KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NAA, BA VÀ KENITINE ĐẾN QUÁ TRÌNH HÌNH THÀNH MÔ SẸO VÀ TÁI SINH NHÂN NHANH GIỐNG HOA CÚC ĐẠI ĐÓA IN VITRO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NAA, BA VÀ KENITINE ĐẾN QUÁ TRÌNH HÌNH THÀNH MƠ SẸO VÀ TÁI SINH NHÂN NHANH GIỐNG HOA CÚC ĐẠI ĐĨA IN VITRO NGÀNH: NƠNG HỌC NIÊN KHÓA: 2007 – 2011 SINH VIÊN THỰC HIỆN: NGUYỄN THỊ THU HIỀN Tháng 08/2011 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NAA, BA VÀ KENITINE ĐẾN Q TRÌNH HÌNH THÀNH MƠ SẸO VÀ TÁI SINH NHÂN NHANH GIỐNG HOA CÚC ĐẠI ĐĨA IN VITRO Tác giả NGUYỄN THỊ THU HIỀN Khố luận đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp Kỹ sư ngành Nông học Giáo viên hướng dẫn PGS TS PHAN THANH KIẾM KS DƯƠNG THỊ LAN OANH Tháng 08/2011 i LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khố luận, ngồi nỗ lực thân cịn có giúp đỡ động viên người Tôi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến: Thầy Phan Thanh Kiếm, tận tình giảng dạy, hướng dẫn giúp đỡ em suốt thời gian thực đề tài hồn thành khóa luận tốt nghiệp Chị Dương Thị Lan Oanh người tạo điều kiện thuận lợi, trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm quý báu góp ý để em thực thí nghiệm q trình thực đề tài Tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn ban lãnh đạo Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam phòng Di truyền Chọn tạo giống trồng Viện tạo điều kiện tốt để thực đề tài Tôi xin trân trọng cảm ơn thầy cô Bộ môn Di truyền - Giống trồng, thầy cô Khoa Nông học, trường Đại học Nông lâm TP.HCM giúp đỡ em q trình học tập thực khóa luận Các bạn ký túc xá bạn thực tập phịng thí nghiệm động viên, giúp đỡ tơi suốt q trình học thực khóa luận Đặc biệt, muốn giành biết ơn sâu sắc tới cha mẹ gia đình người thân sinh thành, nuôi dạy, cổ vũ, động viên giúp đỡ suốt trình học tập để hồn thành chương trình học tập thực khóa luận tốt nghiệp TP Hồ Chí Minh, tháng 08/2011 Sinh viên thực Nguyễn Thị Thu Hiền ii TÓM TẮT Đề tài “Khảo sát ảnh hưởng nồng độ NAA, BA Kinetine đến trình hình thành mơ sẹo nhân nhanh giống hoa cúc Đại Đóa in vitro” tiến hành từ tháng 03 đến tháng 06 năm 2011, phòng Di truyền Chọn giống, viện Khoa học Kỹ thuật Nông Nghiệp Miền Nam, 121 Nguyễn Bỉnh Khiêm, quận 1, Thành phố Hồ Chí Minh nhằm xác định thời gian nồng độ Hypocloride calcium khử trùng mẫu thích hợp, theo dõi trình hình thành mơ sẹo, tái sinh chồi khả rễ từ mẫu cấy hoa cúc Đại Đóa in vitro Các thí nghiệm bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên Kết thí nghiệm: - Thời gian khử trùng thích hợp cho mẫu cấy thân hoa cúc dung dịch Hypocloride calcium 10% 30 phút - Môi trường MS bổ sung 0,2 mg/l NAA kết hợp với mg/l BA mơi trường có khả hình thành mơ sẹo cao, mơ sẹo có đường kính lớn khối mơ có chứa diệp lục tố - Mơi trường MS + mg/l kinitine mơi trường thích hợp cho nhân chồi cúc Đại Đóa in vitro: tạo nhiều chồi, chồi cao, cứng cáp cho hệ số nhân cao - Môi trường MS + 0,1 g/l than hoạt tính + 1,5 mg/l NAA cho có rễ to khỏe, phân nhánh nhiều thích hợp cho việc vườn ươm iii MỤC LỤC Nội dung trang Trang tựa i Lời cảm ơn ii Tóm tắt iii Mục lục iv Danh sách từ viết tắt vii Danh sách bảng viii Danh sách hình ix Danh sách biểu đồ x Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Yêu cầu 1.4 Giới hạn đề tài Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Khái niệm, sở khoa học ứng dụng nuôi cấy mơ thực vật 2.2 Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô 2.2.1 Trên giới 2.2.2 Ở Việt Nam 2.3 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.3.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 2.3.2 Nuôi cấy mô sẹo 2.3.3 Nuôi cấy tế bào đơn 2.3.4 Nuôi cấy protoplast - chuyển gen 2.3.5 Nuôi cấy hạt phấn đơn bội 2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro 2.4.1 Mẫu cấy 2.4.2 Môi trường nuôi cấy 2.4.3 Điều kiện nuôi cấy iv 2.5 Những tồn thường gặp nhân giống in vitro 2.5.1 Tính bất định mặt di truyền 2.5.2 Sự nhiễm mẫu 2.5.3 Sự hóa nâu 10 2.5.4 Hiện tượng thủy tinh thể .10 2.6 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật nuôi cấy mô .10 2.6.1 Các Auxin .10 2.6.2 Cytokinin 11 2.6.3 Giberellin 12 2.6.4 Ethylene 13 2.7 Giới thiệu hoa cúc nghiên cứu nuôi cấy mô hoa cúc .13 2.7.1 Phân loại……………………………………………………………………… 13 2.7.2.2 Thân 13 2.7.2.3 Lá .14 2.7.2.4 Hoa, Quả 14 2.7.4 Một số phương pháp nhân giống hoa cúc 15 2.7.5 Tình hình sản xuất tiêu thụ hoa cúc thị trường 15 2.7.5.1 Thế giới 15 2.7.5.2 Việt Nam 17 2.7.6 Một số kết nghiên cứu nuôi cấy mô hoa cúc 17 2.7.7 Những hạn chế nuôi cấy mô hoa cúc cần thiết phải thực đề tài .20 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian địa điểm tiến hành thí nghiệm 21 3.2 Vật liệu thí nghiệm 21 3.2.1 Giống cúc Đại Đóa .21 3.2.2 Trang thiết bị dụng cụ 21 3.2.2.1 Phòng pha chế môi trường .21 3.2.2.2 Phòng cấy 21 3.2.2.3 Phịng ni 21 3.2.2.4 Môi trường dùng thí nghiệm 22 3.2.2.5 Điều kiện nuôi cấy .23 v 3.3 Nội dung phương pháp nghiên cứu 23 3.3.1 Xác định nồng độ Hypocloride Calcium thời gian khử trùng mẫu thích hợp 23 3.3.2 Ảnh hưởng phối hợp BA NAA đến khả tạo mô sẹo giống hoa cúc Đại Đóa in vitro .24 3.3.3 Ảnh hưởng Kinetine đến trình nhân nhanh chồi giống cúc Đại Đóa in vitro 25 3.3.4 Ảnh hưởng NAA đến trình hình thành rễ cúc Đại Đóa in vitro 25 3.4 Phương pháp xử lý số liệu .26 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Xác định nồng độ Hypocloride calcium thời gian khử trùng thích hợp cho khả đưa mẫu vào phịng thí nghiệm hoa cúc Đại Đóa 27 4.2 Ảnh hưởng phối hợp BA NAA đến khả tạo mô sẹo giống hoa cúc Đại Đóa in vitro 29 4.3 Ảnh hưởng Kinetine đến trình nhân nhanh chồi cúc Đại Đóa in vitro 34 4.4 Ảnh hưởng NAA đến trình hình thành rễ cúc Đại Đóa in vitro 36 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận 39 5.2 Đề nghị 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 PHỤ LỤC .42 vi DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ/nghĩa ANOVA Analysis of Variance BA Benzyl adenine BAP 6- benzyl aminopurin C Nồng độ Ctv Cộng tác viên CV Coefficient of Variance 2,4D 2,4 – Dichlorophenoxyacetic acid Đ/C Đối chứng HSN Hệ số nhân IAA – Indolylacetic acid IBA – Indolebutyric acid LLL Lần lặp lại MS Murashige and Skoog, 1962 MT Môi trường MTN Môi trường NAA – Naphthalene acetic acid NSC Ngày sau cấy NT Nghiệm thức T Thời gian TDZ Thidiazuron CW Coconut water vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Nội dung trang Bảng 2.1 Một số loại hoa cắt cành bán chạy trung tâm đấu giá Hà Lan năm 2005 16 Bảng 2.2 Số lượng loại hoa tiêu thụ Nhật (gồm nhập & tiêu thụ nội địa) năm 2008 16 Bảng 4.1 Ảnh hưởng nồng độ Hypocloride Calcium thời gian khử trùng đến tỷ lệ mẫu sống, nhiễm, chết (%) 10NSC 29 Bảng 4.2 Ảnh hưởng kết hợp NAA BA đến tỷ lệ hình thành mơ sẹo từ nụ hoa cúc Đại Đoá 45NSC 30 Bảng 4.3 Ảnh hưởng kết hợp NAA BA đến đường kính mơ sẹo từ nụ hoa cúc Đại Đoá 45NSC 32 Bảng 4.4 Ảnh hưởng kết hợp NAA BA đến đặc điểm hình thái ngày hình thành mơ sẹo từ nụ hoa cúc Đại Đóa 33 Bảng 4.5 Ảnh hưởng kinitine đến khả nhân chồi cúc Đại Đóa 35 NSC 35 Bảng 4.6 Ảnh hưởng NAA đến rễ cúc Đại Đóa 25 NSC 38 viii DANH SÁCH CÁC HÌNH Nội dung trang Hình 4.1 Mơ sẹo hình thành từ nụ hoa cúc Đại Đoá 45 NSC 34 Hình 4.2 Ảnh hưởng kinitine đến nhân chồi cúc Đại Đóa 35 NSC 37 Hình 4.3 Ảnh hưởng NAA đến trình rễ cúc Đại Đóa 25 NSC 39 Hình Mẫu cúc Đại Đóa bị nhiễm 43 Hình Mơ sẹo hình thành từ nụ hoa cúc Đại Đoá 45 NSC 43 Hình Chồi hình thành từ mẫu thân mang mắt ngủ mơi trường có bổ sung nồng độ kinitine 10 NSC 44 Hình Mẫu thân cúc Đại Đoá mang mắt ngủ tạo chồi nồng độ kinitine 35 NSC 45 Hình Mẫu chồi cúc Đại Đoá phản ứng rễ nồng độ 1,5 mg/l mg/l NAA 45 ix Đồ thị 9: Ảnh hưởng NAA đến số rễ/cây cúc Đại Đoá 25 NSC Đồ thị 10: Ảnh hưởng NAA đến chiều dài rễ cúc Đại Đoá 25 NSC 49 Phụ lục KẾT QUẢ CHUYỂN ĐỔI SỐ LIỆU Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng phối hợp BA NAA đến khả tạo mô sẹo giống hoa cúc Đại Đóa in vitro Bảng chuyển đổi số liệu tỷ lệ hình thành mơ sẹo sang arcsin√% với giá trị từ đến 100% tỷ lệ hình chuyển NAA BA NAA*BA thành (%) p=100 p/100 SQRT ASIN 0 NAA1BA1 0.00 0.028 0.0003 0.017 0.017 NAA1BA2 11.11 11.111 0.1111 0.333 0.340 NAA1BA3 22.22 22.222 0.2222 0.471 0.491 NAA1BA4 33.33 33.333 0.3333 0.577 0.615 0.2 NAA2BA1 0.00 0.028 0.0003 0.017 0.017 0.2 NAA2BA2 55.56 55.556 0.5556 0.745 0.841 0.2 NAA2BA3 100.00 99.972 0.9997 1.000 1.554 0.2 NAA2BA4 100.00 99.972 0.9997 1.000 1.554 0.5 NAA3BA1 0.00 0.028 0.0003 0.017 0.017 0.5 NAA3BA2 100.00 99.972 0.9997 1.000 1.554 0.5 NAA3BA3 100.00 99.972 0.9997 1.000 1.554 0.5 NAA3BA4 100.00 99.972 0.9997 1.000 1.554 0 NAA1BA1 0.00 0.028 0.0003 0.017 0.017 NAA1BA2 11.11 11.111 0.1111 0.333 0.340 NAA1BA3 22.22 22.222 0.2222 0.471 0.491 NAA1BA4 44.44 44.444 0.4444 0.667 0.730 0.2 NAA2BA1 0.00 0.028 0.0003 0.017 0.017 50 đổi 0.2 NAA2BA2 66.67 66.667 0.6667 0.816 0.955 0.2 NAA2BA3 100.00 99.972 0.9997 1.000 1.554 0.2 NAA2BA4 100.00 99.972 0.9997 1.000 1.554 0.5 NAA3BA1 0.00 0.028 0.0003 0.017 0.017 0.5 NAA3BA2 77.78 77.778 0.7778 0.882 1.080 0.5 NAA3BA3 100.00 99.972 0.9997 1.000 1.554 0.5 NAA3BA4 100.00 99.972 0.9997 1.000 1.554 0 NAA1BA1 0.00 0.028 0.0003 0.017 0.017 NAA1BA2 22.22 22.222 0.2222 0.471 0.491 NAA1BA3 33.33 33.333 0.3333 0.577 0.615 NAA1BA4 44.44 44.444 0.4444 0.667 0.730 0.2 NAA2BA1 0.00 0.028 0.0003 0.017 0.017 0.2 NAA2BA2 66.67 66.667 0.6667 0.816 0.955 0.2 NAA2BA3 100.00 99.972 0.9997 1.000 1.554 0.2 NAA2BA4 100.00 99.972 0.9997 1.000 1.554 0.5 NAA3BA1 0.00 0.028 0.0003 0.017 0.017 0.5 NAA3BA2 77.78 77.778 0.7778 0.882 1.080 0.5 NAA3BA3 100.00 99.972 0.9997 1.000 1.554 0.5 NAA3BA4 100.00 99.972 0.9997 1.000 1.554 51 Bảng chuyển đổi số liệu đường kính mơ sẹo sang √(x + 0,5) NAA BA NAA*BA ĐK (X) √(x + 0,5) 0 NAA1BA1 0.707 NAA1BA2 0.4 0.949 NAA1BA3 0.9 1.183 NAA1BA4 0.6 1.049 0.2 NAA2BA1 0.707 0.2 NAA2BA2 0.8 1.140 0.2 NAA2BA3 2.4 1.703 0.2 NAA2BA4 1.9 1.549 0.5 NAA3BA1 0.707 0.5 NAA3BA2 0.9 1.183 0.5 NAA3BA3 1.581 0.5 NAA3BA4 1.4 1.378 0 NAA1BA1 0.707 NAA1BA2 0.6 1.049 NAA1BA3 1.3 1.342 NAA1BA4 0.8 1.140 0.2 NAA2BA1 0.707 0.2 NAA2BA2 0.9 1.183 0.2 NAA2BA3 1.581 0.2 NAA2BA4 1.8 1.517 0.5 NAA3BA1 0.707 0.5 NAA3BA2 0.9 1.183 0.5 NAA3BA3 1.581 0.5 NAA3BA4 1.8 1.517 0 NAA1BA1 0.707 52 NAA1BA2 0.7 1.095 NAA1BA3 1.225 NAA1BA4 0.9 1.183 0.2 NAA2BA1 0.707 0.2 NAA2BA2 0.7 1.095 0.2 NAA2BA3 2.5 1.732 0.2 NAA2BA4 2.1 1.612 0.5 NAA3BA1 0.707 0.5 NAA3BA2 1.225 0.5 NAA3BA3 2.2 1.643 0.5 NAA3BA4 1.5 1.414 ĐK: Đường kính 53 Phụ lục KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ 4.1 Thí nghiệm Ảnh hưởng phối hợp BA NAA đến khả tạo mô sẹo giống hoa cúc Đại Đóa in vitro Tỷ lệ (%) hình thành mơ sẹo từ nụ hoa cúc Đại Đóa                                            Dependent Variable: TYLE                                                     Sum of           Source                      DF         Squares     Mean Square    F Value    Pr > F             Model                       11     13.66262031      1.24205639     154.68     F             NAA                          2      3.34408939      1.67204469     208.23