Đánh giá khả năng sống sót của lactobacillus acidophilus trong vi nang calci alginat chitosan

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ NGỌC ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SỐNG SÓT CỦA Lactobacillus acidophilus TRONG VI NANG CALCI - ALGINAT- CHITOSAN Chuyên ngành: Công nghệ Dƣợc phẩm bào chế thuốc Mã số: 8720202 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS ĐÀM THANH XUÂN HÀ NỘI 2018 LỜI CẢM ƠN Với kính trọng lòng biết ơn, lời cho bày tỏ cảm ơn chân thành tới: PGS.TS Đàm Thanh Xn Cơ hết lòng giúp đỡ, hướng dẫn truyền đạt nhiều kiến thức, kinh nghiệm quý báu, dành nhiều thời gian tận tâm, bảo tơi suốt q trình làm luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô, anh chị kỹ thuật viên phòng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học, môn Công nghiệp Dược, môn Bào chế, mơn Vật lý-Hóa lý mơn Thực vật dược nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện tốt phương tiện để tơi hồn thành luận văn Xin cảm ơn Ban giám hiệu, phòng Sau đại học thầy cô, cán nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội quan tâm giúp đỡ tơi q trình học tập nghiên cứu Xin cảm ơn Lãnh đạo Bộ môn Bào chế Công nghiệp dược, Khoa Dược, Trường Đại Học Y Dược Thái Nguyên ủng hộ tạo điều kiện để học tập, nâng cao kiến thức chuyên môn Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn bố mẹ tồn thể đại gia đình bạn bè bên, động viên giúp đỡ tơi giai đoạn khó khăn Hà Nội, ngày 23 tháng 05 năm 2018 Tác giả Nguyễn Thị Ngọc MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan probiotic 1.1.1 Đại cương probiotic .2 1.1.2 Vai trò probiotic 1.1.3 Tình hình nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic giới Việt Nam 1.1.4 Loài Lactobacilus acidophilus 1.2 Tổng quan vi nang 1.2.1 Khái niệm, đặc điểm ưu nhược điểm vi nang 1.2.2 Các ứng dụng vi nang ngành Dược .12 1.2.3 Các phương pháp bào chế vi nang 13 1.2.4 Tổng quan số thành phần sử dụng bào chế vi nang 19 1.2.5 Một số nghiên cứu nước bào chế vi nang probiotic 23 CHƢƠNG 27 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu 27 2.1.1 Nguyên liệu .27 2.2 Nội dung nghiên cứu 29 2.2.1 Bào chế vi nang calci – alginat - chitosan 29 2.2.2 Đánh giá khả bảo vệ vi sinh vật vi nang calci - alginat chitosan dịch tiêu hóa mơ 29 2.2.3 Theo dõi độ ổn định vi nang thời gian bảo quản 29 2.3 Phương pháp nghiên cứu 29 2.3.1 Phương pháp tiệt khuẩn 29 2.3.2 Phương pháp nhân giống 29 2.3.3 Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào .29 2.3.4 Tạo vi nang calci-alginat-chitosan chứa Lactobacillus acidophilus 30 2.3.5 Phương pháp đông khô 32 2.3.6 Phương pháp tạo dãy pha loãng liên tục để xác định số lượng VSV [1] 33 2.3.7 Phương pháp đánh giá khả bảo vệ L acidophilus môi trường acid pH 3,0 33 2.3.8 Phương pháp đánh giá khả giải phóng L acidophilus môi trường đệm phosphat pH 7,0 34 2.3.9 Phương pháp đánh giá khả bảo vệ L acidophilus mơi trường dịch tiêu hóa mơ 35 2.3.10 Phương pháp xác định hàm ẩm .36 2.3.11 Phương pháp xác định cấu trúc vi nang kính hiển vi điện tử quét (SEM) .36 2.3.12 Phương pháp xác định kích thước vi nang 36 2.3.13 Định tính chitosan vi nang phương pháp đo phổ hồng ngoại (IR) 36 2.3.14 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng môi trường pH 3,0 đến tương tác chitosan-alginat vi nang 36 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 38 3.1 Bào chế vi nang calci-alginat-chitosan theo phương pháp 38 3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ calci clorid tới thời gian hình thành vi nang 38 3.1.2 Tạo vi nang Calci- Alginat bao chitosan với tá dược bảo vệ tinh bột 39 3.1.3 Định tính chitosan vi nang phương pháp đo phổ hồng ngoại (IR) .43 3.1.4 Đánh giá thông số hàm ẩm, cấu trúc, mật độ VSV vi nang calci-alginat-chitosan sau đông khô 46 3.2 Đánh giá khả bảo vệ vi sinh vật vi nang calci - alginat - chitosan dịch tiêu hóa mơ 48 3.2.1 Đánh giá khả bảo vệ VSV mẫu vi nang calci-alginatchitosan môi trường pH 3,0 .48 3.2.2 Đánh giá khả giải phóng VSV mơi trường pH7,0 50 3.2.3 Đánh giá khả sống sót VSV mơi trường dịch tiêu hóa mơ .52 3.2.4 So sánh đối chiếu khả bảo vệ VSV dịch tiêu hóa mơ với chế phẩm tương đương thị trường 55 3.3 Theo dõi độ ổn định vi nang trình bảo quản 57 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 59 4.1 Bào chế vi nang calci-alginat-chitosan theo phương pháp 59 4.1.1 Bàn luận ảnh hưởng nồng độ calci clorid tới thời gian hình thành vi nang 59 4.1.2 Bàn luận ảnh hưởng tá dược bảo vệ tinh bột 59 4.1.3 Bàn luận kết định tính chitosan vi nang phương pháp đo phổ hồng ngoại (IR) .61 4.1.4 Bàn luận thông số hàm ẩm, cấu trúc, mật độ VSV vi nang calci-alginat-chitosan sau đông khô 63 4.2 Bàn luận khả bảo vệ vi sinh vật vi nang calci - alginat chitosan đường tiêu hóa mơ 64 4.2.1 Bàn luận khả bảo vệ VSV mẫu vi nang calci-alginatchitosan môi trường pH 3,0 .64 4.2.2 Bàn luận khả giải phóng VSV mơi trường pH 7,0 65 4.2.3 Bàn luận khả sống sót VSV mơi trường dịch tiêu hóa mơ .66 4.2.4 Bàn luận kết so sánh đối chiếu khả bảo vệ VSV dịch tiêu hóa mơ với chế phẩm tương đương thị trường .67 4.3 Bàn luận kết theo dõi độ ổn định vi nang trình bảo quản 68 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO 71 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ATCC Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ (American Type Culture Collection) ALG Alginat B longum Bifidobacterium longum B bifidum Bifidobacterium bifidum B subtilis Bacillus subtilis Cfu Số đơn vị khuẩn lạc (Colony-Forming Units) CT Công thức E coli Escherichia coli FOS Fructo- oligosaccharides FAO Tổ chức Nông lương giới (Food and Agriculture Organization) GOS Galacto- oligosaccharides GRAS Chứng nhận an toàn (Generally Recognized As Safe) H Giờ IDF Liên đoàn Sữa giới (Internation Dairy Federation) LAB Nhóm vi khuẩn Lactic (Lactic acid bacteria) L Lactobacillus MRS Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (De Man, Rogosa, Sharpe) MRSA Môi trường nuôi cấy thạch (MRS Agar) MT Môi trường NC Nghiên cứu PE Poly Ethylen SEM Kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope) TC NSX Tiêu chuẩn nhà sản xuất TD Tá dược TKHH Tinh khiết hóa học VK Vi khuẩn v/ph Vòng/phút VSV Vi sinh vật WHO Tổ chức Y tế giới (World Health Organization) ĐK Đông khô DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Một số sản phẩm probiotic chứa L acidophilus thị trường Bảng 2.1 Các nguyên liệu pha môi trường 27 Bảng 2.2 Các thiết bị dùng nghiên cứu 28 Bảng 2.3: Các môi trường sử dụng nghiên cứu 28 Bảng 2.4: Bảng thiết kế công thức vi nang 30 Bảng 3.1 Đặc tính mẫu tạo thành thay đổi nồng độ calci clorid 38 Bảng 3.2: Đường kính vi nang trước đơng khơ 42 Bảng 3.3: Mật độ L acidophilus hàm ẩm vi nang sau đông khô 47 Bảng 3.4: Số lượng L acidophilus mẫu vi nang sau ủ 2h pH 3,0 49 Bảng 3.5: Khả giải phóng L acidophilus môi trường pH 7,0 mẫu vi nang 51 Bảng 3.6: Số lượng L acidophilus mẫu vi nang sau ủ 2h dịch dày mô dịch ruột mô nang tan hoàn toàn 54 Bảng 3.7: Số lượng L acidophilus chế phẩm men antibio mẫu vi nang sau ủ dung dịch tiêu hóa mơ 56 Bảng 3.8: Kết theo dõi chất lượng vi nang L Acidophilus M1-TB-VSV sau tháng bảo quản tủ lạnh 57 Bảng 3.9: Kết theo dõi chất lượng vi nang L Acidophilus M2-TB-VSV sau tháng bảo quản tủ lạnh 57 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh L acidophilus kính hiển vi điện tử Hình 1.2: Các loại vi nang 10 Hình 1.3: Các giai đoạn trình tách pha đơng tụ đơn 14 Hình 1.4: Công thức cổ điển hai đơn vị monomeric acid alginic 19 Hình 1.5: Cấu trúc dạng mono α-L-guluronic acid (G); β-D-mannuronic acid (M) dạng liên hợp Alginat 20 Hình 1.6: Vị trí ion calci gel tạo gel calci alginat 21 Hình 1.7 Cấu trúc hóa học chitosan 22 Hình 3.1 Hình ảnh vi nang Calci-alginat tạo thành theo thời gian sử dụng calci nồng độ 1% 38 Hình 3.2 Hình ảnh vi nang Calci-alginat tạo thành theo thời gian sử dụng calci nồng độ 2% 39 Hình 3.3: Hình ảnh mẫu vi nang khơng có TB trước đơng khơ kính lúp soi có độ phóng đại 10X sau đơng khơ camera thường 40 Hình 3.4 Hình ảnh mẫu vi nang khơng có TB kính hiển vi điện tử qu t có độ phóng đại từ 50X đến 350X 41 Hình 3.5 : Hình ảnh mẫu vi nang có TB trước đơng khơ 41 Hình 3.6: Hình ảnh mẫu vi nang có TB sau đơng khơ kính lúp soi có độ phóng đại 10X 41 Hình 3.7: Hình ảnh bề mặt vi nang có TB kính hiển vi điện tử qu t có độ phóng đại từ 297X đến 601X 42 Hình 3.8 Phổ IR chitosan chuẩn 43 Hình 3.9 Phổ IR vi nang M0-TB 44 Hình 3.10 Phổ IR vi nang M1-TB-Chi 44 Hình 3.11 Phổ IR vi nang M2-TB-Chi 44 Hình 3.12 Hình ảnh so sánh phổ IR chitosan, vi nang M0-TB vi nang M1-TB-Chi, M2-TB-Chi 45 4.1.4 Bàn luận thông số hàm ẩm, cấu trúc, mật độ VSV vi nang calci-alginat-chitosan sau đông khô Về hàm ẩm vi nang, kết cho thấy sau đông khô, mẫu vi nang có hàm ẩm nhỏ 2%, đáp ứng yêu cầu chế phẩm đông khô (bảng 3.3) Các nghiên cứu trước hàm ẩm mẫu vi nang alginat-TB cho kết hàm ẩm nhỏ 2% [7] Trong hàm ẩm mẫu M0-TB-VSV lớn hàm ẩm mẫu có chitosan M1-TB-VSV M2-TB-VSV 0,17% 0,26% Mật độ L acidophilus vi nang M0-TB-VSV 5,13×108 CFU/g thấp so với mẫu vi nang M1-TB-VSV, M2-TB-VSV đạt 1,86×109 CFU/g Điều chứng tỏ, có mặt chitosan có ảnh hưởng đến hàm ẩm mật độ VSV sau đông khô Với lượng sinh khối VSV đưa vào, hỗn dịch S đồng hóa, kết cho thấy khả bảo vệ VSV sau đông khô vi nang M1-TBVSV M2-TB-VSV tốt so với vi nang M0-TB-VSV, mật độ VSV đạt 109 CFU/g, đáp ứng tốt yêu cầu chế phẩm probiotic FAO/WHO [22] Như vậy, vi nang calci-alginat-chitosan tạo thành sau đông khô đáp ứng tốt yêu cầu hàm ẩm số lượng VSV nhốt giữ, việc bổ sung chitosan theo phương pháp khác có tác dụng tăng số lượng VSV vi nang sau đông khô Với công thức lựa chọn để tạo vi nang calci-alginat-chitosan nồng độ TB 10%, nồng độ calci clorid 2%, nồng độ alginat 3% Vi nang tạo từ phương pháp khác cho cấu trúc hình cầu, vi nang tạo thành thời gian 30 phút Kết đo IR vi nang M1-TB-chi, M2-TB-Chi cho thấy có xuất chitosan Sự có mặt chitosan khơng làm vi nang thay đổi hình dạng, độ đồng mà tác động đến kích thước vi nang theo hướng khác Việc bổ sung tá dược tinh bột vào công thức giúp tạo vi nang lớn hơn, kích thước hơn, sau đơng khơ vi nang chất tốt so với vi nang khơng có tinh bột Các vi nang Calci-alginat-chitosan tạo thành sau đông khô đáp ứng tốt yêu cầu hàm ẩm số lượng VSV nhốt giữ, việc bổ sung chitosan theo phương pháp khác có tác dụng tăng số lượng VSV vi nang sau đông khô so với vi nang khơng có chitosan 63 4.2 Bàn luận khả bảo vệ vi sinh vật vi nang calci - alginat chitosan đƣờng tiêu hóa mô 4.2.1 Bàn luận khả bảo vệ VSV mẫu vi nang calci-alginatchitosan môi trường pH 3,0 Kết từ bảng 3.4 hình 3.17 cho thấy sau ủ vi nang 120 phút môi trường pH 3,0, số lượng vi sinh vật vi nang khơng bao chitosan (M0-TBVSV) giảm từ 8,71 7,02 log CFU/g đạt 80,52%, mẫu vi nang tạo theo phương pháp giai đoạn M1-TB-VSV, giai đoạn M2-TB-VSV giảm từ 9,27 8,73 8,30 log CFU/g Vi nang M1-TB-VSV bảo vệ 94,15% VSV, vi nang M2-TB-VSV bảo vệ 89,55% VSV sau 120 phút Mặc dù sau tiếp xúc với môi trường acid, mẫu vi nang có số lượng L acidophilus sống sót giảm bổ sung chitosan cho vi nang calci-alginat theo phương pháp khác tạo vi nang calci-alginat-chitosan có tác dụng tăng đáng kể khả bảo vệ L acidophilus môi trường acid pH 3,0 Vi nang M1-TB-VSV bảo vệ VSV tốt so với vi nang M2-TB-VSV Nguyên nhân phương pháp tạo vi nang theo nguyên tắc giai đoạn M2-TB-VSV có nhược điểm thời gian ngâm hạt dung dịch khơng có dinh dưỡng lâu Khi vi nang ngâm lâu mơi trường khơng có dinh dưỡng có calci alginat, lượng lớn vi sinh vật bị chết giai đoạn vi nang tạo thành Nếu thời gian tạo vi nang rút ngắn lại 30 phút phương pháp giai đoạn (giảm nửa so với phương pháp giai đoạn) tỷ lệ vi sinh vật sống sót tăng lên giảm vi sinh vật trình tạo vi nang Mặt khác, pH dày, ion Ca2+ vi nang calci alginat trao đổi điện tích với ion H+ mơi trường acid, làm ion Ca2+ mơ hình “vỉ trứng”, phần VSV bị thoát khỏi vi nang chịu ảnh hưởng trực tiếp môi trường acid, làm lượng VSV bị giảm đáng kể qua dày Các nghiên cứu trước chitosan alginat liên kết với liên kết nhóm acid alginat nhóm amin chitosan, tạo thành lớp áo kép bảo vệ vi sinh vật [45], [59] Vi nang với lớp áo kép chitosan - alginat góp phần làm tăng q 64 trình phân phối VSV, làm tăng mật độ điện tích bề mặt vi nang Bao chitosan cho vi nang calci-alginat-chitosan giúp bổ sung lớp áo polycation bên tạo hàng rào ngăn cản tác động ion H+, làm tăng khả bảo vệ VSV vi nang [45], [47], [59] Điều lý giải cho việc vi nang bao chitosan M1-TB-VSV M2-TB-VSV có khả bảo vệ VSV tốt hẳn so với vi nang M0-TB-VSV không bao chitosan Như vậy, bổ sung chitosan cho vi nang Ca-Alg theo phương pháp khác giúp bảo vệ VSV môi trường pH 3,0 Trong 120 phút, vi nang Calcialginat-chitosan giúp bảo vệ khoảng 108 tế bào L acidophilus sống sót, đạt 90% lượng VSV ban đầu, cao đáng kể so với vi nang caici-alginat không bao chitosan 80% 4.2.2 Bàn luận khả giải phóng VSV môi trường pH 7,0 Vi nang rã theo chế bào mòn, số lượng VSV giải phóng sau thời gian ủ cho thấy Sau 110-160 phút, vi nang giải phóng VSV mức cao 90% so với lượng VSV thời điểm ban đầu Vi nang M0-TB-VSV giải phóng 93,06%, vi nang M2-TB-VSV giải phóng 93,71% vi nang M1-TB-VSV giải phóng nhiều 96,92% so với lượng VSV vi nang trước ủ môi trường pH 7,0 Nguyên nhân khiến vi nang M1-TB-VSV giải phóng nhiều VSV bào chế vi nang, thời gian ngâm dung dịch calci clorid chitosan ngắn so với mẫu M2-TV-VSV, khiến lượng VSV vi nang bảo vệ tốt Tuy nhiên, lượng vi sinh vật giải phóng tối đa đạt 96,92% vi nang M1TB-VSV, nguyên nhân sau giải phóng ngồi mơi trường, VSV tiếp tục phát triển, bị thiếu dinh dưỡng làm số chết dần không bảo toàn 100% lượng VSV ban đầu Như vậy, kết luận chitosan khơng ảnh hưởng lớn đến khả giải phóng VSV mơi trường pH 7,0 Bổ sung Chi theo phương pháp khác tạo vi nang calci-alginat-chitosan khơng ảnh hưởng đến tính chất rã khả giải phóng VSV mơi trường đệm phosphat pH 7,0 mà làm tăng thời gian rã hoàn toàn vi nang Sau thời gian 110-160 phút, vi nang rã hồn tồn giải phóng 90% lượng VSV so với lượng VSV nang ban đầu, đạt 108 65 CFU/g – đáp ứng tốt yêu cầu WHO/FAO chế phẩm probiotic [22] Trong vi nang bào chế theo nguyên tắc giai đoạn giải phóng VSV mức cao so với loại vi nang lại 4.2.3 Bàn luận khả sống sót VSV mơi trường dịch tiêu hóa mơ Sau 100-120 phút, vi nang giải phóng VSV mức cao 108 CFU/g Vi nang M0-TB-VSV giải phóng 8,3 CFU/g, vi nang M2-TB-VSV giải phóng 8,7 CFU/g vi nang M1-TB-VSV giải phóng nhiều 8,9 CFU/g Điều cho thấy, sau tiếp xúc với môi trường dịch dày mơ có bổ sung pepsin mơi trường dịch ruột mơ có bổ xung pancreatin, mẫu vi nang có số lượng L acidophilus sống sót giảm bổ sung chitosan cho vi nang theo phương pháp khác có tác dụng tăng đáng kể khả bảo vệ L acidophilus môi trường dịch tiêu hóa mơ Kết phù hợp với nghiên cứu Zanjani M cộng [47], tác giả sử dụng phương pháp nhũ tương hóa để tạo vi nang chứa L casei B bifidum tạo vi nang calci-alginat-chitosan có bổ xung tinh bột phương pháp ủ vi nang calci-alginat dung dịch chitosan 0,4% đơng khơ Sau ủ vi nang đơng khơ 120 phút mơi trường pH 1,5 có pepsin 3g/l, tỉ lệ L casei sống sót với vi nang không bao chitosan bao chitosan 59,58% 68,42% trì 108 lượng VSV sau thử nghiệm Nguyên nhân khiến lượng VSV bị giảm lượng lớn sau lắc môi trường dày mơ ruột non mơ vì, pH dày, ion Ca 2+ vi nang calci alginat trao đổi điện tích với ion H+ môi trường acid, làm ion Ca2+ mô hình “vỉ trứng”, phần VSV bị khỏi vi nang chịu ảnh hưởng trực tiếp môi trường acid, làm lượng VSV bị giảm đáng kể qua dày Các nghiên cứu trước chitosan alginat liên kết với liên kết nhóm acid alginat nhóm amin chitosan, tạo thành lớp áo kép bảo vệ vi sinh vật [45], [59] Vi nang với lớp áo kép chitosan alginat góp phần làm tăng q trình phân phối VSV, làm tăng độ điện tích bề mặt vi nang Bao chitosan cho vi nang giúp bổ sung lớp áo polycation bên tạo hàng rào ngăn cản tác động ion H+, làm 66 tăng khả bảo vệ VSV vi nang [45], [47], [59] Sau qua dày (pH1 -5), vi nang tới ruột với pH tăng lên khoảng có lượng phosphat lớn hơn, làm ion Ca2+ mơ hình “vỉ trứng”, phá vỡ cấu trúc vi nang giải phóng VSV ngồi mơi trường [45], VSV tiếp tục phát triển, bị thiếu dinh dưỡng làm số chết dần Đây nguyên nhân khiến số lượng VSV giảm sau thí nghiệm Nhiều nghiên cứu trước việc bao chitosan cung cấp lớp áo bảo vệ tốt cho VSV mơi trường dịch ruột giả có men ruột muối mật Nguyên nhân giải thích phản ứng trao đổi ion trình vi nang hấp thụ muối mật tính thấm muối mật vào vi nang bị hạn chế Đồng thời, trương nở tinh bột gặp dịch ruột giả làm cải thiện cấu trúc độ cứng vi nang [47] Như vậy, bổ sung chitosan theo phương pháp khác tạo vi nang Calcialginat-chitosan làm tăng khả bảo vệ VSV môi trường acid dày mà khơng làm ảnh hưởng đến tính chất rã khả giải phóng VSV mơi trường đệm phosphat pH 7,0 mà làm tăng thời gian rã hoàn toàn vi nang Sau thời gian 120 phút ủ dịch dày mô SGJ, 120-140 phút ủ dịch ruột mô SIJ vi nang rã hồn tồn giải phóng 58% lượng VSV so với lượng VSV nang ban đầu, đạt 108 CFU/g – đáp ứng tốt yêu cầu WHO/FAO chế phẩm probiotic [22] Tuy nhiên vi nang tạo phương pháp giai đoạn bảo vệ VSV tốt Nguyên nhân trình tạo vi nang giai đoạn, thời gian ngâm vi nang dung dịch ngắn phương pháp giai đoạn nên số lượng VSV sống sót đảm bảo 4.2.4 Bàn luận kết so sánh đối chiếu khả bảo vệ VSV dịch tiêu hóa mơ với chế phẩm tương đương thị trường Sau thử nghiệm số lượng vi sinh vật antibio giảm từ 8,2 6,3 log CFU/g số lượng VSV sau thử nghiệm giảm từ 1,26.108 2,26.106 Trong mẫu vi nang M1-TB-VSV, M2-TB-VSV giảm từ 9,1 9,3 8,6 8,2 log CFU/g, trì 108 VSV sau thử nghiệm Như vậy, sau tiếp xúc với môi trường acid 120 phút môi trường đệm phosphat pH 7,0 trung bình khoảng 120-140 phút, mẫu vi nang có số 67 lượng L acidophilus sống sót giảm vi nang calci-alginat-chitosan bào chế theo phương pháp khác có ưu hẳn khả bảo vệ L acidophilus môi trường dịch tiêu hóa mơ so với chế phẩm tương đương Antibio 4.3 Bàn luận kết theo dõi độ ổn định vi nang trình bảo quản - Ở thời điểm ban đầu t=0: Kết đánh giá VN L acidophilus sau ĐK thu bảng 3.8 3.9 cho thấy: hàm ẩm sau trình ĐK 1,6 % số lượng VSV sống 1,86 109 cfu/g Như mẫu vi nang calci-alginat-chitosan đạt yêu cầu hàm ẩm (≤ 5%) đạt số lượng VK probiotic (> 107 cfu/g ) - Độ ổn định vi nang bảo quản tủ lạnh: Sau tháng bảo quản hàm ẩm vi nang tăng từ 1,61 % lên 2,89% Điều lý giải sau trình lấy mẫu chuẩn bị đo hàm ẩm, tiếp xúc với độ ẩm cao khơng khí, mẫu hút ẩm làm cho hàm ẩm tăng lên Hàm ẩm phụ thuộc đáng kể vào độ ẩm tương đối khơng khí thời gian mẫu tiếp xúc với MT Hàm ẩm cao khả sống sót VSV giảm Điều giải thích do: điều kiện có ẩm nhiệt độ thích hợp, VSV trở lại trạng thái hoạt động, sinh trưởng, phát triển, già hóa chết đi, mật độ VSV sau tháng giảm từ 1,86.109 xuống 0,45.108 Để vi nang dạng ĐK ổn định mẫu cần phải bảo quản bao bì kín tránh khuếch tán ẩm khơng khí từ ngồi MT Khả sống sót probiotic phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: chủng vi sinh, dạng bào chế vi nang, độ ẩm tuyệt đối (RH) mức độ khử hoạt tính Đối với dạng bào chế VN thấy VSV bảo vệ khỏi tác động nhiệt độ điều kiện nhiệt độ thấp có lợi cho ổn định VSV hơn, góp phần hạn chế ảnh hưởng độ ẩm [15, 43] 68 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN Sau thời gian thực hiện, đề tài giải số mục tiêu sau: Tạo vi nang calci - alginat bao chitosan theo phƣơng pháp Đã tạo vi nang Calci-alginat-chitosan phương pháp, kết cho thấy:  Sau bao chitosan theo phương pháp, vi nang alginat khơng có tinh bột chất xù xì, móp méo, cầu sau đơng khơ, vi nang alginat có tinh bột kích thước lớn hơn, đều, hạt cầu, bề mặt bớt xù xì  Vi nang Calci-alginat-chitosan chứa Lactobacillus acidophilus sau đơng khơ có hàm ẩm nhỏ 2%, mật độ VSV đạt khoảng 109 CFU/g, đáp ứng yêu cầu chế phẩm probiotic Bổ sung Chi theo phương pháp có tác dụng tăng số lượng VSV vi nang sau đông khô  Sau tháng bảo quản vi nang điều kiện nhiệt độ 40C, độ ẩm 20% kết cho thấy, hàm ẩm vi nang có tăng khơng đáng kể nằm giới hạn cho phép 5%, mật độ VSV có giảm đáng kể sau tháng đạt mức cao > 108 CFU/g Đánh giá khả bảo vệ vi sinh vật vi nang alginat - tinh bột - chitosan dịch tiêu hóa mô  Khi ủ vi nang 120 phút môi trường pH 3,0, vi nang bao chitosan theo phương pháp có khả bảo vệ VSV mức độ cao, khoảng 108 tế bào VSV sống sót, chiếm 90% so với mật độ VSV ban đầu  Khi ủ vi nang môi trường pH 7,0, sau 110 - 160 phút, vi nang rã hoàn tồn theo chế bào mòn, giải phóng 90% lượng VSV so với lượng VSV ban đầu, đạt 108 CFU/g  Khi ủ vi nang môi trường dịch tiêu hóa mơ phỏng, số lượng VSV sống sót đạt 108 CFU/g – đáp ứng tốt yêu cầu WHO/FAO chế 69 phẩm probiotic [22] Tuy nhiên vi nang tạo phương pháp giai đoạn bảo vệ VSV tốt  So sánh đối chiếu khả bảo vệ VSV dịch tiêu hóa mơ vi nang Calci-alginat-chitosan với chế phẩm tương đương antibio cho thấy khả bảo vệ VSV vi nang Calci-alginat-chitosan chiếm ưu hẳn so với chế phẩm tương đương điều kiện thử nghiệm ĐỀ XUẤT - Tiếp tục NC bào chế vi nang L acidophilus kết hợp với số VK probiotic khác để tạo thêm nhiều sản phẩm phục vụ cho nhu cầu ngày tăng sản phẩm probiotic - Tiếp tục nghiên cứu khả sống sót VSV vi nang calci-alginat- chitosan dịch tiêu hóa mơ có bổ sung chất dinh dưỡng 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Y Tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuất Y học, Hà Nội, pp Nguyễn Văn Long (2005), Một số chuyên đề bào chế đại, Nhà xuất y học, Hà Nội, pp 114 -130 Nguyễn Văn Long (1997), "Vi nang", Tài liệu sau đại học, trường Đại học Dược Hà Nội., pp Đàm Thanh Xuân cs (2016), "Nghiên cứu bào chế vi nang probiotics phương pháp đơng tụ", Tạp chí Dược học, 56(5), pp 61-65 Đặng Thị Lệ Hằng cs (2017), "Nghiên cứu điều chế hydrogel nanocomposite sở chitosan curcumin ứng dụng tái tạo mô", Tạp chí Dược học, Bộ Y Tế, 57(492), pp 47-50 Đàm Thanh Xuân cs (2016), "Đánh giá vai trò tinh bột sữa gầy đến trình tạo vi nang probiotic chứa vi khuẩn Lactobacillus acidophilus ATCC 4356", Tạp chí Dược học, Bộ Y Tế, 56(487), pp 8-11 Đàm Thanh Xuân cs (2017), "Nghiên cứu khả bảo vệ Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 vi nang alginat-tinh bột bao chitosan", Tạp chí Dược học, Bộ Y Tế, 57(492), pp 10-11 Abadias M, Benabarre A, et al (2001), "Effect of freeze drying and protectants on viability of the biocontrol yeast Candida sake", International Journal of Food Microbiology, 65(3), pp 173-182 Abbaszadeh Sepideh, Gandomi Hassan, et al (2014), "The effect of alginate and chitosan concentrations on some properties of chitosan‐coated alginate beads and survivability of encapsulated Lactobacillus rhamnosus in simulated gastrointestinal conditions and during heat processing", Journal of the Science of Food and Agriculture, 94(11), pp 2210-2216 10 Altermann Eric, Russell W Michael, et al (2005), "Complete genome sequence of the probiotic lactic acid bacterium Lactobacillus acidophilus NCFM", Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 102(11), pp 3906-3912 11 Ana Blandino et all (1999), "Formation of Calcium Alginate Gel Capsules: 71 Influence of Sodium Alginate and CaCl2 Concentration on Gelation Kinetics", Journal of Bioscience and Bioengineering 88(6), pp 686-689 12 Anal Anil Kumar, Singh Harjinder (2007), "Recent advances in microencapsulation of probiotics for industrial applications and targeted delivery", Trends in Food Science & Technology, 18(5), pp 240-251 13 Arnaud J.P, Lacroix C et all (1992), "Effect of agitation rate on cell release rate and metabolism during continuous fermentation with entrapped growing Lactobacillus casei subsp casei", Biotechnology Techniques, 6(3), pp 265270 14 Brownlie K, M Lakkis Jamileh (2007), Encapsulation and Controlled Release Technologies in Food Systems, Second Edition, pp 1-15 15 Carr Frank J, Chill Don, et al (2002), "The lactic acid bacteria: a literature survey", Critical reviews in microbiology, 28(4), pp 281-370 16 Claesson Marcus J, van Sinderen Douwe, et al (2008), "Lactobacillus phylogenomics–towards a reclassification of the genus", International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 58(12), pp 29452954 17 Chopde Santosh, Pawar Nilkanth, et al (2014), "Microencapsulation of probiotic bacteria of available techniques, focusing on biomaterials-a review", Agricultural Reviews, 35(4), pp 287-294 18 Ding WK, Shah Nagendra P (2008), "Survival of free and microencapsulated probiotic bacteria in orange and apple juices", Int Food Res J, 15(2), pp 21932 19 Donthidi AR, Tester Richard F, et al (2010), "Effect of lecithin and starch on alginate-encapsulated probiotic bacteria", Journal of microencapsulation, 27(1), pp 67-77 20 Ernö Pretsch et all (2009), Structure determination of organic compounds: tables of spectral data, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, pp 269-335 21 Etchepare Mariana de Araújo, Barin Juliano Smanioto, et al (2015), "Microencapsulation of probiotics using sodium alginate", Ciência Rural, 72 45(7), pp 1319-1326 22 FAO/WHO (2006), "Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food Joint FAO/WHO Working Group Report on Drafting Guidelines for the evaluation of probiotics in food", pp 23 Favaro-Trindade CS, Heinemann RJB, et al (2011), "Developments in probiotic encapsulation", CAB Rev, 6, pp 1-8 24 Fayol-Messaoudi Domitille, Berger Cédric N, et al (2005), "pH-, Lactic acid-, and non-lactic acid-dependent activities of probiotic Lactobacilli against Salmonella enterica Serovar Typhimurium", Applied and environmental microbiology, 71(10), pp 6008-6013 25 Ghulam Murtaza et al (2011), "Alginate microparticles for biodelivery: A review", African journal of pharmacy and pharmacology 5(25), pp 27262737 26 Goderska Kamila (2012), Different methods of probiotics stabilization, INTECH Open Access Publisher, pp 27 Gomes Ana MP, Malcata F Xavier (1999), "Bifidobacterium spp and Lactobacillus acidophilus: biological, biochemical, technological and therapeutical properties relevant for use as probiotics", Trends in Food Science & Technology, 10(4), pp 139-157 28 Gong Jianhua, Forster Robert J, et al (2002), "Diversity and phylogenetic analysis of bacteria in the mucosa of chicken ceca and comparison with bacteria in the cecal lumen", FEMS microbiology letters, 208(1), pp 1-7 29 Gorbach Sherwood L (2000), "Probiotics and gastrointestinal health", The American journal of gastroenterology, 95(1), pp S2-S4 30 Grant Gregor T et all (1973), "Biological interactions between polysaccharides and divalent cations: the egg-box mode", FEBS letters, 32(1), pp 195-198 31 Gibson Glenn R, Fuller Roy (2000), "Aspects of in vitro and in vivo research approaches directed toward identifying probiotics and prebiotics for human use", The journal of nutrition, 130(2), pp 391S-395S 73 32 Gildas K G.et all (2012), "Probiotic Encapsulation Technology: From Microencapsulation to Release into the Gut", Pharmaceutics, 4, pp 149-163 33 Hanna Marwan Y AlHurr Aseel I Ibrahim Mumtaz K (2011), "Formulation & stability of Lactobacillus acidophilus microcapsules with a clinical trial for treatment and eradication of Helicobacter pylori infections", pp 34 Husni Rola N, Gordon Steven M, et al (1997), "Lactobacillus bacteremia and endocarditis: review of 45 cases", Clinical Infectious Diseases, 25(5), pp 1048-1055 35 Jankowski T., M Zielinska et all (1997), "Encapsulation of lactic acid bacteria with alginate/starch capsules", Biotechnology Techniques, 11(1), pp 31-34 36 Kailasapathy Kaila (2002), "Microencapsulation of probiotic bacteria: technology and potential applications", Current issues in intestinal microbiology, 3(2), pp 39-48 37 Koo Sun-Mo, Cho Young-Hee, et al (2001), "Improvement of the stability of Lactobacillus casei YIT 9018 by microencapsulation using alginate and chitosan", Journal of Microbiology and Biotechnology, 11(3), pp 376-383 38 Krasaekoopt Wunwisa, Bhandari Bhesh, et al (2004), "The influence of coating materials on some properties of alginate beads and survivability of microencapsulated probiotic bacteria", International dairy journal, 14(8), pp 737-743 39 Krasaekoopt Wunwisa Bhandari Bhesh., et al (2003), "Evaluation of encapsulation techniques of probiotics for yoghurt", International Dairy Journal, 13(1), pp 3-13 40 Kumar Manoj, Kumar Ashok, et al (2010), "Cancer-preventing attributes of probiotics: an update", International journal of food sciences and nutrition, 61(5), pp 473-496 41 Lee JS, Cha DS, et al (2004), "Survival of freeze-dried Lactobacillus bulgaricus KFRI 673 in chitosan-coated calcium alginate microparticles", Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52(24), pp 7300-7305 74 42 Lee Yuan-Kun Salminen Seppo (1995), "The coming of age of probiotics", Trends in Food Science & Technology, 6(7), pp 241-245 43 Lotfipour Farzaneh, Mirzaeei Shahla, et al (2012), "Evaluation of the effect of CaCl2 and alginate concentrations and hardening time on the characteristics of Lactobacillus acidophilus loaded alginate beads using response surface analysis", Advanced pharmaceutical bulletin, 2(1), pp 71 44 Martin MJ, Lara-Villoslada F, et al (2013), "Effect of unmodified starch on viability of alginate-encapsulated Lactobacillus fermentum CECT5716", LWT-Food Science and Technology, 53(2), pp 480-486 45 Michael T Cook et al (2011), "Production and Evaluation of Dry AlginateChitosan Microcapsules as an Enteric Delivery Vehicle for Probiotic Bacteria", 12(7), pp 2834-2840 46 Michida Haruhito, Tamalampudi Sriappareddy, et al (2006), "Effect of cereal extracts and cereal fiber on viability of Lactobacillus plantarum under gastrointestinal tract conditions", Biochemical engineering journal, 28(1), pp 73-78 47 Mohammad Ali Khosravi Zanjania Tarzi Babak Ghiassi, et al (2014), "Microencapsulation of Probiotics by Calcium Alginate - gelatinized Starch", Iranian Journal of Pharmaceutical Research, 13(3), pp 843-852 48 Mortazavian Amir, Razavi Seyed Hadi, et al (2007), "Principles and methods of microencapsulation of probiotic microorganisms", Iranian journal of biotechnology, 5(1), pp 1-18 49 Murtaza Ghulam, Waseem Amir, et al (2011), "Alginate microparticles for biodelivery: A review", African Journal of Pharmacy and Pharmacology, 5(25), pp 2726-2737 50 Nazzaro Filomena, Fratianni Florinda, et al (2009), "Fermentative ability of alginate-prebiotic encapsulated Lactobacillus acidophilus and survival under simulated gastrointestinal conditions", Journal of Functional Foods, 1(3), pp 319-323 51 Netherwood Trudy, Gilbert HJ, et al (1999), "Probiotics shown to change 75 bacterial community structure in the avian gastrointestinal tract", Applied and environmental microbiology, 65(11), pp 5134-5138 52 Ouwehand Arthur C Salminen Seppo J (1998), "The health effects of cultured milk products with viable and non - viable bacteria", International Dairy Journal, 8(9), pp 749-758 53 Parvez S Malik KA., et al (2006), "Probiotics and their fermented food products are beneficial for health", Journal of applied microbiology, 100(6), pp 1171-1185 54 Patil Poonam, Chavanke Daksha, et al (2012), "A review on ionotropic gelation method: novel approach for controlled gastroretentive gelispheres", Int J Pharm Pharm Sci, 4(4), pp 27-32 55 Patterson JA, Burkholder KM (2003), "Application of prebiotics and probiotics in poultry production", Poultry science, 82(4), pp 627-631 56 Rokka Susanna, Rantamäki Pirjo (2010), "Protecting probiotic bacteria by microencapsulation: challenges for industrial applications", European Food Research and Technology, 231(1), pp 1-12 57 Rowe Raymond C, Sheskey Paul J, et al (2009), Handbook of pharmaceutical excipients, Pharmaceutical press, pp 58 Saad N Delattre C., Urdaci M., Schmitter J M., Bressollier P (2013), "An overview of the last advances in probiotic and prebiotic field", LWT- Food Science and Technology, 50(1), pp 1-16 59 Sepideh Abbaszadeh et al (2014), "The effect of alginate and chitosan concentrations on some properties of chitosan-coated alginate beads and survivability of encapsulated Lactobacillus rhamnosus in simulated gastrointestinal conditions and during heat processing", Journal of Science of Food and Agriculture, 94, pp 2210-2216 60 Shah Nagendra P (2007), "Functional cultures and health benefits", International Dairy Journal, 17(11), pp 1262-1277 61 Sheu TY, Marshall RT (1993), "Microentrapment of lactobacilli in calcium alginate gels", Journal of Food Science, 58(3), pp 557-561 76 62 Shu X.Z., Zhu K.J.et all (2002), "The release behavior of brilliant blue from calcium–alginate gel beads coated by chitosan: the preparation method effect", European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 53(2002), pp 193-201 63 Singh Pramod Kumar, Deol Parneet Kaur, et al (2012), "Entrapment of Lactobacillus acidophilus into alginate beads for the effective treatment of cold restraint stress induced gastric ulcer", Food & function, 3(1), pp 83-90 64 Sinha V R., Singla A K et all (2004), "Chitosan microspheres as a potential carrier for drugs", Int J Pharm, 274(1-2), pp 1-33 65 Smidsrod O., Skjak-Braek G (1990), "Alginate as immobilization matrix for cells", Trends Biotechnol, 8(3), pp 71-78 66 Soccol Carlos Ricardo, Vandenberghe Luciana Porto de Souza, et al (2010), "The potential of probiotics: a review", Food Technology and Biotechnology, 48(4), pp 413-434 67 Sohail Asma, Turner Mark S, et al (2011), "Survivability of probiotics encapsulated in alginate gel microbeads using a novel impinging aerosols method", International Journal of Food Microbiology, 145(1), pp 162-168 68 Sultana Khalida, Godward Georgia, et al (2000), "Encapsulation of politicos bacteria with alginate–starch and evaluation of survival in simulated gastrointestinal conditions and in yoghurt", International journal of food microbiology, 62(1), pp 47-55 69 Umer Hammad, Nigam Hemlata, et al (2011), "Microencapsulation: Process, techniques and applications", International journal of research in pharmaceutical and biomedical sciences, 2(2), pp 474-481 70 Vivek K (2013), "Use of encapsulated probiotics in dairy based foods", International Journal of Food, Agriculture and Veterinary Sciences, 3(1), pp 188-99 71 Caillard Romain, Lapointe Nicolas (2017), "In vitro gastric survival of commercially available probiotic strains and oral dosage forms", International journal of pharmaceutics, 519(1), pp 125-127 77 ... Hình 1.2: Các loại vi nang d) e) a) Vi nang dạng lỏng; b) Vi nang dạng r n; c) Vi nang nhiều lớp; d) Vi nang đa nhân; e) Vi nang vi nang Vi nang có nhiều loại: vi nang đơn nhân vi nang phần nhân... từ lí tiến hành thực đề tài Đánh giá khả sống sót Lactobacillus acidophilus vi nang calci- alginatchitosan” nhằm thực mục tiêu sau: Bào chế vi nang calci- alginat- chitosan theo phương pháp tách... 48 3.2.1 Đánh giá khả bảo vệ VSV mẫu vi nang calci- alginatchitosan môi trường pH 3,0 .48 3.2.2 Đánh giá khả giải phóng VSV môi trường pH7,0 50 3.2.3 Đánh giá khả sống sót VSV mơi