Nghiên cứu nâng cao tỉ lệ sống sót của lactobacillus acidophilus trong vi nang alginat phối hợp tinh bột

Nghiên cứu gia tăng số lượng sống sót của vi sinh vật trong vi nang alginat phối hợp tinh bột chứa L.. Nghiên cứu gia tăng số lượng sống sót của vi sinh vật trong vi nang alginat phối h

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ KIỀU TRANG

MÃ SINH VIÊN: 1101537

NGHIÊN CỨU NÂNG CAO TỈ LỆ

SỐNG SÓT CỦA Lactobacillus acidophilus TRONG VI NANG

ALGINAT PHỐI HỢP TINH BỘT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ KIỀU TRANG

MÃ SINH VIÊN: 1101537

NGHIÊN CỨU NÂNG CAO TỈ LỆ

SỐNG SÓT CỦA Lactobacillus acidophilus

TRONG VI NANG ALGINAT PHỐI HỢP

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận này được thực hiện và hoàn thành tại tổ Vi sinh – bộ môn Công nghiệp Dược Trong thời gian thực hiện khóa luận, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của thầy cô, bạn bè và gia đình

Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô giáo thạc sĩ Kiều Thị Hồng

đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện từ những ngày đầu đến khi em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô giáo TS Đàm Thanh Xuân đã nhiệt

tình giúp đỡ, chỉ dẫn và đóng góp nhiều ý kiến quý báu giúp em thực hiện đề tài

Đồng thời, em cũng xin cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡ của các thầy cô giáo, các anh chị kĩ thuật viên trong bộ môn Công Nghiệp Dược trong suốt quá trình làm đề tài nghiên cứu và thực hiện tại bộ môn

Nhân dịp này, em xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy

cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã quan tâm, dạy dỗ trong thời gian em học tập tại trường

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã động viên giúp

đỡ em rất nhiều trong quá trình học tập và trong cuộc sống

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 12 tháng 5 năm 2016

Sinh viên

Nguyễn Thị Kiều Trang

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ PROBIOTIC 2

1.1.1 Khái niệm về probiotic 2

1.1.2 Vai trò của probiotic 2

1.1.3 Cơ chế tác dụng của probiotic 3

1.1.4 Các chủng probiotic phổ biến 3

1.1.5 Các thế hệ probiotic 3

1.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ Lactobacillus acidophilus 4

1.2.1 Đặc điểm hình thái 4

1.2.2 Tác dụng 5

1.3 PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG KHÔ 6

1.3.1 Khái niệm đông khô 6

1.3.2 Ưu nhược điểm của đông khô 6

1.3.3 Một số tá được dùng bảo vệ trong đông khô 7

1.4 PHƯƠNG PHÁP VI NANG HÓA 8

1.4.1 Khái niệm 8

1.4.2 Đặc điểm 8

1.4.3 Phương pháp vi nang hóa bằng tách pha đông tụ 9

1.4.4 Tình hình nghiên cứu về vi nang alginat – tinh bột 12

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ 13

2.1.1 Chủng vi sinh vật 13

2.1.2 Hóa chất 13

2.1.3 Môi trường 13

2.1.4 Máy móc, dụng cụ 14

2.1.5 Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu 14

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 15

2.2.1 Nghiên cứu gia tăng số lượng sống sót của vi sinh vật trong vi nang

alginat phối hợp tinh bột chứa L acidophilus 15

2.2.2 Đánh giá độ ổn định của vi nang alginat – tinh bột sau thời gian bảo quản 2 tháng 15

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.3.1 Phương pháp tiệt khuẩn 15

2.3.2 Phương pháp nhân giống 15

2.3.3 Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào 16

2.3.4 Phương pháp tạo hạt vi nang chứa Lactobacillus acidophilus 16

2.3.5 Phương pháp đông khô 17

2.3.6 Phương pháp xác định hàm ẩm 17

2.3.7 Phương pháp pha loãng liên tục để xác định số lượng VSV [1] 17

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19

3.1 Nghiên cứu gia tăng số lượng sống sót của vi sinh vật trong vi nang alginat phối hợp tinh bột chứa L acidophilus 19

3.1.1 Khảo sát số lượng VSV trong nang alginat và alginat – tinh bột sau khi ủ trong dung dịch MRS và cao nấm men 2% 19

3.1.2 Khảo sát số lượng VSV trong vi nang alginat và alginat – tinh bột sau khi đông khô 24

3.2 Đánh giá độ ổn định của vi nang alginat phối hợp tinh bột sau thời gian bảo quản 2 tháng……… 28

3.2.1 So sánh số lượng vi sinh vật sống sót trong vi nang alginat – tinh bột trong các mẫu 28

3.2.2 Theo dõi hàm ẩm của mẫu vi nang alginat – tinh bột sau thời gian bảo quản 2 tháng 30

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32

I KẾT LUẬN 32

II KIẾN NGHỊ 32

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỨ VIẾT TẮT

ATCC (American Type Culture Collection) : Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ Alg : Alginat

LAB (Lactic acid bacterium) : Vi khuẩn lactic

MT

TB

: Môi trường : Tinh bột

WHO (World health organization) : Tổ chức y tế thế giới

DANH MỤC CÁC BẢNG

STT Tên bảng Trang

3

Bảng 3.1 Số lượng vi sinh vật trong vi nang alginat và vi

nang alginat – tinh bột trước và sau khi ủ trong MRS (cfu/g) 21

4

Bảng 3.2 Số lượng vi sinh vật trong vi nang alginat và vi

nang alginat – tinh bột trước và sau khi ủ trong cao nấm men

2% (cfu/g)

22

5

Bảng 3.3 Số lượng vi sinh vật sống sót trong hạt Alg và hạt

Alg-TB ở các điều kiện khác nhau sau đông khô (cfu/g) 25

6

Bảng 3.4 Số lượng vi sinh vật sống sót trong vi nang alginat

– tinh bột sau thời gian bảo quản (2 tháng) ở 4oC (cfu/g) 29

7

Bảng 3.5 Hàm ẩm của vi nang alginat – tinh bột sau thời

Hình 3.1 (1)-(2) Hình ảnh khuẩn lạc trên đĩa petri của

Lactobacillus acidophilus trong vi nang alginat – tinh bột

(3)-(4) Hình ảnh khuẩn lạc trên đĩa petri của Lactobacillus

acidophilus trong vi nang alginat

20

4

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn số lượng vi sinh vật trong hạt Alg

và hạt Alg – TB sau khi ủ trong MRS và cao nấm men 2%

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn hàm ẩm của các mẫu trước và sau

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vi khuẩn probiotic được biết đến là một nhóm vi sinh vật mang lại nhiều lợi ích cho con người như: ngăn ngừa nhiễm khuẩn đường ruột, cải thiện khả năng dung nạp lactose, tăng cường miễn dịch [20]… Tuy nhiên, các vi sinh vật này dễ bị ảnh hưởng bởi các điều kiện môi trường như: pH, nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm… Khi sử dụng theo đường uống, pH acid, enzyme tiêu hóa, acid mật… là các yếu tố làm giảm số lượng sống sót, ngăn cản việc thiết lập cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột Ngoài ra, các thông số liên quan trong quá trình sản xuất cũng ảnh hưởng đến khả năng sống sót của vi khuẩn probiotic [34] Do đó, để đảm bảo số lượng vi sinh vật trong chế phẩm

và đem lại tác dụng mong muốn, cần tạo ra những nguyên liệu có khả năng cung cấp lượng vi sinh vật phù hợp và có thể chất thích hợp Nhiều nghiên cứu được tiến hành nhằm tìm ra những biện pháp làm tăng khả năng chống chịu của vi khuẩn trước điều kiện bất lợi trong sản xuất, bảo quản và sử dụng Một trong những phương pháp phổ biến để bảo quản chế phẩm sinh học là đông khô Phương pháp đông khô và phương pháp vi nang hóa được ứng dụng rộng rãi Đã có nhiều nghiên cứu về việc sử dụng tinh bột làm tá dược bảo vệ để tăng khả năng chống chịu của vi sinh vật và cải thiện thể chất của nguyên liệu probiotic sau đông khô ở dạng vi nang Tinh bột phối hợp Alginat giúp bảo vệ vi sinh vật sau đông khô và tăng tỉ lệ sống sót của vi sinh vật cũng là một hướng nghiên cứu đáng chú ý

Chính vì vậy, đề tài “Nghiên cứu nâng cao tỉ lệ sống sót của Lactobacillus acidophilus trong vi nang alginat phối hợp tinh bột” được thực hiện với các mục tiêu

cụ thể sau:

1 Nghiên cứu gia tăng số lượng sống sót của vi sinh vật trong vi nang alginat

phối hợp tinh bột so với vi nang alginat chứa L acidophilus

2 Đánh giá độ ổn định của vi nang alginat – tinh bột sau thời gian bảo quản 2

tháng

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ PROBIOTIC

1.1.1 Khái niệm về probiotic

Probiotic là thuật ngữ bắt đầu từ tiếng Hy Lạp, từ pro và biota, có nghĩa là

“dành cho sự sống”, dùng để chỉ những vi khuẩn sống có thể cạnh tranh với các tác nhân gây bệnh và giúp cải thiện hệ cân bằng hệ vi sinh vật đường tiêu hóa [27] Theo tổ chức y tế thế giới WHO: “Probiotic là các vi sinh vật sống khi đưa 1 lượng cần thiết vào cơ thể đem lại hiệu quả có lợi cho cơ thể” [41]

1.1.2 Vai trò của probiotic

Kể từ những năm 1990, các nghiên cứu lâm sàng đã chứng minh rằng liệu pháp probiotic có thể giúp điều trị một số căn bệnh tiêu hóa, làm chậm sự phát triển của bệnh dị ứng ở trẻ em, điều trị và ngăn ngừa nhiễm trùng âm đạo và tiết niệu ở phụ nữ…

Một số tác dụng của probiotic:

- Cải thiện chức năng miễn dịch [30] [32]

- Ngăn ngừa các vi khuẩn gây bệnh, lập lại thế cân bằng vi khuẩn đường ruột [30]

- Cải thiện tình trạng không dung nạp lactose [45]

- Giảm cholesterol huyết thanh: Những nghiên cứu trên động vật đã chứng minh

tính hiệu quả của một số probiotic trong việc giảm lượng cholesterol huyết thanh Một số thử nghiệm trên người cũng đã cho thấy sữa lên men với LAB làm giảm mức cholesterol [39]

- Huyết áp: Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc tiêu thụ sữa chua lên men với

các chủng LAB khác nhau có thể dẫn đến giảm nhẹ huyết áp, điều này có thể giải thích do peptid tương tự yếu tố ức chế ACE sinh ra trong quá trình lên men [39]

- Tổng hợp vitamin nhóm B: Một số tác giả cho rằng thành phần vitamin B trong

các chế phẩm sữa lên men được sinh ra bởi vi sinh vật sinh acid lactic [37]

1.1.3 Cơ chế tác dụng của probiotic

- Probiotic kích thích sản xuất acid lactic làm giảm độ pH trong ruột, giúp sản xuất các lợi khuẩn cho đường tiêu hóa [37]

- Probiotic có thể cải thiện chức năng miễn dịch bằng cách kích thích tăng số lượng tế bào sản xuất IgA, tăng tỷ lệ tế bào lympho T [30] [32]

- Probiotic bảo vệ cơ thể, chống lại vi khuẩn gây bệnh bằng cách cạnh tranh chất dinh dưỡng và năng lượng Ngoài ra, trong quá trình trao đổi chất probiotic tạo ra các sản phẩm có tính kháng khuẩn như acid hữu cơ (acid lactic và acid acetic), hydroperoxid, ethanol, diacetyl, acetaldehyde, CO2, reuterin, reutericyclin và bacteriocin…[30]

- Vi khuẩn lactic tích cực chuyển đổi lactose thành acid lactic Vì vậy, khi sử dụng các chế phẩm probiotic sẽ cải thiện được tình trạng không dung nạp lactose [45]

1.1.4 Các chủng probiotic phổ biến

Hiện nay, các chủng vi khuẩn được sử dụng với vai trò là các probiotic chủ

yếu thuộc chi Lactobacillus và Bifidobacterium, ngoài ra Enterococcus và

Streptococus cũng được sử dụng nhưng ít hơn Những vi khuẩn này thường cư trú

trong ruột

Một số chủng tiêu biểu bao gồm: L acidophilus, L gasseri, L rhamnosus, B longum, B bifidum Bên cạnh những vi khuẩn còn có nấm men Saccharomyces boulardii cũng được xem là probiotic

1.1.5 Các thế hệ probiotic

Probiotic có trong các sản phẩm lên men tự nhiên: sữa chua, dưa chua, phô mai, kim chi… được dùng có lợi về mặt dinh dưỡng, nhưng chưa có tính hỗ trợ trị liệu một cách rõ ràng

Thế hệ 1, probiotic không bao (non-coated): vi khuẩn được phân lập và tăng

số lượng để sử dụng, nhưng vẫn là vi khuẩn không bao nên probiotic không thể sống

sót khi qua dạ dày và hiệu quả không được như mong muốn Các dòng sản phẩm như

Antibio, Biolac, Bio-Acimin, Bio-Baby…

Thế hệ 2, dạng bao tan trong ruột (enteric-coated): vi khuẩn chứa trong nang

có lớp bảo vệ chỉ tan trong ruột, hầu hết probiotic được xử lí với một polymer acrylic acid Tác nhân bảo vệ này chỉ được cho phép sử dụng trong dược phẩm, không thích hợp cho thực phẩm bổ sung probiotic vì có thể gây tác dụng phụ [31]

Ví dụ: Primadophilus, Gr-8 Dophilus,…

Thế hệ 3, dạng bao vi nang (micro-encapsulated): giúp vi khuẩn ổn định trong quá trình bảo quản và chống chọi với môi trường dạ dày tốt hơn, nhưng lớp bao không hòa tan hoàn toàn trong đường ruột, đặc biệt với những người có hệ ruột ngắn (trẻ em) hoặc những người ăn nhiều chất béo dẫn đến vi nang có xu hướng đi qua ruột và thải ra ngoài theo phân mà không hoặc tạo rất ít tác dụng có lợi Ví dụ: Lactomin

Thế hệ 4, bao kép: probiotic được bao 2 lớp, hiệu quả cao và khắc phục được nhược điểm phóng thích chậm ở ruột như cách bao của các thế hệ cũ Lớp bao polysaccharid giúp bảo đảm cho vi sinh vật sống tốt trong quá trình sản xuất và bảo quản, lớp bao protein có đặc tính đông vón trong môi trường acid giúp chống được tác động khi qua dịch dạ dày và muối mật để đến ruột Tại ruột, nhờ lớp protein có khả năng phân tán tốt trong pH trung tính hoặc hơi kiềm ở ruột, probiotic sẽ phóng thích tốt nhờ đó sản sinh nhanh chóng để phát huy tối đa tác dụng [31]

Ví dụ: Kidlac, Lacclean Gold, Chewable 7.1, Yamyam

 Sản phẩm nghiên cứu thuộc thế hệ thứ 3 – dạng bao vi nang

1.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ Lactobacillus acidophilus

1.2.1 Đặc điểm hình thái

Lactobacillus acidophilus thuộc họ Lactobacillaceae, chi Lactobacillus, nhóm

vi khuẩn lactic (LAB) và tồn tại trong đường tiêu hóa, âm đạo của người và động vật,

nơi mà môi trường sống khá có tính axit, pH khoảng 5-6, thời gian 24-36 giờ [3] Cấu trúc hình thái của Lactobacillus acidophilus là trực khuẩn hình que, Gram dương,

kích thước thường là 0,6-0,9 × 1,5-6 𝜇𝑚, mọc đơn hoặc mọc đôi tạo thành chuỗi

ngắn, không sinh bào tử, không di động, kị khí không bắt buộc, phản ứng catalase âm tính Nhiệt độ phát triển tối ưu 37oC [16]

Điểm hạn chế của Lactobacillus acidophilus: Khả năng sống sót của L acidophilus phụ thuộc vào nhiều yếu tố như pH, sự acid hóa trong sản phẩm lên men,

sản phẩm hydroperoxid, nồng độ oxy hòa tan (khuếch tán từ bao bì, trong môi trường nuôi cấy, bảo quản), nhiệt độ bảo quản, độ ổn định của dạng khô hoặc đông khô [38] [36], trong đó, nồng độ oxy hòa tan có vai trò đáng kể trong việc hạn chế khả năng

sống sót của L acidophilus Do đó, sau một thời gian bảo quản, số lượng L acidophilus sống sót sẽ bị giảm đáng kể [15]

Hình 1.1 Hình ảnh vi khuẩn Lactobacillus acidophilus 1.2.2 Tác dụng

Cũng là một loại probiotic, L acidophilus có những tác dụng tương tự của

probiotic như:

- Cạnh tranh vị trí, làm giảm số lượng vi sinh vật hoặc nấm gây hại ở ruột non,

có khả năng sinh lactase - một enzyme quan trọng trong quá trình chuyển hóa sữa Tạo môi trường acid là môi trường thuận lợi cho hệ lên men đường ruột và đồng thời

ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh Gram âm [16]

- Tổng hợp các vitamin, ngoài ra còn có khả năng sản xuất acid lactic và các chất diệt khuẩn như Lactocidin, Bacteriocin

- Điều trị các bệnh đường tiêu hóa (táo bón, tiêu chảy) [16]

- Chủng L acidophilus LA-5 có tác dụng lên hệ miễn dịch, làm lượng cytokine

tăng lên, tăng hoạt động thực bào và sản xuất kháng thể [20]

- Giảm sinh tổng hợp cholesterol [16]

- Ức chế các vi khuẩn đường ruột chuyển đổi tiền chất gây ung thư thành chất gây ung thư [16]

1.3 PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG KHÔ

1.3.1 Khái niệm đông khô

Đông khô là quá trình làm khô vật liệu ở nhiệt độ thấp, dưới các điều kiện cho phép, để loại trừ nước bằng cách thăng hoa, thay đổi trạng thái nước từ thể rắn sang thể hơi mà không qua thể lỏng [2] [19]

Quá trình đông khô thường chia thành ba giai đoạn: giai đoạn lạnh đông, giai đoạn thăng hoa, giai đoạn bay hơi ẩm liên kết còn lại

- Giai đoạn lạnh đông: Vật tự lạnh đông ngay trong buồng sấy hoặc được làm lạnh đông riêng bên ngoài buồng sấy nhằm chuyển toàn bộ ẩm từ trạng thái lỏng sang trạng thái rắn, đồng thời làm giảm nhiệt độ xuống dưới nhiệt độ điểm ba của ẩm

- Giai đoạn thăng hoa: Vật đã lạnh đông được đặt trong buồng sấy, đồng thời tiến hành hút chân không Chế độ làm việc trong buồng sấy phải ở chế độ thăng hoa,

áp suất và nhiệt độ phải thấp hơn điểm ba Ẩm trong vật chuyển từ trạng thái rắn sang trạng thái hơi mà không qua trạng thái lỏng

- Giai đoạn bay hơi ẩm liên kết còn lại: Ở giai đoạn này, nhiệt độ của vật tăng nhanh, ẩm trong vật là ẩm liên kết ở trạng thái lỏng Nhiệt độ môi chất trong buồng

sấy lúc này cũng cao hơn nhiệt độ ở giai đoạn thăng hoa

1.3.2 Ưu nhược điểm của đông khô

 Ưu điểm

Do quá trình sấy được thực hiện ở nhiệt độ thấp, nước chuyển trực tiếp từ dạng rắn sang dạng hơi nên đông khô có rất nhiều ưu điểm so với các phương pháp sấy

khác [2] [19] như:

- Giữ nguyên màu sắc, cấu trúc, hương vị

- Giữ được hoạt tính sinh học

- Bảo vệ nguyên vẹn các vitamin như lúc còn tươi

- Không làm biến chất albumin

- Giữ nguyên được thể tích ban đầu của vật

 Nhược điểm

- Giá thành thiết bị cao

- Vận hành phức tạp, đòi hỏi người thao tác phải có trình độ kĩ thuật cao

- Tiêu hao điện năng lớn làm giá thành sản phẩm tăng cao

 Do những ưu nhược điểm trên nên đông khô chỉ được áp dụng khi yêu cầu sản phẩm phải có chất lượng cao [24]

1.3.3 Một số tá được dùng bảo vệ trong đông khô

Đông khô là một trong những phương pháp phổ biến nhất để sản xuất lượng lớn vi sinh vật với nồng độ cao [12] Tuy nhiên, trong quá trình này, vi khuẩn vẫn gặp phải nhiều điều kiện bất lợi, đặc biệt là trong giai đoạn tiền đông Một số nghiên cứu cho rằng các biến đổi sinh học xảy ra trong quá trình chuyển nước thành băng là nguyên nhân chính gây tổn thương cho tế bào Các tinh thể nước đá lớn hình thành bên ngoài tế bào gây ra một áp lực thẩm thấu lớn do làm tăng nồng độ chất tan bên ngoài tế bào làm tế bào bị mất nước, giảm khối lượng dẫn đến một số tình trạng như thay đổi cấu trúc màng tế bào, mất hoặc hợp nhất lớp màng kép hay phá hủy các cơ quan trong tế bào Tiếp theo là sự hình thành các tinh thể nước đá bên trong tế bào

Cơ chế chính xác gây tác hại từ băng trong tế bào vẫn chưa rõ ràng, nhưng có thể do sự phá hủy vật lý của màng tế bào, sự hình thành bong bóng khí trong tế bào

và phá vỡ bào quan [11] Một số nghiên cứu khác lại cho rằng nước kết tinh và nhiệt

độ thấp làm biến tính protein và tổn thương màng tế bào vi khuẩn, làm cho vi khuẩn giảm khả năng tồn tại, mất khả năng sinh sản [23] Để ngăn chặn hoặc giảm thiểu các tác dụng bất lợi này, nhiều chất đã được sử dụng như tá dược bảo vệ trong quá trình đông khô [12]

Các chất bảo vệ hay tá dược đông khô là các chất được thêm vào trong thành phần nguyên liệu đem đông khô nhằm bảo vệ tế bào trong quá trình đông khô và đảm bảo sức chịu đựng của VSV trong quá trình làm khô [23]

Tá dược thường được sử dụng là sữa gầy, trehalose, glycerol, betain, adonotol, glucose, lactose, amino acid (arginine, acid glutamic), peptid, protein, dịch chiết sinh học tự nhiên và polymer như dextran, polyethylene glycol, alginate [10] [21] [28]

1.4 PHƯƠNG PHÁP VI NANG HÓA

Có rất nhiều phương pháp tạo chế phẩm probiotic như tạo dạng bột đông khô, tạo cốm… Các phương pháp này đã và đang được sử dụng phổ biến do đã được nghiên cứu lâu đời nên giá thành rẻ và dễ triển khai trên quy mô công nghiệp, tuy nhiên khả năng sống sót của vi khuẩn lại không cao Vấn đề cải thiện số lượng vi khuẩn sống sót trong quá trình bảo quản và trong những điều kiện bất lợi về môi trường như pH thấp ở dạ dày, các enzyme tiêu hóa là một vấn đề đáng quan tâm Một trong những hướng giải quyết được quan tâm hiện nay là cung cấp cho các VSV một rào cản vật lý để chống lại các điều kiện bất lợi từ môi trường, trong đó phải kể đến công nghệ vi nang hóa [44]

1.4.1 Khái niệm

Vi nang hóa là một trong những phương pháp cố định tế bào được sử dụng rộng rãi hiện nay Phương pháp sử dụng các chất tạo màng (gel) là các polymer có nguồn gốc tự nhiên như gelatin, alginat, chitosan, cellulose… hoặc có nguồn gốc nhân tạo như polyamid, polystyren, polyacrylat, polyacrylamid, polyester, polyvinyl pyrrolidon (PVP), polyethylene glycol (PEG)…để bẫy, nhốt và bao gói các tế bào,

cơ thể vi sinh vật trong các nang nhỏ [9] [5]

1.4.2 Đặc điểm

Vi nang hóa giúp ngăn cách nguyên liệu trong lõi với môi trường cho tới khi chúng được giải phóng, vì thế cải thiện khả năng ổn định, kéo dài tuổi thọ của nguyên liệu trong lõi và giải phóng ổn định có kiểm soát Vi nang có thể có kích thước từ dưới µm đến vài mm và có thể có các hình dạng khác nhau Vi nang là bức tường chắn bán thấm, hình cầu và mỏng, giúp tế bào vi khuẩn được giữ lại trong vi nang, chất dinh dưỡng và chất chuyển hóa có thể phân tán qua màng bán thấm dễ dàng

Màng vi nang cung cấp một rào chắn để bảo vệ tế bào và làm giảm thiểu sự nhiễm khuẩn Lõi nguyên liệu bao gói được giải phóng theo nhiều cơ chế như: đứt gãy màng chắn, hòa tan màng chắn, tan chảy màng chắn và khuếch tán qua màng [44]

1.4.3 Phương pháp vi nang hóa bằng tách pha đông tụ

1.4.3.1 Nguyên tắc

Tách pha nhờ sự thay đổi nhiệt độ, thay đổi pH, sự hóa muối hoặc khi thêm một dung môi thứ hai vào hệ vi nang Tác động vào dung dịch keo trong một dung môi thích hợp nhằm thay đổi độ tan của nó, kết quả là một lượng đáng kể keo được tách ra thành pha mới Như vậy hệ trở thành hai pha, một pha có nồng độ cao chất keo được tách ra dưới dạng giọt nhỏ được gọi là giọt đông tụ Sau đó, các giọt đông

tụ dần kết dính lại với nhau hoặc hấp phụ trên bề mặt chất cần bao gói tạo thành lớp màng bao

1.4.3.2 Nguyên liệu Alginat

a Cấu tạo, nguồn gốc

Alginat là tên gọi chung cho các muối của acid alginic, tồn tại dưới dạng anion Acid aginic là một heteropolymer saccharid mạch thẳng, cấu tạo từ hai gốc uronic là acid 𝛼 − 𝐿 − 𝑔𝑙𝑢𝑟𝑜𝑛𝑖𝑐 và acid 𝛽 − 𝐷 − 𝑚𝑎𝑛𝑛𝑢𝑟𝑜𝑛𝑖𝑐 nối với nhau bằng liên kết 1-4-glucosid

Alginat được chiết xuất từ rong biển nâu, Alginat được khai thác rộng rãi trong các ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm nhờ khả năng bao gói các chất đại phân tử, tế bào [30]

b Tính chất

Hai tính chất quan trọng của alginat là độ nhớt dung dịch và khả năng tạo gel [29]

Độ nhớt: Natri alginat tan trong nước tạo dung dịch có độ nhớt dao động trong

khoảng từ 10-3500 cps Độ nhớt của dung dịch alginat phụ thuộc vào số lượng nhánh của phân tử alginat Ngoài ra, độ nhớt của dung dịch còn thay đổi tùy theo nồng độ, nhiệt độ, pH và sự có mặt của ion kim loại

Khả năng tạo gel: Dung dịch alginat có khả năng tạo gel với các cation kim

loại hóa trị II, III như Ca2+, Ba2+, Sr2+, sự tạo gel được giải thích theo mô hình vỉ trứng Bình thường trong dung dịch alginat tồn tại block M và block G tương ứng là các dải hẹp và dải gấp khúc Khi có mặt ion kim loại đa hóa trị ở nồng độ thích hợp thì sự tạo gel xảy ra Các phân tử alginat sắp xếp lại song song nhau, các phần gấp khúc tạo thành khoảng không gian giống như chỗ đặt trứng Các ion Ca2+ khớp vào các khoảng trống này tạo nên mạng lưới không gian ba chiều Với cấu trúc gel này, khi sử dụng làm màng bao, chúng có vai trò như một tấm chắn chống lại những yếu

tố bất lợi của môi trường và cho phép giải phóng vi sinh vật được bao theo hướng có kiểm soát [29]

c Ưu điểm

Alginat không độc, tạo gel dễ dàng với Calci clorid, gel có độ ổn định cao Vi khuẩn sống không bị ảnh hưởng trong suốt quá trình vi nang hóa Alginat có độ ổn

định cao, độ xốp cao và có khả năng chống chịu các muối và chất tạo phức

Hình 1.2 (a1-3) hình ảnh chụp CT cắt lớp tia X và (b1-3) hình ảnh kính hiển vi

điện tử quét của hạt alginat đông khô ở các nồng độ tá dược độn khác nhau

1.4.3.3 Tinh Bột

a Khái niệm, cấu tạo

Tinh bột là hợp chất hữu cơ rất phổ biến, được phát triển khi người Ai Cập sử dụng nó như chất kết dính làm từ lúa mì Các loại thực phẩm giàu tinh bột có nguồn gốc từ hạt, rễ, củ Từ những năm 1900 tinh bột đã được sử dụng rộng rãi, nguyên liệu

để sản xuất chất ngọt, ethanol, tinh bột sáp-ngô, tinh bột biến tính, acid hữu cơ, acid amin, polyol với nhiều tiện ích

Tinh bột là một polysaccharide được cấu tạo từ 2 polysaccharid là Amylose

và Amylopectin Cả hai cấu tử này đều được cấu tạo từ D glucose bằng liên kết 1,4-glucosid và liên kết 𝛼-1,6-glucosid Tỉ lệ amylose/amylopectin trong đa số tinh bột là 1/4 [7]

𝛼-Amilose có khối lượng phân tử 20000-30000 đvC Mạch thẳng, không phân nhánh, tạo bởi 2 𝛼-D-glucose liên kết với nhau bằng liên kết 𝛼-1,4-glucosid, màu xanh đặc trưng

Amilopectin có khối lượng phân tử 200000-1000000 ĐvC Mạch thẳng, phân nhánh Liên kết trên mạch thẳng là liên kết 𝛼-1,4-glucosid, còn liên kết trên mạch nhánh là liên kết 𝛼-1,6-glucoside

b Tính chất

Trong môi trường acid, tinh bột bị thủy phân thành sản phẩm hòa tan Ở môi trường acid mạnh, sản phẩm thủy phân cuối cùng là glucose Trong môi trường kiềm, tinh bột bị ion hóa từng phần do sự hydrat hóa tốt hơn Tinh bột ở dạng hạt hoặc tinh bột chưa xử lý thì khó bị tấn công bởi những enzyme thủy phân

Khi hòa tan tinh bột vào nước, do sự hấp thụ nước làm hạt tinh bột trương phồng lên, tăng thể tích Hiện tượng này gọi là hiện tượng trương nở của tinh bột Trên 55-70oC, các loại tinh bột trương lên do hấp thụ nước vào các nhóm hydroxyl phân cực, độ nhớt của dung dịch tăng mạnh Kéo dài thời gian xử lí nhiệt có thể gây

nổ vỡ hạt tinh bột, thủy phân từng phần và hòa tan phần nào vào các phần tử cấu thành của tinh bột, kèm theo sự giảm độ nhớt của dung dịch [6]

c Ưu điểm

Tinh bột là một polysaccharid tự nhiên, có mặt trong hầu hết các loại cây xanh

và trong tất cả các loại mô: lá, quả, hạt phấn hoa, rễ, cành và thân cây Tinh bột được tổng hợp trong thời gian phát triển và trưởng thành của các cơ quan lưu trữ, như củ, trái cây và các loại hạt Sau đó, tinh bột tổng hợp được suy thoái trong thời gian này mầm của hạt giống hoặc củ, hoặc trong quá trình chín của quả Trong quá trình chuyển hóa, tinh bột phân hủy tạo ra nguồn Cacbon và năng lượng cho cơ thể sống Tinh bột không độc, không sinh đáp ứng miễn dịch [18]

Tinh bột là tá dược độn phổ biến, giá rẻ và có thể tiêu hóa được

Tinh bột được ứng dụng rộng rãi trong thực phẩm, sản xuất ethanol, polyol…chất ổn định thực phẩm trong sản xuất sữa chua vì vậy tính tương hợp sinh học và độc tính của nó với vi khuẩn đã được thử nghiệm rộng rãi

1.4.4 Tình hình nghiên cứu về vi nang alginat – tinh bột

Vi nang alginat đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu để bảo vệ tế bào, protein, vi khuẩn, các loại thuốc kém bền với dịch vị….[29]

Trong đó, nghiên cứu về hạt vi nang của nisin (một peptid kháng khuẩn) trong alginat, Diamante Maresca và cộng sự (2015) đã cho thấy vi nang tạo bởi hạt alginat

có tính đồng nhất về hình dáng và bề mặt hình thái học [14]

Năm 2013, Martin và cộng sự báo cáo tinh bột giúp nâng cao khả năng sống

sót của Lactobacillus acidophilus trong quá trình đông khô và bảo quản ở 4oC [26]

Năm 2015, nghiên cứu của Mariana de Araujo Etchepare và cộng sự đã chỉ ra

vi nang alginat – tinh bột bảo vệ Lactobacillus acidophilus khi tiếp xúc với dịch tiêu

hóa mô phỏng tốt hơn kể cả ở dạng ẩm hay dạng đông khô [25]

Ở Việt Nam, tác giả Mai Hương (2014) đã báo cáo tinh bột có hiệu quả bảo

vệ L acidophilus trong quá trình vi nang hóa, đông khô và bảo quản [4]

Tác giả của Bùi Thị Lệ Quyên (2015) đã kết luận ở môi trường có pH thấp, các hạt vi nang phối hợp alginat với tinh bột và sữa gầy có khả năng bao gói VSV, giúp tránh tiếp xúc với môi trường khắc nghiệt [6]

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ

2.1.1 Chủng vi sinh vật: Lactobacillus acidophilus ATCC 4356

2.1.2 Hóa chất

Bảng 2.1.Các hóa chất dùng trong nghiên cứu

Tên hóa chất Nguồn gốc Tên hóa chất Nguồn gốc

Natri acetat K2HPO4 MgSO4.7H2O MnSO4.4H2O Nước máy vừa đủ

5,0 g 2,0g 0,2g 0,05g

1000 ml

 Môi trường MRS thạch (MT2)

MT2 = MT1 + thạch (25 g thạch/1000 ml môi trường)