CÔNG NGHỆ sản XUẤT KHÁNG SINH PENICILLIN

2.1. Vi sinh vật tạo sản phẩm: Penicillinum chrysogenum Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Phân ngành : Peziomycotina Lớp: Eurotiomycetes Bộ: Eurotiales Họ: Trichocomaceae Chi: Penicillium Loài: P.chrysogenum Đặc điểm: Penicillium chrysogenum là loại nấm mốc có mặt phổ biến trong tự nhiên, thường tìm thấy trong thức ăn và môi trường. Đa số có hình sợi Hiếu khí bắt buộc Sợi có ngăn vách (đa bào).Sợi nấm thường là một ống hình trụ dài có kích thước lớn nhỏ khác nhau tùy loài. Đường kính của sợi nấm thường từ 35µm, có khi đến 10µm. Chiều dài của sợi nấm có thể tới vài chục cm. Vách tế bào nấm cấu tạo bởi vi sợi chitin. Tế bào chất của tế bào nấm chứa mạng nội mạc (endoplasmic reticulum), không bào (vacuoles), ty thể (mitochondria) và hạt dự trữ (glycogen và lipid), đặc biệt cấu trúc ty thể ở tế bào nấm tương tự như cấu trúc ty thể ở tế bào thực vật. Ngoài ra, tế bào nấm còn có ribosomes và những thể khác chưa rõ chức năng. Không có diệp lục tố, có thể có một nhân hoặc có nhiều nhân. Nhân của tế bào nấm có hình cầu hay bầu dục với lớp màng kép, bên trong màng nhân chứa ARN, phospholipid và protein. Là nấm bào tử hở. Bào tử đính (conidium): các bào tử đính không có túi bao bọc, cuống bào tử đính dạng bình dạng thẻ phân nhánh Sinh sản dưới 2 hình thức: vô tính và hữu tính Penicillium chrysogenum trên môi trường Raistrik tạo thành 2 kiểu khuẩn lạc: • Kiểu I: khuẩn lạc tròn trặn, các nếp nhăn rõ nét. Khuẩn ty khí sinh mọc tốt và có màu xanh; theo rìa khuẩn lạc có đường viền rộng 25 mm của những khuẩn ty bạc trắng không có bào tử; các khuẩn ty cơ chất màu nâu; chất màu không hoà vào môi trường. • Kiểu II: khuẩn lạc có những khuẩn ty màu trắng, phát triển yếu; khuẩn ty cơ chất cũng có màu nâu. Khuẩn lạc kiểu I cho hoạt lự cao, kiểu II thường xuyên cho hoạt tính kháng sinh thấp. Vì vậy cần phải tách những khuẩn lạc kiểu I trên môi trường này và thường xuyên kiểm tra để chọn những khuẩn lạc có hoạt lực cao, giữ được đặc tính của giống. Chủng penicillium được nuôi cấy trên đĩa petri Các chủng penicillium ở các giai đoạn phát triển khác nhau Những chủng Penicillium thường có hoạt lực cao lại kém ổn định. Đặc tính này đặt cho những nhà vi sinh vật một nhiệm vụ khó khăn: tạo được khả năng sinh kháng sinh cao nhất, giữ được ổn định trong quá trình nghiên cứu và sản xuất. Nhiệm vụ này có một ý nghĩa rất lớn trong công nghiệp .các giống này bảo vệ ở kệ, ở trạng thái đông khô có thể tới ba năm, ở đất vô trùng là hai năm. Ngày nay nhờ di truyền học đã tạo được những giống ổn định, ít nhất sau sáu thế hệ không giảm hoạt tính kháng sinh. Trong quá trình nuôi cấy chìm nấm Penicillium chrysogenum trải qua sáu giai đoạn phát triển: • Giai đoạn I: Các bào tử nấm mốc nảy mầm, phát triển thành chồi nhỏ , tế bào chất chưa phân hóa. Thỉnh thoảng không bào có những hạt nhỏ bắt màu trung tính. • Giai đoạn II: Khuẩn ty phát triển, tế bào chất ưa kiềm, những hạt nhỏ trong không bào dần dần biến mất. cuối giai đọan này xuất hiện những giọt chất béo nhỏ . • Giai đoạn III: Tạo thành những giọt chất béo to, không còn không bào, tế bào chất rất ưa kiềm. • Giai đoạn IV : Xuất hiện không bào với những hạt dễ bắt màu đỏ trung tính, những hạt chất béo nhỏ hơn ở giai đoạn III, tính ưa kiềm giảm • Giai đoạn V : Khuẩn ty có hình trống và có những không bào, ở giữat hoặc vài hạt lớn . Các hạt chất béo biến mất , tính ưa kiềm giảm • Giai đoạn VI : Khuẩn ty vẫn có dạng hình trống nhưng không còn những hạt bắt màu trung tính, không bào bắt màu da cam, hoặc màu hồng đồng đều. Các hạt chất béo không còn. Xuất hiện những tế bào riêng biệt bắt đầu tự phân • Quá trình lên men penicillin cũng thuộc loại lên men 2 pha : Pha sinh trưởng ứng với giai đoạn I,II,III . Pha sinh penicillin ứng với giai đoạn IV,V,VI 2.2. Cơ chế sinh tổng hợp penicillin ở nấm mốc P. chrysogenum

Mơn học: Đồ án CNLM GVHD: TS Nguyễn Hồi Hương NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN TP HCM, ngày …… tháng 01 năm 2018 Giáo viên hướng dẫn Mơn học: Đồ án CNLM GVHD: TS Nguyễn Hồi Hương MỤC LỤC Môn học: Đồ án CNLM GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương LỜI MỞ ĐẦU Các kháng sinh nhóm thuốc thiết yếu y học đại Nhờ thuốc kháng sinh mà y học loại bỏ dịch bệnh nguy hiểm dịch hạch, tả, thương hàn điều trị hiệu nhiều loại bệnh gây vi khuẩn dịch ỉa chảy, kiết lỵ, nhiễm khuẩn hô hấp Trước đó, vết thương nhiễm trùng gây tử vong, bệnh nhiễm khuẩn viêm họng khiến bệnh nhân qua đời Kể từ Alexander Fleming phát penicillin vào đầu năm 20, kháng sinh có vai trò quan trọng y học, đặc biệt ca phẫu thuật tiến hành ngăn ngừa tình trạng nhiễm trùng Từ kết đó, hàng trăm triệu người giới cứu sống Trong kỷ qua, kháng sinh trở thành dược phẩm thần kỳ sớm chiếm vị trí hàng đầu lĩnh vực thuốc men giới, với kết ngày lạ, với nhu cầu ngày tăng với lượng sản xuất ngày lớn Penicillin sử dụng làm dược phẩm trị bệnh chết người viêm nội tâm mạc, nhiễm trùng máu, gas gangrene, mủ lậu, sốt vàng da, giang mai, viêm loét lưỡi cấp Vì thế, “Sản xuất chất kháng sinh penicillin” vấn đề cấp thiết giai đoạn hy vọng tương lai Việt Nam có nhà máy sản xuất penicillin với quy mô công nghiệp đại đáp ứng nhu cầu xã hội Môn học: Đồ án CNLM GVHD: TS Nguyễn Hồi Hương CƠNG NGHỆ SẢN XUẤT KHÁNG SINH PENICILLIN ĐẶT VẤN ĐÈ Lịch sử phát sản xuất Penicillin: Người phát kháng sinh A Fleming Năm 1928, nghiên cứu 1.1 - vi sinh vật gây bệnh , ông tình cờ phát VSV gây bệnh bị tiêu diệt loại nấm sợi màu xanh xám , ơng trích li dịch nhỏ lên khuẩn lạc - vi khuẩn gây bệnh, kết VSV bị chết Nấm tạo nên chất tiêu diệt vi sinh vật Penicillium Chất nấm tiết gọi Penicillin Một năm sau ông công bố kết nghiên cứu không quan - tâm đến Đến năm 1938, Howard Florey, Ernst Chain, Norman Heatley đưa Penicillin vào sản xuất thử Vào năm 1940, Dorothy Hodkin xác - định cấu trúc phân tử Penicillin 1942: Mary Hunt tuyển chọn chủng cơng nghiệp Penicillium chrysogenum NRRL 1951 (1943) sau biến chủng P chrysogenum Wis Q - 176 (chủng xem chủng gốc hầu hết chủng công nghiệp sử dụng tồn giới) thành cơng việc điều chỉnh đường hướng trình lên men để lên men sản xuất penicillin G - (bằng sử dụng tiền chất Phenylacetic, 1944) Năm 1959, nhà khoa học Anh Mĩ tách axit 6-aminopenicillanic Đây nguyên liệu để sản xuất hàng loạt chế phẩm penicillin bán tổng hợp khác Ngày giới sản xuất 500 chế phẩm penicillin (trong lên men trực tiếp hai sản phẩm penicillin V penicillin G) tiếp - tục triển khai để sản xuất chế phẩm penicillin bán tổng hợp khác Tình hình sản xuất penicillin giới : Thuốc kháng sinh chiếm khoang 30% thị phần dược phẩm giới Các tập đoàn dược phẩm Mỹ, Anh, Nhật Bản , Italia, Hà Lan, Ấn Độ…chiếm vị trí hang đầu lĩnh vực Ví dụ : Cơng ty DSM có trụ sở thành phố Delf (Hà Lan) Môn học: Đồ án CNLM GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương sản lượng hàng năm 15000 Penicillin chiếm 30% sản lượng loại thuốc - giới Lịch sử tuyển chọn chủng công nghiệp P chrysogenum Vào năm đầu, việc nghiên cứu sản xuất penicillin thường chủng có hoạt lực cao thuộc loài sử dụng P notatum P baculatum Nhưng từ trường đại học Wisconsin (Mỹ) phân lập chủng P.chrysogenum có hoạt tính cao chủng thay từ khoảng sau năm 50 kỷ XX đến tất công ty sản xuất penicillin giới sử dụng biến chủng P.chrysogenum công - nghiệp Việc tuyển chọn chủng công nghiệp để lên men sản xuất penicillin nguyên tắc trải qua sáu giai đoạn bản, giải pháp kỹ thuật áp dụng hiệu để thu nhận biến chủng "siêu tổng hợp" penicillin lại kỹ thuật gây đột biến thường như: xử lý tia Rơn - ghen, xử lý tia cực tím tạo đột biến hố chất, thí dụ Metylbis – amin(metyl -2- β-clo- etylamin), Nmustar (tris - β-clo- etylamin), Sarcrolyzin, HNO2, Dimetylsulfat, 1,2,3,4 -diepoxybutan • Tính chất hóa lý penicillin :  Tính chất vật lý: - Các penicillin dạng muối dạng acid bột trắng không mùi - - tinh khiết Phổ UV: đa số nhóm R acyl hóa 6-APA vòng thơm nên cho phổ hấp thu vùng UV ứng dụng Phổ IR: vùng 1600 – 1800 cm-1 có đỉnh đặc trưng nhóm sau : • Nhóm lactam 1760 1730 cm-1 • Chức carboxyl khoảng 1600 cm-1 • Nhóm chức amid ngoại vòng 1700 1650 cm-1 Normal penicillin has a of 313 to 334 g/mol (latter for penicillin G).Bình thường penicillin có trọng lượng phân tử 313 đến 334 g / mol ( penicillin G) Penicillin types with additional molecular groups attached may have a molar mass Mơn học: Đồ án CNLM GVHD: TS Nguyễn Hồi Hương around 500 g/mol Penicillin với nhóm phân tử đính kèm thêm có khối lượng phân tử khoảng 500 g / mol For example, has a molar mass of 476 g/mol and has a molar mass of 492 g/mol Ví dụ, cloxacillin có khối lượng mol 476 g / mol dicloxacillin có khối lượng mol 492 g / mol  Tính chất hóa học: - Các penicillin có khả tạo muối natri kali tan nước, - muối kim loại nặng ( vi dụ muối Cu2+) khơng tan kích thích phân hủy Các penicillin có khả tạo muối với amin: Tạo penicillin thủy giải chậm ( tác động trễ) procain penicillin ( tác động kéo dài từ 24 – 48h), benethamin penicillin ( tác động kéo dài thừ – ngày), - benzathin penicillin ( tác động kéo dài – tuần) Một số có tính base ví dụ aminosid, alkaloid trộn chung với penicillin - ống tiêm gây kết tủa Các penicillin có khả tạo este, tiền chất có khả - phóng thích kháng sinh invivo Tính khơng bền vòng beta lactam: Sự phân hủy mơi trường kiềm: pH = có công ion OH - carbonyl lactam gây mở vòng theo qui luật chung, cuối có tạo thành acid penicilloic, decarboxyl có - thể xảy để tạo acid peniloic Nếu mơi trường có diện muối kim loại nặng ( Zn 2+, Cd2+, Pb2+ Hg2+) làm cho acid peniciloic bị phân hủy thành carbinolamin không bền, chất tiếp tục bị phân hủy tạo D-penicillamin acid penaldic.Acid - penaloic đến lượt bị decarboxyl hóa để trở thành penicillo-aldehyd Sự alcol phân amino phân: vòng beta lactam nhạy với số tác nhân nhân - khác với xúc tác ion kim loại nặng: Cu2+, Zn2+, Sn2+ Sự phân hủy môi trường acid: diện ion H +, tần công điện tử nguyện tử S, kích thích mở vòng lactam vòng thiazolidin, tái xếp để tạo thành cấu trúc oxazolic cua acid penicillenic Cuối cùng, mơi trường q acid tạo thành acid penillic 1.2 Phân loại Penicillin - Đặc diểm chung: Penixillin dẫn xuất 6-aminopenixilamic gồm vòng thiazolidin vòng beta-lactam Mơn học: Đồ án CNLM GVHD: TS Nguyễn Hồi Hương - Cơng thức cấu tạo chung penicillin : • Khi thay H kim loại kiềm kiềm thổ penixillin dễ tan nước (như Na, K, Ca …) • Vòng beta-lactam yếu tố định hoạt tính kháng sinh • Khi thay R gốc khác penixillin có tác dụng khác - Dựa vào nguồn gốc xếp penixillin vào nhóm : Penixillin nhóm I: Gồm penixillin tự nhiên chiết xuất từ môi trường nuôi cấy nấm penixillium notatum P chrysogenum penixillin G penixillin V • Các penixillin hấp thu nhanh thải trừ khỏi thể nhanh nên thời gian tác dụng ngắn Muốn kéo dài tác dụng phải dùng dẫn xuất chúng procain benzyl penixillin (kéo dài 24 h) benzathin benzyl penixillin • - ( kéo dài tuần ) Các penixillin chậm dung để tim bắp không tiêm tĩnh mạch Penixillin nhóm II : Gồm dẫn xuất penixillin bán tổng hợp có phổ kháng khuẩn hẹp Penixillin G có khả kháng penixilinase dùng để chữa bệnh nhiễm khuẩn tụ cầu kháng penixillin nhóm I methycylin, - cloxaxilin Penixilin nhóm III : Gồm penixillin bán tổng hợp phổ rộng, không kháng penixilase nhung kháng vi khuẩn Gram(-) mà penixillin nhóm II tác dụng bền vững mơi trường dịch vị nên dung để uống ampixillin, amoxycilin Môn học: Đồ án CNLM 1.3 - GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương Nhu cầu sản phẩm thị trường nước quốc tế Báo cáo sử dụng kháng sinh kháng kháng sinh 15 bệnh viện Việt Nam năm 2008-2009: Tình trạng kháng kháng sinh Việt Nam mức độ cao Trong số nước thuộc mạng lưới giám sát nguyên kháng thuốc Châu Á (ANSORP), Việt Nam có mức độ kháng - penicillin cao (71,4%) Sau Thế chiến thứ II, kháng sinh buôn bán rộng rãi thị trường thực trở thành loại thuốc phổ biến Năm 1949, Mỹ sản xuất 1,3 nghìn tỷ đơn vị Penicillin, cao nhiều so với mức 1,7 tỷ đơn vị năm 1944 Mơn học: Đồ án CNLM GVHD: TS Nguyễn Hồi Hương Có thể nói, kháng sinh Penicillin loại thuốc dòng này, mở kỷ nguyên cho ngành dược Trước đó, vết thương nhiễm trùng gây tử vong, bệnh nhiễm khuẩn viêm họng khiến bệnh nhân qua đời Những loại bệnh lậu, giang mai lây lan qua đường tình dục - án tử hình với nhiều người 500 năm trước kháng sinh đời Tuy vậy, mũi tiêm Benzathin G chấm dứt giai đoạn đầu bệnh giang mai nhiều loại bệnh hiểm nghèo khác Thậm chí ngày nay, Benzathin G - kháng sinh hiệu chống lại bệnh thấp khớp cấp giang mai Tổ chức WHO cho biết khoảng 5,6 triệu người giới bị nhiễm giang mai mũi tiêm Penicillin cứu 53.000 trẻ sơ sinh 30 quốc - gia tử vong sinh tử cung nhiễm bệnh vào năm 2012 Khơng riêng nước nghèo, cường quốc Mỹ phải đau đầu với tình trạng thiếu Penicillin Sự thiếu hụt Benzathin G từ tháng 4/2016 khiến kinh tế số giới khơng thể chấm dứt bệnh giang mai tồn - quốc điều đe dọa tới sức khỏe cộng đồng Trong 10 năm qua, bệnh giang mai tăng gấp đôi Mỹ đứa trẻ sinh tử cung nhiễm bệnh mắc chứng bệnh điếc, mù, dị dạng xương, sinh - non chí tử vong Hãng dược lớn Mỹ Pfizer đáp ứng nhu cầu Benzathin G với - lý “chậm trễ sản xuất” Tháng 11/2014, nhân viên kiểm tra quan an toàn sức khỏe dược phẩm Pháp (FNAMHPS) thăm sở sản xuất Smisyntech phát nhiều trường hợp làm giả tài liệu tình trạng hạ tiêu chuẩn sản xuất đến mức có - nguy ô nhiễm sản phẩm cao Ngay lập tức, nhân viên đoàn kiểm tra đề nghị Liên minh Châu Âu (EU) ngừng nhập sản phẩm Semisyntech Cục quản lý dược phẩm Châu Âu (EDQM) đưa giấy chứng nhận chất lượng công ty cho họ đạt tiêu chuẩn Phần lớn chuyên gia nhận định động thái Châu Âu bất đắc dĩ NCPC có vị vơ lớn ngành dược nguồn cung cấp lớn để sản xuất Benzathin G Môn học: Đồ án CNLM - GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương Hàng loạt thị trường khác Hongkong, Ethiopia, Liberia ngừng nhập sản phẩm hãng dược có sử dụng nguyên liệu hoạt tính nhập từ Trung Quốc Vào năm 2015, Brazil định từ chối đề nghị bán Benzathin G - Semisyntech bất chấp dịch bệnh giang mai bùng phát mạnh mẽ Dẫu vậy, tình hình căng thẳng khan nguồn cung buộc Brazil phải chấp nhận mua khẩn cấp 2,7 triệu lọ Benzathin G từ Mỹ vào tháng 4/2016 Đến tháng 7/2016, Brazil buộc phải chấp nhận cho Semisyntech nhập - Benzathin G vào nước Vào năm 2013, khoảng 14.000 trẻ sơ sinh sinh tử cung nhiễm bệnh giang mai việc thiếu Benzathin G khiến số tăng 35% lên 19.000 trường hợp vào năm 2015 Nội dung 2.1 Vi sinh vật tạo sản phẩm: Penicillinum chrysogenum - Giới: Fungi - Ngành: Ascomycota - Phân ngành : Peziomycotina - Lớp: Eurotiomycetes - Bộ: Eurotiales - Họ: Trichocomaceae - Chi: Penicillium - Loài: P.chrysogenum - Đặc điểm: Penicillium chrysogenum loại nấm mốc có mặt phổ biến tự nhiên, thường - tìm thấy thức ăn mơi trường Đa số có hình sợi Hiếu khí bắt buộc Sợi có ngăn vách (đa bào).Sợi nấm thường ống hình trụ dài có kích thước lớn nhỏ khác tùy lồi Đường kính sợi nấm thường từ 3-5µm, có đến 10µm Chiều dài sợi nấm tới vài chục cm Vách tế bào nấm cấu tạo vi sợi chitin 10 Môn học: Đồ án CNLM GVHD: TS Nguyễn Hồi Hương q trình vận hành pha để trì nồng độ glucose ln mức thích hợp nhằm vừa giữ khối lượng hệ sợi ổn định, vừa đảm bảo sinh tổng hợp nhiều penicillin - Trong thực tiễn, để tránh xảy thiếu hụt thời glucose , người ta kết hợp bổ sung lượng nhỏ đường lactose (khi đó, chưa bổ sung kịp glucose nấm mốc tự điều chỉnh để sử dụng đường lactose nên không xảy tượng tự phân hệ sợi) Ngoài nguồn nitơ nước chiết ngô, người ta thường sử dụng phối hợp (NH4)2SO4 để vừa cung cấp thức ăn N S, vừa sử dụng để điều chỉnh pH trình lên men (pH dịch len men ban đầu thường điều chỉnh khoảng pH = 6,5 – 6,8 dung dịch NaOH H3PO4); nồng độ NH4 + thường khống chế khoảng 0,3 – 0,4 kg/m3 dịch lên men Chất phá bọt thường sử dụng loại dầu béo như: mỡ lợn, dầu đậu tương, dầu vừng, dầu cám…Tiền chất tạo nhánh phenylacetic lên men sản xuất penicillin G (hoặc phenooxyacetic lên men sản xuất penicillin V) bổ sung liên tục (hoặc bổ sung gián đoạn làm nhiều lần) suốt thời gian pha lên men penicillin, để trì nồng độ khoảng 0,1 – 1,0 kg/m3 dịch (nếu nấm mốc tổng hợp đồng thời nhiều penicillin khác, nhiều gây độc cho nấm tăng cường thúc đẩy q trình hydroxyl hóa sản phẩm penicillin) - Nhiệt độ lên men pha đầu khống chế 30oC, sau sang pha sau giữ 22 – 25 oC Tốc độ sục khí khuấy trộn điều chỉnh để trì nồng độ oxy hòa tan dịch khoảng 30% Trong điều kiện thời gian lên men mẻ thường kéo dài khoảng 144 – 180 Kết thúc trình lên men người ta cố gắng lọc sớm dịch lên men, làm lạnh chuyển sang cơng đoạn trích ly tinh chế thu penicillin STT Thành phần Cao ngô Khô hạt có dầu (lạc, đậu tương hứơng dương) Lactose Glucose hydol Môi trường 2.0-2.4 Môi trường Môi trường 2.0-3.0 - 2.0-2.4 5.0 1.0 5.0 1.0 1.0 1.0 24 Môn học: Đồ án CNLM 10 11 12 Dầu thực vật Amon nitrat Sulfat natri Kali photphat Magie sulfat Natri hyposunfit Canxi cacbonat Tiên chất GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 0.5-1.0 0.4 0.05 0.4 0.025 0.2 0.5-1.0 0.2-0.4 0.5-1.0 0.4 0.05 0.4 0.025 0.2 0.5-1.0 0.3-0.4 2.5-3.5 0.4 0.05 0.4 0.25 0.2 0.5-1.0 0.3-0.4 Đặc điểm thiết bị lên men chìm: - Quá trình lên men sản xuất penicillin ngày chủ yếu tiến hành thiết bị lên men chìm chế tạo nhóm thép chịu ăn mòn CT2 với khuấy trộn kiểu tuốc-bin (gồm nhiều tầng cánh khuấy), kết hợp bố trí hệ vách dẫn dòng thùng) Cơng suất khuấy trộn tiêu hao thiết kế khoảng 3kW/m 3/h Khơng khí nén vơ khuẩn cấp vào qua hệ ống phân phối kiểu vòng xốy hay kiểu rẻ quạt đục lỗ lắp đặt sát đáy (hay phía cánh tuốc-bin) Bên thiết bị lắp đặt nhiều tầng ống trao đổi nhiệt kiểu vòng xoắn kết hợp đồng thời với trao đổi nhiệt qua thành thiết bị hai lớp vỏ, đảm bảo điều nhiệt hiệu suốt q trình lên men Dung tích thiết bị phổ biến khoảng 150 – 300m 3, hệ số đổ đầy thường chọn khoảng 80%V (phụ thuộc vào kỹ thuật thiết bị phá bọt) Thiết bị nhân sản xuất giống có dung tích khoảng 10%V thiết bị len men, thiết kế tương tự thường ghép cứng với thiết bị lên men Toàn thiết bị lên men sản xuất, thiết bị nhân giống lớn hệ thống trang thiết bị phụ trợ thiết kế lắp đặt đảm bảo vệ sinh thao tác vận hành theo chế độ vô khuẩn cao (tốt nên bố trí cho có thểíap dụng chế độ trùng đồng thời cho toàn hệ thiết bị này) Các thông số kiểm tra trình lên men bao gồm: pH mơi trường, nồng độ oxy hòa tan, nhiệt độ, hàm lượng sinh khối tốc độ biến thiên lượng sinh khối, số lượng, kích thước cấu trúc pellet, nồng độ cấu tử chất, nồng độ penicillin, thành phần khí thải tiêu kiểm tra vi sinh vật Việc giám sát điều chỉnh trình lên men xây dựng sở khai thác hai kiểu 25 Mơn học: Đồ án CNLM GVHD: TS Nguyễn Hồi Hương tương tác trực tuyến (online control) tương tác không phản hồi theo quy luật (offline control), phụ thuộc vào khả đáp ứng hệ thiết bị có Đồng thời xu hướng máy tính hóa kiểm tra giám sát trình lên men dần chiếm ưu sản xuất công nghiệp Sơ đồ hệ lên men dùng cho sản xuất penicillin - Hiệu kinh tế chung trình lên men chìm Năng lực sinh tổng hợp tích tụ penicillin dịch lên men kết mối tương tác đồng thời hàng loạt yếu tố công nghệ như: hoạt tính sinh tổng hợp chúng, cơng nghệ lên men áp dụng, chất lượng nguyên liệu, đặc tính thiết bị lực đáp ứng yêu cầu công nghệ thiết bị, chế độ giám sát điều chỉnh thông số công nghệ, lực kỹ vận hành công nhân Với nguồn chất glucoza lên men theo phương pháp chìm, hệ số phân bổ nguyên liệu dự tính khoảng 25% glucoza nấm mốc sử dụng để tổng hợp hệ sợi, 65% đường sử dụng để trì sống sót hệ sợi, lại khoảng 10% nấm mốc sử dụng để tổng hợp penicillin Hệ số sử dụng thức ăn nitơ lưu huỳnh để tổng hợp penicillin tương ứng 20% 80% Nồng độ penicillin G dịch lên men năm 80 - 90 kỷ XX đạt khoảng 80.000 UI/ml (tương ứng suất khoảng 40 - 50 kg penicillin G/ m3 dịch lên men) 2.3.4 Lọc dịch lên men : - Mục đích: Penicillin sản phẩm lên men ngoại bào Vì vậy, sau kết thúc trình lên men người ta thường tiến hành lọc để giảm tổn hao phân huỷ 26 Môn học: Đồ án CNLM GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương penicillin giảm bớt khó khăn tinh chế, tạp chất tạo hệ sợi nấm - tự phân Thiết bị lọc: phổ biến thiết bị lọc hút kiểu băng tải kiểu thùng quay Thông thường, người ta cần lọc lần làm lạnh dịch để chuyển sang công đoạn Chỉ trường hợp đặc biệt cần phải xử lý kết tủa phần protein lọc lại dịch lần thứ hai Hiện tượng tự phân hệ sợi nấm - thường kéo theo hậu làm cho dịch khó lọc Thu hồi sinh khối nấm: Phần sinh khối nấm rửa sạch, sấy khô sử dụng để chế biến thức ăn gia súc 2.3.5 Trích ly : - Penicillin thường trích ly dạng axít khỏi dịch lọc dung môi amylacetat butylacetat pH = 2,0 - 2,5, nhiệt độ - 0C Nhằm hạn chế lượng penicillin bị phân huỷ, trình trích ly thực thời gian ngắn thiết bị trích ly ngược dòng liên tục kiểu ly tâm nhiều tầng cánh Đồng thời, thời gian trích ly cần giám sát chặt chẽ thơng số công nghệ như: nhiệt độ pH, độ vô khuẩn để hạn chế tổn thất phân huỷ penicillin Dịch lên men sau lọc bơm trộn đồng thời với dung dịch H 2SO4 H3PO4 lỗng có bổ sung thêm chất chống tạo nhũ bơm song song với dung mơi trích ly vào thiết bị Tỉ lệ dịch lọc: dung môi thường chọn khoảng - 10V dịch lọc /1V dung môi Trong số công nghệ, nhằm cải thiện chất lượng sản phẩm, người ta áp dụng phương pháp trích ly hai lần dung mơi, với lần đầu trích ly penicillin amylacetat butylacetat; penicillin lại trích ly ngược sang dung dịch đêm pH = 7,2 - 7,5, thường dung dịch KOH loãng dung dịch NaHCO3; sau penicillin lại trích ly sang dung mơi lần thứ 2, với lượng dung mơi Sơ đồ cơng nghệ trích ly lần dung mơi tinh chế penicillin 27 Môn học: Đồ án CNLM GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 2.3.6 Tẩy màu (hấp thụ than hoạt tính) : - Để tẩy màu loại bỏ số tạp chất khác, người ta thường bổ sung trực tiếp chất hấp phụ vào dung môi chứa penicillin sau trích ly, sử dụng phổ biến than hoạt tính Sau than hoạt tính tách rửa lại sử dụng thiết bị lọc hút băng tải thiết bị lọc hút kiểu thùng quay Phần than sau lọc đưa chưng thu hồi dung mơi xử lý hồn ngun, phục vụ cho mẻ sau 2.3.7 Kết tinh, lọc, rửa sấy thu penicillin tự nhiên: - Việc kết tinh penicillin V hay penicillin G dạng muối thực đơn giản, cách bổ sung trực tiếp vào dung môi sau tẩy màu lượng nhỏ kali acetat (hay natri acetat) người ta trích ly lại sang dung dịch KOH loãng (hay NaOH loãng), tiến hành chân khơng nhiệt độ thấp, sau bổ sung BuOH để penicillin tự kết tinh Các thông số cơng nghệ có ảnh hưởng lớn đến hiệu qủa kết tinh : nồng độ penicillin, nồng độ muối acetat, pH dung môi hay pH dung dịch cô đặc, nhiệt độ kết tinh Sau kết tinh, tinh thể penicillin lọc tách máy lọc hút thùng quay Để đảm bảo độ tinh khiết cao hơn, tiến hành hòa tan kết tinh lại penicillin Khi sản phẩm đạt độ tinh theo yêu 28 Mơn học: Đồ án CNLM GVHD: TS Nguyễn Hồi Hương cầu, thường độ tinh khiết không 99,5%, chúng lọc tánh tinh thể; rửa làm khô sơ dung môi kỵ nước izopropanol hay butylalcohl; hút chân không tách dung môi máy lọc băng tải sấy khơng khí nóng đến dạng sản phẩm bột muối penicillin Sản phẩm này, phần sử dụng trực tiếp để pha chế thuốc kháng sinh penicillin; lại, phần lớn sử dụng làm nguyên liệu phục vụ cho việc sản xuất sản phẩm penicillin cephalosporin bán tổng hợp khác Ngoài ra, để sản xuất sản phẩm penicillin có độ tinh khiết cao, người ta cần phải sử dụng phối hợp thêm số giải pháp công nghệ khác Các thiết bị dùng sản xuất penicillin: Thiết bị sấy chân khơng Thiết bị lọc than hoạt tính Thiết bị lọc sinh học Thiết bị sấy 2.3.8 Tác động thơng số q trình sinh tổng hợp penicillin 29 Môn học: Đồ án CNLM GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương Sự phát triển hệ sợi đặc điểm hình thái hệ sợi nấm: Sự phát triển hệ sợi nấm q trình lên men bao gồm: • Sự tăng trưởng kích thước hệ sợi (tăng độ dài sợi, lớn lên kích 2.3.8.1 - thước, mức độ phân nhánh hệ sợi ) • Sự biến thiên số lượng khóm sợi nấm mơi trường: Thông thường, phát triển đánh giá qua hai tiêu là: hàm lượng sinh khối tốc độ biến thiên hàm lượng sinh khối môi trường Hai tiêu xác định nhiều phương pháp khác như: hàm lượng sinh khối (Sinh khối tươi sinh khối khô), mật độ quang dịch lên men, trở lực lọc dịch lên men, hàm lượng nitơ, hàm lượng hydratcacbon, hàm lượng axit nucleic Trong phương pháp trên, áp dụng phổ biến sản xuất công nghiệp phương pháp xác định qua hàm lượng sinh khối - Tốc độ phát triển hệ sợi nấm phụ thuộc hàng loạt yếu tố khác trình lên men tích tụ penicillin thường xảy mạnh mẽ hệ sợi phát triển đạt trạng thái cân Trạng thái xác lập cung cấp vừa đủ liên tục lượng thức ăn tối thiểu cho nấm mốc Thiếu thức ăn, hệ sợi nấm tự phân, cung cấp nhu cầu trên, hệ sợi phát triển, khơng tích tụ mạnh penicillin mà tích tụ nhiều axit gluconic axit malic - Đặc điểm hình thái cấu trúc hệ sợi nấm: Trong trình lên men, nhiều nguyên nhân khác nhau, số lượng khóm sợi nấm có xu hướng tăng lên, trình lên men tĩnh Trong điều kiện lên men có sục khí khuấy trộn, tác dụng va đập học với cánh khuấy chuyển động dòng xốy mơi trường, mặt đứt gãy hệ sợi nấm xảy nhiều hệ sợi nấm có xu hướng vón cuộn lại thành cấu trúc búi sợi cuộn xoắn, gọi pellet • Pellet xốp (fluffy loose pellets) dạng pellet có phần bên hệ sợi cuộn thành khối mịn, lớp sợi phía bên ngồi cuộn lỏng lẻo tạo thành cấu trúc xốp 30 Môn học: Đồ án CNLM • GVHD: TS Nguyễn Hồi Hương Pellet mịn (compact smooth pellets) có đặc điểm phần sợi phía bên pellet cuộn tương đối chặt chẽ đến gần sát lớp sợi phía ngồi, • lớp sợi phía ngồi cuộn đủ thành lớp sợi mịn Pellet rỗng (hollow pellets) dạng pellet có phần sợi bên bị tự phân tạo thành khoảng rỗng, hệ sợi phía bên ngồi cuộn chặt thành lớp sợi mịn - chắn Hiệu chung q trình lên men có quan hệ hữu với số lượng, kích thước cấu trúc pellet nấm Trong thực tiễn sản xuất công nghiệp, người ta thường điều chỉnh thông số công nghệ theo hướng ưu tiên tạo dạng pellet đủ nhỏ mịn, hạn chế tạo pellet xốp ngăn ngừa hình thành pellet rỗng Điều kiện công nghệ tương ứng với mục tiêu thường áp dụng : tỉ lệ giống 10%, với mật độ dịch giống (2-10).1011 bào tử /m3; phối hợp điều chỉnh sục khí khuấy trộn để đảm bảo cung cấp oxy hòa tan dư so với nhu cầu tương ứng với thời điểm lên men, để tạo pellet mịn nhỏ (kích thước pellet thích hợp khoảng 0,2 - 0,5mm), điều kiện cân nhu cầu tiết kiệm mức tiêu tốn lượng khuấy trộn 2.3.8.2 Đặc tính nhiệt động dịch lên men: - Trong thiết bị lên men dung tích lớn có sục khí khuất trộn, thực tế xác lập đồng khắp vùng thể tích làm việc thiết bị Tại vùng chảy rối (vùng gần cánh khuấy), tốc độ trao đổi nhiệt, tốc độ chuyển khối xảy mạnh mẽ Còn vùng chảy màng (vùng sát thành thiết bị, vùng gần ống xoắn trao đổi nhiệt, vùng hiệu hay vùng chết thiết bị…) tốc độ chuyển khối hay tốc độ truyền nhiệt giảm Ngoài ra, khu vực định thiết bị xuất vùng xốy cục hay dòng chảy - thứ cấp làm thiếu hụt hàm lượng oxy hòa tan Các yếu tố nêu tác động trực tiếp đến lực sinh tổng hợp chủng, hiệu chuyển hóa tạo sản phẩm hiệu kinh tế chung tồn q trình lên men Thực tế thường chọn chế độ khuấy trộn dư mức yêu cầu Thành phần môi trường lên men: Môi trường sở để lên men penicillin, vào thời kỳ đầu năm 40 - 50, 2.3.8.3 - môi trường lactoza - nước chiết ngô 31 Môn học: Đồ án CNLM - GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương Nguồn chất chính: lactoza thay phần toàn chất khác như: loại đường hexoza, đường pentoza, disaccarit, dextrin hay thay dầu thực vật Trong chất nêu trên, hiệu cao glucoza - Ngoài ra, sử dụng dầu thực vật làm chất phá bọt phải xét đến hiệu ứng nấm mốc sử dụng phần dầu thực vật làm nguồn cung cấp thức ăn cacbon, để tính tốn điều chỉnh nồng độ glucoza môi trường lên men (và cản trở trình chuyển khối ảnh hưởng dầu phá bọt) - Nguồn cung cấp thức ăn nitơ: sử dụng bột đậu tương, bột hạt bông, loại dầu cám Nhu cầu thức ăn nitơ đáp ứng cách cung cấp liên tục (NH4)2SO4, trì nồng độ thấp, khoảng 250 - 340g/l (nếu dư thừa hiệu sinh tổng hợp penicillin giảm, thiếu xảy tượng tự phân hệ sợi) - Hàm lượng chất khống bổ sung: tính tốn, phụ thuộc vào lượng dịch chiết ngô sử dụng; pH môi trường điều chỉnh trước trùng, sau suốt q trình lên men giám sát chặt chẽ điều chỉnh theo yêu cầu công nghệ - Nồng độ tiền chất tạo nhánh:Trong trình sinh tổng hợp penicillin, việc kết gắn mạch nhánh phân tử penicillin khơng mang tính đặc hiệu chặt chẽ Nhờ vậy, trì nồng độ tiền chất tạo nhánh cần thiết phenylacetat (hoặc phenooxyacetat) cho phép thu nhận chủ yếu loại penicillin G dịch lên men (hoặc penicillin V) Theo lý thuyết, nhu cầu phenylaceta 0,47g/gam penicillin G (hoặc phenooxyacetat 0,50g/gam penicillin V ) Cần ý hai cấu tử thực chất gây độc cho nấm nên người ta thường lựa chọn giải pháp bổ sung liên tục cấu tử khống chế chặt chẽ nồng độ theo yêu cầu, để không làm suy giảm lực lên men chủng sản xuất Điều kiện tiến hành lên men: Nhiệt độ thơng số có ảnh hưởng lớn đến phát triển nấm mốc, khả 2.3.8.4 - sinh tổng hợp lực tích tụ penicillin chúng Nhìn chung nấm mốc phát 32 Mơn học: Đồ án CNLM GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương triển thuận lợi dải nhiệt độ khoảng 30 0C Tuy nhiên, dải nhiệt độ tốc độ phân huỷ penicillin xảy mạnh mẽ Trong thực tế, giai đoạn nhân giống sản xuất người ta thường nhân dải nhiệt độ 30 0C; sang giai đoạn lên men thường áp dụng hai chế độ nhiệt : • Lên men dải nhiệt độ: Thường trì nhiệt độ suốt q trình lên • men dải nhiệt độ 25 - 270C Lên men hai chế độ nhiệt độ: Giai đoạn lên men bắt đầu tiến hành 30 0C hệ sợi phát triển đạt yêu cầu hàm lượng sinh khối điều chỉnh nhiệt độ sang chế độ lên men penicillin dải nhiệt độ 22 - 25 0C (có cơng nghệ điều chỉnh xuống 22 - 23 0C, giữ nhiệt độ tiếp hai ngày - chuyển sang lên men tiếp 250C kết thúc q trình lên men) pH mơi trường thuận lợi cho phát triển hệ sợi cho trình sinh tổng hợp penicillin thường dao động khoảng pH = 6,8 - 7,4 Tuy nhiên điều kiện pH cao xu hướng phân huỷ penicillin tăng lên Vì vậy, sản xuất pH mơi trường thường khống chế chặt chẽ giá trị lựa chọn khoảng pH = 6,2 - - 6,8 Nồng độ oxy hoà tan cường độ khuấy trộn dịch lên men: Với nhiều chủng nấm mốc, nồng độ oxy hòa tan thuận lợi cho trình sinh tổng hợp penicillin dao - động quanh mức 30% nồng độ oxy bão hòa Nồng độ CO2 dịch lên men mức định cần thiết cho trình nảy mầm bào tử nấm mốc; nhiên nồng độ CO cao làm cản trở trình hấp thu chuyển hoá chất chủng, nghĩa làm làm cản trở trình sinh tổng hợp penicillin Sự tích tụ phân huỷ penicillin: Trong q trình lên men, nhiều nguyên nhân khác nhau, có ảnh hưởng 2.3.8.5 - nồng độ penicillin tích tụ môi trường ngày tăng, làm cho lực sinh tổng hợp penicillin chủng có xu hướng giảm dần theo thời gian lên men Đồng thời, phụ thuộc vào nhiệt pH môi trường, phần lượng penicillin - tích tụ bị phân huỷ theo thời gian Nhằm giảm tổn thất trên, sau kết thúc trình lên men cần xử lý thu sản phẩm sớm có giải pháp hạ thấp nhanh nhiệt độ dịch lên men 2.4 Một số sản phẩm thị trường ngồi nước: 33 Mơn học: Đồ án CNLM GVHD: TS Nguyễn Hồi Hương 34 Mơn học: Đồ án CNLM 2.5 GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương Tiêu chuẩn quốc gia liên quan: 35 Môn học: Đồ án CNLM GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 8348:2010 - Thủy sản sản phẩm thủy sản (Xác định dư lượng thuốc kháng sinh nhóm Penicillin (Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao) TCVN 8348 : 2010 Cục Chế biến, Thương mại nông lâm thuỷ sản nghề muối biên soạn, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố - TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 5147: 1990 Thịt sản phẩm thịt Phương pháp xác định dư lượng Penicillin TCVN 5147:90 Trung tâm kiểm dịch động vật xuất nhập Hà Nội biên soạn, Bộ Nông nghiệp Công nghiệp thực phẩm đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, ủy ban khoa học nhà nước công bố KẾT LUẬN- KIẾN NGHỊ: 36 Môn học: Đồ án CNLM - GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương Xây dựng quy trình sản xuất kháng sinh penicilline quy mơ công nghiệp vừa nhỏ Penicillin sản xuất phương pháp lên men chìm ưa khí chiết xuất độ pH thấp từ dịch lên men - Năng suất tương đối thấp, phương pháp sản xuất truyền thống có chi phí cao Bên cạnh đó, sản xuất Việt Nam 90% nguồn nguyên vật liệu phục vụ cho ngành dược phải nhập Mức thuế nhập nguyên phụ liệu sản xuất dược phẩm lại cao so với nước khác.Những yếu tố đẩy giá thành sản phẩm lên cao mà nước lại chuộng thuốc ngoại nhập hàng nội Cho nên nhà đầu tư mở rộng mạng lưới phân phối tìm đối tác để liên doanh, hợp tác sản xuất không đầu tư sản xuất để giá thuốc rẻ Sự e ngại nhà đầu tư ngoại thực tế gây khó khăn cho số công ty nội Hy vọng tương lai có nhiều cơng ty, nhà đầu tư dây chuyền sản xuất đại, nguồn nguyên liệu chất lượng tốt nước nhà để giá thành giảm bớt phần nhằm cung ứng đủ cho bệnh viện, nhà thuốc mà không phụ thuộc vào số lượng ngoại nhập nữa, tránh tình trạng mở đường cho thuốc giả, thuốc nhái tràn vào nội địa TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Văn Cách, Công nghệ lên men chất kháng sinh, NXB khoa học kỹ thuật Hà Nội, 2004 37 Mơn học: Đồ án CNLM GVHD: TS Nguyễn Hồi Hương http://doc.edu.vn/tai-lieu/do-an-cong-nghe-san-xuat-chat-khang-sinh-penicillin- 8592/ https://123doc.org//document/3167637-quy-trinh-san-xuat-penicillin.htm genk.vn/su-suy-tan-cua-khang-sinh-penicillin-va-moi-de-doa-den-hang-trieu-tinhmang-tren-toan-cau-20170525115203321.chn s1.downloadmienphi.net/file/downloadfile10/204/1316193.docx 38 ... TS Nguyễn Hồi Hương CƠNG NGHỆ SẢN XUẤT KHÁNG SINH PENICILLIN ĐẶT VẤN ĐÈ Lịch sử phát sản xuất Penicillin: Người phát kháng sinh A Fleming Năm 1928, nghiên cứu 1.1 - vi sinh vật gây bệnh , ông... sản xuất hàng loạt chế phẩm penicillin bán tổng hợp khác Ngày giới sản xuất 500 chế phẩm penicillin (trong lên men trực tiếp hai sản phẩm penicillin V penicillin G) tiếp - tục triển khai để sản. .. đến dạng sản phẩm bột muối penicillin Sản phẩm này, phần sử dụng trực tiếp để pha chế thuốc kháng sinh penicillin; lại, phần lớn sử dụng làm nguyên liệu phục vụ cho việc sản xuất sản phẩm penicillin