PHÂN LẬP, NUÔI CẤY VÀ BẢO QUẢN TẾ BÀO GỐC THẦN KINH TỪ THAI CHUỘT NHẮT TRẮNG (Mus musculus var. albino)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ******* ******* KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, NI CẤY VÀ BẢO QUẢN TẾ BÀO GỐC THẦN KINH TỪ THAI CHUỘT NHẮT TRẮNG (Mus musculus var albino) Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : TƠN LONG TUẤN Niên khóa : 2008 - 2012 Tháng 7/2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ******* ******* KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, NUÔI CẤY VÀ BẢO QUẢN TẾ BÀO GỐC THẦN KINH TỪ THAI CHUỘT NHẮT TRẮNG (Mus musculus var albino) Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực ThS Phạm Văn Phúc Tơn Long Tuấn Tháng 7/2012 LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp thành sáu tháng nghiên cứu phòng Thí nghiệm Ứng dụng Tế bào gốc trường Đại học Khoa học Tự Nhiên Tp.HCM tâm huyết sau năm đại học khơng ngừng nỗ lực, phấn đấu vươn lên học tập trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM Xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM, Ban Chủ nhiệm môn Công nghệ Sinh học hỗ trợ tạo điều kiện thuận lợi cho chúng tơi q trình học tập Trân trọng biết ơn quý thầy cô môn Công nghệ Sinh học tận tình truyền đạt kiến thức quý báo cho suốt thời gian học tập Xin bày tỏ lòng kính trọng lời biết ơn sâu sắc đến ThS Phan Kim Ngọc ThS Phạm Văn Phúc, người giúp đỡ tận tình, hướng dẫn tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành luận văn Xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới anh Vương Gia Tuệ, chị Đinh Thị Hồng Nhung tận tình bảo, chia sẻ kinh nghiệm làm việc phòng thí nghiệm Xin gửi lời cảm ơn chân thành tới bạn Yên, Dũng, Triết, Long, người bạn đồng nghiệp giúp hoàn thành luận văn Cảm ơn bạn bè thân yêu lớp DH08SH chia sẻ vui buồn thời gian học tập ghế giảng đường đại học, hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tơi q trình thực khóa luận Thành kính ghi ơn ba mẹ người thân gia đình ln tạo điều kiện động viên suốt trình học tập trường Tp.HCM, ngày 27 tháng năm 2012 Tơn Long Tuấn i TĨM TẮT Các bệnh thối hóa thần kinh vấn đề nghiêm trọng người lớn tuổi toàn giới, bệnh Parkinson Alzheimer thu hút nhiều Việc hạn chế liệu pháp chữa trị cho bệnh dẫn đến tỉ lệ người chết hàng năm cao Cho đến đầu kỉ 20, nhà khoa học chấp nhận giả định tổn thương não chữa trị thiếu khả tạo tế bào Gần đây, nhiều nghiên cứu chứng minh có diện ổ tế bào gốc não trưởng thành Các tế bào gốc có khả biệt hóa thành tế bào thần kinh thay tế bào bị não Do đó, việc thiết lập dòng tế bào gốc thần kinh cần thiết cho việc khám phá vai trò chúng liệu pháp phục hồi não bị tổn thương Thực phân lập tế bào gốc từ chuột mang thai tuần tuổi Tế bào ni cấy mơi trường khơng huyết có bổ sung nhân tố B27, N2, EGF, bFGF, heparin, insulin transferrin Đặc tính gốc thần kinh tế bào ứng viên chứng minh thơng qua thí nghiệm tạo sphere, biệt hóa thành astrocyte phương pháp nhuộm hóa mơ miễn dịch Sau đó, đem tế bào đông lạnh môi trường không huyết Thành công thử nghiệm đạt việc thiết lập môi trường cho nuôi cấy tế bào tạo sphere Khi nuôi cấy mơi trường khơng huyết thanh, sphere hình thành nên sphere thứ cấp Các sphere đạt kích thướt tới mm trì vòng tháng Các tế bào ứng viên chứng minh có đặc tính tế bào gốc thông qua khả tự làm mới, biệt hóa thành astrocyte, biểu nestin- marker phổ biến cho tế bào gốc thần kinh tế bào tiền thân thần kinh Ngoài ta, tế bào đơng lạnh có tỷ lệ sống sau giải đơng cao ii SUMMARY Neurodegenerative diseases, Parkinson and Alzheimer, are the most serious problems in elder people all over the world Limited therapies for these diseases leads to high rate of annual death Until the beginning of 20th century, almost scientists accepted the theory that damage in brain could not be cured due to lack of proliferative ability of neural cells Recently, many researches indicated that there are niches of stem cells in adult brains Therefore, these stem cells have the ability to differentiate to every line of neural cells and replace lost cells in brain They are so-called neural stem cells (NSC) Neural stem cells can be isolated from fetal, adult brains, differentiate from embryonic stem cells or induced-pluripotent stem cells The establishment of neural stem cell lines are crucial for discovering the roles of them in recovery of damaged brains We isolated neural stem cells from 2-week mouse fetus These cells are cultivated in serum-free medium supplemented with B27, N2, EGF, bFGF, heparin, insulin and transferrin Cells are propagated as floating spheres Charactiristics of neural stem cells are demonstrated on candidate cells through by sphere-formation assay, differentiation to astrocyte assay and immunocytochemistry Cells are cryoreserved in serum-free condition We are in establishing the medium in future of floating spheres when cultivating in serum-free medium These spheres can give rise to secondary and tertiary spheres These spheres would reach the diameter of mm and can be maintained in months Candidate cells are proved to have neural stem cells characteristics such as ability to self-renew, differentiate into astrocyte and express nestin – a popular marker for neural stem and progenitor cells Cryoreservation of neural stem cells also gives high rate of active cells after thawing iii MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn i Tóm tắt .ii Summary iii Mục lục iv Danh sách chữ viết tắt viii Danh sách hình, sơ đồ ix Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu đề tài 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tế bào gốc 2.1.1 Định nghĩa 2.1.2 Ổ tế bào gốc 2.1.3 Phân loại gọi tên tế bào gốc 2.1.3.1 Theo tiềm biệt hóa 2.1.3.2 Theo vị trí thu nhận 2.1.3.3 Theo kiểu tế bào biệt hóa 2.1.4 Tình hình nghiên cứu tế bào gốc Việt Nam 2.2 Tế bào gốc thần kinh (neural stem cell_NSC) 2.2.1 Lịch sử nghiên cứu tế bào gốc thần kinh 2.2.2 Định nghĩa 2.2.3 Ổ tế bào gốc thần kinh 2.2.4 NSC trình phát triển hệ thần kinh trung ương 2.2.5 Sự hình thành phát triển tế bào thần kinh não trưởng thành 2.2.6 Phương pháp để chứng minh tế bào ứng viên NSC 11 2.2.6.1 Phân tích tính gốc thơng qua việc phân tích tạo tập đồn 11 iv 2.2.6.2 Khả biệt hóa tạo thành loại tế bào hệ thần kinh 12 2.2.6.3 Sự biểu marker NSC 12 2.3 Nuôi cấy tế bào gốc thần kinh in vitro 12 2.3.1 Đặc điểm NSC nuôi cấy 12 2.3.2 Các phương pháp nuôi cấy tế bào gốc thần kinh 13 2.3.2.1 Nuôi cấy lớp đơn 13 2.3.2.2 Nuôi cấy neurosphere 13 2.3.2.3 Nuôi cấy neurosphere cải tiến 14 2.4 Marker tế bào gốc thần kinh tế bào thần kinh trưởng thành 14 2.4.1 Các marker tế bào gốc thần kinh 14 2.4.1.1 Nestin 14 2.4.1.2 Msi1 (homolog of drosophila musashi/Nrp-1) 14 2.4.1.3 Sox1/2 (SRY-related HMG-box gene) 15 2.4.2 Marker cho tế bào gốc tiền thân 15 2.4.2.1 Marker A2B5 15 2.4.2.2 PSA-NCAM (polysialylayed neural cell adhesion molecule) 15 2.4.2.3 Beta tubulin III 15 2.4.3 Marker tế bào thần kinh trưởng thành 16 2.4.3.1 Oligodendrocyte 16 2.4.3.2 Astrocyte 16 2.4.3.3 Neuron 16 2.5 Ứng dụng tế bào gốc thần kinh 16 2.5.1 Bệnh Parkinson 17 2.5.2 Bệnh Alzheimer 18 2.6 Đông lạnh tế bào gốc thần kinh 19 2.6.1 Nguyên lý chung đông lạnh tế bào 19 2.6.2 Chất bảo quản lạnh cho tế bào gốc thần kinh 20 2.6.3 Dung dịch đệm đại phân tử bảo vệ tế bào gốc thần kinh 20 2.6.4 Các phương pháp đông lạnh tế bào gốc thần kinh 20 2.6.4.1 Phương pháp đông lạnh nhanh 20 2.6.4.2 Phương pháp thủy tinh hóa (vitrification) 21 v 2.6.5 Những yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng NSC sau đông lạnh giải đông 21 2.6.5.1 Chất lượng tế bào trước đông lạnh 21 2.6.5.2 Tốc độ làm lạnh 21 6.5.3 Tốc độ giải đông 21 6.5.4 Sự hình thành tinh thể đá 21 2.7 Đánh giá tế bào gốc thần kinh sau giải đông 22 Chương VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 23 3.2 Vật liệu 23 3.2.1 Mẫu vật 23 3.2.2 Dụng cụ 23 3.2.3 Thiết bị 24 3.2.4 Hóa chất 24 3.2.4.1 Dung dịch đệm rửa tế bào PBS (-) (khơng có ion Ca2+ Mg2+) 24 3.2.4.2 Dung dịch tách tế bào - trypsin/EDTA 0,25 % 25 3.2.4.3 Môi trường nuôi tế bào gốc thần kinh 25 3.2.4.4 Dung dịch hyaluronidase (1,0 mg/ml) 25 3.2.4.5 Dung dịch PBS/agarose 1,5% 26 3.3 Phương pháp nghiên cứu 26 3.3.1 Quy trình phân lập, nuôi cấy bảo quản tế bào gốc thần kinh 26 3.3.1.1 Phương pháp tráng gel bình Roux 26 3.3.1.2 Phương pháp tráng poly-L-lysine bình Roux 27 3.3.1.3 Phương pháp phân lập thu nhận tế bào gốc thần kinh chuột từ não chuột 27 3.3.1.4 Phương pháp cấy chuyền tế bào gốc thần kinh 28 3.3.2 Phương pháp chứng minh tế bào ứng viên tế bào gốc thần kinh 29 3.3.2.1 Phương pháp đánh giá khả tự làm tế bào gốc ứng viên 29 3.3.2.2 Phương pháp biệt hóa tế bào gốc thần kinh thành astrocyte 30 3.3.2.3 Phương pháp chứng minh tế bào ứng viên có biểu marker nestin 30 3.3.2.4 Phương pháp chứng minh tế bào astrocyte marker GFAP 32 3.3.3 Phương pháp đông lạnh tế bào 32 vi 3.3.3.1 Phương pháp đông lạnh tế bào gốc thần kinh 32 3.3.3.2 Phương pháp giải đông tế bào gốc thần kinh 33 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 4.1 Kết phân lập nuôi cấy sơ cấp tế bào gốc thần kinh từ não chuột thai 34 4.1.1 Kết nuôi cấy sơ cấp tế bào gốc thần kinh từ não thai chuột 34 4.1.2 Kết cấy chuyền tế bào gốc thần kinh 39 4.2 Chứng minh tế bào ứng viên tế bào gốc thần kinh từ não thai chuột 41 4.2.1 Kết đánh giá khả tự làm thông qua hình thành sphere 41 4.2.2 Đánh giá biểu marker tế bào gốc thần kinh tế bào ứng viên 43 4.2.3 Kết biệt hóa tế bào gốc thần kinh ứng viên thành tế bào astrocyte 45 4.3 Kết bảo quản tế bào 49 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 52 5.1 Kết luận 52 5.2 Đề nghị 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 PHỤ LỤC vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AS BDNF BSA ctv DMSO DMEM EC EGF EG ES FACS FBS FGF FITC ICM GFAP LV MS NSC PBS PNS PSA-NCAM RMS SC SGZ SVZ Adult stem cell Brain-drived neutrophic factor Bovine serum albumin Cộng tác viên Dimethylsulfoxide Dulbecco’s modified essential medium Embryonic carcinoma Epidermal growth factor Embryonic germ cell Embryonic stem cell Fluorescence activated cell sorting Fetal bovine serum Fibroblast growth factor Fluorescein isothiocyanate Inner cell mass Gial fibrillary acidic protein Lateral ventricle Multiple sclerosis Neural stem cell Phosphate buffer saline Peripheral nervous system Polysialylayed neural cell adhesion molecule Rostral migratory stream Stem cell Subgranular zone Subventricular zone viii Hình 4.8 Sự hình thành sphere sau tuần nuôi cấy (a) Các tế bào đơn tăng sinh tạo thành cụm tế bào nhỏ sau ngày nuôi cấy; (b) Cụm tế bào sau ngày nuôi cấy; (c) Cụm tế bào tiếp tục tăng trưởng kích thước số lượng tế bào sau ngày nuôi cấy; (d) Cụm tế bào sau tuần nuôi cấy Sau thời gian nuôi cấy, mơi trường ni cấy xuất nhiều sphere có kích thước lớn lên gần mm Các sphere có kích thước lớn, khả tăng sinh chậm tế bào xung quanh bề mặt sphere có xu hướng biệt hóa gần hồn tồn Sau khoảng từ 9-10 lần cấy chuyền, sphere độ nén chặt, tế bào bên lớp tế bào biệt hóa bên ngồi rã, sphere có xu hướng chết dần Tuy nhiên, có số sphere nhỏ bên sphere lớn bị rã, tiếp tục tăng sinh môi trường nuôi cấy Thử nghiệm tạo sphere chủ yếu dựa vào tần suất biểu phát triển thành sphere tế bào gốc thần kinh cách cấy chuyền với cường độ liên tục (Reynolds Rietze, 2005) Có số lượng tế bào sphere khả tự làm cấy chuyền lần trở lên, điều chứng tỏ bên cạnh quần thể tế bào gốc nằm sphere tồn số quần thể tế bào khác tế bào tiền thân thần kinh (Gritti ctv, 2008) Người ta chứng minh sau nhiều cấy chuyền, loại bỏ nhiều tế bào tiền thân giữ lại tế bào có khả tự làm – tế bào gốc 42 Điều phù hợp với nghiên cứu Reynolds cộng tác viên năm 2009 với thí nghiệm phát triển kích thước sphere theo thời gian phương pháp thử nghiệm tạo colony tế bào thần kinh Ngồi ra, mật độ ni cấy ảnh hưởng nhiều đến kết thử nghiệm tạo sphere, khả tạo sphere đặc biệt giảm mạnh nuôi với mật độ tế bào đơn giếng có ảnh hưởng trực tiếp đến số lượng sphere tạo thành sau thí nghiệm Các giếng có nhiều tế bào chúng kích thích tăng sinh tạo sphere nhanh Khả hình thành sphere xem thí nghiệm chứng minh khả tự làm tế bào gốc nói chung tế bào gốc thần kinh nói riêng Phương pháp lần đề xuất Reynold Weiss vào năm 1992 Họ phân lập tế bào từ vùng SVZ từ não nuôi cấy mơi trường khơng huyết có bổ sung EGF Khi ni mơi trường bám dính, chúng biệt hố thành neuron tế bào thần kinh đệm Kể từ thí nghiệm đó, thử nghiệm tạo sphere cơng nhận phương pháp chứng minh tế bào có đặc tính tế bào gốc, tự làm Ngồi phương pháp chứng minh tính gốc thử nghiệm tạo sphere có thử nghiệm tạo colony, thử nghiệm chủ yếu dựa khả phân chia không giới hạn tế bào Tuy nhiên, tế bào gốc có khả tạo colony, số tế bào khác tế bào ung thư, tế bào tiền thân thần kinh có khả tạo colony, gây sai sót kết dẫn đến cho hiệu không cao.Thông qua thời gian nuôi cấy, tính thời gian phân chia tế bào gốc thần kinh, tế bào gốc thường có khả phân chia 50 lần Tuy nhiên thử nghiệm tạo sphere thử nghiệm tốt để chứng minh tính gốc 4.2.2 Đánh giá biểu marker tế bào gốc thần kinh tế bào ứng viên Kết nhuộm hóa miễn dịch cho thấy tế bào gốc thần kinh phát huỳnh quang xanh lục có nhân phát huỳnh quang màu xanh dương Màu xanh lục màu FITC gắn kháng thể bắt đặc hiệu với phân tử nestin tế bào chất tế bào gốc thần kinh Màu xanh dương màu thuốc nhuộm Hoescht 33342 Phương pháp nhuộm huỳnh quang với thuốc nhuộm Hoechst 33342 dựa nguyên tắc phân tử thuốc nhuộm thấm qua màng tế bào bắt màu với DNA nhiễm sắc thể Hoechst chất nhuộm đặc trưng cho vùng giàu adenine-thymine (A-T) chuỗi DNA kép phổ phát huỳnh quang khác phụ thuộc vào tỷ lệ thuốc 43 nhuộm cặp base Hoechst 33342 có bước sóng kích thích cực đại 361 nm bước sóng phát xạ cực đại 486 nm Sau đó, kính hiển vi huỳnh quang sử dụng để quan sát mẫu nhuộm với thuốc nhuộm phát huỳnh quang Nestin sợi protein có khung xương tế bào dùng làm marker chuyên biệt để nhuộm NSC Nestin biểu trội với quần thể tế bào gốc hay tiền thân hệ thống thần kinh trung ương Khi tế bào thần kinh biệt hóa dần, gen điều hòa giảm thay protein khác (Doyle ctv, 2001) Dường tất tế bào gốc thần kinh tăng sinh biểu nestin Các sphere có kích thước lớn số lượng tế bào xung quanh sphere phân chia nhiều biểu nestin giảm Nestin dùng marker để xác định tế bào gốc tế bào tiền thân in vivo in vitro Kết thí nghiệm phân tích hóa miễn dịch neurosphere neurosphere dương tính với kháng thể nội bào nestin phát quang màu xanh lục Tuy nhiên, kết nhuộm neurosphere với nestin khơng thấy rõ sợi nestin khác với hình ảnh nhuộm số tác giả Theo kết nhà nghiên cứu viện giải phẩu đại học Kiel (Đức) công tác viên 2005 công bố, neurosphere nuôi cấy bề mặt gelatin 0.1% cắt lát mơ lạnh trước nhuộm hóa mơ miễn dịch cho kết quan sát sợi nestin rõ Màu xanh dương màu thuốc nhuộm DAPI, màu xanh lục FITC gắn kháng thể bắt đặc hiệu với phân tử nestin Hình 4.9 Nhuộm hóa miễn dịch neurosphere (a) Neurosphere bắt màu thuốc màu đặc hiệu thể marker mong muốn vật kính 40X (b) Nhuộm hóa miễn dịch neurosphere với nestin/DAPI http://www.unikiel.de/anatomie/forschung/mentlein/index_en.shtml 44 4.2.3 Kết biệt hóa tế bào gốc thần kinh ứng viên thành tế bào astrocyte Sau 48 nuôi cấy, tế bào bắt đầu bám vào bề mặt bình Roux có số tế bào lơ lửng chưa bám Khoảng ngày sau đó, tế bào bắt đầu biệt hóa, lúc tiến hành thay môi trường cho tế bào cách đổ bỏ hồn tồn mơi trường ni để loại bỏ tế bào chết không bám Đến ngày thứ trở đi, số tế bào gốc bắt đầu biệt hóa thành tế bào có hình dạng giống số tế bào thần kinh trưởng thành Sau 10 ngày biệt hóa khơng định hướng, bình Roux xuất nhiều loại tế bào khác có hình dạng đặc trưng hệ thần kinh Điều chứng chứng tỏ tế bào ứng viên ni cấy có tính gốc Để tiến hành biệt hóa khơng định hướng tế bào gốc thần kinh, tế bào đơn từ sphere ứng viên thu nhận đem nuôi môi trường DMEM/F12 bổ sung thành phần thiết yếu B27, N2, heparin, 10% FBS loại bỏ nhân tố tăng trưởng EGF FGF Tế bào gốc có hai trạng thái q trình tồn tự làm biệt hóa Hai trạng thái đối ngược Khi tế bào có khuynh hướng phân chia liên tục q trình biệt hóa bị kìm hãm ngược lại Đối với tế bào gốc thần kinh, chúng vài tiềm biệt hóa nên q trình biệt hóa chúng nhạy cảm với điều kiện nuôi cấy Khi môi trường bổ sung đầy đủ yếu tố cần thiết giúp tế bào tăng sinh tế bào gốc thần kinh tự làm liên tục khơng vào chu trình biệt hóa Ngược lại, mơi trường ni cấy có bổ sung FBS loại bỏ nhân tố tăng trưởng EGF, FGF chúng nhanh chóng vào trạng thái biệt hóa Để giúp cho tế bào bám xuống bình ni diễn nhanh Các tế bào ni cấy bình Roux có tráng sẵn poly-L-lysine để thích kích bám xuống Hình 4.11 Sự thay đổi hình thái tế bào biệt hóa (a) Sau ngày chờ biệt hóa; (b) Sau ngày chờ biệt hóa; (c) Sau 10 ngày chờ biệt hóa 45 Hình 4.12 Hình thái sphere q trình biệt hóa (a) Sphere bắt đầu biệt hóa sau ngày bám xuống; (b) Tế bào xung quanh sphere lan rộng bề mặt bình ni sau tuần Một kết khác nghiên cứu cho thấy sphere lớn thường có xu hướng bám xuống đáy bình Roux Điều phần giải thích kích thước sphere lớn trọng lượng nặng, khơng thể lăn tròn khơng có tác động học từ bên ngồi Hơn nữa, lớp tế bào bên ngồi rìa sphere tiếp xúc với chất dinh dưỡng trao đổi khí tốt so với tế bào nằm bên sphere, dẫn đến trình tăng sinh tự làm cao nhiều so với tế bào nằm bên sphere Do đó, chúng dần khả tự làm chuyển sang giai đoạn biệt hóa Khi sphere bám xuống bình Roux, tế bào bắt đầu biệt hóa lan rộng bề mặt bình ni Các tế bào thu nhận từ não thai chuột chưa trưởng thành nên việc xác định trạng thái biệt hóa theo giai đoạn tế bào loại tế bào chuyên biệt có hệ thần kinh quan trọng Những nét đặc trưng hình thái nhận diện dễ dàng cho tế bào biệt hóa hồn tồn thơng qua kích thước, độ dày mạng lưới, sợi trục Qua quan sát hình thái kính hiển vi điện tử, có số cấu trúc tế bào dạng hình nhô ra, với mỏm nhánh mảnh, dài, trơn mọc lan xung quanh thân tế bào Bên cạnh đó, có số tế bào có kích thước lớn, tròn, có hai nhiều tua nhỏ xung quanh thân tế bào Những tế bào số lượng nhiều bình Roux ni với mơi trường biệt hóa Qua hình thái, khẳng định tế bào có hình dạng giống tế bào astrocyte hệ thần kinh trung ương Tuy nhiên, tất tế bào ni mơi trường có bổ sung FBS biệt hóa hồn tồn 46 Hình 4.13 Q trình biệt hóa tế bào ứng viên thành tế bào astrocyte (a) Hình dạng tế bào biệt hóa vào ngày thứ 4; (b) Hình dạng tế bào biệt hóa vào ngày thứ 6; (c) Hình dạng tế bào biệt hóa vào ngày thứ 10 Theo Chan-Ling cơng tác viên năm 2009, thay đổi kiểu hình astrocyte trình trưởng thành xác định gồm giai đoạn khác Hầu hết tế bào tiền thân thần kinh astrocyte có thân tương đối tròn, biểu dương tính với vimentin có tua hai cực tế bào (đường kính khoảng 6-9 µm) Các tế bào astrocyte chưa trưởng thành có thân hình bầu dục, biểu dương tính với vimentin/GFAP/Pax2 với nhiều tua mọc hướng khác (đường kính khoảng 17-25 µm), tế bào astrocyte trưởng thành có đường kính thân vào khoảng 11-14 µm, biểu âm tính với vimentin, biểu dương tính với GFAP/Pax2 Điều giúp cho việc hiểu biết rõ thêm thay đổi astrocyte thơng qua hình thái, cấu trúc, cách tổ chức giai đoạn khác Ngoài ra, quần thể tế bào biệt hóa có tế bào neuron xuất khoảng thời gian từ ngày thứ 14 sau biệt hóa, tế bào thần kinh chủ yếu dựa vào cảm ứng tế bào thần kinh hình Các tế bào neuron có hình thái đặc trưng bao gồm thân tế bào, đuôi gai sợi trục dài Sự phát triển tế bào gốc thần kinh thường gồm giai đoạn : giai đoạn tế bào có thân tròn dẹp gần khơng có tua, tua ngắn 10% so với đường kính tế bào, giai đoạn tua bắt đầu mọc nhiều hướng dài 10% so với đường kính tế bào khơng lớn đường kính tế bào, giai đoạn 3, có gai dài đường kính tế bào neuron chưa có sợi trục, giai đoạn cuối tế bào mọc sợi trục dài lần đường kính tế bào (Michelle ctv, 2011) 47 Hình 4.14 Nhuộm tế bào biệt hóa thành astrocyte GFAP Hoechst 33342 (a) Tế bào thần kinh hình sau ngày biệt hóa; (b) Tế bào thần kinh hình sau ngày biệt hóa;(c) Tế bào thần kinh sau ngày biệt hóa Kết nhuộm hóa miễn dịch cho thấy tế bào thần kinh biệt hóa phát huỳnh quang màu đỏ có nhân phát huỳnh quang màu xanh dương Màu đỏ màu rhodamine gắn kháng thể bắt đặc hiệu với phân tử GFAP màng tế bào biệt hóa Màu xanh dương màu thuốc nhuộm Hoescht 33342 GFAP (Glial fibrillary acidic protein) protein sợi trung gian (intermediate filament protein) phân lập bệnh xơ cứng rải rác người (Eng ctv, 1971) sử dụng marker để xác định tế bào thần kinh đệm hình astrocyte in vivo in vitro Vai trò GFAP tế bào thần kinh đệm hình astrocyte ổn định khung xương tế bào, có ý nghĩa q trình biệt hóa tế bào astrocyte Sự biểu GFAP chuột phát giai đoạn cuối thai kỳ Các nghiên cứu phiên mã chứng minh RNA thông tin GFAP (GFAP mRNA) tăng cường giai đoạn sinh sau sinh 15 ngày, sau giảm ngày thứ 55 (Riol Tardy, 1992) 4.3 Kết bảo quản tế bào Sau giải đông, đánh giá tế bào cách quan sát hình thái màu sắc sphere kính hiển vi quang học Tiếp theo tiến hành đếm tế bào sống chết máy đếm tế bào tự động Kết ghi nhận sau lần thực đông lạnh giải đông tế bào cho thấy số tế bào sống sau giải đông đạt tỷ lệ cao (87,5%) Các sphere sau giải đông tiếp tục nuôi cấy môi trường không huyết quan sát tăng sinh phát triển tế bào Trong đến ngày đầu ni cấy, quan sát kính hiển vi có tượng nhiều sphere có xu hướng bị tan rã, chết dần 48 Hình 4.15 Hình thái tế bào giải đơng (a) Mũi tên hình thái sphere sau giải đơng (b) Mũi tên hình thái sphere giải đơng tuần Quy trình đơng lạnh thực với sphere cấy chuyền lần, để đảm bảo mật độ tế bào gốc thần kinh neurosphere hạn chế số lượng loại tế bào nhiễm Kích thước sphere tối ưu cho q trình đơng lạnh khoảng 50-80 µm, kích thước sphere lớn 80µm cần sử dụng pipet huyền phù để tách thành sphere nhỏ Các sphere đông lạnh cryotube 1,8 ml môi trường đông lạnh không huyết Môi trường sử dụng đông lạnh không bổ sung huyết mà thay thành phần albumin có tác dụng đệm protein để điều hòa pH q trình ni cấy Nồng độ DMSO 20% sử dụng môi trường thích hợp với hầu hết loại tế bào Thành phần đường đa chức trehalose môi trường có tác dụng tăng khả sống phục hồi tế bào sau trình bảo quản lạnh Trehalose tương tác mạnh phân tử nước, loại bỏ phân tử nước màng lớp đơi phospholipid Trehalose có tác dụng bảo quản đơng lạnh hiệu sử dụng kết hợp với DMSO nồng độ 10-20% Đối với môi trường giải đông ThawBest, thành phần quan trọng FBS bổ sung để hoạt hóa tế bào sau thời gian đơng lạnh kéo dài Tuy nhiên, nhiều yếu tố khách quan ảnh hưởng đến trình thu nhận tế bào sau giải đơng lần thí nghiệm đầu mật độ tế bào đơng lạnh q thấp, sphere có kích thước lớn, sphere bị tác động môi trường xung quanh thao tác lâu trình đơng lạnh Trong q trình thao tác thí nghiệm, hoạt động trao đổi chất sphere diễn mức độ thấp, tế bào bên sphere phải chống đỡ thay đổi liên tục nhiệt độ áp suất thẩm thấu trình đơng lạnh giải đơng Điều ảnh hưởng đến sức sống khả 49 phát triển tế bào sau giải đông Phương pháp đông lạnh nhanh đòi hỏi xác thời gian Việc xác thời gian giúp trình khử nước bên tế bào xảy hoàn toàn, giúp tránh hình thành tinh thể đá nội bào Nhưng thời gian xử lý tế bào dung dịch ngắn dẫn đến việc khử nước khơng hồn tồn, tinh thể đá nội bào hình thành, làm ảnh hưởng đến tế bào Trong q trình thực thí nghiệm, bình chứa nitơ lỏng khơng ổn định, thường xuyên mở sử dụng cho nhiều nghiên cứu khác Trong nghiên cứu, việc đánh giá sphere trước sau giả đơng có khả lựa chọn phải sphere chết trước đông lạnh sau đông lạnh Điều phần gây ảnh hưởng đến kết đạt 50 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Trên sở kết đạt đưa số kết luận sau: Thai chuột nhắt trắng (Mus musculus var albino) khoảng 14 ngày tuổi cho hiệu nuôi cấy tốt so với thai chuột lớn ( 8,5 ngày tuổi) Tiến hành nuôi cấy tế bào gốc thần kinh từ não thai chuột mơi trường khơng có huyết thanh, bổ sung thành phần dinh dưỡng B27, N2, insulin, heprin yếu tố tăng trưởng EGF, FGF tế bào tăng trưởng phát triển tốt Tế bào ứng viên có khả tạo sphere, biểu dương tính với marker nestin khả biệt hóa thành tế bào astrocyte Điều khẳng định tế bào ứng viên tế bào gốc thần kinh Bước đầu thử nghiệm đông lạnh giải đông neurosphere phương pháp đông lạnh nhanh với tỷ lệ tế bào sống cao sau giải đơng (75,8%) Do đó, giữ tế bào gốc thần kinh trạng thái tiềm sinh thời gian dài 5.2 Kiến nghị Áp dụng phương pháp gây siêu bào nỗn kích thích rụng trứng để xác định xác tuổi thai thực nuôi mẫu sơ cấp Neurosphere nên cố định cắt lát mô lạnh trước đem nhuộm với nestin để thấy rõ sợi nestin Thử nghiệm đông lạnh hai phương pháp tế bào đơn neurosphere để so sánh hiệu tế bào sau giải đông 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc, Trương Định, 2009, “công nghệ tế bào gốc”, Nhà xuất giáo dục Việt Nam, 555 trang Phan Kim Ngọc, Pham Văn Phúc, 2009, “công nghệ sinh học người động vật”, Nhà xuất giáo dục Việt Nam, 895 trang Nguyễn Thị Xuân Trâm 2007 Quy trình đơng lạnh phương pháp thủy tinh hóa (vitrification) sử dụng phôi chuột nhắt trắng Mus musculus var albino Khóa luận cử nhân sinh học Đại học Khoa học Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh TÀI LIỆU TIẾNG ANH Alvarez-Buylla, A., Lim, DA 2004 For the long run: Maintaining germinal niches in the adult brain Neuron 41: 683-686 Ayuso-Sacido, A., Roy, N.S., Schwartz, T.H., Greenfield, J.P., Boockvar, J.A 2008 Long-term expansion of adult human brain subventricular zone precursors Neurosurgery 1: 223-9 Alvarez-Buylla, A., Garcia-Verdugo, J.M., and Tramontin, A.D 2001 A unified hypothesis on the lineage of neural stem cells Nature 2: 287-293 Chan-Ling T., Chu Y., Baxter L., Ii M.W., Hughes S 2009 In vivo characterization of astrocyte precursor cells (APCs) and astrocytes in developing rat retinae: differentiation, proliferation, and apoptosis Glia 1: 3953 Conti, L., and Cattaneo, E 2010 Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities Nature 11: 176-187 Doyle, K.L., Khan, M and Cunningham, A.M 2001 Expression of the intermediate filament protein nestin by sustentacular cells in mature olfactory neuroepithelium J Comp Neurol 437: 186–195 10 Doetsch, F., and Scharff, C 2001 Challenges for brain repair: insights from adult neurogenesis in birds and mammals Brain 58: 306-322 11 Doetsch, F 2003 The glial identity of neural stem cells Nature 6:1127-1134 12 Gritti, A., Gslli, R., and Vescovi A.L 2008 Clonal analyses and cryopreservation of neural stem cell cultures Humana Press 438: 173-83 13 Gotz, M., and Huttner, W.B 2005 The cell biology of neurogenesis Nature Reviews 6: 777-788 14 Haubensak, W., Attardo, A., Denk, W., and Huttner, W.B 2004 Neurons arise in the basal neuroepithelium of the early mammalian telencephalon: a major site of neurogenesis Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101: 3196-3201 15 Johansson, S.J., Price and Modo, M 2008 Effect of infl ammatory cytokines on major histocompatibility complex expression and differentiation of human neural stem/progenitor cells Stem Cells 26: 2444–2454 H 52 16 Johnson, D.E., and Williams, L.T 1993 Crystals of the native FGF2-FGFR1 complex were incubated diversity in the FGF receptor multigene family Adv Cancer Res 60: 1–41 17 Klein, C., and Fishell, G 2004 Neural Stem Cells: Progenitors or Panacea? In: Developmental Neuroscience, Developmental Genetics Program, The Skirball Institute of Biomolecular Medicine and Department of Cell Biology, New York University Medical Center, New York, N.Y., USA, pp 82-92 18 Liljekvist-Larsson, I., Johansson, K 2005 Retinal neurospheres prepared as tissue for transplantation Brain Res Dev Brain Res 2:194-202 19 Loewenbruck, K., & Storch, A 2011 Stem cell-based therapies in Parkinson's disease 20 Landgren, H., & Curtis, M.A 2011 Locating and labeling neural stem cells in the brain Journal of Cellular Physiology 1:1-7 21 Liu, B., Hong, J.S 2003 Primary Rat Mesencephalic Neuron-Glia, NeuronEnriched, Microglia-Enriched, and Astroglia-Enriched Cultures SpringerLink 79: 387-395 22 Lillien, L., Raphael, H 2000 BMP and FGF regulate the development of EGFresponsive neural progenitor cells Development 127: 4993-5005 23 Moore, K.A, Lemischka, I.R 2006 Stem cells and their niches Science 311: 1880-1885 24 Leach, M.K., Feng, Z., Gertz, C.C., Tuck, S.J., Regan, T.M., Naim, Y., et al 2011 The Culture of Primary Motor and Sensory Neurons in Defined Media on Electrospun Poly-L-lactide Nanofiber Scaffolds Journal of visualized experiments : JoVE 25 Mirescu, C., Gould, E 2003 Stem cells in the adult brain In Stem Cells: Adult and Fetal Stem Cells, ed R Lanza, pp 219–24 Burlington, MA: Elsevier Acad 26 Martin, H.M., and Wolfgang, K 2006 Screening the Brain: Molecular Fingerprints of Neural Stem Cells In: Current Stem Cell Research & Therapy, Dept of Physiology and Pathophysiology, University of Heidelberg, Im Neuenheimer Feld 326, 69120 Heidelberg, German, pp 65-77 27 Merkle, F.T., Mirzadeh, Z., and Alvarez-Buylla, A 2007 Mosaic organization of neural stem cells in the adult brain Science 317: 381-384 28 Nguyen, M.M., Stone, M.C., Rolls, M.M 2011 Microtubules are organized independently of the centrosome in Drosophila neurons Neural Development 6:38 29 Nakaguchi, K., Masuda, H., Kaneko, N., & Sawamoto, K 2010 Strategies for regenerating 30 Perrier, A.L., Tabar, V., Barberi T., et al 2004 Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells Proc Natl Acad Sci USA 101: 12543-12548 31 Paspala, S., Murthy, T.K., Mahaboob, V.S., and Habeeb, M.A 2011 Pluripotent stem cells- A review of the current status in neural regeneration Neurology India 59(4): 558-565 32 Kokovay, E., Shen, Q., and Temple, S 2008 The incredible elastic brain: how neural stem cells expand our minds Neuron 60: 420-429 53 33 Reynolds, B.A., Rietze, R.L 2005 Neural stem cells and neurospheres– reevaluating the relationship Nat Methods 2: 333–336 34 Riol, H., Fages, C., Tardy, M 1992 Transcriptional regulation of glial fibrillary acidic protein (GFAP)-mRNA expression during postnatal development of mouse brain J Neurosci Res 32: 79-85 35 Reynolds, B.A., and Weiss, S 1992 Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system Science 55: 1707–1710 36 Shen, Q., Goderie, S.K., Jin, L., Karanth, N., Sun, Y., et al 2004 Endothelial cells stimulate selfrenewal and expand neurogenesis of neural stem cells Science 304: 1338–1340 37 Scheffler, B., Walton, N.M., Lin, DD., Goetz, A.K., Enikolopov, G., et al 2005 Phenotypic and functional characterization of adult brain neuropoiesis Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102: 9353–9358 38 Temple, S 2001 The development of neural stem cells Nature 414:112–117 39 Tsai, R.Y., Mckay, R.D 2000 Cell contact regulates fate choice by cortical stem cells Neurosci 20: 3725–3735 40 Ullian, E.M., Sapperstein, S.K., Christopherson, K.S., Barres, B.A 2001 Control of synapse number by glia Science 291: 657–661 41 Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J.A., Jessell, T.M 2002 Directed Differentiation of Embryonic Stem Cells Into Motor Neurons Cell 110: 385-97 42 Young, T.H., Hung, C.H 2005 Behavior of embryonic rat cerebral cortical stem cells on the PVA and EVAL substrates Biomaterials 26:4291–4299 43 Yun, L., Wei-Min, Z., & Ting-Hua, W 2011 Optimal Location and Time for Neural Stem Cell 44 Young, T.H., Hu, W.W 2003 Covalent bonding of lysine to EVAL membrane surface to improve survival of cultured cerebellar granule neurons Biomaterials 24:1477–1486 45 Zahir, T., Chen, Y.F., MacDonald, J.F., Leipzig, N., Tator, C.H., and Molly, S 2009 Neural Stem/Progenitor Cells Differentiate In Vitro to Neurons by the Combined Action of Dibutyryl cAMP and Interferon-γ Shoichet Stem Cell and Development 18: 1423-1431 46 Zhao, C., Deng, W., and Gage, F.H 2008 Mechanisms and functional implications of adult neurogenesis Cell 132: 645-660 47 Zheng, X.S., Yang, X.F., Liu, W.G., Shen, G., Pan, D.S., Luo, M 2007 A novel method for culturing neural stem cells SpringerLink 43: 155-158 TÀI LIỆU TRANG WEB 48 Ertelt S 2009 “Adult Stem Cell Research Reverses Effects of Parkinson’s Disease in Human Trial” LifeNews.com http://www.lifenews.com/bio2751.html 49 Lindvall O, and Kokaia Z 2004 “Recovery and Rehabilitation in Stroke” American Heart Association http://stroke.ahajournals.org/cgi/content/full/35/11_suppl_1/2691 50 http://www.uni-kiel.de/anatomie/forschung/mentlein/index_en.shtml 54 55 PHỤ LỤC Đông lạnh tế bào môi trường thương mại công ty Gene World Môi trường dùng cho đông lạnh tế bào CryoSave Solution - Là dung dịch bảo quản tế bào nhiệt độ lạnh -1960C tế bào gốc trung mô, nội mô, tế bào ung thư, tế bào CHO, nguyên bào sợi, tế bào thần kinh CryoSave nâng tỉ lệ sống sót tế bào sau giải đông lên đến 80-95% tùy theo loại tế bào Môi trường dùng cho giải đông tế bào ThawBest Solution - Là dung dịch hỗ trợ giải đông tế bào bảo quản đông lạnh nhằm tăng cường hiệu sống tế bào cao nhất, sử dụng cho rã đơng dòng tế bào gốc trung mơ, nội mô, tế bào ung thư, tế bào CHO, nguyên bào sợi, tế bào thần kinh ThawBest kết hợp với CryoSave nâng tỉ lệ sống sót tế bàoo sau giải đông lên đến 80-95% tùy theo loại tế bào Bảng 4.1 Kết bảo quản tế bào gốc thần kinh Lần thực đông lạnh Tổng số tế bào sau giải đông (tế bào/ml) Tế bào sống sau giải đông Tế bào chết sau giải đông 4.105 3,5.105 5.104 4.105 3,86.105 1,14.105 5,13.105 2,23.105 2,9.105 ... CHUỘT NHẮT TRẮNG (Mus musculus var albino) Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực ThS Phạm Văn Phúc Tơn Long Tuấn Tháng 7/2012 LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp thành sáu tháng nghiên cứu phòng Thí nghiệm... sẻ kinh nghiệm làm việc phòng thí nghiệm Xin gửi lời cảm ơn chân thành tới bạn Yên, Dũng, Triết, Long, người bạn đồng nghiệp giúp tơi hồn thành luận văn Cảm ơn bạn bè thân yêu lớp DH08SH chia sẻ... gia đình ln tạo điều kiện động viên suốt trình học tập trường Tp.HCM, ngày 27 tháng năm 2012 Tơn Long Tuấn i TĨM TẮT Các bệnh thối hóa thần kinh vấn đề nghiêm trọng người lớn tuổi toàn giới, bệnh