaldazol làm tăng tổng hợp vitamin B12  Ngoài ra, muối coban thêm vào với nồng độ -5 µg/lít - Điều kiện trình lên men:  Nhiệt độ: 121 C  Thời gian tiệt trùng: 30 phút pH = 6.5 –  Các giai đoạn trình lên men: + Giai đoạn đầu kị khí + Giai đoạn sau hiếu khí  Thời gian cho giai đoạn 72 – 88  Nồng độ vitamin B12 làm tăng nhanh giai đoạn hiếu khí, khoảng 35 – 40 mg vitamin B12 /lít  pH tối ưu = - 7.5 3.2.3 Quy trình thu nhận tinh chế vitamn B12: - Sau kết thúc lên men, dịch lên men đem lọc ly tâm thu lấy sinh khối, loại dịch Tiến hành chiết xuất dung mơi hữu - Hòa sinh khối vào nước tạo hỗn dịch chỉnh pH 4,5 HCl 10% thêm chất ổn định - Đun nóng hỗn hợp 800C 30 phút để giải phóng vitamin B 12 vào dịch lọc Lọc lấy dịch lọc, bỏ bã tận thu làm thức ăn chăn nuôi - Vitamin B12 từ dung dịch nước sang pha hữu hỗn hợp dung môi phenol: n-butanol (1:1) với tỉ lệ V pha hữu cơ: V pha nước 1:10 - Dịch chiết hữu pha lỗng băng tricrezol carbon tetraclorid (CCl4) –sau chiết vitamin B12 trở lại pha nước nhiều lần nước - Chỉnh pH pha dung dịch nước 8,0-8,5 tiến hành cyanid hóa Sử dụng KCN để chuyển dạng vitamin B12 coenzym thành Cyanocobalamin Chỉnh pH trung tính, chân khơng =< 600C đến nồng độ vitamin B12 đạt khoảng 10.000 mcg/ml 12 - Quá trình tinh chế tiến hành cột oxyd nhôm + Hấp phụ dung dịch vitamin B12 lên cột dung dịch aceton-nước 75%.sau phản hấp thụ thu lấy phân đoạn đậm đặc nhất.pha loãng dịch đậm đặc aceton, khuấy nhẹ để kết tinh 12 40C + Lọc thu tinh thể hình kim màu đỏ đậm, rửa aceton nguyên chất sấy khô nhiệt độ 50oC  Vitamin B12 tinh chế phải có hàm lượng >_ 95%  Định lượng Vitamin B12 quang phổ tử ngoại bước sóng 3611nm, 13 IV TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.Từ Minh Koóng, Kỹ thuật sản xuất dược phẩm, Tập II – Kỹ thuật sản xuất thuốc phương pháp sinh tổng hợp http://bsdao.blogspot.com/2007/11/vitamin-b12-hay-cobalamin.html https://text.123doc.org/document/1477647-vitamin-b12-va-vai-tro.htm http://naturalshop.com.vn https://www.bachhoaxanh.com/kinh-nghiem-hay/vitamin-b12-hay-cobalamin-la- gi-995834 14 ... 1kg vitamin B12 bổ xung vào thức ăn cho lợn thu thêm 860 kg thịt •Trong cơng nghệ nuôi cấy mô tế bào: dùng làm thành phần mơi trường ni cấy III QUY TRÌNH SẢN XUẤT VITAMIN B12 BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÊN... lượng vitamin B12 lớn - Đặc điểm chung vi khuẩn sinh metan: + Chúng thuộc vi khuẩn gram âm + Chúng không chuyển động + Không tạo bào tử 3.2 Quy trình sản xuất Vitamin B12 phương pháp lên men snh... chứa vitamin B12 Vì nhu cầu tổng hợp viatmin B12 quy mô công nghiệp thiết yếu, để bổ sung vitamin B12 cho người ăn chay trường chữa loại bệnh thiếu vitamin B12 1.2 - Đặc điểm Vitamin B12: Vitamin