CÔNG NGHỆ sản XUẤT KHÁNG SINH PENICILLIN

2.1. Vi sinh vật tạo sản phẩm: Penicillinum chrysogenum Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Phân ngành : Peziomycotina Lớp: Eurotiomycetes Bộ: Eurotiales Họ: Trichocomaceae Chi: Penicillium Loài: P.chrysogenum Đặc điểm: Penicillium chrysogenum là loại nấm mốc có mặt phổ biến trong tự nhiên, thường tìm thấy trong thức ăn và môi trường. Đa số có hình sợi Hiếu khí bắt buộc Sợi có ngăn vách (đa bào).Sợi nấm thường là một ống hình trụ dài có kích thước lớn nhỏ khác nhau tùy loài. Đường kính của sợi nấm thường từ 35µm, có khi đến 10µm. Chiều dài của sợi nấm có thể tới vài chục cm. Vách tế bào nấm cấu tạo bởi vi sợi chitin. Tế bào chất của tế bào nấm chứa mạng nội mạc (endoplasmic reticulum), không bào (vacuoles), ty thể (mitochondria) và hạt dự trữ (glycogen và lipid), đặc biệt cấu trúc ty thể ở tế bào nấm tương tự như cấu trúc ty thể ở tế bào thực vật. Ngoài ra, tế bào nấm còn có ribosomes và những thể khác chưa rõ chức năng. Không có diệp lục tố, có thể có một nhân hoặc có nhiều nhân. Nhân của tế bào nấm có hình cầu hay bầu dục với lớp màng kép, bên trong màng nhân chứa ARN, phospholipid và protein. Là nấm bào tử hở. Bào tử đính (conidium): các bào tử đính không có túi bao bọc, cuống bào tử đính dạng bình dạng thẻ phân nhánh Sinh sản dưới 2 hình thức: vô tính và hữu tính Penicillium chrysogenum trên môi trường Raistrik tạo thành 2 kiểu khuẩn lạc: • Kiểu I: khuẩn lạc tròn trặn, các nếp nhăn rõ nét. Khuẩn ty khí sinh mọc tốt và có màu xanh; theo rìa khuẩn lạc có đường viền rộng 25 mm của những khuẩn ty bạc trắng không có bào tử; các khuẩn ty cơ chất màu nâu; chất màu không hoà vào môi trường. • Kiểu II: khuẩn lạc có những khuẩn ty màu trắng, phát triển yếu; khuẩn ty cơ chất cũng có màu nâu. Khuẩn lạc kiểu I cho hoạt lự cao, kiểu II thường xuyên cho hoạt tính kháng sinh thấp. Vì vậy cần phải tách những khuẩn lạc kiểu I trên môi trường này và thường xuyên kiểm tra để chọn những khuẩn lạc có hoạt lực cao, giữ được đặc tính của giống. Chủng penicillium được nuôi cấy trên đĩa petri Các chủng penicillium ở các giai đoạn phát triển khác nhau Những chủng Penicillium thường có hoạt lực cao lại kém ổn định. Đặc tính này đặt cho những nhà vi sinh vật một nhiệm vụ khó khăn: tạo được khả năng sinh kháng sinh cao nhất, giữ được ổn định trong quá trình nghiên cứu và sản xuất. Nhiệm vụ này có một ý nghĩa rất lớn trong công nghiệp .các giống này bảo vệ ở kệ, ở trạng thái đông khô có thể tới ba năm, ở đất vô trùng là hai năm. Ngày nay nhờ di truyền học đã tạo được những giống ổn định, ít nhất sau sáu thế hệ không giảm hoạt tính kháng sinh. Trong quá trình nuôi cấy chìm nấm Penicillium chrysogenum trải qua sáu giai đoạn phát triển: • Giai đoạn I: Các bào tử nấm mốc nảy mầm, phát triển thành chồi nhỏ , tế bào chất chưa phân hóa. Thỉnh thoảng không bào có những hạt nhỏ bắt màu trung tính. • Giai đoạn II: Khuẩn ty phát triển, tế bào chất ưa kiềm, những hạt nhỏ trong không bào dần dần biến mất. cuối giai đọan này xuất hiện những giọt chất béo nhỏ . • Giai đoạn III: Tạo thành những giọt chất béo to, không còn không bào, tế bào chất rất ưa kiềm. • Giai đoạn IV : Xuất hiện không bào với những hạt dễ bắt màu đỏ trung tính, những hạt chất béo nhỏ hơn ở giai đoạn III, tính ưa kiềm giảm • Giai đoạn V : Khuẩn ty có hình trống và có những không bào, ở giữat hoặc vài hạt lớn . Các hạt chất béo biến mất , tính ưa kiềm giảm • Giai đoạn VI : Khuẩn ty vẫn có dạng hình trống nhưng không còn những hạt bắt màu trung tính, không bào bắt màu da cam, hoặc màu hồng đồng đều. Các hạt chất béo không còn. Xuất hiện những tế bào riêng biệt bắt đầu tự phân • Quá trình lên men penicillin cũng thuộc loại lên men 2 pha : Pha sinh trưởng ứng với giai đoạn I,II,III . Pha sinh penicillin ứng với giai đoạn IV,V,VI 2.2. Cơ chế sinh tổng hợp penicillin ở nấm mốc P. chrysogenum

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

TP HCM, ngày …… tháng 01 năm 2018

Giáo viên hướng dẫn

MỤC LỤC

LỜI MỞ ĐẦU

Các kháng sinh là một nhóm thuốc thiết yếu trong y học hiện đại Nhờ các thuốckháng sinh mà y học đã có thể loại bỏ được các dịch bệnh nguy hiểm như dịch hạch, tả,thương hàn và điều trị hiệu quả nhiều loại bệnh gây ra bởi các vi khuẩn như dịch ỉa chảy,kiết lỵ, nhiễm khuẩn hô hấp Trước đó, bất kỳ vết thương nào cũng có thể nhiễm trùng

và gây tử vong, các bệnh nhiễm khuẩn như viêm họng cũng có thể khiến bệnh nhân quađời

Kể từ khi Alexander Fleming phát hiện penicillin vào đầu những năm 20, kháng sinh

đã có vai trò hết sức quan trọng trong y học, đặc biệt các ca phẫu thuật có thể tiến hành vìngăn ngừa được tình trạng nhiễm trùng Từ kết quả đó, hàng trăm triệu người trên thế giới đã được cứu sống

Trong hơn nữa thế kỷ qua, kháng sinh đã trở thành một dược phẩm thần kỳ sớmchiếm vị trí hàng đầu trong lĩnh vực thuốc men thế giới, với những kết quả ngày càngmới lạ, với nhu cầu ngày càng tăng và với lượng sản xuất ngày càng lớn

Penicillin được sử dụng làm dược phẩm trị các căn bệnh chết người như viêm nộitâm mạc, nhiễm trùng máu, gas gangrene, mủ lậu, và sốt vàng da, giang mai, viêm loétlưỡi cấp Vì thế, “Sản xuất chất kháng sinh penicillin” là vấn đề cấp thiết trong giai

đoạn hiện nay và hy vọng trong tương lai Việt Nam sẽ có một nhà máy sản xuấtpenicillin với quy mô công nghiệp hiện đại đáp ứng được nhu cầu của xã hội

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT KHÁNG SINH PENICILLIN

1.1 Lịch sử phát hiện và sản xuất Penicillin:

- Người đầu tiên phát hiện ra kháng sinh là A Fleming Năm 1928, khi nghiên cứucác vi sinh vật gây bệnh , ông tình cờ phát hiện ra VSV gây bệnh bị tiêu diệt bởimột loại nấm sợi màu xanh xám , ông trích li dịch này nhỏ lên khuẩn lạc của các

vi khuẩn gây bệnh, kết quả là VSV đó bị chết

- Nấm tạo nên chất tiêu diệt vi sinh vật đó là Penicillium Chất do nấm tiết ra gọi làPenicillin Một năm sau ông công bố kết quả nghiên cứu nhưng không được quantâm đến

- Đến năm 1938, Howard Florey, Ernst Chain,

Norman Heatley mới đưa Penicillin vào sản

xuất thử Vào năm 1940, Dorothy Hodkin xác

định được cấu trúc phân tử của Penicillin

- 1942: Mary Hunt đã tuyển chọn được chủng

công nghiệp Penicillium chrysogenum NRRL

1951 (1943) và sau đó đã được biến chủng P.

chrysogenum Wis Q - 176 (chủng này được xem là chủng gốc của hầu hết các

chủng công nghiệp đang sử dụng hiện nay trên toàn thế giới) đã thành công trongviệc điều chỉnh đường hướng quá trình lên men để lên men sản xuất penicillin G(bằng sử dụng tiền chất Phenylacetic, 1944)

- Năm 1959, các nhà khoa học Anh và Mĩ đã tách ra được axit 6-aminopenicillanic.Đây là nguyên liệu để sản xuất ra hàng loạt chế phẩm penicillin bán tổng hợp khácnhau Ngày nay trên thế giới đã sản xuất ra được trên 500 chế phẩm penicillin(trong đó chỉ lên men trực tiếp hai sản phẩm là penicillin V và penicillin G) và tiếptục triển khai để sản xuất các chế phẩm penicillin bán tổng hợp khác

- Tình hình sản xuất penicillin hiện nay trên thế giới :

Thuốc kháng sinh chiếm khoang 30% thị phần dược phẩm thế giới Các tập đoàndược phẩm của Mỹ, Anh, Nhật Bản , Italia, Hà Lan, Ấn Độ…chiếm các vị trí hangđầu trong lĩnh vực này Ví dụ : Công ty DSM có trụ sở tại thành phố Delf (Hà Lan)

sản lượng hàng năm 15000 tấn Penicillin chiếm 30% sản lượng loại thuốc nàytrên thế giới

Lịch sử tuyển chọn chủng công nghiệp P chrysogenum

- Vào những năm đầu, việc nghiên cứu sản xuất penicillin thường sử dụng các

chủng có hoạt lực cao thuộc loài P notatum và P.

baculatum Nhưng từ khi trường đại học Wisconsin

(Mỹ) phân lập được chủng P.chrysogenum có hoạt tính cao hơnthì chủng này dần dần đã thay thế và từ khoảng sau

những năm 50 của thế kỷ XX đến nay tất cả các

công ty sản xuất penicillin trên thế giới đều sử

dụng các biến chủng P.chrysogenum công

nghiệp

- Việc tuyển chọn chủng công nghiệp để lên men sản xuất penicillin trên nguyên tắccũng trải qua sáu giai đoạn cơ bản, trong đó giải pháp kỹ thuật đã được áp dụnghiệu quả để thu nhận biến chủng "siêu tổng hợp" penicillin lại chính là các kỹthuật gây đột biến thường như: xử lý tia Rơn - ghen, xử lý tia cực tím và tạo độtbiến bằng hoá chất, thí dụ như Metylbis – amin(metyl -2-β-clo- etylamin), N-mustar (tris - β-clo- etylamin), Sarcrolyzin, HNO2, Dimetylsulfat, 1,2,3,4-diepoxybutan

• Tính chất hóa lý của penicillin :

• Chức carboxyl ở khoảng giữa 1600 cm-1

• Nhóm chức amid ngoại vòng ở giữa 1700 và 1650 cm-1

- Normal penicillin has a of 313 to 334 g/mol (latter for penicillin G).Bình thườngpenicillin có trọng lượng phân tử của 313 đến 334 g / mol ( penicillin G).Penicillin types with additional molecular groups attached may have a molar mass

around 500 g/mol Penicillin với các nhóm phân tử đính kèm thêm có thể có mộtkhối lượng phân tử khoảng 500 g / mol For example, has a molar mass of 476g/mol and has a molar mass of 492 g/mol Ví dụ, cloxacillin có khối lượng molcủa 476 g / mol và dicloxacillin có khối lượng mol của 492 g / mol

 Tính chất hóa học:

- Các penicillin có khả năng tạo muối natri và kali tan trong nước, trong khi đó cácmuối kim loại nặng ( vi dụ muối Cu2+) thì không tan hoặc kích thích sự phân hủy

- Các penicillin cũng có khả năng tạo muối với các amin:

- Tạo các penicillin thủy giải chậm ( tác động trễ) như procain penicillin ( tác độngkéo dài từ 24 – 48h), benethamin penicillin ( tác động kéo dài thừ 3 – 7 ngày),benzathin penicillin ( tác động kéo dài 2 – 4 tuần)

- Một số có tính base ví dụ các aminosid, các alkaloid khi trộn chung với penicillintrong cùng một ống tiêm sẽ gây ra kết tủa

- Các penicillin cũng có khả năng tạo ra các este, sẽ là những tiền chất có khả năngphóng thích các kháng sinh này trong invivo

- Tính không bền của vòng beta lactam: Sự phân hủy trong môi trường kiềm: ở pH

= 8 sẽ có sự tấn công của ion OH- trên carbonyl lactam gây ra sự mở vòng theo quiluật chung, cuối cùng sẽ có sự tạo thành acid penicilloic, nhưng sự decarboxyl cóthể xảy ra tiếp theo để tạo acid peniloic

- Nếu trong môi trường có sự hiện diện của những muối kim loại nặng ( Zn2+, Cd2+,

Pb2+ hoặc Hg2+) sẽ làm cho acid peniciloic bị phân hủy thành carbinolamin khôngbền, chất này sẽ tiếp tục bị phân hủy tạo D-penicillamin và acid penaldic.Acidpenaloic đến lượt nó có thể bị decarboxyl hóa để trở thành penicillo-aldehyd

- Sự alcol phân và amino phân: vòng beta lactam nhạy với một số tác nhân ái nhânkhác với xúc tác của các ion kim loại nặng: Cu2+, Zn2+, Sn2+.

- Sự phân hủy trong môi trường acid: dưới sự hiện diện của ion H+, sự tần công áiđiện tử trên nguyện tử S, kích thích sự mở vòng lactam và vòng thiazolidin, tiếptheo là sự tái sắp xếp để tạo thành cấu trúc oxazolic cua acid penicillenic Cuốicùng, nếu môi trường quá acid có thể tạo thành acid penillic

1.2 Phân loại Penicillin

- Đặc diểm chung: Penixillin là dẫn xuất của 6-aminopenixilamic gồm 1 vòngthiazolidin và một vòng beta-lactam

- Công thức cấu tạo chung của penicillin :

• Khi thay thế H bằng kim loại kiềm hoặc kiềm thổ sẽ được các penixillin dễ tantrong nước (như Na, K, Ca …)

• Vòng beta-lactam là yếu tố quyết định hoạt tính của kháng sinh

• Khi thay thế R bằng các gốc khác nhau sẽ được các penixillin có tác dụng khácnhau

Dựa vào nguồn gốc có thể sắp xếp penixillin vào 3 nhóm :

- Penixillin nhóm I: Gồm các penixillin tự nhiên được chiết xuất từ môi trường nuôicấy nấm penixillium notatum hoặc P chrysogenum như penixillin G hoặcpenixillin V

• Các penixillin được hấp thu nhanh và thải trừ ra khỏi cơ thể nhanh nên thời giantác dụng ngắn Muốn kéo dài tác dụng phải dùng các dẫn xuất của chúng nhưprocain benzyl penixillin (kéo dài trong 24 h) hoặc benzathin benzyl penixillin( kéo dài trong 4 tuần )

• Các penixillin chậm chỉ dung để tim bắp không được tiêm tĩnh mạch

- Penixillin nhóm II : Gồm các dẫn xuất của các penixillin bán tổng hợp có phổkháng khuẩn hẹp hơn Penixillin G nhưng có khả năng kháng penixilinase dùng đểchữa bệnh nhiễm khuẩn do tụ cầu kháng penixillin nhóm I như methycylin,cloxaxilin

- Penixilin nhóm III : Gồm các penixillin bán tổng hợp phổ rộng, không kháng đượcpenixilase nhung kháng được các vi khuẩn Gram(-) mà các penixillin nhóm II íttác dụng bền vững trong môi trường dịch vị nên có thể dung để uống nhưampixillin, amoxycilin

1.3 Nhu cầu sản phẩm đối với thị trường trong nước và quốc tế

- Báo cáo sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh tại 15 bệnh viện ViệtNam năm 2008-2009: Tình trạng kháng kháng sinh ở Việt Nam đã ởmức độ cao Trong số các nước thuộc mạng lưới giám sát các cănnguyên kháng thuốc Châu Á (ANSORP), Việt Nam có mức độ khángpenicillin cao nhất (71,4%)

- Sau Thế chiến thứ II, kháng sinh được buôn bán rộng rãi trên thị trường và thực sựtrở thành loại thuốc phổ biến Năm 1949, Mỹ đã sản xuất 1,3 nghìn tỷ đơn vịPenicillin, cao hơn rất nhiều so với mức 1,7 tỷ đơn vị năm 1944

Có thể nói, kháng sinh Penicillin là loại thuốc đầu tiên trong dòng này, mở ra kỷnguyên mới cho ngành dược Trước đó, bất kỳ vết thương nào cũng có thể nhiễmtrùng và gây tử vong, các bệnh nhiễm khuẩn như viêm họng cũng có thể khiếnbệnh nhân qua đời Những loại bệnh lậu, giang mai lây lan qua đường tình dục làbản án tử hình với nhiều người trong 500 năm trước khi kháng sinh ra đời.

- Tuy vậy, một mũi tiêm Benzathin G có thể chấm dứt giai đoạn đầu của bệnh giangmai và nhiều loại bệnh hiểm nghèo khác Thậm chí ngày nay, Benzathin G làkháng sinh hiệu quả nhất chống lại bệnh thấp khớp cấp và giang mai

- Tổ chức WHO cũng cho biết khoảng 5,6 triệu người trên thế giới đang bị nhiễmgiang mai và 1 mũi tiêm Penicillin có thể cứu được 53.000 trẻ sơ sinh tại 30 quốcgia đã tử vong vì sinh ra trong tử cung nhiễm bệnh vào năm 2012

- Không riêng gì những nước nghèo, ngay cả 1 cường quốc như Mỹ cũng đang phảiđau đầu với tình trạng thiếu Penicillin Sự thiếu hụt Benzathin G từ tháng 4/2016khiến nền kinh tế số 1 thế giới không thể chấm dứt căn bệnh giang mai trên toànquốc và điều này đe dọa tới sức khỏe cộng đồng

- Trong 10 năm qua, bệnh giang mai đã tăng gấp đôi tại Mỹ và những đứa trẻ sinh

ra trong tử cung nhiễm bệnh sẽ mắc chứng bệnh điếc, mù, dị dạng về xương, sinhnon và thậm chí tử vong

- Hãng dược lớn tại Mỹ là Pfizer không thể đáp ứng được nhu cầu Benzathin G với

lý do “chậm trễ sản xuất”

- Tháng 11/2014, nhân viên kiểm tra của cơ quan an toàn sức khỏe và dược phẩmPháp (FNAMHPS) đã thăm cơ sở sản xuất của Smisyntech và phát hiện rất nhiềutrường hợp làm giả tài liệu cũng như tình trạng hạ tiêu chuẩn sản xuất đến mức cónguy cơ ô nhiễm sản phẩm cao

- Ngay lập tức, nhân viên đoàn kiểm tra đã đề nghị Liên minh Châu Âu (EU) ngừngnhập khẩu sản phẩm của Semisyntech nhưng Cục quản lý dược phẩm Châu Âu(EDQM) đã đưa ra các giấy chứng nhận chất lượng của công ty này và cho rằng

họ đạt tiêu chuẩn Phần lớn chuyên gia nhận định động thái này của Châu Âu làbất đắc dĩ khi NCPC có vị thế vô cùng lớn trong ngành dược cũng như là nguồncung cấp lớn để sản xuất Benzathin G

- Hàng loạt các thị trường khác như Hongkong, Ethiopia, Liberia cũng ngừng nhậpkhẩu sản phẩm của các hãng dược có sử dụng nguyên liệu hoạt tính nhập từ TrungQuốc Vào năm 2015, Brazil cũng quyết định từ chối đề nghị bán Benzathin G củaSemisyntech bất chấp dịch bệnh giang mai đang bùng phát mạnh mẽ tại đây.

- Dẫu vậy, tình hình quá căng thẳng cũng như sự khan hiếm nguồn cung buộc Brazilphải chấp nhận mua khẩn cấp 2,7 triệu lọ Benzathin G từ Mỹ vào tháng 4/2016.Đến tháng 7/2016, Brazil buộc phải chấp nhận cho Semisyntech nhập khẩuBenzathin G vào nước này

- Vào năm 2013, chỉ khoảng 14.000 trẻ sơ sinh được sinh trong tử cung nhiễm bệnhgiang mai và việc thiếu Benzathin G đã khiến con số này tăng 35% lên 19.000trường hợp vào năm 2015

- Penicillium chrysogenum là loại nấm mốc có mặt phổ biến trong tự nhiên, thường

tìm thấy trong thức ăn và môi trường

- Đa số có hình sợi

- Hiếu khí bắt buộc

- Sợi có ngăn vách (đa bào).Sợi nấm thường là một ống hình trụ dài có kích thướclớn nhỏ khác nhau tùy loài Đường kính của sợi nấm thường từ 3-5µm, có khi đến10µm Chiều dài của sợi nấm có thể tới vài chục cm Vách tế bào nấm cấu tạo bởi

vi sợi chitin

- Tế bào chất của tế bào nấm chứa mạng nội mạc (endoplasmic reticulum), khôngbào (vacuoles), ty thể (mitochondria) và hạt dự trữ (glycogen và lipid), đặc biệtcấu trúc ty thể ở tế bào nấm tương tự như cấu trúc ty thể ở tế bào thực vật Ngoài

ra, tế bào nấm còn có ribosomes và những thể khác chưa rõ chức năng

- Không có diệp lục tố, có thể có một nhân hoặc có nhiều nhân Nhân của tế bàonấm có hình cầu hay bầu dục với lớp màng kép, bên trong màng nhân chứa ARN,phospholipid và protein

- Là nấm bào tử hở

- Bào tử đính (conidium): các bào tử đính không có túi bao bọc, cuống bào tử đínhdạng bình dạng thẻ phân nhánh

- Sinh sản dưới 2 hình thức: vô tính và hữu tính

- Penicillium chrysogenum trên môi trường Raistrik tạo thành 2 kiểu khuẩn lạc:

• Kiểu I: khuẩn lạc tròn trặn, các nếp nhăn rõ nét Khuẩn ty khí sinh mọc tốt

và có màu xanh; theo rìa khuẩn lạc có đường viền rộng 2-5 mm của nhữngkhuẩn ty bạc trắng không có bào tử; các khuẩn ty cơ chất màu nâu; chấtmàu không hoà vào môi trường

• Kiểu II: khuẩn lạc có những khuẩn ty màu trắng, phát triển yếu; khuẩn ty cơchất cũng có màu nâu Khuẩn lạc kiểu I cho hoạt lự cao, kiểu II thườngxuyên cho hoạt tính kháng sinh thấp Vì vậy cần phải tách những khuẩn lạckiểu I trên môi trường này và thường xuyên kiểm tra để chọn những khuẩnlạc có hoạt lực cao, giữ được đặc tính của giống

Chủng penicillium được nuôi cấy trên đĩa petri

Các chủng penicillium ở các giai đoạn phát triển khác nhau

- Những chủng Penicillium thường có hoạt lực cao lại kém ổn định Đặc tính nàyđặt cho những nhà vi sinh vật một nhiệm vụ khó khăn: tạo được khả năng sinhkháng sinh cao nhất, giữ được ổn định trong quá trình nghiên cứu và sản xuất.Nhiệm vụ này có một ý nghĩa rất lớn trong công nghiệp các giống này bảo vệ ở

kệ, ở trạng thái đông khô có thể tới ba năm, ở đất vô trùng là hai năm Ngày naynhờ di truyền học đã tạo được những giống ổn định, ít nhất sau sáu thế hệ khônggiảm hoạt tính kháng sinh

- Trong quá trình nuôi cấy chìm nấm Penicillium chrysogenum trải qua sáu giai

đoạn phát triển:

• Giai đoạn I: Các bào tử nấm mốc nảy mầm, phát triển thành chồi nhỏ , tế bàochất chưa phân hóa Thỉnh thoảng không bào có những hạt nhỏ bắt màu trungtính

• Giai đoạn II: Khuẩn ty phát triển, tế bào chất ưa kiềm, những hạt nhỏ trongkhông bào dần dần biến mất cuối giai đọan này xuất hiện những giọt chấtbéo nhỏ

• Giai đoạn III: Tạo thành những giọt chất béo to, không còn không bào, tế bàochất rất ưa kiềm

• Giai đoạn IV : Xuất hiện không bào với những hạt dễ bắt màu đỏ trung tính,những hạt chất béo nhỏ hơn ở giai đoạn III, tính ưa kiềm giảm

• Giai đoạn V : Khuẩn ty có hình trống và có những không bào, ở giữat hoặcvài hạt lớn Các hạt chất béo biến mất , tính ưa kiềm giảm

• Giai đoạn VI : Khuẩn ty vẫn có dạng hình trống nhưng không còn những hạtbắt màu trung tính, không bào bắt màu da cam, hoặc màu hồng đồng đều.Các hạt chất béo không còn Xuất hiện những tế bào riêng biệt bắt đầu tựphân

• Quá trình lên men penicillin cũng thuộc loại lên men 2 pha : Pha sinh trưởngứng với giai đoạn I,II,III Pha sinh penicillin ứng với giai đoạn IV,V,VI

2.2. Cơ chế sinh tổng hợp penicillin ở nấm mốc P chrysogenum

- The first step in the biosynthesis of penicillin G is the condensation of three aminoacids L -α-aminoadipic acid, L -cysteine, L -valine into a Before condensinginto a tripeptide, the amino acid L-valine will undergo epimerization and becomeD-valine After the condensation, the tripeptide is named δ-(L-α-aminoadipyl)-L-cysteine-D-valine, which is also known as ACV.Theo quan điểm phổ biến hiện

nay, quá trình sinh tổng hợp penicillin ở nấm mốc P chrysogenum có thể tóm tắt

như sau: từ ba tiền chất ban đầu là α- aminoadipic, cystein và valin sẽ ngưng tụ lại

thành tripeptit δ- (α - aminoadipyl)-cysteinyl-valin; tiếp theo là quá trình khép mạch tạo vòng β - lactam và vòng thiazolidin để tạo thành izopenicillin-n; rồi trao đổi nhóm α - aminoadipyl với phenylacetic (hay phenooxyacetic) tạo ra sản phẩm penicillin G (hay penicillin V).

Ta có phương trình tổng hợp penicillin từ Penicillium chrysogenum

10/6 C6H12O6 + 2 NH3+ 1/2 O2+ H2SO4+ C8H8O2→ C16H18O4N2S + CO2 + 9 H2O

2.3 Quy trình lên men sản xuất Penicillin trong công nghiệp

- Theo công nghệ lên men của hãng Gist-Brocades (Hà Lan), toàn bộ dây chuyểnsản xuất thuốc kháng sinh penicillin có thể phân chia làm bốn công đoạn chínhnhư sau :

- Sơ đồ khối và thuyết minh:

2.3.1 Chuẩn bị nguyên liêu và môi trường lên men:

 Thành phần hóa học của hạt ngô khô (trong 100g)

- Nguồn khoáng trong ngô có Na, K, Mg, Ca, Fe, Zn, P, S

- Thành phần acid amin trong ngô là lysin, methionin, tryptophan, phenylalanin, threonin, valin, leucin, alanin, serin

- Dầu hột bắp chứa: a-tocopherol, b-sitosterol và propyl gallat

- Về mặt enzym, trong hột bắp có phosphohexokinase

 Khoáng trong ngô:

Dịch chiết ngô cô đặc :Corn steep liquor(CSL)

- Đầu tiên ngô được ngâm, nhúng chìm trong bồn chứa hở, nhiệt độ nước ngâm từ

42 đến 43oC trong vòng 40-48h

- Yêu cầu: Khoảng 5-7 gallon nước cho mỗi bushel ngô

- SO2 được bổ sung với nồng độ 0,1 -0,2% để tránh việc thối rửa và giúp trích ly cácchất từ ngô hiệu quả hơn.

- Sau quá trình cô đạc, nồng độ chất tan khoảng 50%

- Bã ngô được sản xuất các loại sản phẩm khác

Đường không khử (glucose) 0.1-11

 Vi sinh vật trong corn steep liquor:

 Tiêu chuẩn nguyên liệu corn steep liquor

- Nguyên liệu corn steep liquor cần đạt được những thành phần đã nêu

- Nguồn muối khoáng phải cao để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp penicillin

• Thành phần môi trường lên men:

- Lactoza 20-50 kg/m3.(nguồn cơ chất chính)

- Glucoza 0-10kg/m3, bổ sung gián đoạn hoặc liên tục trong quá trình lên men

- Dịch chiết ngô cô đặc 15-50 kg/m3.(nguồn nito)

 Giải thích:

- Môi trường cơ sở để lên men penicillin, vào thời kỳ đầu trong những năm 40 - 50,

là môi trường lactoza - nước chiết ngô

- Nguồn cơ chất chính: là lactoza có thể được thay thế từng phần hoặc toàn bộ bằngcác cơ chất khác như: các loại đường hexoza, đường pentoza, disaccarit, dextrinhay thay thế bằng dầu thực vật Trong các cơ chất nêu trên, hiệu quả cao hơn cảvẫn là glucoza

- Khi sử dụng dầu thực vật làm chất phá bọt phải xét đến hiệu ứng nấm mốc sửdụng một phần dầu thực vật làm nguồn cung cấp thức ăn cacbon, để tính toán điềuchỉnh nồng độ glucoza trong môi trường lên men (và cả sự cản trở quá trìnhchuyển khối do ảnh hưởng của dầu phá bọt)

- Nguồn cung cấp thức ăn nitơ: có thể sử dụng là bột đậu tương, bột hạt bông, cácloại dầu cám Nhu cầu về thức ăn nitơ cũng có thể được đáp ứng bằng cách cungcấp liên tục (NH4)2SO4, nhưng duy trì ở nồng độ thấp, khoảng 250 - 340g/l (nếu dưthừa hiệu quả sinh tổng hợp penicillin sẽ giảm, nếu thiếu sẽ xảy ra hiện tượng tựphân hệ sợi)

- Hàm lượng các chất khoáng bổ sung: được tính toán, phụ thuộc vào lượng dịchchiết ngô sử dụng;

- Nồng độ tiền chất tạo nhánh:Trong quá trình sinh tổng hợp penicillin, việc kết gắnmạch nhánh của phân tử penicillin không mang tính đặc hiệu chặt chẽ Nhờ vậy,nếu duy trì nồng độ tiền chất tạo nhánh cần thiết phenylacetat (hoặcphenooxyacetat) sẽ cho phép thu nhận chủ yếu một loại penicillin G trong dịch lênmen (hoặc penicillin V) Theo lý thuyết, nhu cầu về phenylaceta là 0,47g/gampenicillin G (hoặc phenooxyacetat là 0,50g/gam penicillin V ) Cần chú ý cả haicấu tử trên thực chất đều gây độc cho nấm nên người ta thường lựa chọn giải pháp

bổ sung liên tục cấu tử này và khống chế chặt chẽ nồng độ theo yêu cầu, để khônglàm suy giảm năng lực lên men của chủng sản xuất

pH môi trường được điều chỉnh trước khi thanh trùng, sau đó trong suốt quá trìnhlên men được giám sát chặt chẽ và điều chỉnh theo yêu cầu công nghệ