KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Weissella paramesenteroides CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG VỚI Edwardsiella ictaluri

  BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Weissella paramesenteroides CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG VỚI Edwardsiella ictaluri Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : TĂNG NGỌC KIỀU VY Niên khóa : 2007 – 20011 Tháng 07/2011 1      Lời cảm ơn Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến: - Ths Võ Minh Sơn, người hướng dẫn khoa học, người động viên, quan tâm tận tình hướng dẫn tơi thực hiện, hồn thành khố luận tốt nghiệp - Quý thầy cô môn Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học Nơng Lâm tận tình dạy truyền đạt kiến thức quý báu cho suốt thời gian đại học - Xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo viện, cô Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh anh chị nghiên cứu viên trực thuộc viện nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản II tạo điều kiện thuận lợi có giúp đỡ thiết thực cho tơi suốt q trình thực hồn thành luận văn - Con xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến bố mẹ, gia đình ln chỗ dựa vững tạo điều kiện cho học tập tốt - Cuối xin cảm ơn bạn bè động viên, hỗ trợ sát cánh bên Tăng Ngọc Kiều Vy 2      TÓM TẮT Cá tra hay cá da trơn nước Pangasius hypophthalmus loài cá địa vùng đồng sông Cửu Long, Việt Nam Một bệnh gây thiệt hại kinh tế nhiều đến ngành nuôi cá tra Việt Nam bệnh gan thận mủ vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây Hiện nay, phương thức điều trị thông thường không phát huy tác dụng mà gây tượng kháng thuốc ô nhiễm môi trường Nghiên cứu cho thấy Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum Weissella paramesenteroides ba chủng vi khuẩn lactic có khả đối kháng với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Vì thế, nghiên cứu tiến hành để khảo sát đặc tính sinh lý vi khuẩn lactic trên, cung cấp sở cho q trình lên men quy mơ thí điểm, từ hướng tới sản xuất chế phẩm sinh học giúp tăng cường khả đối kháng cá tra với bệnh gan thận mủ Kết cho thấy ba chủng vi khuẩn có khả sinh trưởng tốt mơi trường ni cấy có độ pH – biên nhiệt độ rộng 25 – 40oC Tất ba chủng có khả sống sót độ pH thấp (pH 3) hàm lượng muối cao 5% L plantarum có tỷ lệ sống 100% sau tất nồng độ muối mật dùng nghiên cứu Ở nồng độ muối mật 0,5%, chủng L fermentum cho thấy khả chịu đựng ổn định suốt 24 tỷ lệ sống sau 24 chủng L plantarum cao Chủng W paramesenteroides chết sau hai nồng độ muối mật 2% Thử nghiệm khả tương thích cho thấy chủng W paramesenteroides tiết yếu tố ức chế chủng L plantarum 3      SUMMARY Title: A survey of physiological characteristics of Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum and Weissella paramesenteroides antagonistic to Edwardsiella ictaluri The freshwater catfish, Pangasius hypophthalmus (Sauvage), is indigenous to the Mekong Delta in Vietnam It has been cultured traditionally for decades in earthen ponds and more recently in river-based cages One of the most economically important diseases of this intensively reared freshwater catfish is liver and kidney disease Major presenting signs included an increase in mortality that would not respond to treatment In addition, the traditional treatments would cause antibiotic resistance and environmental pollution Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum and Weissella paramesenteroides are three strains of lactic bacteria antagonistic to Edwardsiella ictaluri bacterium that causes liver and kidney disease in P hypophthalmus This study was conducted to examine physiological characteristics of these three lactic bacteria, providing a basis for the pilot-scale fermentation process that aims to produce probiotics beneficial to the host catfish against liver and kidney disease The results showed that the three strains could grow better in culture media with pH – and a wide temperature range 25 – 40oC All these three strains survived at a low pH (pH = 3) and high salt content with values of 5% respectively L plantarum showed more than 100 % survival rate after h at all three concentrations examined of bile salts At the bile salts concentration of 0,5%, L fermentum showed the best stable resistance during 24 h though survival rate after 24h of L plantarum was higher W paramesenteroides cells were 0% resistant just 2h post challenges at two bile salts concentrations of and 2% In compatibility test, W paramesenteroides secreted factors that inhibited L plantarum Keywords: freshwater catfish, Pangasius hypophthalmus (Sauvage), Edwardsiella ictaluri, liver and kidney disease, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Weissella paramesenteroides 4    iii   MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii SUMMARY iii MỤC LỤC iv DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH SÁCH CÁC BẢNG vii DANH SÁCH CÁC HÌNH viii Chương MỞ ĐẦU .2  1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 10  1.2 YÊU CẦU CỦA ĐỀ TÀI 11  1.3 NỘI DUNG THỰC HIỆN 12  Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 13  2.1 TỔNG QUAN VỀ BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA 13  2.1.2 Tình hình kháng thuốc vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 14  2.1.3 Một số phương pháp phòng trị bệnh gan thận mủ cá tra.15  2.2 PROBIOTIC – CHẾ PHẨM SINH HỌC TRONG NUÔI TRỒNG THUỶ SẢN16  2.2.1 Định nghĩa probiotic 16  2.2.2 Cơ chế tác động probiotic 17  2.3 VI KHUẨN LACTIC – TIỀM NĂNG SẢN XUẤT PROBIOTIC 19  2.4 QUORUM SENSING – PHÂN TỬ TÍN HIỆU Ở VI SINH VẬT 21  2.4.1 Định nghĩa trình quorum sensing 21  2.4.2 Các enzyme tham gia trình phân hủy AHL 21  2.4.3 Hệ thống quorum sensing vi khuẩn Edwardsiella spp .23  Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .24  3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 24  3.2 VẬT LIỆU 24  5      3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26  3.3.1 Nội dung thử nghiệm 26  3.3.2 Xây dựng đường chuẩn tương quan mật độ vi khuẩn giá trị OD 27  3.3.3 Khảo sát đặc tính đối kháng với E ictaluri chủng gây bệnh 28  3.3.4 Khảo sát phân huỷ quorum sensing .29  iv 3.3.5 Khảo sát đặc tính sinh lý 30  3.3.6 Khảo sát đặc tính tương thích chủng vi khuẩn lactic 32  Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .34  4.1 Kết 34  4.1.1 Đường chuẩn tương quan mật độ vi khuẩn giá trị OD600 34  4.1.2 Kết đối kháng với Edwardseilla ictaluri chủng gây bệnh 35  4.1.3 Kết phân huỷ quorum sensing .36  4.1.4 Kết khảo sát đặc tính sinh lý 38  4.1.5 Kết khảo sát đặc tính tương thích 44  4.2 Thảo luận 45  Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 48  5.1 Kết luận .48  5.2 Đề nghị 48  TÀI LIỆU THAM KHẢO 50  6      DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AHL N-acyl homoserine lactone BA Blood agar BHIA Brain heart infusion Agar BHIB Brain Heart Infusion Broth CFU Colony forming unit Ctv Cộng tác viên ĐBSCL Đồng Bằng Sông Cửu Long EMB Eosine Methylene blue agar ESC Enteric Septicaemia of Catfish) FAO Food and Agriculture Organization HHL N-hexanoyl homoserine lactone LAB Lactic acid bacteria (vi khuẩn lactic) LBA Luria Bertani agar MRSA DeMan, Rogosa, and Sharpe agar MRSB DeMan, Rogosa, and Sharpe broth TSA Trytone Soya Agar VSV Vi sinh vật WHO World Health Organization (Tổ chức y tế giới) 7      DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 4.1 Kết đối kháng với E ictaluri chủng gây bệnh 22 Bảng Khảo sát khả phân hủy phân tử tín hiệu HHL 37 Bảng 4.3 Kết khảo sát tương thích chủng vi khuẩn lactic 44 8      DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Sự phân hủy phân tử AHL enzyme 22 Hình 4.2 Phương trình đường chuẩn tương quan mật độ vi khuẩn OD .35 Hình 4.3 Vịng kháng khuẩn chủng lactic .36 Hình 4.4 Đường chuẩn tương quan nồng độ HHL đường kính vịng sắc tố 37 Hình 4.5 Vịng sắc tố violacein nồng độ HHL khác 37 Hình 4.6 Kết khả dung huyết chủng lactic 38 Hình 4.7 Ảnh hưởng pH lên tăng trưởng .39 Hình 4.8 Ảnh hưởng nhiệt độ lên tăng trưởng .40 Hình 4.9 Ảnh hưởng nồng độ muối lên tăng trưởng 41 Hình 4.10 Khả chịu pH thấp .42 Hình 4.11 Khả chịu muối mật 44 Hình 4.12 Vịng đối kháng tạo thành 108 ức chế 111 45 9      Chương MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Thuỷ sản ngành mang lại lợi nhuận cao cho kinh tế thu hút nhiều lao động Trong khoản 10 năm gần ngành thuỷ sản nói chung ni trồng thuỷ sản nói riêng phát triển mạnh mẽ Cá Tra (Pangasius hypophthalmus) loài cá da trơn nước có giá trị kinh tế cao, phân bố tự nhiên tập trung chủ yếu vùng hạ lưu sông Mekong Việt Nam, Campuchia, Lào Thái Lan quốc gia ni đối tượng Ở Việt Nam cá tra nuôi với quy mô lớn số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) như: An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Bến Tre, Tiền Giang Sản lượng cá tra ước tính đạt khoảng 300000 năm 2004, đạt 400000 năm 2005, đạt 800000 năm 2006, đạt 1000000 vào năm 2007, 1128014 năm 2008 1,2 triệu năm 2009, tổng sản lượng năm 2010 1,141 triệu tấn, kim gạch xuất khuẩu đạt 1,44 tỉ USD (Báo cáo hội nghị tổng kết cá tra xuất năm 2010) Kỹ thuật nuôi thâm canh giúp cải thiện đáng kể suất ni trồng thủy sản nói chung cá tra nói riêng Tuy nhiên, bên cạnh đó, đồng thời gây tình trạng nhiễm mơi trường, dịch bệnh Bệnh cá tra chủ yếu vi khuẩn ký sinh trùng gây nên gây chết lên đến 70 - 80% (Loan ctv, 2007) Một bệnh truyền nhiễm gây thiệt hại nghiêm trọng đến suất sản lượng cá nuôi bệnh gan thận mủ gây vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Bệnh gan thận mủ cá tra nuôi phát vào cuối năm 1998 Hiện bệnh gây thiệt hại lớn cho người nuôi cá tra thâm 10      TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Báo cáo hội nghị tổng kết xuất cá tra tôm năm 2010 (2011),Thủy sản việt nam 4, Tr.107 Nguyễn Khoa Diệu Hà 2009 Chế phẩm sinh học BOKASHI: Một vị thuốc hay cho ngành nuôi trồng thủy sản Trung tâm Thông tin Khoa học công nghệ Thừa Thiên – Huế Lý Thị Thanh Loan, Đỗ Quang Tiến Vương, Nguyễn Thanh Trúc, Thới Ngọc Bảo, Đặng Ngọc Thùy , Lưu Đức Điền 2007 Quan trắc, cảnh báo môi trường phịng ngừa dịch bệnh số vùng ni thủy sản tỉnh phía nam, Tuyển tập Nghề Cá Sông Cửu Long, NXB Nông Nghiệp Nguyễn Thanh Phương 2007 Báo cáo tổng kết đề tài “Quan trắc môi trường xác định tác nhân gây bệnh cá da trơn (Tra – Pangasianodon hypophthalmus Basa – Pangasius bocourti) Tôm xanh (Macrobrachium rosenbergii) tỉnh An Giang” Khoa Thủy sản trường Đại học Cần Thơ, tr 81 Nguyễn Hữu Thịnh, Trương Thanh Loan 2007 Phân lập khảo sát đặc điểm kháng kháng sinh Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ cá tra, Pangasianodon hypophthalmus, ni thâm canh Tạp chí KHKT Nơng Lâm nghiệp số 1&2/2007, trang 175-179 Tài liệu tiếng Anh 1) Aly, S.M., Y Abdel-Galil Ahmed, A Abdel-Aziz Ghareeb, and M.F Mohamed 2008 Studies on Bacillus subtilis and Lactobacillus acidophilus, as potential probiotics, on the immune response and resistance of Tilapia nilotica (Oreochromis niloticus) to challenge infections Fish & Shellfish Immunology 25:128-136 2) Austin, B & Austin, D.A 1999 Enterobacteriacea representatives In: Bacterial Fish Pathogens: Diseases of Farmed and Wild Fish (ed By B Austin & D.A Austin), 3rd edn, pp 81-84 Springer Praxis Publishing, Chichester 3) Avella, M.A., G Gioacchini, O Decamp, P Makridis, C Bracciatelli, and O Carnevali 2010 Application of multi-species of Bacillus in sea bream larviculture Aquaculture 305:12-19 4) Balca´zar et al 2006 The role of probiotics in aquaculture Veterinary Microbiology:114 173–186 5) Botes, M., C.A van Reenen, and L.M.T Dicks 2008 Evaluation of Enterococcus mundtii ST4SA and Lactobacillus plantarum 423 as probiotics by using a gastro-intestinal model with infant milk formulations as substrate International Journal of Food Microbiology 128:362-370 6) Byun, J.-W., S.-C Park, Y Benno, and T.-K Oh 1997 Probiotic effect of Lactobacillus sp DS-12 in flounder (Paralichthys olivaceus) The Journal of General and Applied Microbiology 43:305-308 50      7) Cabello, F.C 2006 Heavy use of prophylactic antibiotics in aquaculture: a growing problem for human and animal health and for the environment Environmental Microbiology 8:1137– 1144 8) Chythanya R., Karunasagar I., Karunasagar I 2002 Inhibition of shrimp pathogenic vibrios by a marine Pseudomonas I-2 strain Aquaculture 208, 1-10 9) Crumlish.M, T T Dung, J F Turnbull, N T N Ngoc and H W Ferguson 2002 Identification of Edwardsiella ictaluri from diseased freshwater catfish Pangasius hypophthalmus cultured in Mekong delta, Viet Nam Journal of fish diseases 2002, 25, 733-736 10) Dalmin, G., K Kathiresan, A.Purushothaman 2001 Effect of probiotics on bacterial population and health status of shrimp in culture pond ecosystem Indian J Exp Biol 39, 939–942 11) Defoirdt, T., Boon, N., Bossier, P., Verstraete, W 2004 Disruption of bacterial quorum sensing: an unexplored strategy to fight infections in aquaculture Aquaculture 240: 69-88 12) Defoirdt, T., L.D Thanh, B Van Delsen, P De Schryver, P Sorgeloos, N Boon, and P Bossier 2011 N-acylhomoserine lactone-degrading Bacillus strains isolated from aquaculture animals Aquaculture 311:258-260 13) Dong, Y.H., Xu, J.L., Li, X.Z., Zhang, L.H 2000 AiiA, an enzyme that inactivates the acylhomoserine lactone quorum-sensing signal and attenuates the virulence of Erwinia carotovora Proc Natl Acad Sci USA 97: 3526-3531 14) Dong, Y.H., Wang, L.H., Xu, J.L., Zhang, H.B., Zhang, X.F., Zhang, L.H 2001 Quenching quorum-sensing-dependent bacterial infection by an N-acyl homoserine lactonase Nature 411: 813-817 15) Dong, Y.H., Zhang, X.F., Xu, J.L., Zhang, L.H 2004 Insecticidal Bacillus thuringiensis silences Erwinia carotovora virulence by a new form of microbial antagonism, signal interference Appl Environ Microbiol 70: 954-960 16) Ellis, A 1988 Fish vaccination London: Academic Press 17) FAO/WHO 2002 Report of a Joint FAO/WHO expert consultation on guidelines for the evaluation of probiotics in food World Health Organization and Food and Agriculture Organization of the United Nations, London Ontario, Canada 18) Fuller R.1992 History and development of probiotics In: Fuller, R (Ed.), Probiotics: The Scientific Basis Chapman and Hall, London, pp 1–8 19) Hai, N.V., R Fotedar, and N Buller 2007 Selection of probiotics by various inhibition test methods for use in the culture of western king prawns, Penaeus latisulcatus (Kishinouye) Aquaculture 272:231-239 20) Han, Y., X Li, Z Qi, X.H Zhang, and P Bossier 2010 Detection of different quorumsensing signal molecules in a virulent (Edwardsiella tarda) strain LTB-4 Journal of Applied Microbiology 108:139-147 21) Harutoshi Tsuda, Kazushi Hara and Taku Miyamoto 2007 High bile- and low pHresistant lactic acid bacteria isolated from traditional fermented dairy products in Inner Mongolia, China 51      22) Hawke J.P 1979 A bacterium associated with disease of pond cultured channel catfish, Ictalurus punctatus Journal of the Fisheries Research Board of Canada 36, PP 1508-1512 23) Irianto A and Austin B 2002 Probiotics in aquaculture Journal of Fish Diseases 25, 633- 642 24) Jacobsen, C.N., V Rosenfeldt Nielsen, A.E Hayford, P.L Moller, K.F Michaelsen, A Parregaard, B Sandstrom, M Tvede, and M Jakobsen 1999 Screening of Probiotic Activities of Forty-Seven Strains of Lactobacillus spp by In Vitro Techniques and Evaluation of the Colonization Ability of Five Selected Strains in Humans Appl Environ Microbiol 65:4949-4956 25) Jimmy W Page 1976 Hydrogen ion concentration in the gastrointestinal tract of channel catfish Journal of Fish Biology 8: 225–228 26) Leadbetter J.R., and Greenberg E.P 2000 Metabolism of acylhomoserine lactone quorum-sensing signals by Variovorax paradoxus, J Bacteriol 182, PP 6921-6926 27) Lee, Y.K., and S Salminen 2009 Handbook of probiotics and prebiotics ISBN 978-0-47013544-0 Published by John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey pp 65-66 28) Lilly D.M., and R.H Stillwell 1965 Probiotics: Growth-promoting factors produced by microorganisms, Science 147, PP 747-748 29) Lombardi A, Dal Maistro L, De Dea P, Gatti M, Giraffa G, and Neviani E 2002 A polyphasic approach to highlight genotypic and phenotypic diversities of Lactobacillus helveticus strains isolated from diary starter cultures and cheeses 30) Maragkoudakis P.A., G Zoumpopoulou, C Miaris, G Kalantzopoulos, B Pot, and E Tsakalidou 2006 Probiotic potential of Lactobacillus strains isolated from dairy products International Dairy Journal 16:189-199 31) McClean K.H., M.K Winson, L Fish, A Taylor, S.R Chhabra, M Camara, M Daykin, J.H Lamb, S Swift, B.W Bycroft, G.S.A.B Stewart, and P Williams 1997 Quorum sensing and Chromobacterium violaceum: exploitation of violacein production and inhibition for the detection of Nacylhomoserine lactones Microbiology 143:3703-3711 32) Newton J.C., Bird R.C., Blevins W.T., Wilt G.R., Wolfe L.G (1988), Isolation, characterization, and molecular cloning of cryptic plasmids isolated from Edwardsiella ictaluri, Am J Vet Res 49(11), 1856-1860 33) Ringø, E., F.J Gatesoupe, 1998 Lactic acid bacteria in fish: a review Aquaculture 160, 177–203 34) Sakai, M., T Yoshida, S Astuta, M Kobayashi 1995 Enhancement of resistance to vibriosis in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum) by oral administration of Clostridium butyricum bacteria J Fish Dis 18, 187–190 35) Salinas I., L Abelli, F Bertoni, S Picchietti, A Roque, D Furones, A Cuesta, J Meseguer, and M.Á Esteban 2008 Monospecies and multispecies probiotic formulations produce different systemic and local immunostimulatory effects in the gilthead seabream (Sparus aurata L.) Fish & Shellfish Immunology 25:114-123 36) Schrøder, K., E Clausen, A.M Sandberg, and J Raa 1980 Psychrotrophic Lactobacillus plantarum from fish and its ability to produce antibiotic substances In: 52      Connell, J.J Advances in Fish Science and Technology Fishing News Books, Farnham, Surrey, England, pp 480–483 37) Shea Beasley.2004 Isolation, identification and exploitation of lactic acid bacteria from human and animal microbiota Academic Dissertation in Microbiology.6-12 38) Vo Minh Son, Chin-Chyuan Chang, Mi-Chen Wu, Yuan-Kuang Guu, Chiu-Hsia Chiu, Winton Cheng.(2009) Dietary administration of the probiotic, Lactobacillus plantarum, enhanced the growth, innate immune responses, and disease resistance of the grouper Epinephelus coioides Fish & Shellfish Immunology 26 691–698 39) Speyerer P D and Boyle J A.1987 The plasmid profile of Edwardsiellaictaluri, J Fish Dis 10, 461-469 40) Tinh, N.T.N., R.A.Y.S.A Gunasekara, N Boon, K Dierckens, P Sorgeloos, and P Bossier 2007 N -acyl homoserine lactone-degrading microbial enrichment cultures isolated fromPenaeus vannamei shrimp gut and their probiotic properties in Brachionus plicatilis cultures FEMS Microbiol Ecol 62:45-53 41) Verschuere, L., Rombaut, G., Sorgeloos, P., Verstraete, W 2000a Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture Microbiology and Molecular Biology Review 64, 655 – 671 42) Vine N.G., W.D Leukes, and H Kaiser 2006 Probiotics in marine larviculture FEMS Microbiology Reviews 30:404-427 43) Watson A.K 2008 Probiotic in aquaculture: the need, Priciples and mechenisms of action and screening processes 53      PHỤ LỤC Phụ lục A: Bảng giá trị tương quan giá trị OD600 mật độ vi khuẩn Chủng 111 (Weissella paramesenteroides) OD600 CFU/ml 0,895 1,91E+08 0,646 9,56E+07 0,366 4,78E+07 0,188 2,39E+07 0,092 1,19E+07 0,047 5,97E+06 0,022 2,99E+06 0,013 1,49E+06 0,009 7,47E+05 0,003 3,73E+05 Chủng 108 (Lactobacillus plantarum) OD600 CFU/ml 0,748 5,03E+08 0,507 2,52E+08 0,266 1,26E+08 0,138 6,29E+07 0,07 3,15E+07 0,033 1,57E+07 0,012 7,87E+06 0,007 3,93E+06 Chủng 109 (Lactobacillus fermentum) OD600 0,847 0,504 0,269 0,141 0,076 0,039 0,03 0,009 CFU/ml 3,19E+09 1,60E+09 7,98E+08 3,99E+08 1,99E+08 9,97E+07 4,99E+07 2,49E+07 54      Phụ lục B  Kết xử lý ANOVA ảnh hưởng pH Std N Mean Deviation Std Error Chủng 111 0,196667 0,050332 0,029059 2,256667 0,081445 0,047022 3,343333 0,045092 0,026034 3,826667 0,110151 0,063596 2,906667 0,040415 0,023333 2,312667 0,035233 0,020342 10 0,018333 0,007638 0,00441 Total 21 2,123 1,40806 0,307264 Chủng 108 0,315 0,01249 0,007211 1,429333 0,024685 0,014252 4,136667 0,102632 0,059255 4,083333 0,085049 0,049103 3,23 0,055678 0,032146 0,0475 0,003536 0,0025 10 0 Total 20 1,9839 1,78315 0,398724 Chủng 109 0,263667 0,010017 0,005783 0,764333 0,059869 0,034566 4,066667 0,086217 0,049777 4,376667 0,055076 0,031798 0,028667 0,004041 0,002333 0,036333 0,006028 0,00348 10 0,027333 0,004726 0,002728 Total 21 1,366238 1,869205 0,407894 55      Chủng 111 Tukey HSD ph N 10 Sig Subset for alpha = 05 0,0183 0,1966 3 3 3 2,9066 3,3433 Chủng 108 Tukey HSD ph N 10 Sig 3 3 3 3 3 3 0,9116 Subset for alpha = 05 0,0475 0,315 3,8266 1 1,4293 3,23 0,9512 Chủng 109 Tukey HSD ph N 1 Subset for alpha = 05 0,0273 0,0286 0,0363 0,2636 4,083 4,136 0,919 4,0666 0,9999 1 E E D C B A A 0,7643 56    2,2566 2,3126 10 Sig 4,376 F' F' F' E' C' B' A' f e d d c b a    Kết xử lý ANOVA ảnh hưởng nhiệt độ Descriptives N Chủng 111 Chủng 109 Total 25 30 35 3 0,54 0,045825757 0,026457513 1,716 0,02116601 0,012220202 2,138 0,078307088 0,045210618 40 12 0,968 0,061579217 0,035552778 1,3405 0,653287699 0,188587915 25 30 35 40 3 3 12 0,3416667 2,0966667 3,2566667 4,7533333 2,6120833 0,070237692 0,04055175 0,036055513 0,02081666 0,025059928 0,014468356 0,045445939 0,026238225 0,788699947 0,227678063 0,035472994 0,075055535 0,113724814 0,109696551 1,687558024 57    Std Error 3 3 12 Total 0,7766667 0,96 2,626 1,9686667 1,5828333 Std Deviation 25 30 35 40 Total Chủng 108 Mean 0,020480343 0,043333333 0,065659052 0,063333333 0,48715604   Chủng 111 Tukey HSD nhietdo N Subset for alpha = 05 25 30 40 35 3 25 40 30 35 Sig 0,96 1,9686 3 3 1 Subset for alpha = 05 0,54 0,968 1,716 Chủng 109 Tukey HSD nhietdo N 25 30 35 40 Sig d 3 3 1 Subset for alpha = 05 0,3416 2,0966 3,2566 1 c b 2,626 a 2,138 1 58    0,7766 Sig Chủng 108 Tukey HSD nhietdo N D C B A 4,7533 D’ C’ B’ A’    Kết xử lý ANOVA ảnh hưởng độ mặn Descriptives N Chủng 111 Total Chủng 108 Total Total 2,361333 2,077333 1,818667 1,677333 1,44 0,752 0,18 0,110024 0,116796 0,033843 0,060178 0,072111 0,04015 0,02 21 1,472381 Chủng 109 3 3 3 Mean Std Std Deviation Error 3 3 3 21 2,728667 2,456667 2,276 1,510667 0,712 0,564 0,062667 1,472952 4,043333 3,746667 3 3 21 3,59 3,413333 3,083333 1,486667 0,027 2,770048 0,72803 0,158869 0,078647 0,085049 0,083594 0,040017 0,030199 0,060893 0,009018 0,995197 0,045407 0,049103 0,048263 0,023104 0,017436 0,035157 0,005207 0,21717 0,097125 0,056075 0,094516 0,054569 0,026458 0,060277 0,110151 0,030551 0,004583 1,393982 59    0,063523 0,067432 0,019539 0,034744 0,041633 0,02318 0,011547 0,015275 0,034801 0,063596 0,017638 0,002646 0,304192   Chủng 111 Tukey HSD doman N Sig 3 3 3 Subset for alpha = 05 0,18 0,752 1,44 1,677333 1,818667 2,077333 1 0,284086 Chủng 108 Tukey HSD doman N Subset for alpha = 05 0,062667 0,564 0,712 3 1,510667 3 Sig 0,115025 60  2,361333 1 2,276 2,456667 Chủng 109 Tukey HSD doman N Subset for alpha = 05 0,027 1,486667 3,083333 3 3,413333   f e d c c b a F E E D C B 2,728667 A F' E' D' C'   Sig 3 1 3,59 3,59 3,746667 0,098512 0,17342 B'C' B' 4,043333 A' Phụ lục C  Kết xử lý khảo sát đặc tính sinh lý dựa kết xử lý ANOVA Bảng B.1 Kết thử nghiệm ảnh hưởng pH lên tăng trưởng pH Giá trị OD600nm Chủng 10 0,20 ± 2,26 ± 3,34 ± 3,83 ± 2,91 ± 2,31 ± 0,02 ± 0,03e 0,05d 0,03b 0,06a 0,02c 0,02d 0,00f 0,32 ± 1,43 ± 4,14 ± 4,08 ± 3,23 ± 0,01D 0,01C 0,06A 0,05A 0,03B 0,05 ± 0E 0E 0,26 ± 0,76 ± 4,07 ± 4,38 ± 0,04 ± 0,03 ± 0,01E’ 0,03C’ 0,05B’ 0,03A’ 0F’ 0F’ VK 111 108 109 0,03 ± 0F’ (*) Số liệu biểu thị cho giá trị OD 600 nm trung bình (Trung bình ± SE) lần lập lại, chữ (Weisella 111: a, Lactobacillus 108: A, Lactobacillus 109: A’) khác đường cong biểu thị khác biệt có ý nghĩa (p < 0,05) nghiệm thức Bảng B.2 Kết thử nghiệm ảnh hưởng nhiệt độ lên tăng trưởng Nhiệt độ (oC) OD (600nm) 25 30 35 40 111 0,78 ± 0,04d 0,96 ± 0,02c 2,63 ± 0,01a 1,97 ± 0,03b 108 0,54 ± 0,03D 1,72 ± 0,01B 2,14 ± 0,05A 0,97 ± 0,04C 109 0,34 ± 0,02D’ 2,10 ± 0,04C’ 3,26 ± 0,07B’ 4,75 ± 0,06A’ Chủng VK 61      (*) Số liệu biểu thị cho giá trị OD600 trung bình lần lập lại, chữ (a, A, A’) biểu thị khác biệt có ý nghĩa (p < 0,05) nghiệm thức Bảng B.3 Kết thử nghiệm ảnh hưởng nồng độ muối lên tăng trưởng % Giá trị OD 600 NaCl VK 111 108 109 2,36 ± 0,06 2,08 ± a 0,07 b 1,82 ± 1,68 ± 1,44 ± 0,02 c 0,03 c 0,04 d 2,73 ± 2,46 ± 2,28 ± 1,51 ± 0,71 ± 0,05A 0,05B 0,05C 0,02D 0,02E 4,04 ± 3,75 ± 3,59 ± 3,41 ± 3,08 ± 0,06A’ 0,05B’ 0,02B’C’ 0,03C’ 0,06D’ 0,75±0,02e 0,18±0,01f 0,56 ± 0,04E 1,49 ± 0,02E’ 0,06 ± 0,01F 0,03 ± 0,00F’ (*) Số liệu biểu thị cho giá trị OD600 trung bình lần lập lại, chữ (a, A, A’) biểu thị khác biệt có ý nghĩa (p < 0,05) nghiệm thức Bảng B.4 Tỷ lệ sống sót chủng khảo sát pH khác Chủng VK 111 108 109 pH Thời gian ủ (giờ) 24 100 60,5±62,8 0 0 100 62,8 ± 0,7 94,4 ± 0,9 96,6 ± 0,6 94,4 ± 0,7 100 58,1 ± 0,6 0 0 100 95,0 ± 0,7 100,3 ± 0,3 100,6 ± 0,6 101,6 ± 0,3 100 101,9±0,7 102,3 ± 0,4 101,7 ± 0,2 95,5 ± 0,7 100 101,5±0,4 104,6 ± 0,3 104,4 ± 0,2 100,9 ± 0,2 (*)Số liệu biểu thị cho giá trị trung bình (Trung bình ± SE) lần lập lại 62    97,4 ± 0,3 0,0 83,2 ± 0,3   Bảng B.5 Tỷ lệ sống chủng khảo sát nồng độ muối mật khác Nồng Chủng vi khuẩn Thời gian ủ (giờ) độ muối 24 0,5 100 43,3±1,4 46,6± 1,6 49,0± 0,9 50,8± 0,6 100 41,2±2,1 0 0 100 39,0±1,3 0 0 0,5 100 86,7±1,3 98,4 ± 101,0±1,3 100 80,0±2,0 83,7± 1,4 94,1± 1,9 101,2± 2,0 115,9±2,2 100 86,0±2,5 102,0± 1,2 102,7±1,5 103,7 ±1,5 110,9±1,2 0,5 100 97,0±2,1 96,8± 1,2 98,9± 1,2 100,4± 1,3 94,0± 2,1 100 75,2±2,2 80,6± 0,7 81,1± 1,7 80,5± 1,3 100 74,9±0,7 71,8± 1,0 0 mật (%) 111 108 109 102,9 ± 1,0 (*)Số liệu biểu thị cho giá trị trung bình (Trung bình ± SE) lần lập lại Phụ lục D: Bảng số liệu khả phân huỷ HHL  Số liệu xây dựng đường chuẩn [HHL] ppm 0,625 1,25 2,5 ln[HHL] -0,4700 0,2231 0,9163 1,6094 63    10 2,3026 133,1±1,2   Đường kính vịng Violacein (mm) Trung bình 12 12 20 22 26 27 36 35 43 44 11 11,7 24 22,0 26 26,3 34 35,0 45 44,0  Số liệu phân huỷ HHL Đường kính vịng sắc tố 12h Chủng 108 28 28 28,5 109 27 30 29 111 Đối chứng 28 30 30 30 15 16 30 31 17 17,5 64    24h 16 16 14,5 16,5 17 16 17 15,5 ... nghiệm Chủng? ?vi khuẩn lactic  khảo? ?sát Khảo? ?sát? ?đặc? ?tính? ?đối? ? kháng? ?với? ?E.? ?ictaluri? ?và  các? ?chủng? ?gây bệnh  khác Khảo? ?sát? ?phân hủy  Quorum Sensing Khảo? ?sát? ?đặc? ?tính? ?sinh? ? lý  Khảo? ?sát? ?tính? ?tương ... HIỆN - Khảo sát khả đối kháng với Edwardsiella ictaluri chủng vi khuẩn gây bệnh động vật thủy sản - Khảo sát khả phân hủy HHL - Khảo sát đặc tính sinh lý chủng vi khuẩn lactic:  Khảo sát đặc tính. .. 3.3.3 Khảo sát đặc tính đối kháng với E ictaluri chủng gây bệnh 28  3.3.4 Khảo sát phân huỷ quorum sensing .29  iv 3.3.5 Khảo sát đặc tính sinh lý 30  3.3.6 Khảo sát đặc tính