Khảo sát khả năng sống sót của Lactobacillus sporogenes trong quá trình tạo nguyên liệu đông khô

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI MAI THỊ HƯỜNG MÃ SINH VIÊN: 1101250 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SỐNG SÓT CỦA Lactobacillus sporogenes TRONG QUÁ TRÌNH TẠO NGUYÊN LIỆU ĐÔNG KHÔ KHÓA LUẬN TỐ

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SỐNG SÓT CỦA

Lactobacillus sporogenes TRONG QUÁ

TRÌNH TẠO NGUYÊN LIỆU ĐÔNG KHÔ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

MAI THỊ HƯỜNG

MÃ SINH VIÊN: 1101250

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SỐNG SÓT CỦA

Lactobacillus sporogenes TRONG QUÁ

TRÌNH TẠO NGUYÊN LIỆU ĐÔNG KHÔ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Với tất cả sự kính trọng, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới

ThS Kiều Thị Hồng, người đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện

thuận lợi để em có thể hoàn thành khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn TS Đàm Thanh Xuân và DS Tô Ngọc Sắc đã

đóng góp nhiều ý kiến quý báu, luôn động viên và tận tình giúp đỡ em thực hiện

đề tài này

Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Công nghiệp Dược đã luôn quan tâm, giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu và làm thực nghiệm tại bộ môn

Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn gia đình, thầy cô, bạn bè, những người luôn bên em động viên, giúp đỡ em vượt qua mọi khó khăn trong học tập và trong cuộc sống

Em xin trân trọng cảm ơn!

Hà nội, ngày 10 tháng 5 năm 2016

Sinh viên

Mai Thị Hường

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ PROBIOTIC……….…2

1.2 Các vi sinh vật thường dùng trong các chế phẩm probiotic 3

1.3 Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trên thế giới và Việt Nam……….… 3

1.4 Lactobacillus sporogenes ……… 5

1.4.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa điều kiện nuôi cấy…….….6

1.4.2 Vai trò của Lactobacillus sporogenes………9

1.4.3 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về L sporogenes…… 10

1.5 Phương pháp đông khô……… 11

1.5.1 Khái niệm……….11

1.5.2 Các giai đoạn của quá trình đông khô……….……… 11

1.5.3 Ưu, nhược điểm của phương pháp đông khô……….… 12

1.5.4 Một số tá dược thường dùng trong đông khô VSV……….12

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……….14

2.1 Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu……….….14

2.1.1 Nguyên vật liệu……… 14

2.1.2 Môi trường sử dụng trong nghiên cứu………15

2.1.3 Thiết bị………16

2.2 Nội dung nghiên cứu………16

2.2.1 Tạo nguyên liệu đông khô chứa Lactobacillus sporogenes… 16

2.2.2 Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng nguyên liệu tạo thành trong quá trình bảo quản……… ……… 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu……… 17

2.3.1 Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng………17

2.3.2 Phương pháp nuôi cấy……….17

2.3.3 Phương pháp xử lý dịch nuôi cấy thu sinh khối…… ……… 18

2.3.4 Phương pháp tạo nguyên liệu đông khô………… ………… 18

2.3.5 Phương pháp nhuộm màu quan sát bào tử (pp Ogietska)….… 18

2.3.6 Phương pháp đo hàm ẩm……….19

2.3.7 Phương pháp nuôi cấy thu bào tử trên môi trường rắn…… ….19

2.3.8 Xác định số lượng vi sinh vật theo pp pha loãng liên tục…… 20

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN……… 22

3.1 Tạo nguyên liệu đông khô chứa Lactobacillus sporogenes… 22

3.2 Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng nguyên liệu tạo thành trong quá trình bảo quản……… ……… ………33

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ……… 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

B subtilis Bacillus subtilis

CFU (Colony – Forming Unit) Số đơn vị khuẩn lạc

CPA Cryoprotectant

FAO (Food and Agriculture Organization) Tổ chức Nông lương thế

giới HMG-CoA 3-hydroxy-3-methylglutaryl–coenzyme A

L sporogenes Lactobacillus sporogenes

WHO (World Health Organization) Tổ chức Y tế thế giới

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

Tên bảng, biểu Trang

Bảng 1.1 So sánh các đặc tính cơ bản của Lactobacillus

sporogenes với các chi Bacillus và Lactobacillus

7

Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng trong đề tài 16

Bảng 3.1 Mật độ vi sinh vật có trong 1ml hỗn dịch bào tử

nuôi cấy trên môi trường MT4

26

Bảng 3.2 Mật độ L sporogenes trong mẫu đông khô với các

thể tích nuôi cấy khác nhau

28

Bảng 3.3 Mật độ L sporogenes trong mẫu đông khô theo

thời gian nuôi cấy

30

Bảng 3.4 Biến thiên mật độ VSV và hàm ẩm của mẫu đông

khô L sporogenes trong quá trình bảo quản

35

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Tên hình vẽ, đồ thị Trang

Hình 1.1 Hình ảnh nhuộm Gram tế bào vi khuẩn L.sporogenes 6

Hình 1.2 Cấu tạo bào tử Lactobacillus sporogenes 8

Hình 3.1 Hình ảnh nhuộm Ogietska của Lactobacillus

sporogenes tại thời điểm 96 giờ

23

Hình 3.2 Hình ảnh nhuộm quan sát bào tử của Lactobacillus

sporogenes sau khi nuôi cấy trong môi trường tạo

bào tử MT4

25

Hình 3.3 Hình ảnh nhuộm quan sát bào tử của Bacillus

subtilis sau khi nuôi cấy trong môi trường tạo bào tử

MT4

25

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc mật độ L.sporogenes

trong mẫu đông khô vào thể tích nuôi cấy

28

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc mật độ L sporogenes

trong mẫu đông khô vào thời gian nuôi cấy

31

Hình 3.6 Hình ảnh khuẩn lạc của L sporogenes pha loãng ở

nồng độ 10-6 sau 2 tuần bảo quản

34

Hình 3.7 Hình ảnh khuẩn lạc của L sporogenes pha loãng ở

nồng độ 10-7 sau 2 tuần bảo quản

34

Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn biến thiên mật độ VSV và hàm ẩm

của mẫu đông khô L sporogenes trong quá trình bảo

quản

35

ĐẶT VẤN ĐỀ

Probiotics là các lợi khuẩn có nhiều giá trị thiết thực đối với sức khỏe con người như: ức chế các vi sinh vật gây bệnh trong đường tiêu hóa, cải thiện khả năng dung nạp lactose, tăng cường miễn dịch, giảm cholesterol… Trong thời gian gần đây, các sản phẩm y tế chăm sóc sức khỏe có nguồn gốc từ probiotic đã có sự tăng mạnh mẽ về số lượng

Lactobacillus sporogenes là một chủng vi khuẩn có nhiều đặc tính nổi trội để

có thể sử dụng làm nguyên liệu cho các chế phẩm probiotic: có khả năng sinh bào tử giúp chống chịu tốt với các điều kiện bất lợi của môi trường, do đó làm tăng tỉ lệ sống sót và tăng hiệu quả điều trị; có khả năng lên men đồng hình tạo acid L (+) lactic mà cơ thể có thể chuyển hóa hoàn toàn được [8]

Hiện nay đông khô là phương pháp rất tốt để bào chế các chế phẩm có dược chất kém bền với nhiệt độ, dễ bị phân hủy hoặc các chất mang bản chất sinh học Các VSV sau đông khô có khả năng sống sót cao trong quá trình bảo quản, đặc

biệt là các vi sinh vật probiotics như: Lactobacillus và Bifidobacterium

Xuất phát từ các lí do trên chúng tôi thực hiện đề tài : “Khảo sát khả năng

sống sót của Lactobacillus sporogenes trong quá trình tạo nguyên liệu đông

khô ” Nhằm 2 mục tiêu sau:

1 Tạo nguyên liệu đông khô chứa Lactobacillus sporogenes

2 Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng nguyên liệu tạo thành trong quá trình bảo quản

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về probiotics

Vào đầu thế kỷ 19, những vai trò tích cực của 1 số vi khuẩn lần đầu tiên được quan sát bởi nhà khoa học người Nga Metchnikoff (1845-1916) Ông nhận thấy rằng: Những người nông dân Bungari thường xuyên sử dụng sữa lên men lactic acid thường sống mạnh khỏe và có tuổi thọ cao Cùng thời đó một giáo sư

ở viện Pasteur – Pari cũng nhận thấy: 1 số vi khuẩn như Clostria có sẵn trong đường ruột trong quá trình phân giải protein sinh ra 1 số chất gây nhiễm độc ruột (như phenol, indols và amoniac ), khi sử dụng sữa lên men với vi khuẩn lactic acid thì đường ruột không còn bị nhiễm độc nữa Giáo sư cho rằng: do quá trình lên men lactose tạo độ pH thấp và vì thế mà ức chế sự phát triển của các vi khuẩn phân giải protein

Từ những khám phá ban đầu đó, giới khoa học bắt đầu quan tâm nghiên cứu nhóm vi khuẩn có lợi này Thuật ngữ “Probiotic” được giới thiệu lần đầu tiên vào năm 1953 bởi Kollath Theo ông, Probiotic là “các yếu tố có nguồn gốc

từ vi khuẩn, kích thích sự phát triển của các vi khuẩn khác” [16] Năm 1989, Fuller đã đưa ra một định nghĩa khác về Probiotic: “Probiotic là thực phẩm bổ sung các VSV sống đem lại các tác động có lợi cho vật chủ bằng cách cải thiện cân bằng hệ vi sinh đường ruột” Năm 1992, Havenaar đã mở rộng định nghĩa

về probiotic: “Probiotic là các vi khuẩn đơn lẻ hay hỗn hợp các vi sinh vật sống khi được dùng cho người hoặc động vật sẽ có ảnh hưởng có lợi cho sinh vật chủ bằng cách cải thiện hệ vi khuẩn đường ruột” [40]

Năm 2002, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và tổ chức Nông lương thế giới (FAO) đã đưa ra định nghĩa ngắn gọn và hoàn chỉnh nhất về Probiotics ở thời điểm hiện tại như sau: “Probiotics là những vi sinh vật sống mà khi đưa vào cơ

thể với một lượng đủ lớn sẽ đem lại tác động có lợi cho sức khỏe vật chủ” [33], [39] Tuy nhiên, không phải tất cả những vi sinh vật sống có lợi nào cũng là probiotics Theo đánh giá của tổ chức FAO và WHO, tiêu chuẩn quan trọng nhất

để chọn chủng VSV probiotics sử dụng dưới dạng thực phẩm và dược phẩm là chủng khuẩn đó phải có khả năng sống sót qua hệ tiêu hóa và phải có khả năng phát triển trong ruột Do trong quá trình sử dụng vi khuẩn probiotics phải đối mặt với nhiều điều kiện bất lợi của đường tiêu hóa nên để đem lại tác dụng bất

cứ sản phẩm chứa probiotics nào cũng phải chứa ít nhất 106 cfu/ml tế bào vi sinh vật sống cho đến ngày hết hạn sử dụng vì liều điều trị tối thiểu mỗi ngày được

đề xuất là từ 108

÷ 109 tế bào [19], [37]

1.2 Các vi sinh vật thường dùng trong các chế phẩm probiotic

Bốn nhóm vi sinh vật thường được sử dụng trong chế phẩm probiotic là:

Lactobacillus, Bifidobacterium, Saccharomyces, Enterococcus Trong đó, Lactobacillus và Bifidobacterium là hai loại vi khuẩn được sử dụng nhiều nhất

1.3 Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotics trên thế giới và Việt Nam

Việc sử dụng thực phẩm có chứa các vi sinh vật có lợi cho cơ thể đã được biết đến từ lâu, tuy nhiên việc nghiên cứu hệ vi sinh vật đường ruột và sử dụng probiotics mới thực sự phát triển từ những năm 80 của thế kỉ 20 Năm 1998, Apajalahti và cộng sự đã thực hiện những nghiên cứu về đặc điểm phân loại và quần thể vi sinh vật đường ruột ở người và động vật [11]

Netherwood và cộng sự (1999) [35]; Gong và cộng sự (2002) [21]; Yoon

và cộng sự (2002) [41] đã sử dụng kỹ thuật gen để nghiên cứu sự thay đổi cấu trúc quần thể và đặc điểm sinh học của hệ vi sinh vật đường ruột ở động vật dưới tác động của probiotics Tuy nhiên, cho đến nay những nhân tố nào góp phần tạo

nên một hệ vi sinh vật cân bằng hoặc làm rối loạn sự cân bằng của hệ vi sinh vật đường ruột cũng chưa được hiểu biết đầy đủ

Probiotics đem lại nhiều tác dụng có lợi cho cơ thể vật chủ, nhưng hiểu biết của con người về cơ chế tác động của probiotics còn rất hạn chế Có một số tác giả cho rằng hiệu quả của probiotics trong việc ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh trong đường tiêu hóa của động vật có ý nghĩa rất quan trọng Sự kìm hãm được thực hiện theo những cách sau: cạnh tranh chất dinh dưỡng, sản xuất độc tố và các sản phẩm trao đổi (các acid béo bay hơi, các chất giống kháng sinh…), cạnh tranh vị trí bám dính ở niêm mạc ruột và kích thích hệ thống miễn dịch ruột [28], [36]

Trong thời gian gần đây đã có sự gia tăng mạnh mẽ về số lượng các sản phẩm y tế chăm sóc sức khỏe có nguồn gốc từ probiotics Probiotics ngày càng được bào chế dưới nhiều dạng chế phẩm khác nhau sử dụng theo đường uống như bột, cốm, viên nang… hay sử dụng trong các sản phẩm cho đường dùng khác như viên đặt, kem bôi da Tuy nhiên, nhiều báo cáo chỉ ra rằng số lượng các

vi khuẩn probiotics trong các chế phẩm này rất nghèo nàn Để cải thiện số lượng

vi khuẩn sống sót trong suốt quá trình bảo quản và trong môi trường có độ pH thấp trong cơ thể, trên thị trường đã có các sản phẩm probiotics được bao tới thế

hệ 1,2,3… [3]

Đa phần các sản phẩm probiotics sử dụng theo đường uống, chúng phải chịu tác dụng của dịch vị, cũng như của acid mật vì thế vi sinh vật bị chết rất nhiều và không đến ruột được hoặc đến ruột với số lượng rất ít không đủ gây tác dụng Việc đảm bảo khả năng sống sót của vi sinh vật probiotics trong sản xuất, bảo quản, lưu hành, và tỉ lệ sống sót cao khi đến ruột không đơn giản; do vậy đã

có nhiều hướng nghiên cứu khác nhau như cải tiến phương pháp đông khô tạo

bột, áp dụng phương pháp lên men 2 bước, phương pháp vi nang hóa, phương pháp sử dụng kết hợp với tá dược bảo vệ [20]

Một số cơ sở có sản xuất nguyên liệu probiotics ở nước ta là công ty trách nhiệm hữu hạn một thành viên Pasteur Đà Lạt, công ty trách nhiệm hữu hạn một thành viên vaccin và sinh phẩm Nha Trang, với một số chế phẩm hay gặp trên thị trường như Enzym biosub, Biosubtyl DL, Viabiovit, Vivac bio, Healthy liver với

chủng vi sinh vật Bacillus subtilis Thị trường chế phẩm probiotics của Việt Nam

hiện nay đã phát triển, không chỉ lớn về số lượng mà còn đa dạng về chủng loại

vi sinh vật, đồng thời giá thành sản phẩm các chế phẩm probiotics đã được hạ nhiều lần

1.4 Lactobacillus sporogenes

Lactobacillus sporogenes được phân lập bởi B.W Hammer tại Phòng thí

nghiệm nông nghiệp Iowa (Mỹ) vào năm 1915 và được biết đến lần đầu tiên

dưới tên gọi Bacillus coagulans do một đợt bùng phát của việc một sản

phẩm đặc biệt của sữa bị đông vón hàng loạt [22] Năm 1932, vi khuẩn này

lại được Horowitz và Wlasowa phân lập và đặt tên là Lactobacillus sporogenes

[30] Đến năm 1957, vi sinh vật này được phân loại lại trong Bergey’s Manual

of Determinative Bacteriology dựa trên các đặc tính sinh hóa và danh pháp

chính xác hiện tại là Bacillus coagulans [14] Do vi khuẩn này có các đặc điểm của cả hai chi Lactobacillus và Bacillus, nên vị trí phân loại của nó giữa hai

họ Lactobacillaceae và Bacillaceae vẫn còn gây nhiều tranh cãi [24] Ngày nay, vi khuẩn này được biết đến với cả hai tên gọi trên, nhưng tên gọi

Lactobacillus sporogenes vẫn được sử dụng nhiều hơn trong các chế phẩm

thương mại xuất hiện trên thị trường Do nguồn gốc của giống vi sinh vật

trong khóa luận, tên gọi Lactobacillus sporogenes sẽ được sử dụng

1.4.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa, điều kiện nuôi cấy

Lactobacillus sporogenes tồn tại trong tự nhiên ở hai dạng: dạng tế bào

sinh dưỡng và dạng bào tử

1.4.1.1.Tế bào sinh dƣỡng

 Đặc điểm hình thái:

 Lactobacillus sporogenes được mô tả là trực khuẩn Gram dương, hình

que, có khả năng di động, có khả năng sinh bào tử [22], [25]

 Tế bào Lactobacillus sporogenes có xu hướng mọc đơn hoặc hiếm khi ở

dạng chuỗi ngắn [22], [25]

Hình 1.1 Hình ảnh nhuộm Gram tế bào vi khuẩn Lactobacillus sporogenes

Lactobacillus sporogenes có các đặc tính chung của cả hai chi Lactobacillus và Bacillus, bảng dưới đây so sánh các đặc tính cơ bản của Lactobacillus sporogenes với hai chi này

Bảng 1.1 So sánh các đặc tính cơ bản của Lactobacillus sporogenes với các chi

nhiệt độ, bức xạ, hóa chất… Lactobacillus sporogenes chuyển từ dạng tế bào

sinh dưỡng sang dạng bào tử, là thể nghỉ của vi khuẩn ở cuối giai đoạn sinh trưởng Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử nảy mầm trở lại và phát triển thành tế bào sinh dưỡng

Bào tử của Lactobacillus sporogenes có hình elip, nằm ở một đầu tế bào

sinh dưỡng, có kích thước 0,9 – 1,2 µm × 1,0 – 1,7 µm [9] Cấu tạo chi tiết của

bào tử Lactobacillus sporogenes được mô tả theo hình sau:

Hình 1.2 Cấu tạo bào tử Lactobacillus sporogenes

Cấu tạo bao gồm: lớp ngoại bào tử (exosporium), màng ngoài (outer coat), màng trong (inner coat), lớp vỏ dưới màng trong (cortex), màng vỏ của vách tế bào mầm (cortical membrane of the germ cell wall), tế bào chất sát nhập vào tế bào mẹ (incorporated mother cell cytoplasma), nguyên sinh chất (core or protoplast), vật chất nhân (nuclear material) [9], [38]

Một số đặc tính của bào tử Lactobacillus sporogenes:

 In vitro

Bào tử Lactobacillus sporogenes bền với nhiệt và chịu được các tác động

bất lợi từ môi trường: chúng vẫn sống ngay cả sau khi xử lý nhiệt ở 100oC trong

20 phút trong dung dịch đệm phosphat pH 7 và có khả năng nảy mầm trở lại kể

cả trong dịch pha loãng của acid HCl (pH 4,6 – 5,6) hay của NaOH (pH 7,6 – 9,6), trong dịch muối (nồng độ 5%, 10%, 20%), dịch acid boric 2,5% và nước cất; bào tử có khả năng chịu được kháng sinh gấp 2 – 8 lần so với tế bào sinh dưỡng [9]

 In vivo

Sau khi được đưa vào cơ thể, Lactobacillus sporogenes xuống đến dạ dày

ở dạng bào tử Dưới tác động của pH thấp và sự co bóp của dạ dày, các lớp màng của bào tử hút nước và trương phồng lên; sự gia tăng hàm lượng nước làm tăng tỉ

lệ trao đổi chất trong bào tử, chồi hình thành và ló ra ngoài lớp màng của bào tử Khoảng thời gian trung bình từ lúc uống đến lúc bào tử nảy chồi trong tá tràng là khoảng 4 – 6 giờ, khoảng 85% vi khuẩn ban đầu xuống được đến ruột, tại tá

tràng, bào tử nảy mầm và phát triển nhanh chóng Bào tử Lactobacillus

sporogenes tồn tại trong ống tiêu hóa khoảng 7 ngày, sau đó được thải trừ ra

ngoài qua phân [9], [23]

1.4.2 Vai trò của Lactobacillus sporogenes

Lactobacillus sporogenes có khả năng ức chế sự phát triển của vi sinh vật

gây bệnh Hiệu quả trong điều trị nhiễm trùng đường ruột cấp tính gây ra bởi

vi khuẩn gây bệnh ở động vật; cho hiệu quả điều trị cao hơn khi phối hợp với vi khuẩn probiotic truyền thống khi điều trị cho con người

Lactobacillus sporogenes còn ngăn ngừa tiêu chảy có nguyên nhân liên quan

đến kháng sinh Việc phối hợp điều trị cho thấy giảm số lượng bệnh nhân tiêu chảy và rút ngắn thời gian tiêu chảy.Cải thiện sức khỏe đường ruột Hiệu quả trong việc giảm co thắt đường ruột, đau bụng và đầy hơi ở bệnh nhân bị hội chứng ruột kích thích.Cải thiện đau bụng, chướng bụng và các triệu chứng đường tiêu hóa

Hơn thế nữa Lactobacillus sporogenes có thể liên kết với cholesterol trong ruột

và ức chế enzym sản xuất cholesterol HMG- CoA reductase, giúp làm giảm tổng lượng cholesterol trong huyết thanh [23]

1.4.3 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về L sporogenes

Lactobacillus sporogenes thể hiện đặc tính của cả hai chi Lactobacillus và Bacillus L sporogenes được phân lập và mô tả lần đầu tiên vào năm 1933 bởi

Horowitz-Wlassowa và Nowotelnow, sau đó được phân loại lại thành Bacillus

sporogenes L sporogenes là vi khuẩn Gram dương, di động, xếp đơn lẻ hoặc

hiếm gặp hơn, tồn tại thành các chuỗi ngắn với độ dài khác nhau Bào tử của L

sporogenes là tế bào hình elip nằm tại một trong các cực của tế bào, có khả năng

chịu nhiệt và các điều kiện môi trường bất lợi, nảy mầm ngay cả trong dung dịch HCl hoặc NaOH loãng [25]

Lactobacillus sporogenes có thể phát triển tối ưu ở nhiệt độ 35-50°C và

pH trong khoảng 5.5 và 6.5 Chúng là những vi khuẩn kị khí tùy tiện (hay hiếu khí không bắt buộc), lên men maltose, mannitol, raffinose, sucrose và trehalose, sinh axit nhưng không sinh khí Những đặc điểm này cho thấy chúng phát triển tốt trong môi trường acid và nhiều báo cáo cho thấy chúng thường là nguyên nhân gây hỏng các sản phẩm từ sữa, rau quả do sản sinh một lượng lớn acid

lactic [25] L sporogenes còn được sản xuất axit lactic và các sản phẩm khác

như: enzyme chịu nhiệt và dung môi hữu cơ có thể được ứng dụng trong sản xuất công nghiệp [41]

Ở Việt Nam, các nghiên cứu về L sporogenes (hay Bacillus coagulans)

còn khá ít hoặc chưa được công bố nhiều Năm 2005, tại trường Đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Trần Hạnh Triết đã tiến hành nghiên cứu đặc điểm

sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Lactobacillus sporogenes [9]

1.5 Phương pháp đông khô

1.5.1 Khái niệm:

Đông khô (sấy thăng hoa) là phương pháp tách ẩm ra khỏi vật liệu bằng cách thăng hoa, nghĩa là ẩm được chuyển thẳng từ pha rắn sang pha hơi mà không qua trạng thái lỏng Muốn vậy trước khi đông khô phải biến ẩm trong vật liệu thành thể rắn, nghĩa là phải tiến hành làm lạnh đông vật liệu Như vậy, đông khô được thực hiện ở môi trường có độ chân không cao và nhiệt độ rất thấp (thường là âm) Chế độ làm việc phải thấp hơn điểm ba của nước Ở áp suất nhất định, nhiệt độ thăng hoa của vật là không đổi, khi áp suất tăng thì nhiệt độ thăng hoa cũng tăng [10], [27], [29]

1.5.2 Các giai đoạn của quá trình đông khô

 Giai đoạn lạnh đông: Vật tự lạnh đông ngay trong buồng sấy hoặc

được làm lạnh đông riêng bên ngoài buồng sấy nhằm chuyển toàn bộ ẩm từ trạng thái lỏng sang trạng thái rắn, đồng thời làm giảm nhiệt độ xuống dưới

nhiệt độ điểm ba của ẩm [10], [27], [29]

 Giai đoạn thăng hoa: Vật đã lạnh đông được đặt trong buồng sấy, đồng

thời tiến hành hút chân không Chế độ làm việc trong buồng sấy phải ở chế độ thăng hoa: áp suất và nhiệt độ phải thấp hơn điểm ba Ẩm trong vật chuyển từ

trạng thái rắn sang trạng thái hơi mà không qua trạng thái lỏng [10], [27], [29]

 Giai đoạn bay hơi ẩm liên kết còn lại: Ở giai đoạn này, nhiệt độ của

vật tăng nhanh, ẩm trong vật là ẩm liên kết ở trạng thái lỏng Quá trình sấy trong giai đoạn này giống như quá trình sấy trong các thiết bị sấy chân không bình thường Nhiệt độ môi chất trong buồng sấy lúc này cũng cao hơn nhiệt độ ở giai đoạn thăng hoa [10], [27], [29]

1.5.3 Ưu, nhược điểm của phương pháp đông khô

 Ưu điểm: Do quá trình sấy được thực hiện ở nhiệt độ thấp, nước chuyển

trực tiếp từ dạng rắn sang dạng hơi nên đông khô có rất nhiều ưu điểm so với các phương pháp sấy khác như: giữ nguyên màu sắc, cấu trúc, hương vị; giữ được hoạt tính sinh học; bảo vệ nguyên vẹn các vitamin như lúc còn tươi, không làm biến chất albumin…; giữ nguyên được thể tích ban đầu của vật sấy nhưng

có cấu trúc xốp nên dễ hấp thụ nước để trở lại trạng thái ban đầu [27]

 Nhược điểm: Giá thành thiết bị cao Vận hành phức tạp, đòi hỏi người

thao tác phải có trình độ kĩ thuật cao Tiêu hao điện năng lớn làm giá thành sản phẩm tăng cao Do những ưu nhược điểm trên nên đông khô chỉ được áp dụng khi yêu cầu sản phẩm phải có chất lượng cao [27]

1.5.4 Một số tá dược thường dùng trong đông khô vi sinh vật

Đông khô là một trong những phương pháp phổ biến nhất để giữ được độ sống sót của vi sinh vật với nồng độ cao [12] Tuy nhiên, trong quá trình này, vi khuẩn vẫn gặp phải nhiều điều kiện bất lợi, đặc biệt là trong giai đoạn tiền đông Một số nghiên cứu cho rằng các biến đổi sinh học xảy ra trong quá trình chuyển nước thành băng là nguyên nhân chính gây tổn thương cho tế bào Các tinh thể nước đá lớn hình thành bên ngoài tế bào gây ra một áp lực thẩm thấu lớn do làm tăng nồng độ chất tan bên ngoài tế bào làm tế bào bị mất nước, giảm khối lượng dẫn đến một số tình trạng như thay đổi cấu trúc màng tế bào, mất hoặc hợp nhất lớp màng kép hay phá hủy các cơ quan trong tế bào Tiếp theo là sự hình thành các tinh thể nước đá bên trong tế bào Cơ chế chính xác gây tác hại từ băng trong

tế bào vẫn chưa rõ ràng, nhưng có thể do sự phá hủy vật lý của màng tế bào, sự hình thành bong bóng khí trong tế bào và phá vỡ bào quan [13] Một số nghiên cứu khác lại cho rằng nước kết tinh và nhiệt độ thấp làm biến tính protein và tổn

thương màng vi khuẩn tế bào vi khuẩn, làm cho vi khuẩn giảm khả năng tồn tại,

độ nhạy cao hơn với không khí và mất khả năng sinh sản [26] Để ngăn chặn hoặc giảm thiểu các tác dụng bất lợi này, nhiều chất đã được sử dụng như tá dược bảo vệ trong quá trình đông khô [12]

Các chất bảo vệ hay tá dược đông khô (Cryoprotectant – CPA) là các chất được thêm vào trong thành phần nguyên liệu đem đông khô nhằm bảo vệ tế bào trong quá trình đông khô và đảm bảo sức chịu đựng của VSV trong quá trình làm khô [26]

Một số tá dược được sử dụng trong đông khô bao gồm: sữa gầy là sữa béo

đã loại bỏ các acid béo, thành phần gồm lactose (chủ yếu), acid amin, các vitamin và khoáng chất; các loại đường như glucose, lactose, dextrin glucose, Các acid amin: arginin, acid glutamic, Peptid, protein, dịch chiết sinh học tự nhiên và polyme

Trong nghiên cứu này tá dược được sử dụng là sữa gầy:

Sữa gầy hay còn gọi là “skim milk” là các sản phẩm sữa mà trong thành phần có chứa không quá 0,5% chất béo Thành phần dinh dưỡng chính trong sữa gầy: 32% - 35,7% protein; 48,4% - 54,1% lactose

Thành phần lactose có trong sữa gầy cũng như một số disaccharid khác có thể thấm qua thành tế bào, sau đó chúng hình thành liên kết hydro giữa đường - protein Các liên kết này giúp duy trì cấu trúc của protein màng khi nước bị loại

đi Protein giúp hình thành trạng thái glass xung quanh và bên trong tế bào tạo ra một môi trường đủ nhớt bên trong và ngoài tế bào giúp ngăn cản sự biến đổi của

tế bào ở mức thấp nhất [15]

Theo một nghiên cứu khác thì protein trong sữa giúp ổn định pH trong quá trình đông khô [26]

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1: Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Nguyên vật liệu:

 Chủng Lactobacillus sporogenes do Bộ môn Công Nghiệp Dược trường

Đại học Dược Hà Nội cung cấp

 Chủng Bacillus subtilis ATCC 6633 do Viện kiểm nghiệm thuốc Trung

ương cấp

Bảng 2.1: Nguyên liệu pha môi trường

Tên hóa chất Nguồn gốc

MnSO4.4H2O Trung Quốc Triamoni citrate Trung Quốc Acetat natri Trung Quốc

Natri clorid Trung Quốc

2.1.2 Môi trường sử dụng trong nghiên cứu

K2HPO4 MgSO4.7H2O MnSO4.4H2O Nước máy vừa đủ

0.2 g 0.02 g 0.005 g

100 ml

 Môi trường MRS thạch (MT 2)

MT 2 = MT 1 + Thạch agar (2 g/100 mL môi trường)

 Môi trường canh thang (MT3)

Pepton 1.0

Cao thịt 0.5 g

Natri clorid 0.5 g

Nước máy vừa đủ 100 ml

 Môi trường sữa gầy:

Sữa gầy 10.0 g Nước cất vừa đủ 100 ml

 Môi trường sản xuất bào tử (MT4) (Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương)

2.1.3 Thiết bị

Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng trong đề tài

Tên thiết bị Nguồn gốc

Cân phân tích Đức ( Satorious) Cân kỹ thuật Đức ( Satorious)

Nồi hấp tiệt khuẩn ALP- Nhật

Tủ cấy vô trùng Trung Quốc

- Các dụng cụ sử dụng: Ống nghiệm, bình nón, đĩa petri, đèn cồn…

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Tạo nguyên liệu đông khô chứa Lactobacillus sporogenes

- Khảo sát ảnh hưởng của lượng dịch nuôi cấy ban đầu đến số lượng L

sporogenes trong nguyên liệu đông khô

- Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến số lượng L sporogenes trong

nguyên liệu đông khô

2.2.2 Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng nguyên liệu tạo thành trong quá trình bảo quản

- Đánh giá số lượng vi sinh vật và hàm ẩm của các mẫu nguyên liệu trong thời gian bảo quản

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng

Pha môi trường MRS thạch (MT2) theo công thức ở mục 2.1.2, đun nóng làm đồng nhất các thành phần trong môi trường, phân phối vào các ống nghiệm, mỗi ống 7 ml, nút kín, hấp tiệt trùng ở 115oC trong 20 phút Đặt các ống nghiệm nằm nghiêng, môi trường không lên quá 2/3 chiều cao của ống, để yên cho đến khi mặt thạch đông lại Dùng que cấy cấy giống từ khuẩn lạc vi sinh vật sang ống thạch nghiêng, đặt nuôi trong tủ ấm ở 37oC trong 48 giờ [1], [6]

Định kỳ cấy truyền giống sang môi trường thạch nghiêng mới sau mỗi 1 –

2 tháng nhằm giữ được hoạt tính vi khuẩn

2.3.2 Phương pháp nuôi cấy

 Hoạt hóa giống

Pha 100 ml môi trường MRS lỏng (MT1) theo công thức ở mục 2.1.2 vào bình nón dung tích 250 ml, hấp tiệt trùng ở 115oC trong 20 phút, để nguội Dùng que cấy cấy một vòng khuẩn lạc từ ống giữ giống vào bình môi trường, đặt trong máy lắc ở 37 o

C và tốc độ lắc 110 vòng/phút trong 48 giờ [1], [5]

 Nuôi cấy

Chuẩn bị môi trường lỏng nuôi cấy vi sinh vật thích hợp trong bình nón dung tích thích hợp, hấp tiệt trùng ở 115oC trong 20 phút, để nguội Cấy hỗn dịch giống đã được hoạt hóa ở trên vào bình theo tỉ lệ 10% Đặt trong máy lắc

ở 37o

C và tốc độ lắc 110 vòng/phút trong thời gian thích hợp [1], [5]

2.3.3 Phương pháp xử lý dịch nuôi cấy thu sinh khối

Nuôi cấy vi sinh vật theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.2 Đem xử lý nhiệt dịch nuôi cấy bằng cách đun cách thủy ở 80oC/1h Ly tâm thu sinh khối (4000v

/p), rửa sinh khối nhiều lần bằng nước cất đã hấp tiệt trùng [1]

2.3.4 Phương pháp tạo nguyên liệu đông khô

Sử dụng máy lắc (Vortex) phân tán đều sinh khối thu được trong 60 ml dung dịch sữa gầy 10% đã được hấp tiệt khuẩn Đổ hỗn dịch các mẫu này ra đĩa petri đã được làm sạch và hấp tiệt khuẩn từ trước, đậy kín bằng giấy nhôm, để các đĩa này vào trong tủ lạnh sâu -800C cho đông rắn hoàn toàn Sau đó tiến hành giai đoạn làm khô trong máy đông khô nhiệt độ khoảng -500

C; áp suất 0,055 mbar trong 24h

2.3.5 Phương pháp nhuộm màu quan sát bào tử (phương pháp Ogietska)

 Nguyên tắc:

Dựa trên cấu trúc đặc biệt của màng bào tử: dày, chắc, khó bắt màu, chứa nhiều lipid Đầu tiên: xử lý để tế bào chất của bào tử dễ bắt màu với nhiệt và acid Tiếp theo, nhuộm màu cả tế bào chất của tế bào và bào tử bằng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh Sau đó, tẩy màu tế bào chất của tế bào đi và nhuộm bằng thuốc nhuộm màu bổ sung Kết quả là phân biệt được tế bào sinh dưỡng

và bào tử của vi sinh vật do màu sắc khác nhau

Tiến hành: