PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT SAPONIN TRONG CAO SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis) ĐÃ BẢO QUẢN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT SAPONIN TRONG CAO SÂM NGỌC LINH Panax vietnamensis... PHÂN LẬP CÁC HỢP CH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT SAPONIN TRONG

CAO SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis)

PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT SAPONIN TRONG CAO SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis)

ĐÃ BẢO QUẢN

Tác giả

PHẠM DUY LINH

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu

cấp bằng Kỹ sư ngành Công nghệ hóa học

Giảng viên hướng dẫn:

ThS BÙI THẾ VINH

LỜI CẢM ƠN

Lời cảm ơn đầu tiên em xin gửi đến Ban Giám Hiệu cùng các thầy cô Bộ môn Công nghệ Hóa học trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM đã tạo điều kiện cho em học tập và thực hành tốt, tạo nền tảng kiến thức vững chắc cho tương lai sau này

Em xin chân thành cảm ơn thầy PGS.TS Trần Công Luận, giám đốc Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp.HCM đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em được thực hành và nghiên cứu để hoàn thành đề tài luận văn này

Em vô cùng cảm ơn thầy ThS Bùi Thế Vinh đã tận tình hướng dẫn em từ lúc

em bắt đầu đến khi hoàn thành đề tài, thầy luôn theo dõi, quan tâm chỉ dạy em giúp em giải đáp những thắc mắc, khó khăn trong quá trình thực hiện để hiểu rõ hơn về nhiệm

vụ luận văn của mình và thực hiện nhiệm vụ đó cách tốt nhất có thể

Em xin cảm ơn các thầy cô khác của Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp.HCM, cùng các anh chị đã giúp đỡ, động viên em hoàn thành tốt đề tài luận văn của mình

Con xin chân thành gửi đến gia đình lòng biết ơn sâu sắc, gia đình đã tạo cho con mọi điều kiện tốt nhất về tinh thần và vật chất, làm chỗ dựa vững chắc để con yên tâm học tập và hoàn thành tốt bài luận văn của mình

Sau cùng, tôi xin cảm ơn tất cả các bạn lớp DH08HH và tại Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp.HCM đã chia sẻ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian thực hiện

đề tài

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu “PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT SAPONIN TRONG CAO

SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis) ĐÃ BẢO QUẢN” được tiến hành tại Trung

tâm Sâm và Dược liệu Tp.HCM, thời gian từ tháng 01/2012 đến tháng 8/2012

Saponin là một hợp chất chính có hoạt tính sinh học, có nhiều trong các cây

thuộc chi Sâm (Panax), họ Nhâm Sâm (Araliaceae) Panax vietnamensis (sâm Ngọc

Linh hay sâm Việt Nam, sâm K5,…) là một loài sâm đặc hữu của Việt Nam, ngoài các

thành phần giống như các loài sâm nổi tiếng như sâm Triều Tiên (Panax ginseng) hay sâm Mỹ (Panax quinquefolium L) với cấu trúc protopanaxadiol, protopanaxatriol Sâm

Việt Nam còn có hợp chất saponin dammaran kiểu ocotillol là majonosid R2 (MR2) chiếm hơn 50% hàm lượng saponin có trong sâm Thành phần này quyết định những khác biệt của sâm Việt Nam so với sâm Triều Tiên và sâm Trung Quốc trong trị liệu.[27]

Dựa trên kĩ thuật sắc kí: sắc kí cột cổ điển, sắc kí bản mỏng, đề tài đã phân lập

và định danh được hai hợp chất saponin là majonoside R2 (MR2) và Ginsenoside Rb1 Ngoài ra, còn xác định được cấu trúc một phân tử đường là -D-Fructo pyranose bằng kĩ thuật phổ học NMR

The thesis "Isolation of the saponin compounds from Panax vietnamensis

extract preserved" was conducted at HCMC Research Center of Ginseng and Medicinal Materials from 01/2012 to 8/2012

Saponin were the major compounds which have biological activity, can be

found in the genus Ginseng (Panax), araliaceae Panax vietnamensis (ginseng or

ginseng Vietnam Ngoc Linh, K5 ginseng, ) is an endemic species of ginseng in Vietnam, in addition to the ingredients like ginseng species known as Korean ginseng

(Panax ginseng) or American ginseng (Panax quinquefolium L) with the structure of

protopanaxadiol, protopanaxatriol, the Vietnam ginseng has the saponin compounds with majonosid dammaran ocotillol type (majonosid R2, MR2) over 50% concentration of saponin in ginseng This component was the remarkable differences compared with Korean ginseng and Chinese ginseng[27]

Basing on the chromatographic techniques: column chromatography, thin layer chromatography This study has isolated and identified two compounds are saponins majonoside R2 (MR2) and ginsenoside Rb1 In addition, a sugar was also isolated and elucidared,it’s structure was determited that α-D-fructo-pyranose by NMR spectroscopy techniques

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

ABSTRACT iii

MỤC LỤC iv

Chương 1 1

GIỚI THIỆU 1

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.2 MỤC ĐÍCH VÀ PHẠM VI CỦA ĐỀ TÀI 2

1.3 Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI 2

Chương 2 3

TỔNG QUAN 3

2.1 HỌ NHÂN SÂM (ARALIACEAE) 3

2.2 CHI SÂM (PANAX) 3

2.3 PHÂN BỐ 4

2.4 GIỚI THIỆU VỀ SÂM NGỌC LINH 4

2.4.1 Nguồn gốc và lịch sử phát hiện 4

2.4.2 Danh pháp khoa học 5

2.4.3 Hình thái thực vật 5

2.4.4 Dược tính 8

2.4.5 Quá trình nghiên cứu TPHH của sâm Ngọc Linh 10

2.5 TỔNG QUAN VỀ HỢP CHẤT SAPONIN 11

2.5.1 Định nghĩa 11

2.5.2 Tính chất của saponin 12

2.5.3 Phân loại saponin (theo thành phần hóa học) 13

2.5.4 Sự phân bố trong thực vật 15

2.6 KỸ THUẬT SẮC KÍ 16

2.6.1 Sắc kí nhanh 17

2.6.2 Sắc kí cột cổ điển 17

2.6.3 Sắc kí lớp mỏng 18

Chương 3 20

3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 20

3.1.1 Thời gian 20

3.1.2 Địa điểm 20

3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 20

3.3 VẬT LIỆU 20

3.3.1 Đối tượng nghiên cứu 20

3.3.2 Dụng cụ 20

3.3.3 Hoá chất 21

3.4.1 Sắc kí cột nhanh 23

3.4.2 Sắc ký cột cổ điển 24

3.4.2.1 Sắc ký cột T2 24

3.4.2.2 Sắc kí cột T4 25

Chương 4 26

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

4.1 KẾT QUẢ SẮC KÝ CỘT NHANH 26

4.2 KẾT QUẢ SẮC KÝ CỘT CỔ ĐIỂN 27

4.2.1 Kết quả cột T2 27

4.2.2 Kết quả sắc kí cột tổng kết các phân đoạn cột T4 31

4.2.3 Tổng kết toàn bộ kết quả 34

4.3 THẢO LUẬN 34

Chương 5 35

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35

5.1 KẾT LUẬN 35

5.2 KIẾN NGHỊ 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO 36

PHỤ LỤC 39

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Kết quả khảo sát hạt thu hái trong tự nhiên 7

Bảng 3.1 Thông số cột sắc kí cao áp (sắc kí cột nhanh) 24

Bảng 3.2 Thông số cột sắc kí của các phân đoạn cột thường 24

Bảng 3.3 Các phân đoạn của cột T2 24

Bảng 3.4 Các phân đoạn của cột T2-3 25

Bảng 3.5 Các phân đoạn của cột T4 25

Bảng 4.1 Kết quả sắc ký cột nhanh 26

Bảng 4.2 Kết quả sắc ký cột T2 27

Bảng 4.3 Kết quả các phân đoạn tách được từ phân đoạn cột T2-3 28

Bảng 4.4 Kết quả các phân đoạn tách được từ phân đoạn cột T4 31

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Trang

Hình 2.1 Cây sâm Ngọc Linh 5

Hình 2.2 Rễ sâm Ngọc Linh trong tự nhiên 8

Hình 2.3 Rễ sâm Ngọc Linh trồng 8

Hình 2.4 Cấu trúc hóa học của saponin MR2 11

Hình 2.5 Cấu trúc hóa học của saponin Rb1 11

Hình 2.6 Cấu trúc hóa học của saponin Rd 11

Hình 2.7 Cấu trúc hóa học của saponin Rg1 11

Hình 2.8 Phân loại saponin theo cấu trúc hóa học 13

Hình 2.9 Một số khung triterpen (tt) 15

Hình 3.1 Sơ đồ quy trình tách, tinh sạch và xác định cấu trúc một chất 22

Hình 3.2 Sơ đồ tóm tắt các kết quả thu được 23

Hình 4.1 Bản SKLM các phân đoạn cột nhanh 26

Hình 4.2 Kết quả các phân đoạn tách được từ phân đoạn T2 27

Hình 4.3 Bản SKLM tất cả các phân đoạn cột T2-3 30

Hình 4.4 Kết quả SKLM của phân đoạn T2-3-6 so với chuẩn MR2 30

Hình 4.5 Cấu trúc hóa học của Saponin MR2 31

Hình 4.6 Bản SKLM tất cả các phân đoạn cột T4 32

Hình 4.7 T4-6 chấm so với các chuẩn 33

Hình 4.8 Cấu trúc Ginsenoside Rb1 33

Chương 1

GIỚI THIỆU1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Sâm Ngọc Linh là loài sâm đặc hữu ở Việt Nam đã được chứng minh có nhiều tác dụng dược lý như tăng cường miễn dịch, tăng sức đề kháng cho cơ thể, bảo vệ tế bào gan, cải thiện trí nhớ, giúp chống viêm, phục hồi sự suy giảm chức năng giúp cho tình trạng của cơ thể trở lại bình thường, kháng các độc tố gây hại tế bào, ngăn ngừa sự lão hóa, giúp kéo dài sự sống của tế bào và tăng các tế bào mới Đặc biệt, sâm Ngọc Linh còn có những tính năng mà sâm Triều Tiên và sâm Trung Quốc không có là tính kháng khuẩn, chống trầm cảm, giảm lo âu, chống oxy hóa, và hiệp lực tốt với thuốc kháng sinh, thuốc trị bệnh tiểu đường.[12,24,30]

Sâm Ngọc Linh ngoài thành phần ginsenoside như các sâm khác, còn chứa hợp chất majonoside R2 (MR2), đây là điểm khác biệt mà các loài sâm khác không có.[15]

Do vậy, việc đánh giá định tính, định lượng ginsenoside, đặc biệt là majornoside R2 (MR2) góp phần tiêu chuẩn hóa nguyên liệu, đánh giá chất lượng sâm Việt Nam, cũng như để so sánh, phân biệt với các loài sâm khác hay các mẫu dược liệu có hình dạng giống sâm là rất quan trọng

Hiện nay, nguồn dược liệu sâm rất phong phú và đa dạng, tuy nhiên nguồn sâm Ngọc Linh là loại sâm quý hiếm được xếp đầu bảng trong sách đỏ thực vật Việt Nam năm 1994 và có giá trị kinh tế rất cao,[11,16] chính vì giá trị này mà không ít các nhà kinh doanh vô tình hay cố ý khẳng định nguồn sâm của mình là sâm Ngọc Linh mặc

dù chưa có đánh giá một cách chính xác về mặt khoa học: đặc điểm hình thái, thành phần hoá học, Đứng trước thực trạng này, về mặt hoá phân loại, cần có các chất chuẩn được tinh sạch từ nguyên liệu sâm Ngọc Linh rõ nguồn gốc như các ginsenoside , đặc biệt là hợp chất majonoside R2 (MR2), dùng làm chuẩn đánh giá tiêu chuẩn nguyên liệu sâm Việt Nam Với mong muốn tiếp tục tìm kiếm các thành phần hoá học tồn tại trong sâm Ngọc Linh có nguồn gốc rõ ràng để làm các chuẩn đánh giá, kiểm

định sâm mà tôi thực hiện đề tài: “Phân lập các hợp chất saponin trong cao sâm Ngọc

Linh (Panax vietnamensis) đã bảo quản”

1.2 MỤC ĐÍCH VÀ PHẠM VI CỦA ĐỀ TÀI

Phân lập các hợp chất saponin từ cao chiết methanol của cây sâm Ngọc Linh

(Panax Vietnamensis)

1.3 Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI

Cung cấp chất chuẩn đánh dấu (marker compound) phục vụ công tác đánh giá, kiểm tra chất lượng nguyên liệu cây sâm Ngọc Linh

Làm tiền đề cho những nghiên cứu sâu hơn về thành phần, hoạt tính sinh học của những hợp chất saponin đã tách được

C hương 2

TỔNG QUAN 2.1 HỌ NHÂN SÂM (ARALIACEAE)

Theo thống kê năm 1985 (Grushvitsky, Hà Thị Dung), họ Araliaceae ở Việt

Nam có 110 loài, thuộc 18 chi Trong đó, có 46 loài và 11 thứ là đặc hữu trong hệ thực vật Việt Nam, đã có 40 loài được sử dụng làm thuốc Đến nay, số loài chưa được cập nhật và thống kê đầy đủ nhưng trên thực tế số loài trong họ đã tăng lên trên 130 loài (Shang, 1983, 1997) với trên 60 loài đặc hữu.[15]

2.2 CHI SÂM (PANAX)

Chi Panax thuộc giới Thực vật (Plantae), ngành Thực vật có hoa (Magnoliophyta), l ớp Hai lá mầm (Magnoliopsida), bộ Hoa tán (Apiales), họ Cam Tùng (Araliaceae) theo hệ thống phân loại mới nhất của Jun Wen thống kê lại 11 loài

và 1 thứ loài của chi Panax.[22]

Ở Việt Nam, ghi nhận có sự hiện diện của 4 loài thuộc chi sâm: Panax pseudoginseng Wall, Panax bipinnatifidus Seem, Panax stipuleanatus H T Tsaiet K

M Feng và Panax vietnamensis Ha et Grushv Đây là loài thứ 11 được phát hiện trong

vòng 30 năm gần đây, là loài mới đối với khoa học và là loài đặc hữu trong hệ thực vật Việt Nam.[22]

Panax là cây thảo mộc, sống nhiều năm, cao 0,4-0,8 m Thân rễ (củ) nạc gồm

nhiều đốt, phân nhánh, nằm ngang, đường kính 1,5-2,5 cm, phần đầu có nhiều vết sẹo

do thân khi sinh tàn lụi, người ta dựa vào sẹo trên thân rễ để tính tuổi của sâm, chiều dài rễ tùy theo số năm sinh trưởng Lá kép chân vịt, gồm 2-3 cái, mọc vòng, lá chét thuôn, dài 10-14 cm, rộng 3-5 cm, gốc nhọn, đầu vuốt nhọn, mép khía răng cưa, cuống

lá chét ngắn dưới 1 cm.[22]

Cụm hoa tán, mọc ở ngọn, thường gồm 1 tán, cá biệt có tán phụ, cuống cụm hoa dài 15-30 cm Hoa nhỏ, màu trắng ngà, cuống hoa 1-1,5 cm, đài 5, hợp ở gốc, hình tam

giác, 5 cánh hoa hình tam giác rộng, nhị 5, chỉ nhị mảnh, bầu 2 ô, cá biệt 1 ô, bầu nhụy

có 2-3 lá noãn, đầu nhụy chẻ đôi.[22]

Quả hình cầu hoặc hình cầu hơi dẹt, đường kính 0,6-1,0 cm, khi chín màu đỏ hoặc cam, có chấm đen Hạt 1-2, gần tròn, đường kính 2-3 mm, dài 3-4 mm, màu trắng xám.[22]

Năm 1973, lúc 16 giờ ngày 19 tháng 3, đoàn điều tra Dược Liệu ban Dân Y khu

5 do dược sĩ Đào Kim Long và Nguyễn Châu Giang hướng dẫn, đã phát hiện được một

loài Panax mọc thành quần thể ở độ cao 1800 m tại vùng Ngọc Lây, huyện Đắc Tô,

tỉnh Kon Tum, và đặt tên là “sâm Đốt Trúc” với tên khoa học sơ bộ xác định là Panax articulates L., họ Araliaceae.[3] Theo đánh giá của Tiến sĩ Trần Chí Liêm, Thứ trưởng Bộ Y tế Việt Nam: đây là cống hiến quan trọng cho khoa học, bổ sung tri thức mới về

vùng phân bố chi Panax xuống tới vĩ tuyến 15 và bổ sung cho chi Panax họ Araliaceae một loài mới.Sau khi sâm được phát hiện, khu uỷ Khu 5 đã bí mật bảo vệ

và khai thác, giao cho xưởng Dược Trung Trung Bộ chế biến làm thuốc phục vụ cán bộ, chiến sĩ và nhân dân, đồng thời gửi mẫu ra Bộ Y tế, Viện Dược Liệu Hà Nội nghiên cứu.[6]

Trải qua hơn 30 năm, sâm Ngọc Linh, một loài sâm đặc hữu của nước ta đã

được thế giới biết đến với tên khoa học là Panax vietnamensis Ha et Grushv [5]

2.4.2 Danh pháp khoa học

Dược sĩ Đào Kim Long đã đặt tên khoa học của cây sâm Ngọc Linh này là

Panax articulatus KL Dao, hay Panax articulatus Kim Long Đào theo tên người phát hiện.[3]12 năm sau, tên Nhân Sâm Việt Nam và tên khoa học là Panax vietnamesis Ha

et Grushy, họ Cam Tùng Araliaceae, được công bố tại Viện Thực Vật Kamarov (Liên

Xô cũ) năm 1985, do Hà Thị Dung và I V Grushvistky đặt tên [5] Áp dụng quy tắc quốc tế về danh pháp thực vật công bố năm 1994 (ICBN - Tokyo code), điều 1, mục 3, phần C, danh pháp khoa học của sâm Ngọc Linh có

thể được nối tên của người thứ hai công bố với tên người thứ nhất qua chữ ex,

và khi đó tên

khoa học của cây nhân sâm Ngọc Linh được viết hợp pháp theo luật quốc tế

hiện nay sẽ phải là

Panax articulatus KL Dao (1973) ex Ha et Gruskv (1985).[5]

2.4.3 Hình thái thực vật

Sâm Ngọc Linh thuộc dạng cây thân thảo, sống nhiều năm nhờ thân rễ, cao khoảng 40-60 cm, đôi khi trên 1 m Thân rễ nạc, đường kính 1-3,5 cm, chiều dài tùy

Giới (regnum): Plantae

(không phân hạng): Angiospermae

(không phân hạng): Eudicots

(không phân hạng): Asterids

Họ (familia): Araliaceae

Phân họ (subfamilia): Aralioideae

Phân chi (subgenus): Panax Hình 2.1: Cây sâm Ngọc Linh

Đoạn (section): Panax

Loài (species): P vietnamensis

theo số năm sinh trưởng, màu vàng nhạt hay màu vàng đất, có nhiều đốt, mang nhiều vết sẹo, mỗi vết sẹo tương đương với 1 năm tuổi Thân rễ mang nhiều rễ con và những vết nhăn dọc, dễ bẻ gãy, mùi thơm nhẹ, vị đắng hơi ngọt Ở cuối thân rễ có rễ củ thường ít phát triển, có dạng con quay, hình trụ, đôi khi có dạng hình người, màu vàng nhạt, mang nhiều rễ con và có vân ngang Thân rễ to nhất được phát hiện năm 1978 dài

90 cm, có 62 vết sẹo và nặng 710 g.[8]

Thân mọc thẳng đứng, màu xanh hoặc hơi tím, đường kính 5-8 mm, thường rụng hằng năm sau mùa sinh trưởng Tuy vậy, đôi khi có 2-3 thân vẫn tồn tại vài năm Thân rễ có thể phân nhánh nhiều lần và hình thành một bụi sâm, nhưng rất hiếm Cây sâm thường héo chết vào mỗi mùa đông, để rồi mọc trở lại từ củ sâm vào đầu mùa xuân.[8]

Lá kép hình chân vịt, mọc ở đỉnh thân Cuống lá kép dài 2-12 cm, mỗi lá kép thường có 5 lá chét hình trứng ngược, hình mác hoặc bầu dục, mép khía răng cưa, đầu

lá nhọn, đôi khi có mũi nhọn, gốc lá hình nêm Lá chét ở giữa lớn nhất, dài 15 cm, rộng 3-5 cm Gân lá hình lông chim, thường có 10 cặp, gân phụ hình mạng Phiến lá màu xanh lục, mảnh, dễ rách, có nhiều lông cứng dài 1-2 mm, mặt dưới ít hơn.[18]

Cây nảy mầm từ hạt chỉ có 1 lá kép với 5 lá chét, năm thứ 3 đa số 2 lá kép, năm thứ 4 đa số 3 lá kép, năm thứ 5 và 6 đa số 4-5 lá kép, rất hiếm gặp cây 6 lá kép.[18]

Cụm hoa thường xuất hiện ở cây có 3 lá kép trở lên Cuống cụm hoa dài 10-12

cm mang 1 tán đơn ở tận cùng, đôi khi có thêm 1-4 tán phụ hay 1 hoa đơn ở phía dưới tán chính Mỗi cụm hoa có 50-120 hoa, cuống dài 1-1,5 cm.[19]

Hoa màu vàng lục nhạt, đường kính 3-4 mm, gồm 5 lá dài hợp thành hình chuông, trên chia thành 5 răng nhỏ, hình tam giác, dài 1-1,5 mm, 5 cánh hoa, 5 nhị màu trắng, dài 1,5-2 mm Bao phấn hình xoan, đính lưng, đĩa hoa hơi lồi Bầu cao 1-1,5 mm, có 2 lá noãn, nhưng thường chỉ có 1 lá noãn phát triển Hoa thường nở vào buổi sáng từ 9 giờ đến 11 giờ, lúc này nhiệt độ không khí khoảng 18-20°C và độ ẩm 85-90% Hoa nở dần từ ngoài vào và từ dưới lên Đài hoa rụng 1-2 ngày sau khi nở và tán bắt đầu kết quả Mùa hoa thay đổi tùy theo vùng nhưng thường bắt đầu từ tháng 4 đến tháng 6.[19]

Quả mọng, khi chín màu đỏ tươi, có chấm đen không đều ở đỉnh Quả chủ yếu

có 1 hạt hình thận, một số ít quả hình cầu dẹt chứa 2 hạt và số quả trên cây bình quân khoảng 10 đến 30 quả Quả có chứa 3 hạt hay hơn đến nay chưa tìm thấy.[19]

Trọng lượng trung bình 1 quả là 275mg (ghi nhận trên quả) Thỉnh thoảng gặp quả khi chín không có chấm đen giống như quả của nhân sâm Hạt màu trắng hay vàng nhạt, dài 6-8 mm, rộng 5-6 mm, dày 2 mm, bề mặt có nhiều chỗ lồi lõm Trọng lượng trung bình của 1 quả là 275 mg và 1 hạt là 75 mg Số quả chín tối đa trên 1 tán có thể đến 40 nhưng thường số hạt thu được đáp ứng yêu cầu gieo trồng chỉ từ 10- 15 hạt Quả chín rải rác trong tháng 5-tháng 6, chín rộ vào tháng 8 và giảm dần vào các tháng cuối năm Ở triền phía đông Ngọc Linh thuộc tỉnh Quảng Nam, mùa ra hoa kết trái có thể chậm hơn 1 tháng so với vùng sâm thuộc triền phía tây thuộc tỉnh Kon Tum.[17]

Cây sâm Ngọc Linh đặc biệt ưa ẩm và ưa bóng, thường mọc rải rác hoặc thành đám nhỏ dưới tán rừng kín xanh ẩm, độ cao 1900-2300 m Nhiệt độ trung bình ở vùng

có sâm mọc tự nhiên từ 15-18oC, độ ẩm 90%, lượng mưa khoảng 3000 mm/năm, đất nhiều mùn, giàu chất dinh dưỡng

Bảng 2.1: Kết quả khảo sát hạt thu hái trong tự nhiên.[14]

Khảo sát trên 4910 quả thu hái tự nhiên %

Hình 2.2: Rễ sâm Ngọc Linh trong tự nhiên

Hình 2.3: Rễ sâm Ngọc Linh trồng 2.4.4 Dược tính

Trong hai năm 1974 và 1975, Viện Dược Liệu thuộc Bộ Y tế nghiên cứu thấy thành phần saponin triterpen của Tam Thất, Nhân Sâm và sâm Ngọc Linh có 9 hoặc 11 chất có Rf ngang nhau, màu giống nhau ở hai hệ dung môi khác nhau Theo đánh giá của Nguyễn Minh Đức, Võ Duy Huấn trong nǎm 1994 thì từ sâm Ngọc Linh đã chiết được 50 hợp chất, xác định cấu trúc hóa học cho thấy 26 hợp chất có cấu trúc đã biết (thường thấy ở sâm Triều Tiên, sâm Mỹ, sâm Nhật) và 24 saponin dammaran có cấu trúc mới không bắt gặp tại các loại sâm khác trên thế giới Sâm Ngọc Linh chứa chủ yếu các saponin triterpen, nhưng cũng là một trong những cây sâm có hàm lượng saponin khung dammaran cao nhất (khoảng 12-15%) và số lượng saponin nhiều nhất

16 acid amin (trong đó có 8 acid amin không thay thế được) và 18 nguyên tố đa lượng,

vi lượng.[27]

Những kết quả nghiên cứu, phân lập thành phần hóa học mới nhất được công bố còn kéo dài danh sách saponin của sâm Ngọc Linh hơn nữa, lên tổng cộng 52 loại.[22] Những kết quả nghiên cứu mới nhất bổ sung thêm danh sách saponin và acid amin dài hơn nữa Theo tiến sĩ Nguyễn Bá Hoạt, cán bộ Viện Dược liệu thì về mặt hoá học, thân

rễ và rễ củ sâm Ngọc Linh hiện nay (2007) đã phân lập được 52 saponin Trong lá và cọng đã phân lập được 19 saponin dammaran, trong đó có 8 saponin có cấu trúc mới

Đã xác định được trong sâm Ngọc Linh 17 acid amin, 20 chất khoáng vi lượng và hàm lượng tinh dầu là 0,1%.[8]

Sâm Triều Tiên và sâm Trung Quốc mọc ở vùng ôn đới và hàn đới Chỉ riêng sâm Việt Nam mọc ở vùng khí hậu nhiệt đới Khác biệt chính ở các loài sâm này là đều có hoạt chất chính là saponin nhưng thành phần các nhóm chất khác nhau Sâm Việt Nam được xếp cùng nhóm với sâm Triều Tiên là nhóm có hầu hết hoạt chất saponin thuộc khung dammaran với số lượng và hàm lượng ginsenosid cao, chỉ có 1-2 saponin olean có hàm lượng không đáng kể Riêng sâm Trung Quốc chỉ có nhóm saponin dammaran, không có saponin olean Cả ba được xem là những loài sâm quý hiện nay Tuy nhiên chỉ có sâm Việt Nam mới có hợp chất saponin dammaran kiểu ocotillol với majonosid R2 (MR2) chiếm hơn 50% hàm lượng saponin có trong sâm Việt Nam Thành phần này quyết định những khác biệt của sâm Việt Nam so với sâm Triều Tiên và sâm Trung Quốc trong trị liệu.[25] Đặc biệt MR2 chiếm gần 50% hàm lượng saponin toàn phần từ phần dưới mặt đất của SVN và trở thành 1 hợp chất chủ yếu của SVN so với thành phần saponin trong các loài sâm khác trên thế giới và gấp

48 lần hiệu suất chiết được từ Đại Diệp Tam Thất (Panax japonicum C.A Mey Var major (Burk.) C.Y.Wu et K.M.Feng).[31]Hoạt chất majonoside R2 (MR2) có tác động

ức chế cả giai đoạn bắt đầu và giai đoạn tiến triển của tế bào ung thư biểu mô da chuột

được gây bằng nitric oxide phối hợp với 12-O-tetradecanoylphorbol-13 acetate (TPA)

hay bằng peroxynitrite phối hợp với TPA.[25]

Như vậy, sâm Việt Nam là một trong những loại sâm có hàm lượng saponin nhiều nhất, tương tự một số cây sâm quý đã từng được nghiên cứu sử dụng từ lâu trên thế giới Hợp chất hóa học đa dạng và tác dụng thực tiễn đối với sức khỏe của con

người khiến sâm Ngọc Linh hiện nay được bán trên thị trường với giá càng ngày càng cao, thậm chí còn cao hơn sâm Triều Tiên nhiều lần.[13]

2.4.5 Quá trình nghiên cứu TPHH của sâm Ngọc Linh

1973: Nguyễn Thới Nhâm, Nguyễn Văn Bàn (Viện Dược Liệu) Sơ bộ phân tích trên SKLM so sánh sâm Việt Nam với Hồng Sâm Triều Tiên và Sâm Tam Thất

1976: Nguyễn Thới Nhâm, Lutomski, J ( Viện cây thuốc Poznan-Balan) Phân

lập 13 hợp chất saponin đặt tên K5VN Panax osid 1-13 tương tự như saponosid có

trong Sâm Triều Tiên

1978- 1981: Nguyễn Thới Nhâm và các cộng sự (Đơn vị nghiên cứu chuyên đề SK5) Nghiên cứu thành phần hóa học cơ bản và hợp chất saponin SVN: Xác định các acid béo, acid amin, các yếu tố vi đa lượng v.v Phân lập được các saponin G.Rb1, G.Rg1 và MR2

1987: Nguyễn Thới Nhâm, Trần Công Luận, Lutomski, J (Viện cây thuốc Poznan- Balan) Phân lập và xác định cấu trúc 5 hợp chất saponin (MR2, PG.RT4, G.Rg1, G.Rd, G.Rb1)

1987-1990: Nguyễn Thới Nhâm và cộng sự (Trung tâm Sâm VN) Nghiên cứu thành phần hoá học trong callus SVN nuôi cấy mô Phân lập được 5 saponin và xác định được cấu trúc của PG-F11 và VG-R1 Các thành phần khác như acid béo, acid amin, b- sitosterol, daucosterin và các yếu tố vi đa lượng cũng được xác định

1987-1990: Trần Công Luận, Lutomski, J (Viện cây thuốc Poznan-Ba lan) Phân lập và xác định cấu trúc 7 polyacetylen trong sâm VN

1990: Nguyễn Minh Đức, Yamasaki K (Viện nghiên cứu khoa học Dược, Trường đại học Y Hiroshima - Nhật) Phân lập và xác định cấu trúc 49 saponin trong SVN, phát hiện 24 saponin mới, đặt tên VG.R1-R24

1999-2001: Võ Duy Huấn, Yamasaki, K (Viện nghiên cứu khoa học Dược, Trường đại học Y Hiroshima – Nhật) Phân lập và xác định cấu trúc 19 saponin trong

lá SVN, phát hiện 8 saponin mới đặt tên VG.L1-L8

1999-2001: Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp.HCM và Sở Y tế Quảng Nam Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu: phần thân rễ và rễ củ (đã đưa vào Dược điển Việt Nam tập 3) và phần lá (dự thảo)

2001-2002: Trần Lê Quan, Kadota, S (Viện nghiên cứu Y học Phương Đông, trường Đại học Y Dược Toyama, Nhật bản) Phát hiên thêm 3 saponin và 1 genin

trong SVN, 2 saponin mới là 20-O-Me-G.Rh1 và VG-R25

Một vài cấu trúc các hợp chất saponin

Saponin là một nhóm glycosid lớn mà cấu trúc hóa học gồm có hai phần: phần đường và phần không đường thường gọi là aglycon, gặp rộng rãi trong thực vật, có tính chất đặc trưng Saponin còn gọi là saponosid do chữ latinh “sapo” nghĩa là “xà phòng” (vì tạo bọt như xà phòng) Tuy vậy một vài tính chất trên không thể hiện ở một vài saponin.Ví dụ: sarsaparillosid thì không có tính phá huyết cũng như tính tạo phức với cholesterol.[9]

Saponin cũng có trong một số động vật như hải sâm, cá sao.[1]

Một số dược liệu chứa saponin: Atisô, Bạch Thược, Cam Thảo, Cát Cánh, Cỏ Nhọ Nồi, Dâm Dương Hoắc, Dứa Bà, Đại, Hoa Hoè, Hoàng Kỳ, Kim Ngân, Mạch Môn, Ngưu Tất, Nhân Sâm, Phục Linh, Rau Má, Râu Mèo, Ngũ Gia Bì Chân Chim, Sài Đất, Sài Hồ, Sài Hồ Nam Sơn Thù, Tam Thất, Táo Nhân, Thất Diệp Đởm, Thiên Môn, Trạch Tả, Trinh Nữ Hoàng Cung, Viễn Chí, Vối.[2]

2.5.2 Tính chất của saponin

Saponin thường kết tinh ở dạng vô định hình , vị đắng, khó tinh chế, điểm nóng chảy từ 200°C trở lên Bị tủa bởi acetat chì , sulfat amonium, hydroxid barium Phần genin tức là sapogenin và dẫn chất acetyl sapogenin thường dễ kết tinh hơn saponin [9]

Saponin triterpenoid thì có loại trung tính và loại acid, saponin steroid thì có loại trung tính và loại kiềm.[9]

Tan trong nước, cồn, rất ít tan trong aceton, eter, hexan.[9]

Tạo bọt nhiều và bền khi lắc với nước vì có hoạt tính bề mặt cao Có thể giải thích là do phân tử saponin có phần ưa nước và phần kị nước Tính chất này làm cho saponin giống với xà phòng: có tính nhũ hóa và tẩy sạch.[9]

Làm vỡ hồng cầu ngay ở những nồng độ rất loãng Saponin làm vỡ tế bào hồng cầu còn gọi là tính phá huyết Tính phá huyết có liên quan đến sự tạo phức giữa saponin với cholesterol và các ester của cholesterol trong màng hồng cầu, nhưng lại thấy có nhiều trường hợp chỉ số phá huyết và khả năng phá huyết không tỉ lệ thuận với nhau nên phải xét đến ảnh hưởng của saponin trên các thành phần khác của màng hồng cầu Qua việc theo dõi tính phá huyết, người ta thấy rằng cấu trúc của phần aglycon có tác dụng trực tiếp đến tính phá huyết còn phần đường ảnh hưởng đến mức độ phá

Kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt, có tác dụng long đờm, lợi tiểu, liều cao gây nôn mửa, đi lỏng.[4]

Có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các chất 3-b-hydroxysteroid khác.[9]

Dưới tác dụng của enzym có trong thực vật hay vi khuẩn hoặc do axit loãng, saponin bị thuỷ phân thành các phần gồm sapogenin và phần đường gồm một hoặc nhiều phân tử đường Các đường phổ biến là D-glucose, D-galactose, L-arabinose

Phần sapogenin có thể là sapogenin steroid hoặc sapogenin triterpenoid.[4]

2.5.3 Phân loại saponin (theo thành phần hóa học)

Saponin được phân loại thành hai nhóm lớn dựa vào phần aglycon là: saponin steroid và saponin triterpen Trong đó, saponin triterpen còn được chia thành

pentacyclic (khung oleanan, ursan, hopan, lupan…) và tetracyclic (khung dammaran, nostan, cucurbitan…), còn saponin steroid thì có các nhóm như spirostan, furostan…[7]

Hình 2.8: Phân loại saponin theo cấu trúc hóa học.[7]

12 11

6 7 7

13

12 11

19

23 24

2

10 1

6 7 8

13

12 11

17 18

23 24

20 30

13

12 11

17 18

22 30

29 28

Hình 2.9: Một số khung triterpen[7]

2.5.4 Sự phân bố trong thực vật

Saponin steroid thường gặp trong những cây một lá mầm Các họ hay gặp là: Amaryllidaceae, Dioscoreaceae, Liliaceae, Smilacaceae Ðáng chú ý nhất là một số loài thuộc chi Dioscorea L Agave L.Yucca L.[22]

Saponin triterpenoid thường gặp trong những cây hai lá mầm thuộc các họ như: Acanthaceae, Amaranthaceae, Araliaceae, Campanulaceae, Caryophyllaceae, Fabaceae, Polygalaceae, Rubiaceae, Sapindaceae, Sapotaceae.[22]

Trong cây saponin thường tích lũy ở những bộ phận khác nhau: tích lũy ở quả như Bồ Kết, Bồ Hòn, rễ như Cam Thảo, Viễn Chí, Cát Cánh, lá như Dứa Mỹ.[2]

2.5.5 Hoạt tính của saponin

Kháng khuẩn và kháng nấm: Do có khả năng tạo phức với sterol của màng tế bào nấm làm màng nấm tan rã.[12,15]

Kháng viêm.[30]

Ngăn ngừa ung thư: Saponin nhóm spirostan có nhiều chất có hoạt tính kháng ung thư Các glycosid spirostanol có chứa trên bốn đơn vị đường thì thấy có tác dụng chống ung thư rõ rệt) Hoạt chất majonoside R2 (MR2) có tác động ức chế cả giai đoạn bắt đầu và giai đoạn tiến triển của ung thư biểu mô da chuột được gây bằng nitric

oxide phối hợp với 12-O-tetradecanoylphorbol-13 acetate (TPA) hay bằng

peroxynitrite phối hợp với (TPA).[24]

Pha tĩnh: có thể là chất rắn hoặc chất lỏng Pha tĩnh tách riêng các hợp chất trong một hỗn hợp nào đó là nhờ vào tính chất hấp thu của nó Pha tĩnh là chất rắn thường là alumin hoặc silicagel đã được xử lý, nó có thể được nạp nén vào trong một cột (sắc kí cột hở), hoặc được tráng thành một lớp mỏng, phủ lên trên bề mặt một tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm nhựa (sắc kí lớp mỏng) Pha tĩnh là chất lỏng có thể là một chất lỏng được tẩm lên bề mặt một chất mang rắn hoặc một chuỗi dây carbon dài được gắn bằng một nối hóa trị lên trên chất mang rắn.[9]

Pha động: có thể là chất lỏng hoặc chất khí Chất khí được sử dụng trong kĩ thuật sắc kí khí, trường hợp này chất khí được gọi là khí mang hoặc khí vectơ Chất lỏng dùng trong sắc kí giấy, sắc kí lớp mỏng, sắc kí cột, lúc này chất lỏng gọi là dung môi giải ly (eluant).[9]

Có rất nhiều loại hệ sắc kí khác nhau và người ta có thể phân chia chúng dựa vào bản chất pha, cơ chế tách hay cấu hình của hệ sắc kí như sắc kí phân chia, sắc kí hấp thu, sắc kí trao đổi ion, sắc kí lọc gel.[9]