BÀI 1: VI KHUẨN AMÔN HÓA ILÝ THUYẾT Quá trình amôn hóa là quá trình phân giải protein và các hợp chất hữu cơ khác có chứa nitơ tạo thành amoniac. Các vi sinh vật có khả năng amôn hóa bao gồm nhiều loài sinh bào tử hoặc không sinh bào tử, có khả năng sử dụng nhiều nguồn vật chất khác nhau. Ngoài ra còn nhiều loại xạ khuẩn và nấm khuẩn ty. Tuy vậy, những vi sinh vật chỉ sử dụng riêng một loại protein thì không nhiều. Các vi sinh vật này có khả năng tiết men phân giải protein vào môi trường, thủy phân thành các amino acid. Khi đó, chúng sử dụng các amino acid này trong quá trình dị hóa và đổng hóa. Các sản phẩm đặc trưng của quá trình phân giải protein là NH3 và H2S. Quá trình phân giải protein có thể xảy ra trong các điều kiện hiếu khí và kỵ khí. Trong điều kiện hiếu khí, các hợp chất hữu cơ có chứa nitơ được phân giải bởi các loài trong giống Bacillus và Pseudomonas, các đại diện trong họ Enterobacteriaceae, các xạ khuẩn và nấm khuẩn ty. Trong đó, vai trò quan trọng và chủ yếu nhất là giống Bacillus. Trong điều kiện kỵ khí thì các loài trong giống Clostridium tham gia quá trình chuyển hóa này. Còn trong điều kiện thông khí hạn chế, quá trình amôn hóa được thực hiện bới các loài vi khuẩn và trực khuẩn kỵ khí tùy nghi. IITHỰC HÀNH Việc phát hiện và xác định số lượng các vi sinh vật amôn hóa được thực hiện bằng cách cấy các mẫu phân tích vào môi trường lỏng và rắn canh thịtpeptone. Việc cấy lên môi trường thạch được tiến hành bằng dịch huyền phù đã thanh trùng Pasteur nhằm tiêu diệt các tế bào sinh dưỡng và chỉ còn giữ lại bào tử của các đại diện thuộc giống Bacillus – giống đặc trưng nhất cho quá trình amôn hóa. Ngoài ra, việc cấy lên môi trường thạch cho phép nhận định được các đặc tính khác nhau của khuẩn lạc các vi khuẩn khác nhau này. 1 Môi trường hóa chất Môi trường canh thịt peptone: Cao thịt: 1,25g Peptone: 2,5g Nước: 250ml Môi trường canh thịt peptone được phân vào ống nghiệm khoảng 10 ml, khử trùng ở 1atm, 15 phút. Các dải giấy quỳ và giấy lọc thấm acetate chì được cho vào đĩa peptri, hấp tiệt trùng ở 1 atm, 15 phút. Môi trường thạch cao thịt peptone: trộn vào môi trường lỏng 2% thạch, sau khi hấp tiệt trùng được đổ vào các đĩa peptri, giữ ở 300C. Dung dịch pha loãng mẫu: dung dịch nước muối sinh lý tiệt trùng. Giấy lọc loại thấm acetate chì Giấy quỳ Các loại thuốc nhuộm quan sát vi sinh vật: thuốc nhuộm Gram và thuốc nhuộm bào tử,Thuốc thử Nessler 2 Dụng cụ Các dụng cụ pha chế môi trường Các dụng cụ cấy, khử trùng Kinh hiển vi 3 Tiến hành thí nghiệm • Chuẩn bị môi trường: Môi trường canh thịtpeptone được phân vào khoảng 13 chiều cao ống nghiệm, khử trùng ở 1 atm, 15 min. Các dải giấy quỳ và giấy lọc thấm acetat chì được cho vào đĩa petri, hấp khử trùng. Môi trường thạch canh thịtpeptone: sau khi hấp khử trùng được phân vào các đĩa petri, giữ ở 30OC • Chuẩn bị mẫu: Rửa sạch ruột cá, cắt lấy mặt trong ruột. Cân lấy 10g ruột cá + 90ml nước muối sinh lý, lắc đều. Ủ vi sinh vật trên môi trường lỏng: Lấy 1ml dịch pha loãng nồng độ 101 cấy vào ống nghiệm có chứa môi trường canh thịt peptone đã khử trùng ở trên Dùng kẹp lấy các dải giấy quỳ và giấy lọc thấm acetate chì gài vào giữa nút bông và ống nghiệm Ủ ở nhiệt độ 2830OC trong 3 ngày đêm. Ủ vi sinh vật trên môi trường thạch: Lấy 0,1ml dịch pha loãng nồng độ 101 cho vào các đĩa petri có chứa môi trường đã khử trùng ở trên. Dùng que trang trải đều lên bề mặt thạch cho khô. Ủ ở nhiệt độ 28300C trong 3 ngày đêm. 4Quan sát và ghi nhận kết quả Đối với môi trường lỏng, quan sát: Sự đục môi trường Sự tạo bông, kết cạn Nổi váng trên bề mặt Phản ứng sinh hóa: Màu kết tủa với thuốc thử Nessler: Nhỏ một giọt thuốc thử Nessler lên đĩa sứ trắng, thêm một que cấy đầy đất vườn ủ trong peptone broth. Quan sát màu kết tủa: o Màu vàng nhạt – ít ammoniac o Vàng sậm – nhiều ammoniac o Nâu – rất nhiều ammoniac o Sự sinh NH3 làm giấy quỳ hóa xanh o Sự sinh H2S làm giấy lọc thấm acetate chì hóa đen. Quan sát hiện tượng Độ pha loãng 101 Đục môi trường Có Tạo bông Không Tạo cặn Có Sinh NH3 Có làm giấy Quỳ hóa xanh (pH=7) Sinh H2S H2S sinh ra tác dụng với chì làm đen giấy lọc thấm acetate chì, tạo kết tủa đen. Thử với thuốc thử Nessler: Dung dịch chuyển sang màu nâu, chứng tỏ có nhiều NH4+ sinh ra, có vi sinh vật phân giải protein thành NH4+. Môi trường thạch Trên môi trường thạch, ghi nhận: Trước và sau khi ủ, môi trường không có gì thay đổi do mẫu pha loãng lại ruột cá rửa sạch nên có lẽ không có vi vi khuẩn phân giải protein, hoặc có thể do que trang còn quá nóng làm chết vi khuẩn. Chọn một khuẩn lạc Bacillus subtilis thuần (mẫu đối chứng dương) làm tiêu bản và soi kính hiển vi Nhuộm gram: Làm vết bôi, cố định vết bôi. Nhuộm crystalviolet 30 giây. Rửa nước. Nhuộm lugol 1 phút, sau đó rửa nước. Tẩy cồn 960 30 giây. Rửa nước. Nhuộm fucshin 30 giây, rửa nước, để khô, đậy lamel, quan sát dưới kính hiển vi. Tế bào Bacillus subtilis dưới kính hiển vi tế bào hình que, bắt màu tím (thuộc gram dương). BÀI TẬP Câu 1: Vi khuẩn amôn hóa thực hiện những chuyển hóa nào trong môi trường tự nhiên? Phân hủy xã bã động thực vật, phân chường, rác thải hữu cơ sinh hoạt, nước thải chứa nhiều tinh bột, ure... Câu 2: Môi trường tăng sinh chọn lọc là gì? Môi trường tăng sinh chọn lọc là môi trường lỏng,dùng để tăng số lượng vi sinh vật cần quan tâm và ức chế những vi sinh vật không mong muốn do có chất ức chế đặc hiệu. Câu 3: Vì sao sử dụng môi trường cao thịt – pepton để tăng sinh vi khuẩn amôn hóa? Yếu tố chọn lọc trong môi trường này là gì? Sử dụng cao thịt peptone để tăng sinh vi khuẩn amôn hóa vì vi khuẩn amôn hóa phân giải các hợp chất chứa protein,ure,acid amin....thành NH4+.Do trong môi trường trên có cao thịt làm từ chiết thịt cô đặc(cung cấp đạm hữu cơ,muối khoáng,đường,vitamin) và peptone là dạng thủy phân protein (chứa đạm hữu cơ,vitamin và đường) đáp ứng đủ nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn amôn. Yếu tố chọn lọc của môi trường trên là cao thịtpeptone. Câu 4: Cho biết vì sao để phát hiện vi khuẩn amôn hóa người ta lại thử giấy quỳ, giấy lọc tẩm acetate chì, dùng thuốc thử Nessler? Thử nghiệm nào có giá trị khẳng định vi khuẩn amôn hóa là dương tính trong mẫu? Vì khi thực hiện quá trình amôn hóa sản sinh ra NH3,H2S và NH4+.NH3 có tính chất kiềm làm giấy quỳ hóa xanh,H2S phản ứng với acetate chì làm hóa đen giấy lọc, Nessler phản ứng với NH4+ thành kết tủa nâu. Thí nghiệm với thuốc thử Nessler khẳng định vi khuẩn amôn hóa dương tính trong mẫu. Câu 5: Nêu vai trò của vi khuẩn amôn hóa trong môi trường. Vai trò của vi khuẩn amôn hóa là chuyển hóa các nguồn chất hữu cơ chứa nitơ trong tự nhiên thành NH4+ Câu 6: Ứng dụng của vi khuẩn amôn hóa là gì? Ứng dụng của vi khuẩn amôn hóa là: Làm phân bón và xử lý môi trường. BÀI 2: VI KHUẨN NITRAT HÓA I Lý thuyết: Nitrat hóa là quá trình oxi hóa NH3 thành HNO3, cung cấp năng lượng cho vi sinh vật hoạt động. Quá trình oxi hóa này xảy ra cùng với quá trình đồng hóa CO2. Hầu hết các vi sinh vật tự dưỡng hóa năng vô cơ thuộc loại hiếu khí bắt buộc đều có khả năng thực hiện quá trình này. Nitrat hóa qua 2 giai đoạn: Đầu tiên là giai đoạn oxi hóa NH3 thành nitrit bởi một số đại diện thuộc nhóm vi khuẩn nitrit hóa: Nitrosomonas, Nitrosocystis, Nitrosococcus, Nitrosolobus, ...Tất cả chúng đều giống nhau về mặt sinh lý, sinh hóa, chỉ khác nhau về mặt hình thái học và cấu trúc tế bào. Các đại diện của giống Nitrosomonas không sinh nội bào tử, tế bào nhỏ bé hình bầu dục. Trên môi trường lỏng, Nitrosomonas trải qua một số pha, phát triển tùy thuộc một số điều kiện. Hai pha chủ yếu là pha di động tế bào có 1 hay chùm tiên mao và pha tập đoàn khuẩn keocác tế bào không di động. Giai đoạn 2 của quá trình nitrat hóa oxi hóa nitrit thành nitrat bởi một số vi khuẩn: Nitrobacter winogradski, N. agilis, Nitrospina gracilis, Nitrococcus mobilis. Tế bào đặc trưng của Nitrobacter trong dịch nuôi thường có dạng hình que tròn, hình hạt đậu, hoặc hình trứng, có thể di động hoặc không di động. Khi điều kiện không thuận lợi chúng có thể hình thành những tập đoàn khuẩn keo. Nitrospina gracilis là những trực khuẩn thẳng, mảnh dẻ, thỉnh thoảng có dạng hình cầu, không di động, và có đặ trưng là hình thành những tập đoàn khuẩn keo.Nitrococcus mobilis thì có dạng hình tròn, có tiên mao. Vi khuẩn nitrat hóa không sử dụng các chất hữu cơ và chuyển hóa một cách chặt chẽ đối với việc oxi hóa cơ chấtNH3 và nitrit Việc phát hiện và xác định số lượng vi khuẩn nitrat hóađược thực hiện bằng cách cấy dịch huyền phù cần phân tích lên môi trường chọn lọc vô cơ Winogradski. Nguồn C duy nhất trong môi trường này là CO2 có trong không khí và trong thành phần của CaCO3. Nguyên liệu năng lượng và nguồn N cho các vi khuẩn gây ra giai đoạn đầu của quá trình nitrat hóa là NH3 và muối amon, còn đối với vi khuẩn gây ra giai đoạn hai là nitrit. Điều kiện cần thiết đối với sự phát triển của vi khuẩn nitrat hóa là việc thông khí đầy đủ vào môi trường nuôi cấy. Số lượng vi khuẩn nitrat hóa được xác định bằng phương pháp pha loãng tới hạn. II Thực hành: 1Nguồn phân lập: Đất vườn (độ sâu