TÌM HIỂU QUY TRÌNH PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIÊU VI SINH TRONG THỊT TƯƠI VÀ THỊT ĐÔNG LẠNH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP TÌM HIỂU QUY TRÌNH PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIÊU VI SINH TRONG THỊT TƯƠI VÀ THỊT ĐÔNG LẠNH Họ tên sinh viên: VÕ THỊ HIỀN Ngành: BẢO QUẢN CHẾ BIẾN NƠNG SẢN VÀ VI SINH THỰC PHẨM Niên khóa: 2007 - 2011 Tháng 08/2011 TÌM HIỂU QUY TRÌNH PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIÊU VI SINH TRONG THỊT TƯƠI VÀ THỊT ĐÔNG LẠNH Sinh viên thực VÕ THỊ HIỀN Khóa luận đệ trình để đáp ứng u cầu cấp Kỹ sư ngành Bảo quản Chế biến Nông sản Thực phẩm Vi Sinh Thực Phẩm Giáo viên hướng dẫn: TS Vũ Thị Lâm An Tháng năm 2011 i LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại Học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh, ban chủ nhiệm khoa Công nghệ thực phẩm tất quý thầy cô tận tâm truyền đạt cho kiến thức tổng quan kiến thức chuyên ngành suốt thời gian học tập trường Đồng thời, gửi lời cảm ơn Ban Giám Đốc – Cơ Quan Thú Y Vùng VI, Ban Giám Đốc Trung Tâm Chuẩn Đốn Xét Nghiệm Bệnh Động Vật, Vũ Thị Lâm An tạo điều kiên cho thực tập quan, tiếp xúc thực tế với đầy đủ trang thiết bị đại, chuyên dùng Tôi xin chân thành cảm ơn anh Võ Minh Châu anh chị làm việc Trung Tâm tận tình dẫn cho tơi kiến thức, kỹ thực tế, hữu ích cho công việc sau Cuối xin gửi lời cảm ơn tới tất bạn bè động viên giúp đỡ suốt trình học tập làm khóa luận Một lần tơi xin chân thành cảm ơn Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2011 Võ Thị Hiền ii TÓM TẮT Đề tài “Tìm hiểu quy trình phân tích tiêu vi sinh thịt tươi thịt đông lạnh” tiến hành Trung tâm Chuẩn Đoán - Xét Nghiệm Bệnh động vật trực thuộc Cơ Quan Thú Y Vùng VI, thời gian từ ngày 7/3/2011 đến ngày 30/6/2011 với mục tiêu tìm hiểu quy trình kiểm nghiệm vi sinh sản phẩm thịt tươi thịt đông lạnh, đồng thời làm quen với điều kiện làm việc thực tế, cách giao tiếp ứng xử điều kiện làm việc nhóm Trong q trình thực tập tơi hiểu tiêu chuẩn qui định áp dụng Trung tâm CĐ - XN Bệnh động vật quy trình kiểm nghiệm vi sinh sản phẩm có nguồn gốc động vật nói chung sản phẩm thịt tươi thịt đơng lạnh nói riêng Tham gia vào quy trình kiểm nghiệm tiêu vi sinh sản phẩm thịt sản phẩm có nguồn gốc động vật, tơi nắm rõ quy trình kiểm nghiệm vi sinh vật trung tâm từ khâu chuẩn bị môi trường đến khâu tiến hành trả kết phân tích Ngồi tơi nắm điểm cần lưu ý cơng tác kiểm nghiệm iii MỤC LỤC Trang Trang tựa i Lời cảm ơn ii Tóm tắt iii Mục lục iv Danh sách chữ viết tắt v Danh sách bảng danh sách hình vi CHƯƠNG MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Nội dung đề tài 1.4 Phương pháp đề tài CHƯƠNG TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu Cơ Quan Thú Y Vùng VI 2.2 Tổng quan kiểm nghiệm vi sinh CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 12 3.1 Tìm hiểu quy định áp dụng trung tâm 12 3.2 Quy trình kiểm nghiệm 15 3.2.1 Chuẩn bị môi trường kiểm nghiệm 15 3.2.2 Trích mẫu 15 3.2.3 Phương pháp kiểm nghiệm tiêu vi sinh 16 3.3 Kết ghi nhận 29 3.3.1 Kết 29 3.3.2 Nhận xét 30 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 31 4.1 Kết luận 31 4.2 Đề nghị 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 PHỤ LỤC iv DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BGBL: Brilliant Green Bile Broth BP: Baird Parker Agar BPW: Buffered Pepton Water BYT: Bộ Y Tế CĐ – XN: chuẩn đoán – xét nghiệm CFU : Colony Formin Unit ctv : cộng tác viên E coli: Escherichia coli FDA: Food anh Drug Administation ISO: Internation Organization for Standardizion LDC: Lysine Decarboxylation Medium LT: Lauryl sufate broth MR: Methyl red MRD: Maxinum Recovery Diluent NA: Nutrient Agar PCA: Plate Count Agar PTN: Phòng thí nghiệm QĐ - BNN: Quyết định - Bộ Nơng Nghiệp QĐ: định S aureus: Staphylococcus aureus SEM: Rappaport Vassiliadis TCVN: tiêu chuẩn Việt Nam TSC: Tryptose Sulfite Cycloserine agar TSVKHK: Tổng số vi khuẩn hiếu khí VP: Voges Proskauer XLD: Xylose Lysine Desoxycholate Agar v DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3.1: Giới hạn cho phép vi sinh vật thịt 11 Bảng 3.2: Kết nhóm thịt tươi thịt đông lạnh 29 Bảng 3.3: Tỉ lệ nhiễm vi sinh vật nhóm thịt tươi thịt đông lạnh 29 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1: Quy trình định lượng số vi sinh vật Hình 2.2: Quy trình định tính số vi sinh vật Hình 2.3: Khuẩn lạc Escherichia coli Hình 2.4: Vi khuẩn Staphylococcus aureus 10 Hình 2.5: Vi khuẩn Salmonella 10 Hình 3.1: Quy trình định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí 19 Hình 3.2: Quy trình định lượng tổng số coliform E coli 20 Hình 3.3: Khuẩn lạc coliform E coli môi trường 21 Chromocult Coliform Agar Hình 3.4: Quy trình định lượng coliform 22 Hình 3.5: Quy trình định lượng E coli 23 Hình 3.6: Khuẩn lạc Salmonella môi trường XLD .25 Hình 3.7: Quy trình kiểm tra định tính Salmonella 26 Hình 3.8: Quy trình kiểm tra định lượng Clostridium perfringens 28 vi Chương MỞ ĐẦU Đặt vấn đề 1.1 Nước ta trình xây dựng kinh tế - xã hội phát triển theo nhịp điệu sôi động giới, người nguồn lực quan trọng Để đáp ứng nhu cầu ngày cao người, thị trường xuất nhiều sản phẩm thực phẩm đa dạng bao gồm sản phẩm nước sản phẩm nhập từ nước ngồi, nhằm mục đích cung cấp lượng chất dinh dưỡng cho người phát triển, trì sống lao động hiệu Trong đó, thịt thực phẩm động vật nguồn protein tốt thực phẩm thực vật Thịt chứa amino acids - acids hữu thành phần tích hợp protein khơng thể tổng hợp thể người - tạo nên khả cân thành phần hàm lượng Thịt sản phẩm thịt nguồn tuyệt hảo chứa vitamin chất khoáng cần thiết cho thể Tuy nhiên, thực tế cho thấy để thực phẩm thực “chất lượng” “an tồn” việc tuân thủ biện pháp “an toàn vệ sinh thực phẩm” vấn đề cần quan tâm, đặc biệt tình hình ngộ độc thực phẩm ngày gia tăng giới nói chung Việt Nam nói riêng Một nguyên nhân chủ yếu thực phẩm có chứa vi khuẩn gây bệnh, chúng xâm nhập vào thể đường tiêu hóa tác động tới thể diện chất độc tạo Do để đạt sản phẩm chất lượng an toàn cho người tiêu dùng yêu cầu kiểm nghiệm vi sinh vật thực phẩm cần thiết nhu cầu thiết yếu xã hội Trong đó, thực phẩm kiểm tra tiêu vi sinh cách nghiêm ngặt thịt tươi thịt đông lạnh nhằm nâng cao chất lượng sản phẩm đảm bảo sống người Đồng thời ngăn chặn mối nguy gây an toàn vệ sinh thực phẩm Từ nhận thức với cho phép khoa Công nghệ thực phẩm Cơ Quan Thú Y Vùng VI, tơi thực khóa thực tập Trung tâm Chuẩn Đoán Xét Nghiệm Bệnh động vật với đề tài “Tìm hiểu quy trình phân tích tiêu vi sinh thịt tươi thịt đông lạnh” Mục tiêu 1.2 Tìm hiểu quy trình kiểm nghiệm vi sinh sản phẩm thịt tươi thịt đông lạnh Làm quen với điều kiện làm việc thực tế, cách giao tiếp ứng xử điều kiện làm việc nhóm Nội dung đề tài 1.3 Tìm hiểu quy định tiêu chuẩn kiểm nghiệm áp dụng trung tâm Phân tích tiêu vi sinh sản phẩm có nguồn gốc động vật, đặc biệt phân tích tiêu vi sinh thịt tươi thịt đông lạnh Phương pháp 1.4 Tham khảo tài liệu để hiểu quy định tiêu chuẩn áp dung trung tâm Học hỏi kinh nghiệm cán nhân viên có chun mơn kỹ thuật Trực tiếp tham gia vào công đoạn quy trình kiểm nghiệm: chuẩn bị mơi trường, quy trình phân tích Chương TỔNG QUAN Giới thiệu quan thú y vùng VI 2.1 Căn theo định số 80/2006/QĐ - BNN ngày 18/09/2006, Cơ Quan Thú Y Vùng VI trực thuộc Cục Thú Y thành lập sở hợp tổ chức lại Trung Tâm Thú Y vùng thành phố Hồ Chí Minh Bộ phận thường trực Cục Thú Y thành phố Hồ Chí Minh Cơ Quan Thú Y Vùng VI trụ sở 124 Phạm Thế Hiển, phường 2, Quận 8, thành phố Hồ Chí Minh 2.1.1 Chức nhiệm vụ quan Cơ Quan Thú Y Vùng VI thực chức nhiệm vụ sau: Cơ Quan Thú Y Vùng VI thực chức quản lý nhà nước thú y chẩn đoán, xét nghiệm bệnh động vật, sản phẩm động vật vùng phân công Cơ Quan Thú Y Vùng VI có tư cách pháp nhân, có dấu riêng, hưởng kinh phí từ ngân sách Nhà nước, mở tài khoản theo quy định pháp luật Trụ sở Cơ Quan Thú Y Vùng VI đặt thành phố Hồ Chí Minh Phạm vi hoạt động Cơ Quan Thú Y Vùng VI gồm tỉnh, thành phố trực thuộc Trung Ương: thành phố Hồ Chí Minh, Bà Rịa Vũng Tàu, Đồng Nai, Ninh Thuận, Bình Thuận, Bình Dương, Bến Tre, Bình Phước, Tây Ninh, Long An, Tiền Giang Hướng dẫn, đôn đốc, kiểm tra việc thực văn quy phạm pháp luật, chương trình, dự án, tiêu chuẩn, quy trình kỹ thuật thú y Chi Cục Thú Y cấp tỉnh Cơ Quan Thú Y Vùng VI có nhiệm vụ quyền hạn việc phòng chống dịch bệnh động vật, kiểm dịch động vật, kiểm soát giết mổ kiểm tra vệ sinh thú y Ngồi tham gia tuyên truyền, phổ biến kiến thức, giáo dục pháp luật, tra chuyên Tiến hành Pha loãng mẫu theo tiêu chuẩn ISO 6887 ta dịch mẫu Cấy mẫu: cấy mẫu theo phương pháp cấy trang mặt thạch môi trường phân lập Baird Parker Agar Trong trường hợp công tác chuẩn bị môi trường không tốt không đủ môi trường nuôi cấy trung tâm dùng petri film dành để nuôi cấy S aureus Dùng pipet vô trùng hút 0,1 ml dịch mẫu nhỏ mặt đĩa petri có chứa mơi trường phân lập BP: Dùng que gạt thủy tinh cấy trang khắp mặt thạch tránh va chạm vào thành đĩa Sử dụng que thủy tinh phải khử trùng sau lần cấy trang nhằm tránh nhiễm chéo Khi dịch mẫu thấm vào môi trường, lật úp đĩa, ủ 37 oC/ 24 - 48 h Có thể cấy độ pha loãng cần, độ pha loãng cấy đĩa, dùng pipet que cấy vô trùng riêng cho đĩa Đọc kết Chọn đĩa số đếm khuẩn lạc từ 10 - 150 để đếm khuẩn lạc Khuẩn lạc đặc trưng S aureus môi trường phân lập có màu đen nhánh, sáng, tròn, lồi, đường kính từ – 1,5 mm bao quanh quầng sáng (phản ứng lecithinase) ∑ Staphylococcus aureus = C * 10n C: số khuẩn lạc đếm n: hệ số pha loãng Khuẩn lạc Staphylococcus aureus tiến hành sinh hóa để khẳng định, phản ứng sinh hóa sử dụng trung tâm: kháng huyết nhuộm Gram Kỹ thuật tiến hành nhuộm Gram trình bày phần phụ luc 3.2.3.5 Định lượng Clostridium perfringens Phương pháp ISO 7937/2004 Phương pháp phát đếm số vi khuẩn kỵ khí Clostridium perfringens kỹ thuật đổ đĩa Quy trình kiểm tra định lượng Clostridium perfringens trình bày Hình 3.8 27 Mẫu Pha loãng mẫu (theo ISO 6887) TSC Agar Ủ ( 370C/20±2 h) kỵ khí Quan sát đọc kết Hình 3.8: Quy trình kiểm tra định lượng Clostridium perfringens Mẫu sau pha loãng theo tiêu chuẩn ISO 6887 ta dịch mẫu Dùng pipet vô trùng lấy ml dịch mẫu pha loãng cho vào đĩa petri Sử dụng pipet riêng cho độ pha lỗng, rót vào đĩa khoảng 10 ml Tryptose Sulfite Cycloserine Agar (TSC) Lắc tròn đĩa xi ngược theo chiều kim đồng hồ, chiều lần Đặt đĩa lên mặt phẳng ngang cho đông tự nhiên Sau tiến hành rót thêm vào đĩa khoảng ml TSC nhằm tạo mơi trường yếm khí Đặt đĩa lên mặt phẳng ngang cho đông tự nhiên Khi môi trường đơng, lật úp đĩa đặt vào hộp kín sau ủ tủ ấm 37 oC/24 h Kết quả: đếm số khuẩn lạc môi trường TSC, khuẩn lạc có màu đen đặc trưng ∑ Clostridium perfringens = C * 10n C: số khuẩn lạc đếm n: hệ số pha loãng 28 Kết ghi nhận 3.3 3.3.1 Kết Qua trình thực tập tốt nghiệp Trung Tâm Chuẩn Đoán – Xét Nghiệm Bệnh Động Vật với đề tài “Tìm hiểu quy trình phân tích tiêu vi sinh thịt tươi thịt đông lạnh” Tôi ghi nhận số kết mẫu thịt thể Bảng 3.2 Bảng 3.2: Kết nhóm thịt tươi thịt đông lạnh Số thứ tự (tháng) Tổng số mẫu khảo sát Tổng số mẫu không đạt Tỷ lệ (%) 145 10 6,90 207 16 7,73 248 10 4,03 Tổng 600 36 Kết tỉ lệ nhiễm vi sinh vật nhóm thịt tươi thịt đông lạnh thể Bảng 3.3 Bảng 3.3: Tỉ lệ nhiễm vi sinh vật nhóm thịt tươi thịt đông lạnh STT Tên tiêu Số lượng mẫu Kết Đạt tiêu chuẩn Không đạt tiêu chuẩn TSVKHK 600 593 (1,2%) Coliform E coli 600 590 10 (1,7%) Salmonella 600 581 19 (3,2%) Staphylococcus aureus 600 600 Clostridium perfringens 600 600 3.3.2 Nhận xét 3.3.2.1 Tổng số vi khuẩn hiếu khí Trong tổng số mẫu thịt kiểm nghiệm có mẫu thịt vượt tiêu chuẩn cho phép tổng số vi khuẩn hiếu khí Bộ Y Tế (105 CFU/g 1ml sản phẩm): Mẫu bị nhiễm thuộc lơ thịt trâu, thịt bò ướp lạnh, thịt gà xay, đùi gà ¼ 29 Tổng số vi sinh vật hiếu khí phản ánh mức độ nhiễm vi sinh vật mẫu điều kiện đóng gói bảo quản mẫu, nhiên không phản ánh tổng số vi sinh vật mẫu mức độ an toàn vệ sinh thực phẩm tổng số vi sinh vật hiếu khí đếm nhỏ nhiều so với mật độ vi sinh vật mẫu Do ta thấy mẫu có tổng vi sinh vật hiếu khí vượt mức quy định phản ánh điều kiện đóng gói bảo quản sản phẩm chưa đạt yêu cầu 3.3.2.2 Coliform E coli So với tiêu chuẩn cho phép coliform Bộ Y Tế (102 CFU/g 1ml sản phẩm) tổng số mẫu thịt kiểm nghiệm có 10 mẫu thịt vượt tiêu chuẩn cho phép Các mẫu bị nhiễm thuộc lô thịt gà xay, đùi gà ¼, đùi tỏi, thịt trâu Do E coli thuộc nhóm coliforms nên mẫu có số lượng E coli cao mẫu có số lượng coliforms cao E coli đóng vai trò vi sinh vật thị an tồn vệ sinh thực phẩm mơi trường, số lượng E coli cao mẫu phản ánh điều kiện an toàn vệ sinh thực phẩm chưa đạt yêu cầu Coliforms vi sinh vật thị an toàn vệ sinh thực phẩm có quan hệ họ hàng gần với vi sinh vật gây bệnh đường ruột, số lượng coliforms cao thực phẩm khả có mặt vi sinh vật gây bệnh khác cao 3.3.2.3 Salmonella Salmonella có mặt 19 mẫu kiểm nghiệm, mẫu thuộc lơ thịt gà (đùi gà ¼, đùi tỏi, cánh gà) Salmonella nhiễm vào thực phẩm từ nguyên liệu chế biến, nguồn nước bị nhiễm hay q trình chế biến, vận chuyển, bảo quản khơng đảm bảo vệ sinh Tính chất gây bệnh Salmonella nguy hiểm cho người khơng phép có Salmonella thực phẩm 3.3.2.4 Staphylococcus aureus Tất mẫu thịt kiểm nghiệm đạt tiêu chuẩn số lượng Staphylococcus aureus 3.3.2.5 Clostridium perfringens So với tiêu chuẩn tất mẫu thịt kiểm nghiệm số lượng Clostridium perfringens đạt yêu cầu 30 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Sau tháng thực tập Trung Tâm Chuẩn Đoán - Xét Nghiệm Bệnh Động Vật, rút mặt mạnh trung tâm sau: Trung tâm có đội ngũ cán nhân viên có trình độ chun mơn kỹ thuật, ln có ý thức thực quy định tiêu chuẩn áp dụng trung tâm Áp dụng quy trình kiểm nghiệm nhanh tiêu vi sinh nhằm giảm thời gian phân tích, có kết xác Sử dụng đầy đủ trang thiết bị, máy móc đại qui trình kiểm nghiệm đưa đến kết có độ tin cậy cao Bên cạnh mặt mạnh trung tâm tơi nhìn nhận trên, tơi nhận thấy trung tâm mặt hạn chế sau: Các mẫu lưu không xếp gọn gàng dẫn đến gây khó khăn cho việc tìm kiếm mẫu cần phân tích lại Ở trung tâm số môi trường chưa chuẩn bị phòng mơi trường diện tích chưa đáp ứng Do không đủ điều kiện nên trung tâm môi trường bảo quản chung với mẫu để phân tích tủ mát dẫn đến ảnh hưởng đến chất lượng môi trường 4.2 Kiến nghị Do thời gian thực tập hạn chế nên kết sơ lược Để công tác kiểm nghiệm tốt tơi có số đề nghị sau: Cán nhân viên nên có ý thức xếp mẫu lưu có hệ thống để thuận tiện cơng tác kiểm nghiệm Ví dụ mẫu lưu nên xếp ô chứa theo thứ tự ngày 31 Trung tâm nên trang bị thêm tủ mát để môi trường dinh dưỡng chưa cấy thuốc thử bảo quản riêng với mẫu để phân tích nhằm tránh vấy nhiễm Các vật bảo quản tủ nên xếp cho trì tuần hồn khơng khí Ngồi nên tạo điều kiện để cơng tác chuẩn bị mơi trường thực phòng mơi trường nhằm tránh tạp nhiễm xảy 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO Quan tuyết Anh, 2010 Khảo sát Listeria Monocytogenes thực phẩm Luận văn tốt nghiệp kỹ sư, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh, trang – 10 Bộ Y Tế, 2007 Quy định giới hạn cho phép vi sinh vật thịt theo Bộ Y tế số 46/2007/QĐ-BYT, trang 57 Nguyễn Tiến Dũng, 2007 Phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật thực phẩm Trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM, trang 60 - 61 Nguyễn Minh Hiền, 2009 Bài giảng Kiểm nghiệm vi sinh Khoa Công nghệ thực phẩm, trường ĐH Nông Lâm TP.HCM, trang - 10 ISO, 2009 An toàn vệ sinh thực phẩm Merck, trang - 8; 14;18 Lương Đức Phẩm, 2000 Vi sinh vật học vệ sinh an toàn thực phẩm Nhà Xuất Nông Nghiệp Hà Nội Trần Thị Ngọc Quỳnh, 2010 Phân tích tiêu vi sinh thịt nhập Luận văn tốt nghiệp kỹ sư, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh, trang - 12 TCVN, 2002, Tiêu chuẩn Việt Nam vi sinh vật ban hành 2001 Nhà xuất Hà Nội, trang Trần Linh Thước, 2008 Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm Nhà xuất Giáo Dục, trang 10 - 13 10 Nguyễn Phùng Tiến; Bùi Minh Đức; Nguyễn Văn Dịp, 2003 Vi sinh vật thực phẩm - Kỹ thuật kiểm tra tiêu đánh giá chất lượng an toàn thực phẩm Nhà xuất y học Hà Nội, trang 67 - 69 33 11 Trung tâm Chuẩn Đoán – Xét Nghiệm Bệnh động vật, 2011 Phân tích tiêu vi sinh Tài liệu nội bộ, trang - 12 Trung Tâm Thú Y Vùng TPHCM, 2009 Qui Định Trích Mẫu Tài liệu Nội Bộ 13 Nguyễn Văn Ý, 2009 Khảo sát tỉ lệ nhiễm Salmonella thịt gia súc, gia cầm đông lạnh nhập Luận văn tốt nghiệp bác sĩ thú y, trường Cao Đẳng Nông Nghiệp Nam Bộ, trang 12 – 13 34 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Một số sơ đồ quan Hình 1: Sơ đồ mặt tổng thể quan Hình 1: Sơ đồ mặt tổng thể quan thú y vùng VI 35 Hình 2: Sơ đồ tổ chức máy Cơ quan Thú Y Vùng 36 Phụ lục 2: Bảng MPN dùng cho mẫu pha loãng nồng độ 0,1; 0.01 0,001 với khoảng tin cậy 95% Số ống dương 0.1 0.01 0.001 0 0 0 Giới hạn tin Số ống dương cậy MPN/g low High 0.1 1100 420 37 0.01 0.001 Phụ lục 3: Thành phần cách pha loại môi trường sử dụng Buffered Peptone Water (BPW)/ Merck Peptone 10 g Sodium chloride (NaCl) 5g Disodium hydrogen phosphate (Na HPO 4) 9g Potassium dihydrogen phosphate 1,5 g Nước cất 1000 ml Điều chỉnh pH tới 7, chia vào bình 500 ml Tiệt khuẩn 121 oC/15 Maximum Recovery Diluent (MRD)/ Merck Sodium chloride 8,5 g Peptone 1.0 g Điều chỉnh pH tới tiệt khuẩn 121 oC/15 Plate Count Agar (PCA)/ Merck Peptone 5g Yeast extract 2,5 g D (+) glucose 1g Agar 14 g Nước cất 1000 ml Điều chỉnh pH tới tiệt khuẩn 121 oC/15 Nutrient Agar (NA)/ Merck Peptone from meat 5g Meat extract 3g Agar - agar 12 g Điều chỉnh pH tới tiệt khuẩn 121 oC/15 Brilliant Green Bile Lactose Broth (BGBL)/ Merck Peptone form meat 10 g Lactose 10 g Ox bile 2,6 g Brilliant green 0,0133 g Điều chỉnh pH tới 7,2, phân phối môi trường vào ống nghiệm chứa ống durham tiệt khuẩn 121 oC/15 38 Lauryl Sulfate Broth (LT)/ Merck Tryptose 20 g Lactose 5g Sodium chloride 5g Laurylsulfat - Natriumsalz 0,1 g Dipotassium hydrogen phosphate 2,75 g Potassium dihydrogen phosphate 2,75 g Điều chỉnh pH tới 6,8 tiệt khuẩn 121 oC/15 Chromocult Coliform Agar/ Merck Peptone 3g Sodium dihydrogen phosphate 2,2 g Disodium dihydrogen phosphate 2,7 g Tryptophan 1g Sodium chloride 5g Sodium pyruvate 1g Tergitol 0,15 g Sorbitol 1g Isopropyl - beta - D - thiogalactopyranoside 0,1 g - bromo - chloro - indoxyl – D glucuronic 0,1 g Điều chỉnh pH tới 7,4; không hấp tiệt trùng đun tan môi trường EC Broth/ Merck Peptone from casein 20 g Lactose 5g Bile salt mixture 1,5 g Sodium chloride 5g Di – Potassium hydrogen phosphate 4,6 g Potassium dihydrogen phosphate 1,5 g Điều chỉnh pH tới 6,9; chia ống nghiệm có chứa ống durham 5ml tiệt khuẩn 121 oC/15 39 Pappaport Vassiliadis Broth (SEM)/ Merck Magnesium chloride haxanhydrate 28,6 g Peptone from soymeal 4,5 g Sodium chloride 7,2 g Di - Potassium hydrogen phosphate 0,18 g Potassium dihydrogen phosphate 1,26 g Malachite green oxalate 0,036 g Điều chỉnh pH tới 5,2 tiệt khuẩn 115 oC/15 10 Xylose Lysine Desoxycholate Agar (XLD)/ Merck Yeast extract 3g D (+) Xylose 3,75 g Lactose 7,5 g Sucrose 7,5 g L (+) Lysine 5g Sodium deoxycholate 1g Sodium thiosulfate 6,8 g Aminium iron (III) citrate 0,8 g Phenol red 0,08 g Agar - agar 14,5 g Điều chỉnh pH tới 7,4; không hấp tiệt trùng đun tan môi trường 11 Tryptose Sulfite Cycloserine Agar (TSC)/ Merck Tryptose 15 g Peptone from soymeal 5g Yeast extract 5g Sodium disulfite 1g Amonium iron III citrate 1g Agar - agar 12 g Điều chỉnh pH tới 6,9 tiệt khuẩn 121 oC/15 40 12 Baird Parker Agar (BP)/ Merck Peptone 10 g Beef extract 4g Yeast extract 2g Sodium pyruvate 10 g Lithium chloride 5g Glycine 12 g Agar 12 g Nước cất 1000 ml Điều chỉnh pH tới 7,2 tiệt khuẩn 121 oC/15 Sau hấp tiệt trùng, để nguội môi trường 45 – 50 oC, 100 ml môi trường bổ sung vào ml lòng đỏ trứng có chứa potassium tellurite + 2,5 ml sulfamethazin 0,2 % 13 IDS 14 GNR - Hệ thống định danh trực khuẩn Gram (-) Phụ Lục 4: Quy trình nhuộm Gram Chuẩn bị phiến phết: dùng que cấy vơ trùng lấy vi khuẩn rừ khuẩn lạc (sau cấy 24 giờ) hòa vào giọt nước muối vơ trùng phiến kính, làm khơ tự nhiên Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi lửa đèn cồn - lần Nhuộm dung dịch thuốc tím kết tinh (crystal violet): phút, rửa nước thấm khô Nhuộm lại dung dịch Iod phút, rửa nước, thấm khô Nhỏ dịch tẩy màu etanol 95%, giữ khoảng 30 giây (cho đến vừa thấy màu), rửa nước, thấm khô Nhuộm bổ sung dung dịch safranin - phút, rửa nước, để khơ khơng khí Soi kính: thị kính 10X, dùng vật kính 100X (độ phóng đại 1000 lần) Đọc kết quả: vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, vi khuẩn Gram (-) bắt màu hồng 41 ... sản phẩm chất lượng an tồn cho người tiêu dùng u cầu kiểm nghiệm vi sinh vật thực phẩm cần thi t nhu cầu thi t yếu xã hội Trong đó, thực phẩm kiểm tra tiêu vi sinh cách nghiêm ngặt thịt tươi thịt... dung đề tài 1.4 Phương pháp đề tài CHƯƠNG TỔNG QUAN 2.1 Giới thi u Cơ Quan Thú Y Vùng VI 2.2 Tổng quan kiểm nghiệm vi sinh CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ... tiêu chuẩn Việt Nam TSC: Tryptose Sulfite Cycloserine agar TSVKHK: Tổng số vi khuẩn hiếu khí VP: Voges Proskauer XLD: Xylose Lysine Desoxycholate Agar v DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3.1: Giới hạn cho