KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NAA, BA VÀ KENITINE ĐẾN QUÁ TRÌNH HÌNH THÀNH MÔ SẸO VÀ TÁI SINH NHÂN NHANH GIỐNG HOA CÚC ĐẠI ĐÓA IN VITRO

TÓM TẮT Đề tài “Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA, BA và Kinetine đến quá trình hình thành mô sẹo và nhân nhanh giống hoa cúc Đại Đóa in vitro” được tiến hành từ tháng 03 đến tháng 06

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NAA, BA VÀ KENITINE ĐẾN QUÁ TRÌNH HÌNH THÀNH MÔ SẸO VÀ TÁI SINH NHÂN

NHANH GIỐNG HOA CÚC ĐẠI ĐÓA IN VITRO

NIÊN KHÓA: 2007 – 2011 SINH VIÊN THỰC HIỆN: NGUYỄN THỊ THU HIỀN

Tháng 08/2011

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NAA, BA VÀ KENITINE ĐẾN QUÁ TRÌNH HÌNH THÀNH MÔ SẸO VÀ TÁI SINH NHÂN

NHANH GIỐNG HOA CÚC ĐẠI ĐÓA IN VITRO

Tác giả

NGUYỄN THỊ THU HIỀN

Khoá luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp

bằng Kỹ sư ngành Nông học

Giáo viên hướng dẫn

PGS TS PHAN THANH KIẾM

KS DƯƠNG THỊ LAN OANH

Tháng 08/2011

Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn ban lãnh đạo Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam và phòng Di truyền và Chọn tạo giống cây trồng của Viện đã tạo điều kiện tốt nhất để tôi thực hiện đề tài

Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn các thầy cô Bộ môn Di truyền - Giống cây trồng, các thầy cô Khoa Nông học, trường Đại học Nông lâm TP.HCM đã giúp đỡ em trong quá trình học tập và thực hiện khóa luận của mình

Các bạn ở ký túc xá và các bạn thực tập cùng phòng thí nghiệm đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học và thực hiện khóa luận

Đặc biệt, con muốn giành sự biết ơn sâu sắc tới cha mẹ và gia đình cùng những người thân đã sinh thành, nuôi dạy, cổ vũ, động viên và giúp đỡ con trong suốt quá trình học tập để hoàn thành chương trình học tập và thực hiện khóa luận tốt nghiệp

TP Hồ Chí Minh, tháng 08/2011

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Thu Hiền

TÓM TẮT

Đề tài “Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA, BA và Kinetine đến quá

trình hình thành mô sẹo và nhân nhanh giống hoa cúc Đại Đóa in vitro” được tiến

hành từ tháng 03 đến tháng 06 năm 2011, tại phòng Di truyền và Chọn giống, viện Khoa học Kỹ thuật Nông Nghiệp Miền Nam, 121 Nguyễn Bỉnh Khiêm, quận 1, Thành phố Hồ Chí Minh nhằm xác định thời gian và nồng độ Hypocloride calcium khử trùng mẫu thích hợp, theo dõi quá trình hình thành mô sẹo, tái sinh chồi và khả năng ra rễ từ

các mẫu cấy của cây hoa cúc Đại Đóa in vitro Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên

- Môi trường MS + 2 mg/l kinitine là môi trường nhất thích hợp nhất cho nhân

chồi cúc Đại Đóa in vitro: tạo ra nhiều chồi, chồi cao, cứng cáp và cho hệ số nhân cao

- Môi trường MS + 0,1 g/l than hoạt tính + 1,5 mg/l NAA cho ra cây có bộ rễ to

khỏe, phân nhánh nhiều thích hợp nhất cho việc ra cây ngoài vườn ươm

MỤC LỤC

Trang tựa i

Lời cảm ơn ii

Tóm tắt iii

Mục lục iv

Danh sách các từ viết tắt vii

Danh sách các bảng viii

Danh sách các hình ix

Danh sách các biểu đồ x

Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Yêu cầu 2

1.4 Giới hạn đề tài 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Khái niệm, cơ sở khoa học và ứng dụng của nuôi cấy mô thực vật 3

2.2 Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô 4

2.2.1 Trên thế giới 4

2.2.2 Ở Việt Nam 6

2.3 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 7

2.3.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 7

2.3.2 Nuôi cấy mô sẹo 7

2.3.3 Nuôi cấy tế bào đơn 7

2.3.4 Nuôi cấy protoplast - chuyển gen 7

2.3.5 Nuôi cấy hạt phấn đơn bội 8

2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro 8

2.4.1 Mẫu cấy 8

2.4.2 Môi trường nuôi cấy 8

2.4.3 Điều kiện nuôi cấy 9

2.5 Những tồn tại thường gặp trong nhân giống in vitro 9

2.5.1 Tính bất định về mặt di truyền 9

2.5.2 Sự nhiễm mẫu 9

2.5.3 Sự hóa nâu 10

2.5.4 Hiện tượng thủy tinh thể 10

2.6 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong nuôi cấy mô 10

2.6.1 Các Auxin 10

2.6.2 Cytokinin 11

2.6.3 Giberellin 12

2.6.4 Ethylene 13

2.7 Giới thiệu về cây hoa cúc và những nghiên cứu về nuôi cấy mô cây hoa cúc 13

2.7.1 Phân loại……… 13

2.7.2.2 Thân 13

2.7.2.3 Lá 14

2.7.2.4 Hoa, Quả 14

2.7.4 Một số phương pháp nhân giống hoa cúc 15

2.7.5 Tình hình sản xuất và tiêu thụ hoa cúc trên thị trường 15

2.7.5.1 Thế giới 15

2.7.5.2 Việt Nam 17

2.7.6 Một số kết quả nghiên cứu về nuôi cấy mô hoa cúc 17

2.7.7 Những hạn chế trong nuôi cấy mô hoa cúc và cần thiết phải thực hiện đề tài 20

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm 21

3.2 Vật liệu thí nghiệm 21

3.2.1 Giống cúc Đại Đóa 21

3.2.2 Trang thiết bị và dụng cụ 21

3.2.2.1 Phòng pha chế môi trường 21

3.2.2.2 Phòng cấy 21

3.2.2.3 Phòng nuôi cây 21

3.2.2.4 Môi trường cơ bản dùng trong thí nghiệm 22

3.2.2.5 Điều kiện nuôi cấy 23

3.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 23

3.3.1 Xác định nồng độ Hypocloride Calcium và thời gian khử trùng mẫu thích hợp 23 3.3.2 Ảnh hưởng phối hợp giữa BA và NAA đến khả năng tạo mô sẹo của giống hoa cúc Đại Đóa trong in vitro 24

3.3.3 Ảnh hưởng của Kinetine đến quá trình nhân nhanh chồi của giống cúc Đại Đóa in vitro 25

3.3.4 Ảnh hưởng của NAA đến quá trình hình thành rễ của cây cúc Đại Đóa in vitro 25 3.4 Phương pháp xử lý số liệu 26

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Xác định nồng độ Hypocloride calcium và thời gian khử trùng thích hợp cho khả năng đưa mẫu vào phòng thí nghiệm của cây hoa cúc Đại Đóa 27

4.2 Ảnh hưởng phối hợp giữa BA và NAA đến khả năng tạo mô sẹo của giống hoa cúc Đại Đóa trong in vitro 29

4.3 Ảnh hưởng của Kinetine đến quá trình nhân nhanh chồi của cây cúc Đại Đóa in vitro 34

4.4 Ảnh hưởng của NAA đến quá trình hình thành rễ của cây cúc Đại Đóa in vitro 36

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận 39

5.2 Đề nghị 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40

PHỤ LỤC 42

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

Viết tắt Viết đầy đủ/nghĩa

LLL Lần lặp lại

NT Nghiệm thức

T Thời gian

TDZ Thidiazuron

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Một số loại hoa cắt cành bán chạy nhất ở trung tâm đấu giá Hà Lan trong

năm 2005 16 Bảng 2.2 Số lượng loại hoa tiêu thụ ở Nhật (gồm cả nhập khẩu & tiêu thụ nội địa) năm

2008 16 Bảng 4.1 Ảnh hưởng của nồng độ Hypocloride Calcium và thời gian khử trùng đến tỷ

lệ mẫu sống, nhiễm, chết (%) 10NSC 29 Bảng 4.2 Ảnh hưởng của sự kết hợp NAA và BA đến tỷ lệ hình thành mô sẹo từ nụ

hoa cúc Đại Đoá 45NSC 30 Bảng 4.3 Ảnh hưởng của sự kết hợp NAA và BA đến đường kính mô sẹo từ nụ hoa

cúc Đại Đoá 45NSC 32

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của sự kết hợp NAA và BA đến đặc điểm hình thái và ngày hình

thành mô sẹo từ nụ hoa cúc Đại Đóa 33

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của kinitine đến khả năng nhân chồi cây cúc Đại Đóa 35 NSC 35 Bảng 4.6 Ảnh hưởng của NAA đến năng ra rễ của cây cúc Đại Đóa 25 NSC 38

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 4.1 Mô sẹo được hình thành từ nụ hoa cúc Đại Đoá 45 NSC 34

Hình 4.2 Ảnh hưởng của kinitine đến nhân chồi cúc Đại Đóa 35 NSC 37

Hình 4.3 Ảnh hưởng của NAA đến quá trình ra rễ của cây cúc Đại Đóa 25 NSC 39

Hình 1 Mẫu cúc Đại Đóa bị nhiễm 43

Hình 2 Mô sẹo được hình thành từ nụ hoa cúc Đại Đoá 45 NSC 43

Hình 3 Chồi được hình thành từ mẫu thân mang một mắt ngủ trong môi trường có bổ sung các nồng độ kinitine 10 NSC 44

Hình 4 Mẫu thân cúc Đại Đoá mang một mắt ngủ tạo chồi ở các nồng độ kinitine

35 NSC 45

Hình 5 Mẫu chồi cúc Đại Đoá phản ứng ra rễ ở nồng độ 1,5 mg/l và 2 mg/l NAA 45

DANH SÁCH CÁC BIẾU ĐỒ

Đồ thị 1 Ảnh hưởng của các nồng độ Hypocloride calcium và thời gian xử lý mẫu đến

tỷ lệ nhiễm của mẫu thân cúc Đại Đoá 46

Đồ thị 2 Ảnh hưởng của nồng độ Hypocloride calcium và thời gian khử xử lý mẫu đến tỷ lệ sống của mẫu thân cúc Đại Đoá 46

Đồ thị 3 Ảnh hưởng của các nồng độ Hypocloride calcium và thời gian xử lý mẫu đễn tỷ lệ chết của mẫu thân cúc Đại Đoá 47

Đồ thị 4 Ảnh hưởng của NAA phối hợp với BA đến tỷ lệ hình thành mô sẹo 45 NSC 47 Đồ thị 5 Ảnh hưởng của NAA phối hợp với BA đến đường kính mô sẹo 45 NSC 48

Đồ thị 6 Ảnh hưởng của kinitine đến cố chồi/cụm của cúc Đại Đoá 35 NSC 48

Đồ thị 7 Ảnh hưởng của kinitine đến chiều cao chồi của cúc Đại Đoá 35 NSC 49

Đồ thị 8 Ảnh hưởng của kinitine đến HSN của cúc Đại Đoá 35 NSC 49

Đồ thị 9 Ảnh hưởng của NAA đến số rễ/cây của cúc Đại Đoá 25 NSC 50

Đồ thị 10 Ảnh hưởng của NAA đến chiều dài rễ của cúc Đại Đoá 25 NSC 50

Cúc Đại Đóa hay còn gọi là cúc vàng hay thu cúc có hình dáng, màu sắc đẹp và hoa lại to nên được người tiêu dùng rất ưa chuộng, nó đóng vai trò rất quan trọng trong thị trường hoa cúc

Hoa cúc được dùng như những cây hoa kiểng để chơi giải trí hoặc được chưng trang trí vào những ngày lễ hay trong các dịp cúng giỗ Cứ mỗi dịp tết đến, lễ hội, rằm nhu cầu về hoa cúc rất lớn Nên đòi hỏi cần có nguồn giống hoa cúc với số lượng lớn

và người sản xuất phải tốn một số tiền lớn cho chi phí giống Để tiết kiệm chi phí này thì người sản xuất thường để lại giống Thông thường cây hoa cúc được để giống bằng cách lưu lại cây mẹ, phương pháp này cây giống được lưu giữ qua nhiều năm, không chủ động và chịu nhiều rủi ro Đây chính là nguyên nhân gây thoái hóa giống, cây giống bị nhiễm nhiều bệnh, sức sinh trưởng và phát triển kém dẫn đến năng suất và chất lượng hoa giảm

Phương pháp nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào là phương pháp khoa học và hiện đại phục vụ cho sản xuất với quy mô công nghiệp lớn Ưu điểm của phương pháp này là hệ số nhân giống rất cao từ một bộ phận của cây cúc sau một năm

có thể cho ra đời 410 - 610 cây, các cây này sạch bệnh tương đối đồng đều và đồng nhất về mặt di truyền Cây giống được tạo ra bằng phương pháp này có năng suất tăng

150% so với các phương pháp để giống thông thường (Nguyễn Quang Thạch và Đặng Văn Đông, 2002)

Tìm ra môi trường thích hợp là một yếu tố quan trọng quyết định đến sự thành công trong nuôi cấy mô, không có môi trường nào là chuẩn tuyệt đối cần phù hợp cho

sự phát triển của tất cả các tế bào nên sự thay đổi môi trường nuôi cấy là điều cần thiết, tùy thuộc vào từng giống, loại mô nuôi cấy khác nhau (Dương Công Kiên, 2003) Do đó việc tìm ra được môi trường thích nghi cho quá trình nhân giống cúc Đại Đóa nhằm cung cấp đủ nguồn giống chất lượng, sạch bệnh là cần thiết cho sản xuất hiện nay

Vì vậy đề tài: “Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA, BA và kinetine đến

quá trình tạo mô sẹo và nhân nhanh giống hoa cúc Đại Đóa in vitro” được thực

hiện

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định nồng độ Hypocloride calcium và thời gian khử trùng thích hợp cho khả năng đưa mẫu vào trong ống nghiệm của giống cúc Đại Đóa

Xác định nồng độ BA và NAA thích hợp cho quá trình tạo mô sẹo trong ống nghiệm của giống hoa cúc Đại Đóa

Xác định nồng độ Kinetine thích hợp cho quá trình nhân chồi của giống cúc Đại Đóa trong ống nghiệm

Xác định được nồng độ NAA thích hợp cho quá trình ra rễ của giống cúc Đại Đóa trong ống nghiệm

1.3 Yêu cầu

Đưa được mẫu vào trong ống nghiệm của giống cúc Đại Đóa

Tạo được mô sẹo, chồi và rễ cho giống cúc Đại Đóa trong ống nghiệm

Theo dõi các chỉ tiêu nghiên cứu

1.4 Giới hạn đề tài

Đề tài chỉ thực hiện trong thời gian từ tháng 3 đến tháng 6 nên không thể thực hiện các thí nghiệm nhiều lần để có kết quả chính xác hơn

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Khái niệm, cơ sở khoa học và ứng dụng của nuôi cấy mô thực vật

Khái niệm: Nuôi cấy mô và tế bào thực vật (gọi tắt là nuôi cấy mô) là thuật ngữ

chung cho tất cả các loại nuôi cấy các nguyên liệu (tế bào, mô, phôi) thực vật trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo trong ống nghiệm để tạo ra cây hoàn chỉnh

Các vật liệu thường sử dụng trong nuôi cấy là:

- Các đỉnh sinh trưởng, chóp rễ nhằm nhân nhanh số lượng cây đồng nhất về mặt di truyền và sạch bệnh

- Nuôi cấy bầu, noãn, chưa thụ tinh hoặc bao phấn nhằm tạo ra cây đơn bội, tạo thể đồng hợp tử

- Nuôi cấy phôi nhằm mục đích cứu phôi khi lai xa

- Nuôi cấy mô sẹo (callus) nhằm tạo dòng vô tính, tạo dòng đơn bào và tạo cây biến dị soma

- Nuôi cấy tế bào để tạo dòng đơn bào, từ đó tạo ra tế bào trần để lai vô tính hoặc để chuyển gen

Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô:

Theo Trần Văn Minh, 1994:

- Do tế bào có tính toàn năng: Haberlandt (1902) đã đề cập đến tính toàn năng của tế bào Ông cho rằng, mỗi tế bào của bất kỳ cơ thể đa bào nào đều có khả năng phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Theo quan điểm hiện đại: mỗi tế bào hoàn chỉnh đều mang toàn bộ thông tin di truyền của cả cá thể đó là tính toàn năng của tế bào

- Do sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào, tức là từ tế bào ban đầu có thể tạo thành các tế bào chuyên hóa và chuyên biệt Các tế bào chuyên biệt ở các bộ phận thực vật lại có khả năng như một tế bào ban đầu Quá trình đó được gọi là sự phân hóa

và phản phân hóa của tế bào

Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006 thì ý nghĩa thực tiễn quan trọng nhất của nuôi cấy mô tế bào là áp dụng sản xuất đại trà có kiểm soát trong tạo giống và nhân giống cây trồng Những lợi ích trong việc áp dụng nuôi cấy mô trong sản xuất nông nghiệp và lâm nghiệp được tóm tắt như sau:

- Kiểm soát dịch bệnh cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô hay nuôi cấy tế bào, ta hoàn toàn có thể loại được những cá thể nhiễm bệnh hay mang mầm bệnh

- Kiểm soát được chất lượng giống thông qua kiểm soát kiểu gen của giống mang vào sản xuất

- Kiểm soát được toàn bộ kỹ thuật từ khâu nhân giống đến khâu thu hoạch

- Tạo ra sự đồng loạt về giống, từ đó tạo ra sự đồng loạt của sản phẩm cuối Sự đồng loạt này giúp cơ giới hóa được khâu trồng trọt và thu hoạch Do đó năng suất lao động sẽ tăng lên Chất lượng sản phẩm đồng nhất, tạo điều kiện thuận lợi cho khâu tiêu thụ và chế biến

2.2 Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô

2.2.1 Trên thế giới

Theo Trần Văn Minh, 1994:

Năm 1838, hai nhà sinh vật học Đức là Schleiden và Schwann đã đề xướng thuyết tế bào và nêu rõ: mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm nhiều đơn vị nhỏ, các tế bào hợp thành Các tế bào đã phân hóa đều mang các thông tin di truyền có trong tế bào đầu tiên, đó là trứng sau khi thụ tinh, là những đơn vị độc lập, từ đó có thể xây dựng toàn bộ cơ thể

Năm 1902, Haberlandt là người đầu tiên đưa các giả thiết của Schleiden và Schwann vào thực nghiệm Nhưng ông đã gặp thất bại trong nuôi cấy các tế bào đã phân hóa tách từ cây một lá mầm như Erythronium, Ornithogalum, Tradescantia

Năm 1922, Kotte học trò của Haberlandt và Robbins đã lặp lại thí nghiệm của Haberlandt với đỉnh sinh trưởng tách từ rễ một cây hòa thảo trong môi trường lỏng gồm các muối khoáng và glucose đầu rễ sinh trưởng khá mạnh tạo nên một hệ rễ nhỏ

có cả rễ phụ Tuy nhiên, sự sinh trưởng như vậy chỉ tồn tại trong một thời gian, sau đó chậm dần và ngừng lại mặc dù tác giả đã chuyển qua môi trường mới

Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ hai trong nuôi cấy mô thực vật, khi White đã nuôi cấy thành công trong một thời gian dài đầu rễ cà chua với môi trường lỏng với

muối khoáng, glucose và nước chiết nấm men Sau đó ít lâu, White đã chứng minh có thể thay thế nước chiết nấm men bằng hỗn hợp ba loại vitamin nhóm B: Thiamin (B1), Pyridoxin (B6), Nicotinic acid Từ đó việc nuôi cấy đầu rễ trong thời gian vô hạn đã được tiến hành trong nhiều cây khác

Cũng trong thời gian này, ở Pháp, Gautheret, đã tiến hành các nghiên cứu cấy

mô tượng tầng của một số cây gỗ Sau khi Went và Thimann phát hiện ra chất sinh trưởng đầu tiên, acid-β-indolancetic và kết tinh được chất này Cùng với Nobercourt (1939), Gautheret đã thành công trong việc duy trì sinh trưởng trong thời gian vô hạn của mô sẹo cà rốt trên môi trường thạch, bằng cách cấy chuyền 6 tuần một lần

Việc phát hiện vai trò của IAA, NAA, 2,4-D và kinetine cùng với vai trò của vitamin và nước dừa là những bước tiến rất quan trọng trong giai đoạn thứ hai của lịch

sử nuôi cấy mô tế bào thực vật, đó là tiền đề kỹ thuật cho việc xây dựng các môi trường xác định về mặt hóa học và cho việc làm các thí nghiệm ổn định để đi đến các giai đoạn tiếp theo của ngành khoa học này

Năm 1957, Skoog và Miller đã công bố các kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của tỷ lệ Kinetine/Auxin trong môi trường nuôi cấy đối với sự hình thành cơ quan của

mô sẹo thuốc lá Khi giảm thấp tỷ lệ này thì mô sẹo có xu hướng phát triển rễ, nếu tăng thì mô sẹo có xu hướng tạo chồi Hiện tượng này cũng đã được xác định trên nhiều cây khác và có đóng góp rất lớn về điều khiển sinh trưởng, phát triển, phát sinh

cơ quan của mô tế bào trong nuôi cấy Thành công này đã mở đầu cho giai đoạn thứ 3 của lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật

Giai đoạn 1954 - 1959, kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơn, các tế bào sống độc lập không dính với các tế bào khác đã được phát triển 1956, Nickell nuôi liên tục được một huyền phù tế bào cây đậu Năm 1959, Melchers và Beckman đã nuôi liên tục

tế bào đơn trong các dung tích khá lớn bằng cách sục khí liên tục và thỉnh thoảng thu hoạch tế bào, thêm dung dịch mới 1980 - 1992 hàng loạt các thành công mới trong lĩnh vực công nghệ gen thực vật đã được công bố

Chúng ta đang bước vào giai đoạn phát triển thứ 4 của nuôi cấy mô thực vật

Đó là giai đoạn nuôi cấy mô thực vật được ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, nhân giống, vào việc sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học vào nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao

2.2.2 Ở Việt Nam

Việt Nam bắt đầu nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật từ năm 1975 Phòng nuôi cấy mô đầu tiên được xây dựng tại Viện Sinh học, Viện Khoa học Việt Nam do Lê Thị Muội đứng đầu Thấy được triển vọng to lớn của ngành khoa học này trong việc chọn giống và nhân giống nên các cơ sở thuộc trung tâm nghiên cứu Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia Hà Nội, Thành Phố Hồ Chí Minh, một số đơn vị nghiên cứu thuộc Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, Bộ Lâm Nghiệp, Bộ Y Tế, Viện Nghiên Cứu Hạt Nhân đã xây dựng các phòng nuôi cấy mô thực vật, từng bước xây dựng tiềm lực khoa học cho ngành này (Nguyễn Đức Thành, 2000)

Theo Nguyễn Văn Uyển và các tác giả, 1993, nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật

ở Việt Nam đã đạt được một số thành tựu như sau:

- Nhân giống khoai tây (Solanum tuberosum L.) bằng nuôi cấy mô thực vật

(Trần Văn Ngọc, Trần Văn Minh, Nguyễn Văn Uyển)

- Nhân giống vô tính cây cà phê (họ Rubiaceae) (Nguyễn Thị Quyền, Nguyễn Văn Uyển)

- Ứng dụng nuôi cấy mô trong nhân giống cây cỏ ngọt (họ Compositae) (Bùi Tường Thu, Nguyễn Đức Minh Hùng, Nguyễn Văn Uyển)

- Nhân giống chuối (Musa spp.) bằng phương pháp cấy mô (Đoàn Thị ÁiThuyền, Nguyễn Thị Quyền, Trần Văn Minh, Nguyễn Đức Minh Hùng, Nguyễn Văn Uyển)

- Ứng dụng nuôi cấy mô trong nhân giống cây Kiwi (Actinidia chinensis

Planch) (Đoàn Thị Ái Thuyền)

- Nhân giống cây bắt ruồi (Nepenthes madagascariens) bằng phương pháp cấy

mô (Đoàn Thị Ái Thuyền)

- Nhân giống dứa Cayen và Queen Long An bằng phương pháp nuôi cấy mô (Nguyễn Hữu Hổ, Vũ Mỹ Liên)

- Ứng dụng nuôi cấy mô trong nhân giống cây mía đường (Saccharum

offcinarum) (Nguyễn Đức Minh Hùng, Trần Văn Minh, Vũ Mỹ Liên, Thái Xuân Du)

- Nhân giống cây Vani (Vanilla sp.) bằng nuôi cấy mô (Vũ Thị Mỹ Liên)

- Đặc biệt, theo tài liệu của trung tâm nghiên cứu giống cây rừng Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn vừa tổ chức Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Lâm Nghiệp 20 năm (1996 - 2005), một tiến bộ kỹ thuật nổi trội của nghiên cứu nuôi cấy mô

thực vật trong lĩnh vực Lâm Nghiệp là: "Ứng Dụng Công Nghệ Mô - Hom Trong nhân

giống Trầm Hương (Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte)

(trích dẫn bởi Lê Thị Mận,2009)

2.3 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.3.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Một trong những phương thức để đạt được mục tiêu trong nuôi cấy mô tế bào

và mô thực vật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm nuôi cấy chồi đỉnh và chồi bên) Sau khi vô trùng, mẫu sẽ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp chứa đầy đủ chất dinh dưỡng khoáng vô cơ và hữu cơ hoặc môi trường khoáng có bổ sung chất kích thích sinh trưởng thích hợp

Từ đỉnh sinh trưởng, sau một khoảng thời gian nuôi cấy nhất định mẫu sẽ phát triển thành một chồi hay nhiều chồi Chồi tiếp tục phát triển vươn thân, ra lá và rễ để trở thành cây hoàn chỉnh Cây con được chuyển ra đất dần dần thích nghi và phát triển bình thường

2.3.2 Nuôi cấy mô sẹo

Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức, hình thành do sự phản phân hóa của tế bào đã phân hóa Mô sẹo sẽ phát triển nhanh khi môi trường có sự hiện diện của auxin Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường không có chất khích thích tạo mô sẹo

2.3.3 Nuôi cấy tế bào đơn

Khối mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng và được đặt trên máy lắc có tốc độ điều chỉnh thích hợp sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng rẽ gọi là tế bào đơn Tế bào đơn được lọc và nuôi cấy trên môi trường đặc biệt để tăng sinh khối

Sau một thời gian nuôi cấy kéo dài trong môi trường lỏng tế bào đơn được tách

ra và trải trên môi trường thạch Khi môi trường thạch có bổ sung auxin, tế bào đơn phát triển thành cụm tế bào mô sẹo Khi trên môi trường thạch có tỷ lệ cytokinin/auxin thích hợp, tế bào đơn có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh

2.3.4 Nuôi cấy protoplast - chuyển gen

Protoplast (tế bào trần) là tế bào đơn tách lớp vỏ cellulose, trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, protoplast có khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh

Khi tế bào mất vách và tiến hành dung hợp, hai protoplast có khả năng dung hợp với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện giống cây trồng Quá trình dung hợp protoplast có thể được thực hiện trên hai đối tượng cùng loài hay khác loài

2.3.5 Nuôi cấy hạt phấn đơn bội

Hạt phấn ở thực vật được nuôi cấy trên những môi trường thích hợp tạo thành

mô sẹo Mô sẹo này được tái sinh thành cây hoàn chỉnh là cây đơn bội

2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro

2.4.1 Mẫu cấy

Mẫu thường sử dụng là các mô non như chồi đỉnh, chồi nách hay chồi bất định

sẽ tái sinh tốt hơn mô già của cùng một cây Chồi hoa non hay cụm hoa non cũng thường có khả năng tái sinh rất tốt

Mẫu cấy thích hợp cho nuôi cấy in vitro phải có tỷ lệ lớn mô phân sinh hiện diện hay những tế bào có khả năng biểu hiện tính toàn thể

2.4.2 Môi trường nuôi cấy

Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp trong nuôi cấy mô là rất cần thiết Vì mỗi loại cây trồng khác nhau, bộ phận nuôi cấy khác nhau, đều yêu cầu một hàm lượng dinh dưỡng khác nhau Mặt khác, môi trường còn thay đổi tùy thuộc sự phân hóa của mô cấy, tùy theo trường hợp duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ, tạo mầm hay tái sinh cây hoàn chỉnh

Việc lựa chọn môi trường cần dựa vào các tài liệu đã cho cùng đối tượng nuôi cấy hoặc thăm dò qua một số môi trường đã cho để xác định môi trường thích hợp cho mẫu nuôi cấy

Các môi trường đều được thành lập từ một số thành phần chính với nguyên tắc

có sự cân bằng các yếu tố trong môi truờng

Các thành phần chính trong môi trường: đường làm nguồn cacbon; các muối khoáng đa lượng; các muối khoáng vi lượng; các vitamin; các chất điều hòa sinh trưởng; ngoài ra các tác giả còn thêm một số chất hữu cơ như nước dừa, dịch chiết nấm men

2.4.3 Điều kiện nuôi cấy

Ánh sáng

Ánh sáng đóng vai trò quan trọng trong phản ứng tạo hình cây in vitro Trong giai đoạn một và hai của quá trình nhân giống in vitro, việc nuôi cấy tốt nhất là ở 1000

lux Khi cường độ ánh sáng tăng lên 3000 - 10.000 lux rất thuận lợi cho giai đoạn

chuẩn bị cây in vitro trước khi đem trồng

Nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng rõ đến sự tạo hình của cây nuôi cấy Mỗi loại cây trồng có nhiệt độ tối ưu cho sự tạo hình, hầu hết thích hợp ở nhiệt độ 22 - 250C khi nuôi cấy (Dương Công Kiên, 2002)

2.5 Những tồn tại thường gặp trong nhân giống in vitro

Theo Dương Công Kiên, 2002:

2.5.1 Tính bất định về mặt di truyền

Mặc dù kỹ thuật nhân giống vô tính đã được sử dụng nhằm mục đích tạo ra quần thể cây trồng đồng nhất với số lượng lớn, nhưng phương pháp này cũng tạo ra biến dị soma qua nuôi cấy mô sẹo và nuôi cấy tế bào đơn Những biến dị này được nghiên cứu và vận dụng vào cải thiện đời sống cây trồng (Evans và Sharp, 1986; Larkin, 1987) Tần số biến dị thì hoàn toàn khác nhau và không lặp lại (Creissen và Karp, 1985; Fish và Karp, 1986) Nuôi cấy mô sẹo và tế bào đơn có biến dị nhiều hơn nuôi cấy chồi đỉnh

Nguyên nhân gây ra biến dị tế bào soma là:

- Kiểu di truyền: Tần số biến dị khác nhau do kiểu di truyền của các loại cây khác nhau

- Thể bội: Cây đa bội thể biến dị nhiều hơn cây nhị bội thể

- Số lần cấy truyền: Số lần cấy truyền càng nhiều cho tần số biến dị càng cao Biến dị nhiễm thể nhiều, khi nuôi cấy kéo dài (Amstrong và Phillips, 1988) Số lần cấy truyền ít, thời gian giữa hai lần cấy truyền ngắn làm giảm sự biến dị

2.5.2 Sự nhiễm mẫu

Mẫu nhiễm virus: Nên sử dụng mẫu nuôi cấy là mô phân sinh đỉnh thì có thể loại bỏ được virus

Mẫu nhiễm khuẩn: Có thể sử dụng kháng sinh như: Penicillin, Ampicillin, Kanamycin, Amphotericin Nồng độ sử dụng từ 5 – 100 g/l tùy vật liệu nuôi cấy

Mẫu nhiễm nấm: Không giữ mẫu được do bào tử phát tán nhanh

2.5.3 Sự hóa nâu

Hiện tượng hoá nâu hay hoá đen xuất hiện do mẫu nuôi cấy có chứa nhiều chất tannin hay hydroxyphenol có nhiều trong mô già hơn mô non Than hoạt tính được đưa vào môi trường để hấp thu hợp chất phenol nhằm ngăn chặn quá trình hoá nâu hay đen hoặc dùng Polyvinylpyrolidone (PVP), một chất thuộc loại polyamide Một số phương pháp khác có thể làm giảm sự hoá nâu được các nhà khoa học đồng ý như:

- Sử dụng mẫu cấy nhỏ từ mô non, gây ít vết thương trên mẫu khi khử trùng

- Ngâm mẫu vào dung dịch Asocorbic acid và Citric acid vài giờ trước khi cấy

- Chuyển mẫu từ môi trường có chất kích thích sinh trưởng nồng độ thấp qua môi trường có nồng độ cao hơn

2.5.4 Hiện tượng thủy tinh thể

Dạng này được nhận thấy khi có sự trao đổi không khí thấp, quá trình thoát hơi nước tập trung trong cây Biểu hiện của hiện tượng thuỷ tinh thể là thân, lá của cây chứa nước trong suốt

Ngăn chặn hiện tượng thuỷ tinh thể bằng một số biện pháp như:

- Giảm sự hút nước của cây bằng cách tăng nồng độ đường trong môi trường

- Giảm sự gây thương tích trên mẫu khi khử trùng

- Giảm nồng độ đạm trong môi trường nuôi cấy

- Giảm khí ethylene trong bình nuôi cấy bằng cách thông gió tốt

- Tăng cường độ ánh sáng và giảm nhiệt độ phòng cấy

2.6 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong nuôi cấy mô

Các chất sinh trưởng thực vật gồm hai nhóm chính là auxin và cytokinin, ngoài

ra gibberelin và ethylene cũng có vai trò quan trọng đối với sinh trưởng, phát triển và trao đổi chất ở thực vật

2.6.1 Các Auxin

Chất auxin tự nhiên được tìm thấy ở nhiều thực vật là indol axetic acid (IAA) IAA có tác dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào và điều khiển sự hình thành rễ Ngoài IAA còn có các dẫn xuất của nó là naphtyl axetic acid (NAA) và 2,4-

Diclophenoxy axetic acid (2,4D) Các chất này cũng đóng vai trò quan trọng trong việc phân chia của mô và trong quá trình tạo rễ NAA được Went và Thimann (1937) phát hiện, chất này có tác dụng làm tăng hô hấp của tế bào và nuôi cấy, tăng hoạt tính của enzyme và ảnh hưởng mạnh đến trao đổi chất của nitơ, tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng đường trong môi trường NAA là một auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn auxin tự nhiên IAA NAA có vai trò quan trọng đối với sự phân chia tế bào và tạo rễ kết quả nghiên cứu của Butenko (1964) cho thấy NAA có tác dụng tạo rễ mạnh hơn các auxin khác Nhiều kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng NAA tác động ở mức phân tử trong tế bào theo ba cơ chế Cơ chế thứ nhất là NAA gắn với phân tử enzyme và kích thích enzyme hoạt động Sarkissian đã phát hiện tác dụng của auxin lên citrate synthetase còn Yamaki thông báo rằng auxin kích thích hoạt tính của ATPase Cơ chế thứ hai là auxin tác động vào gen và các auxin phân giải acid nucleic Cơ chế thứ ba là tác động thông qua sự thay đổi tính thẩm thấu của màng Dùng phương pháp đánh dấu phân tử có thể thấy NAA dính kết vào màng tế bào làm cho màng hoạt động như một bơm proton và bơm ra ngoài ion H+ làm màng tế bào mềm và kéo dài ra, do đó tế bào lớn lên và dẫn tới sinh trưởng Trong tế bào, NAA có tác dụng tổng hợp acid nucleic

Trong cây, auxin được tổng hợp ở các mô non đặc biệt là lá đang phát triển và vùng đỉnh chồi Từ những vùng này auxin được chuyển xuống các phần dưới của cây

2.6.2 Cytokinin

Cytokinin là chất điều hòa sinh trưởng có tác dụng làm tăng sự phân chia tế bào Các cytokinin thường gặp là kinetin, 6- benzyl aminopurin (BAP) Kinetin được Skoog phát hiện ngẫu nhiên trong khi chiết xuất acid nucleic Kinetin thực chất là dẫn xuất của bazơ nitơ adenine BAP là cytokinin tổng hợp nhân tạo nhưng có hoạt tính mạnh hơn Kinetine Kinetine và BAP cũng có tác dụng kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và làm hạn chế sự hóa già của tế bào Ngoài ra các chất này có tác dụng lên quá trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp AND, tổng hợp protein và làm tăng cường hoạt tính của một số enzyme Cơ chế tác dụng của cytokinin ở mức độ phân tử trong tế bào thể hiện bằng tác dụng tương hỗ của cytokinin với các nucleoprotein làm yếu mối liên kết của histon với AND tạo điều kiện cho sự tổng hợp AND

Những nghiên cứu của Miller và Skoog, 1963, đã cho thấy không phải các chất kích thích sinh trưởng ngoại sinh tác dụng độc lập với hooc môn sinh trưởng nội sinh Phân chia tế bào, phân hóa và biệt hóa được điều khiển bằng sự tác động tương hỗ giữa các loại hooc môn ngoại sinh và nội sinh Tác động phối hợp của auxin và cytokinin có tác dụng quyết định đến sự phát triển và phát sinh hình thái của tế bào và

mô thực vât

Những nghiên cứu của Skoog cho thấy tỷ lệ auxin/cytokinin cao thì thích hợp cho hình thành rễ và thấp sẽ kích thích quá trình phát sinh chồi, nếu tỉ lệ này ở mức cân bằng thì thuận lợi cho phát triển mô sẹo Das (1958) và Nitsch (1986) khẳng định rằng chỉ khi tác dụng đồng thời của auxin và cytokinin thì mới kích thích mạnh mẽ sự tổng hợp AND, dẫn đến quá trình mitos và cảm ứng cho sự phân chia tế bào Theo Dmitrieva (1972) giai đoạn đầu của quá trình phân bào được cảm ứng bởi auxin còn trong các giai đoạn tiếp theo thì cần tác động đồng thời của cả hai chất kích thích Skoog và Miller (1957) đã khẳng định vai trò của cytokinin trong quá trình phân chia

tế bào cụ thể là cytokinin điều khiển quá trình chuyển pha trong mitos và giữ cho quá trình này diễn ra một cách bình thường

Cytokinin được tổng hợp ở rễ và hạt đang phát triển vấn đề vận chuyển cytokinin trong cây còn chưa được xác định rõ

Trong cây giberellin được tổng hợp ở lá đang phát triển, quả và rễ sau đó được vận chuyển đi khắp nơi trong cây và có nhiều trong phloem và xylem

2.6.4 Ethylene

Ethylene là một chất điều hòa sinh trưởng ở dạng khí, ethylene có rất nhiều tác dụng đối với các hoạt động sinh lý và trao đổi chất ở thực vật Đã từ lâu vai trò của ethylen đối với việc làm tăng hô hấp trong thời gian quả chín đã được ứng dụng nhiều Trong những năm gần đây đã xem xét tác dụng của ethylene lên sự kéo dài của thân và

rễ, kích thích tế bào phát triển về bề ngang, kích thích nảy mầm, tạo lông rễ, tạo hoa ở dứa và lan, ức chế vận chuyển ngang và xuống của auxin

2.7 Giới thiệu về cây hoa cúc và những nghiên cứu về nuôi cấy mô cây hoa cúc 2.7.1 Phân loại

Theo Nguyễn Xuân Linh và Nguyễn Thị Kim Lý, 2006:

2.7.2.2 Thân

Cây hoa cúc thuộc loại thân thảo Thân có thể đứng hay bò, khả năng phân nhánh mạnh, có nhiều đốt giòn, dễ gãy, càng lớn càng cứng Những giống nhập nội

thân thường to mập và thẳng, còn những giống cúc cổ truyền thân nhỏ, mảnh và cong

Cây cao hay thấp, đốt dài hay ngắn, sự phân cành mạnh hay yếu tùy thuộc vào từng giống Nhìn chung cây ở điều kiện Việt Nam có thể cao từ 30 - 80 cm Ở điều kiện ngày dài cây cúc có thể cao đến 1,5 - 2 m

2.7.2.3 Lá

Lá cúc xẻ thùy có răng cưa to, sâu, thường là lá đơn mọc so le nhau, mặt dưới lá bao phủ một lớp lông tơ, mặt trên nhẵn, gân hình mạng lưới Từ mỗi nách lá phát sinh một mầm nhánh Phiến lá có thể to hay nhỏ, dày hoặc mỏng, màu sắc xanh đậm, xanh vàng hay xanh nhạt còn phụ thuộc vào từng giống

2.7.2.4 Hoa, Quả

Hoa lưỡng tính hoặc đơn tính có nhiều màu sắc khác nhau (trắng, vàng, đỏ, tím, xanh) Đường kính hoa từ 1,5 - 12 cm Hoa kép nhiều hơn hoa đơn và thường mọc nhiều hoa trên một cành phát sinh từ các nách lá Hoa cúc gồm nhiều hoa nhỏ hợp lại trên một cuống hoa, hình thành hoa tự đầu trạng mà mỗi cánh thực chất là một bông hoa Tràng hoa dính vào bầu như hình cái ống, trên ống đó phát sinh cánh hoa, những cánh nằm ở phía ngoài thường có màu đậm hơn xếp thành nhiều tầng, sít chặt hay lỏng tùy theo từng giống Cánh có nhiều hình dáng khác nhau cong hoặc thẳng, có loại cánh

ngắn đều, có loại dài, cuốn ra ngoài hay cuốn vào trong

Hoa có 4 – 5 nhị, dính vào nhau bao xung quanh vòi nhụy Vòi nhụy mảnh, hình chỉ chẻ đôi Khi phấn của nhị chín, bao phấn nở tung ra ngoài, nhưng lúc này nhụy còn non chưa có khả năng tiếp nhận hạt phấn, cho nên hoa cúc tuy lưỡng tính mà thường biệt giao, nghĩa là không thể thụ phấn trên cùng một hoa Vì vậy muốn lấy hạt giống phải thụ phấn nhân tạo

Quả là loại quả bế khô chỉ chứa một hạt, hạt có phôi thẳng và không có nội nhũ

2.7.3 Giá trị dược liệu

Ngoài giá trị thẩm mỹ, làm hoa kiểng và mang lại thu nhập cho người sản xuất thì hoa cúc còn là một loại dược liệu rất tốt Thành phần hoạt chất trong hoa cúc có carotenoid, tinh dầu, sesquiterpen, flavvanoid, các acid amin và một số thành phần khác Hạt chứa 15,8% dầu béo, bộ phận dùng là hoa cúc (flos chrysanthemum)

Theo Đông y, cúc hoa vị ngọt đắng, tính hơi hàn, vào các kinh phế, can vàng thận Tác dụng: phát tán phong nhiệt, thanh can minh mục, thanh nhiệt giải độc Dùng cho các trường hợp cảm mạo phong nhiệt, thanh can minh mục, thanh nhiệt giải độc, chóng mặt, ù tai, viêm kết mạc mắt, mụn nhọt lở ngứa

Nước chè hoa cúc: dùng cho các trường hợp ù tai, điếc tai cấp tính do phong tà hoặc do can hòa vượng, can dương thịnh hoặc do khí huyết ứ gây ra

2.7.4 Một số phương pháp nhân giống hoa cúc

Có ba phương pháp nhân giống vô tính đang được áp dụng là giâm cành, tách mầm giá và nuôi cấy tế bào

Nuôi cấy tế bào

Đây là phương pháp khoa học và hiện đại, phục vụ cho sản xuất với quy mô công nghiệp lớn Ưu điểm của phương pháp này là nhân nhanh giống rất cao, từ một

bộ phận của cây cúc sau một năm có thể cho ra đời từ rất nhiều cây Các cây đều sạch bệnh, chất lượng tương đối đồng đều và đồng nhất về mặt di truyền

2.7.5 Tình hình sản xuất và tiêu thụ hoa cúc trên thị trường

2.7.5.1 Thế giới

Trong ngành sản xuất hoa toàn cầu, hoa cúc là loài quan trọng thứ hai sau hoa hồng Cúc còn được xem như là một trong những loài hoa trang trí được ưa chuộng nhất trên toàn thế giới

Bảng 2.1: Một số loại hoa cắt cành bán chạy nhất ở trung tâm đấu giá Hà Lan trong

năm 2005

Cúc 293Tulip 192 Lyly 164

Hàng năm, Nhật Bản cũng là quốc gia sản xuất hoa cúc nhiều nhất, với 2 tỷ

cành, tiếp theo là Hà Lan với 800 triệu; Colombia 600 triệu; Italia: 500 triệu; Hoa Kì:

300 triệu (Boase và cs, 1997) Ở nước Anh, hoa cúc là loại hoa cắt cành quan trọng

đứng thứ hai trên thị trường (Flowers and Plants Association, 2001)

Tại Nhật Bản, hoa cúc cắt cành được sử dụng khá phổ biến: 40% được dùng

làm quà tặng; 25% được dùng để trang trí tại các khách sạn hay trong các lễ hội; 25%

được dùng để trang trí trong gia đình và cúng theo đạo Phật; và 10% phục vụ trong

việc giảng dạy nghiên cứu (Jaime, 2003) Số lượng hoa tiêu thụ tại Nhật Bản năm

2008 được thể hiện trong Bảng 2.2

Bảng 2.2: Số lượng loại hoa tiêu thụ ở Nhật (gồm cả nhập khẩu & tiêu thụ nội địa)

Hà Lan là quốc gia lớn trên thế giới về xuất khẩu hoa, cây cảnh nói chung và

xuất khẩu cúc nói riêng Diện tích trồng cúc của Hà Lan chiếm 30% tổng diện tích hoa

tươi Năng suất hoa tươi từ năm 1990 - 1995 tăng trung bình từ 10 - 15%/ha Hàng

năm Hà Lan đã sản xuất hàng triệu cành hoa cắt và hoa chậu phục vụ cho thị trường

tiêu thụ rộng lớn trên 80 nước trên thế giới Năm 1989, sản xuất 1046 triệu cành hoa

cắt cành

Sau Hà Lan là Colombia, năm 1990 thu được 15 triệu USD từ việc xuất khẩu

hoa cúc, đến năm 1992 đã lên đến 200 triệu USD

Năm 2008, Malaysia cung cấp hơn 120 triệu cành cúc, chiếm 64% thị phần nhập khẩu của Nhật, lượng cung tăng đều hàng năm từ năm 2004 đến 2008 Việt Nam cung ít hơn, nhưng mức tăng trưởng cũng tương tự như Malaysia

Trung Quốc cũng là nơi có nguồn hoa cúc phong phú, việc xuất khẩu hoa cúc được chú trọng ở màu sắc hoa và hình dạng hoa Đây cũng là nước có kỹ thuật tiên tiến trong việc sản xuất hoa cúc khô

2.7.5.2 Việt Nam

Ở nước ta, có nhiều loài cây dại thuộc họ cúc mọc ở nhiều nơi Một số loài

được dùng làm thuốc trong y học cổ truyền, ví dụ như bồ công anh (Lactuca laciniata

L.) Hoa cúc làm cảnh được đưa vào trồng ở nước ta vào khoảng từ thế kỉ XV đến đầu thế kỷ XVI Lúc đó chủ yếu dùng làm cảnh Mãi đến sau này, cúc mới được trồng như một loại cây thương mại Ở nước ta, Hà Nội là nơi có diện tích trồng hoa cúc nhiều nhất, với diện tích 387 ha, sau đó là Lâm Đồng với diện tích là 360 ha Thành Phố Hồ Chí Minh là vùng trồng hoa cúc lớn thứ ba, với diện tích 160 ha (Tổng cục thống kê, 2002)

Hầu hết diện tích trồng hoa cúc ở Lâm Đồng tập trung ở thành phố Đà Lạt, ở các huyện Đơn Dương, Đức Trọng, Lạc Dương diện tích không đáng kể Mặc dù được trồng từ khá lâu, nhưng hoa cúc trở thành một sản phẩm thương mại mới từ năm 1995

Diện tích trồng hoa cúc ở Đà Lạt đã tăng nhanh trong những năm gần đây Diện tích trồng hoa cúc chiếm đến 40 - 50% diện tích trồng hoa nói chung Trong việc trồng hoa cúc, bà con nông dân đã áp dụng nhiều biện pháp kỹ thuật, như dùng hệ thống đèn chiếu sáng, hệ thống tưới phun sương, nhà kín Đa số hoa cúc ở Đà Lạt được trồng với mục đích cắt cành Mỗi năm, Đà Lạt cung cấp cho thị trường từ 10 - 15 triệu cành

Tại Đà Lạt, hiện có khoảng 70 giống, được du nhập chủ yếu ở Hà Lan, theo nhiều con đường khác nhau: chính thức và không chính thức Do đó, việc xác định tên thương phẩm và chủng loại cho từng chủng loại cúc là rất khó khăn

2.7.6 Một số kết quả nghiên cứu về nuôi cấy mô hoa cúc

Nghiên cứu tái sinh và nhân nhanh in vitro cây cẩm chướng, cây cúc sau khi xử

lý gây đột biến của Nguyễn Thị Lý Anh và ctv, viện Sinh học Nông nghiệp Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, năm 2008 Kết quả đạt được: xác định được môi trường tái sinh cây cúc hiệu quả nhất: MS +2 mg/l BAP và 0,5 mg/l IBA, cây tái sinh có mầu

xanh đậm, khỏe, lá cứng; Bước đầu đã xác định được môi trường có khả năng tái sinh

in vitro cây cẩm chướng từ mô lá của 2 giống cẩm chướng nghiên cứu là MS + 0,75 - 1,0 mg TDZ/l + 0,2 mg/l IAA

Hoàn thiện hệ thống sản xuất giống hoa (lan, hồng môn, đồng tiền, lily, cúc) bằng công nghệ nuôi cấy mô quy mô công nghiệp và phát triển vùng sản xuất hoa hàng hoá ở Đồng Bằng Sông Hồng của Đặng Văn Đông và ctv, Viện Nghiên cứu Rau quả, Viện Khoa học Nông Nghiệp Việt Nam năm 2008 Kết quả đạt được là tìm ra các môi trường thích hợp để nhân giống cúc là: Thời gian khử trùng mẫu là 5 phút lần 1 và

2 phút lần 2 Với HgCl2 0,1%; Môi trường khởi động: MS + 2 mg/l BAP + 4 mg/l NAA+ 6,5 mg/l Agar+ 30 g/l đường; Môi trường nhân nhanh là: MS + 2 mg/l BAP +150 ml CW+ 6,5 g /l agar+ 30 g/l đường; Môi trường ra rễ là: MS + 0,5 mg/l NAA+ 6,5 mg/l agar+ 30 g/l đường

Điều tra và nghiên cứu bảo tồn nguồn gen các giống hoa cúc và hoa lan cắt cành hiện đang sản xuất tại Đà Lạt của Nguyễn Văn Kết và ctv, Trường Đại học Đà

Lạt Kết quả đạt được: đã phục tráng thành công 14 giống địa lan, 54 giống cúc in

vitro

Khảo sát một số điều kiện nuôi cấy in vitro hoa cúc của Vũ Hồng Liên, Phạm

Thị Thùy Dương, Từ Bích Thủy, Bùi Văn Lệ khoa sinh học trường Đại học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh và trường Đại học Nông Lâm Thành phố

Hồ Chí Minh thí nghiệm được tiến hành trên ba loại cúc cắt cành thương phẩm phổ biến trên thị trường Thành phố Hồ Chí Minh và các vùng lân cận có tên thông thường

là cúc xanh, cúc mai vàng và cúc đại đóa trắng Sau khi đã loại bỏ phần đế, cánh hoa được cắt thành những đoạn dài 3 mm và cấy trên môi trường Đoạn tràng cánh có vị trí ngay trên đoạn đã loại bỏ là cho mô sẹo tốt nhất ở cả ba loại hoa Sẹo được hình thành sau 1 tuần và tạo chồi sau 14 – 16 ngày Môi trường cho nhiều chồi nhất đối với cúc xanh, cúc mai vàng và cúc đại đóa trắng lần lượt là MS bổ sung 1 mg/l BA và 0,2 mg/l NAA, MS bổ sung 1 mg/l BA và 0,4 mg/l NAA, MS bổ sung 2 mg/l Kinetine và 0,4 mg/l NAA Các chồi vươn thân tốt khi được chuyển sang môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l BA Cắt đốt và cấy trên môi trường MS, đốt sẽ cho rễ sau 3 ngày nuôi cấy

Nhân nhanh in vtro giống hoa cúc Nhật Rivalry của Nguyễn Thị Lý Anh và

Nguyễn Quang Thạch, thí nghiệm được tiến hành trên giống cúc Nhật Rivalry Kết

quả thu được: khử trùng cho mô thân và mô lá cúc là HgCl2 0,2 % trong 7 phút; mô thân mang mắt ngủ được sử dụng làm vật liệu nuôi cấy khởi động và môi trường MS +

1 ppm được chọn nuôi cấy khởi động, nhân nhanh in vitro; môi trường không bổ sung

chất điều hòa sinh trưởng được chọn làm môi trường nuôi cấy cây hoàn chỉnh

Tối ưu quy trình sản xuất giống cây hoa cúc (Chrysanthemum sp) bằng kỹ thuật

thủy canh của Bùi Ngọc Huy và ctv, 2007 Thí nghiệm dùng mẫu chồi ngọn (1- 3 cm)

của cây hoa cúc (Chrysanthemum morifolium) mua ở chợ Hàn, Đà Nẵng được sử dụng làm vật liệu nuôi cấy, chồi in vitro (4 – 5 cm) được sử dụng làm vi thuỷ canh Kết quả

nghiên cứu cho thấy thời gian và nồng độ thích hợp để khử trùng đối với đoạn thân và chồi của cây hoa cúc là 70% trong thời gian 1 phút, HgCl2 0,1% trong thời gian 4 phút (chia làm 2 lần mỗi lần 2 phút) Với nồng độ và thời gian như trên tỷ lệ sống và tái sinh đạt 63,80% Môi trường nhân nhanh phù hợp cho hoa cúc là môi trường có sự kết hợp 1 mg/l BA và 0,2 mg/l NAA đạt hệ số nhân chồi cao nhất là 8,67 chồi/mô và chồi

có chiều cao tối đa là 4,67 cm Môi trường MP3 có chứa 10% dung dịch MS thích hợp

và rút ngắn thời gian ra rễ cũng như kéo dài chồi của cây hoa cúc khi sử dụng phương pháp vi thủy canh Với phương pháp này đã tạo ra rễ trong thời gian 12 ngày và chiều cao chồi đạt cao nhất là 5,6 cm Cây thủy canh có sức sống tốt khi được đem đi trồng ở vườn ươm Với thời gian thích nghi là 1 tuần và trồng ra bên ngoài tỷ lệ cây sống và phát triển tốt đạt rất cao 95%, cây thích nghi ngay với điều kiện khí hậu trong vườn ươm

Nghiên cứu hiệu quả của IAA và BA đến sự tái sinh trực tiếp chồi từ lá của cây hoa cúc của Lâm Ngọc Phương và Phạm Lê Tuấn, trường Đại học Cần Thơ, năm

2007 Các mẫu lá nguyên và phân nửa lá của hoa cúc được dùng để tạo chồi bất định trực tiếp trên môi trường MS đặc với sự kết hợp 0,5 – 2 mg/l BA và 1- 4 mg/l IAA trong quang kỳ 16 giờ Kết quả thí nghiệm cho thấy số chồi cao nhất trên môi trường

có bổ sung 1 mg/l BA kết hợp với 2 mg/l IAA với số chồi/mẫu cao (9,5 chồi) sau 4

tuần nuôi cấy Các chồi cao 35 – 50 mm được tạo rễ in vitro và thuần hóa ex vitro

thành công

2.7.7 Những hạn chế trong nuôi cấy mô hoa cúc và cần thiết phải thực hiện đề tài

Hiện nay, việc áp dụng nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô cho hoa cúc đang được chú ý Đã có nhiều nghiên cứu về nuôi cấy mô cho cây hoa cúc tuy nhiên kết quả thu được từ những nghiên cứu còn nhiều vấn đề bàn cãi, nhiều tác giả đã tiến hành thử nghiệm tạo mô sẹo, nhân chồi, tạo rễ trên nhiều loại môi trường và đã đưa ra các công thức khác nhau Mặt khác, tùy theo từng loại hoa cúc mà cần điều kiện môi trường thích hợp khác nhau Cây hoa cúc Đại Đóa cũng vậy, để cây sinh trưởng tốt và

đủ khả năng đưa cây ra vườn sản xuất thì cần tìm ra môi trường thích hợp để cây sinh trưởng tốt nhất Vì vậy, cần thiết phải tiến hành nhiều hơn nữa các nghiên cứu tìm ra môi trường thích hợp nhất cho việc nhân nhanh giống hoa cúc Đại Đóa

Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm

Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 03 đến tháng 06 năm 2011, tại phòng Di truyền và Chọn giống, viện Khoa học Kỹ thuật Nông Nghiệp Miền Nam, 121 Nguyễn Bỉnh Khiêm, quận 1, Thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu thí nghiệm

3.2.1 Giống cúc Đại Đóa

Giống cúc Đại Đóa được thu thập từ thành phố Phan Thiết, tỉnh Bình Thuận Cây được chọn làm thí nghiệm là những cây khỏe và không bị sâu bệnh

Mẫu cấy được lấy từ chồi ngọn, chồi thân và nụ hoa để làm vật liệu nuôi cấy trong thí nghiệm

3.2.2 Trang thiết bị và dụng cụ

3.2.2.1 Phòng pha chế môi trường

Thiết bị gồm: nồi hấp vô trùng, tủ lạnh, bể rửa chai lọ, bếp điện, lò vi sóng, cân điện tử, cân phân tích, máy lắc từ, nước cất hai lần, máy đo pH, bình nuôi cấy thể tích

250 – 500 ml, pipet, ống đong, đũa thủy tinh, đĩa petri

3.2.2.4 Môi trường cơ bản dùng trong thí nghiệm

Môi trường cơ bản trong thí nghiệm là môi trường MS ( Murashige and Skoog,

Các chất khác: đường sucrose, agar

Môi trường nuôi cấy được được điều chỉnh pH ở 5,7 – 5,8 Môi trường được

hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC, áp suất 1atm trong thời gian 20 phút

3.2.2.5 Điều kiện nuôi cấy

Cường độ chiếu sáng: 2000 lux

Thời gian chiếu sáng: 12 giờ/ngày

Nhiệt độ phòng nuôi cấy: 25 ± 1oC

Ẩm độ trung bình: 70 - 80 %

3.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Xác định nồng độ Hypocloride Calcium và thời gian khử trùng mẫu thích hợp

Vật liệu: chồi thân của cây cúc Đại Đóa

Quy trình thí nghiệm khử trùng: các mẫu được rửa sạch dưới vòi nước, tiếp theo rửa bằng xà phòng, sau đó rửa sạch bề mặt mẫu thí nghiệm dưới vòi nước Mẫu được đưa vào tủ vô trùng, tiếp tục rửa lại 4 lần bằng nước hấp vô trùng Cho mẫu vào dung dịch khử trùng đã pha sẵn, tùy thuộc vào từng nghiệm thức mà bổ sung nồng độ Hypocloride calcium và thời gian khử trùng khác nhau Sau đó ta lấy mẫu ra rửa lại 3 lần bằng nước hấp vô trùng

Mẫu được nuôi cấy vào môi trường khoáng MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng để theo dõi Sau 7 - 10 ngày mẫu không bị nhiễm ta cấy chuyền sang môi trường có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng

- Tổng số mẫu thí nghiệm: 360 mẫu

Chỉ tiêu theo dõi: các chỉ tiêu được theo dõi 10 NSC

Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = số mẫu nhiễm/số mẫu đưa vào x 100

Tỷ lệ mẫu chết (%) = số mẫu chết/số mẫu đưa vào x 100

Tỷ lệ mẫu sạch bệnh (sống) (%) = số mẫu thu được/số mẫu đưa vào x 100

3.3.2 Ảnh hưởng phối hợp giữa BA và NAA đến khả năng tạo mô sẹo của giống

cúc Đại Đóa trong in vitro

Vật liệu: Mẫu sử dụng để tạo mô sẹo là những nụ hoa cúc đã được khử trùng

bằng Hypocloride calcium Sau đó đưa vào môi trường thí nghiệm

MTN: Môi trường MS + 30 g/l đường + 8 g/l agar

Bố trí thí nghiệm:

Thí nghiệm hai yếu tố: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên được tiến hành với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại được thực hiện với 1 bình thủy tinh 500 ml, mỗi bình 5 mẫu

Yếu tố A: nồng độ của NAA (0 mg/l, 0,2 mg/l, 0,5 mg/l ), ký hiệu A0, A1, A2Yếu tố B: nồng độ của BA (0 mg/l, 1 mg/l, 2 mg/l, 3 mg/l) được ký hiệu từ B0,

B1, B2, B3

Phối hợp 2 yếu tố thành 12 nghiệm thức

Số LLL: 3

Số bình/LLL: 3

Số mẫu/bình: 3

Tổng số mẫu dùng trong TN: 324

Chỉ tiêu theo dõi:

- Tỷ lệ mô sẹo được hình thành = tổng số mẫu mô sẹo hình thành/tổng số mẫu đem cấy x 100 (giai đoạn 45 NSC)

- Đường kình mô sẹo: đo đường kính dài nhất của mô sẹo (cm) (45NSC)

- Mô tả đặc điểm hình thái mô sẹo hình thành

3.3.3 Ảnh hưởng của Kinetine đến quá trình nhân nhanh chồi của giống cúc Đại

Đóa in vitro

Vật liệu: mẫu được lấy từ nguồn nhân nhanh cấy chuyền một lần sang môi

trường không có chất điều hòa sinh trưởng Mẫu được cắt ra từng đoạn thân mang một mắt ngủ

Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, đơn yếu tố

Chỉ tiêu theo dõi:

- Số chồi/ mẫu: đếm toàn bộ số chồi trên mẫu

- Tỷ lệ tạo chồi (%): (đếm toàn bộ số mẫu tạo chồi/tổng số mẫu cấy) x 100

- Chiều cao chồi: đo từ gốc đến đỉnh đọt của chồi cao nhất

- Hệ số nhân = tổng số mẫu thu được sau khi nhân/ tổng số mẫu cấy ban đầu

3.3.4 Ảnh hưởng của NAA đến quá trình hình thành rễ của cây cúc Đại Đóa in vitro

Vật liệu: mẫu được lấy từ nguồn nhân nhanh cấy chuyền một lần sang môi

trường không có chất điều hòa sinh trưởng

Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, đơn yếu tố

TN1 (Đ/C): MTN + 0 mg/l NAA

TN2: MTN + 1 mg/l NAA

Chỉ tiêu và phương pháp theo dõi:

- Số rễ/cây: đếm toàn bộ số rễ/ mẫu

- Tỷ lệ ra rễ (%) = (tổng số cây ra rễ/tổng mẫu cấy) x 100

- Chiều dài rễ (cm): đo từ gốc đến chóp rễ dài nhất

- Mô tả đặc điểm hình thái của rễ tạo thành

3.4 Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu thu thập được tính toán trên phần mềm Excel, phân tích ANOVA và đánh giá sự sai khác giữa các nghiệm thức bằng phép trắc nghiệm F So sánh giá trị trung bình giữa các nghiệm thức bằng phép trắc nghiệm LSD ở mức α = 0,05 hoặc α = 0,01 Việc xử lý số liệu được thực hiện trên phần mềm SAS 9.13