TẠO PHÁC đồ MIỄN DỊCH CHỦ ĐỘNG và ĐÁNH GIÁ MIỄN DỊCH TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG (mus musculus var albino) BẰNG VACCINE PHÓ THƯƠNG hàn

Trong cộng đồng sinh vật, đấu tranh sinh tồn là một trong các qui luật tự nhiên, cho nên mọi sinh vật đều ít nhiều có khả năng tự bảo vệ chống lại sự xâm nhập của bất kỳ vật lạ nào, nhằm bảo toàn tính toàn vẹn của chúng. Khả năng tự bảo vệ xuất hiện ngay ở cơ thể sống nhỏ bé chưa tiến hóa. Trước khi vắcxin ra đời, đã xuất hiện rất nhiều dịch bệnh làm cho số ca mắc bệnh liên quan đến virus, vi khuẩn, không ngừng tăng lên. Cùng với sự tiến hóa của sinh vật, các biện pháp bảo vệ ngày càng phong phú và hoàn thiện, trong đó đáp ứng miễn dịch là một biện pháp quan trọng và phức tạp nhất. Trong việc nghiên cứu về miễn dịch thì thí nghiệm gây đáp ứng miễn dịch nhân diện kháng nguyên kháng thể ở chuột là thí nghiệm tốt nhất giúp nhận diện và định lượng kháng thể trong huyết thanh chuột, giúp hiểu rõ hơn về miễn dịch và thực tế hơn. Vì vậy, để có được những thông tin chính xác nhất nên nhóm chúng tôi chọn đề tài:” Tạo phác đồ miễn dịch chủ động và đánh giá miễn dịch trên chuột nhắt trắng (mus musculus var. Albino) bằng vaccine phó thương hàn”.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Đề tài:

TẠO PHÁC ĐỒ MIỄN DỊCH CHỦ ĐỘNG VÀ ĐÁNH GIÁ

MIỄN DỊCH TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG (Mus Musculus Var Albino) BẰNG VACCINE PHÓ THƯƠNG HÀN

SVTH:

Đàm Thị Đào 2008120156

Phạm Nguyễn Hải Bằng 2008120102

Trần Hoài Thương 2008120165

Khâu Đăng Quang 2008120178

Nguyễn Thị Lập 2008120139 GVHD:

ThS Lại Đình Biên

TP Hồ Chí Minh, Tháng 12 Năm 2015 LỜI CẢM ƠN

ThS Lại Đình Biên – Giảng Viên Khoa Công Nghệ Sinh Học & Kỹ Thuật Môi

Trường, Trường Đại học Công nghiệp Thực Phẩm Thành Hồ Chí Minh là người trựctiếp hướng dẫn, giúp đỡ chúng em trong suốt thời gian thực hiện đồ án

Ban chủ nhiệm Khoa Công Nghệ Sinh Học & Kỹ Thuật Môi Trường, Trường

Đại học Công nghiệp Thực Phẩm Thành Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện về vậtchất: nơi làm việc, thiết bị, hóa chất, … để chúng em hoàn thành tốt đồ án

Tp Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2015

Nhóm sinh viên thực hiện

LỜI CAM ĐOAN

Nhóm cam đoan rằng báo cáo đề tài đồ án chuyên ngành này là do chính nhómthực hiện Các số liệu thu thập và kết quả phân tích trong báo cáo là trung thực, khôngsao chép từ bất cứ đề tài nghiên cứu khoa học nào.

Nhóm xin chịu hoàn toàn trách nhiệm nội dung bài của mình

Tp HCM, ngày 05 tháng 12 năm 2015

Nhóm sinhviên thực hiệnMỤC LỤC

1.ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong cộng đồng sinh vật, đấu tranh sinh tồn là một trong các qui luật tự nhiên,cho nên mọi sinh vật đều ít nhiều có khả năng tự bảo vệ chống lại sự xâm nhập củabất kỳ vật lạ nào, nhằm bảo toàn tính toàn vẹn của chúng Khả năng tự bảo vệ xuấthiện ngay ở cơ thể sống nhỏ bé chưa tiến hóa

Trước khi vắc-xin ra đời, đã xuất hiện rất nhiều dịch bệnh làm cho số ca mắc bệnhliên quan đến virus, vi khuẩn, không ngừng tăng lên Cùng với sự tiến hóa của sinhvật, các biện pháp bảo vệ ngày càng phong phú và hoàn thiện, trong đó đáp ứng miễndịch là một biện pháp quan trọng và phức tạp nhất Trong việc nghiên cứu về miễndịch thì thí nghiệm gây đáp ứng miễn dịch nhân diện kháng nguyên - kháng thể ởchuột là thí nghiệm tốt nhất giúp nhận diện và định lượng kháng thể trong huyết thanhchuột, giúp hiểu rõ hơn về miễn dịch và thực tế hơn

Vì vậy, để có được những thông tin chính xác nhất nên nhóm chúng tôi chọn đề

tài:” Tạo phác đồ miễn dịch chủ động và đánh giá miễn dịch trên chuột nhắt

trắng (mus musculus var Albino) bằng vaccine phó thương hàn”.

1.1 Mục tiêu nghiên cứu

− Xây dựng được phác đồ gây miễn dịch

− Xác định được cơ chế đáp ứng miễn dịch đối với vaccin Phó Thương Hàn trên chuộtnhắt trắng và khả năng đáp ứng miễn dịch của chuột nhắt với vaccin Phó ThươngHàn

1.2 Ý nghĩa khoa học

− Kết quả nghiên cứu của đề tài cũng là cơ sở khoa học phục vụ cho các nghiên cứu tiếptheo, đồng thời đóng góp tư liệu tham khảo cho các nhà nghiên cứu về miễn dịch trênđộng vật trong ngành thú y và miễn dịch ở người

1.3 Ý nghĩa thực tiễn

- Sinh viên được củng cố lại kiến thức về miễn dịch, làm quen với phương phápOuterlony và Macini, đặc biệt nắm được kiến thức thực tế về miễn dịch

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 Giới thiệu miễn dịch học

1.1 Khái niệm về miễn dịch học

- Trong cộng đồng sinh vật, đấu tranh sinh tồn là một trong các quy luật tự nhiên, chonên mọi sinh vật đều có ít nhiều khả năng tự bảo vệ để chống lại sự xâm nhập của bất

kỳ vật lạ nào

- Theo những quan niệm ban đầu “miễn dịch là trong khi cơ thể này không mắc bệnhtruyền nhiễm còn những cơ thể khác lại mắc bệnh truyền nhiễm tuy ở trong cùng điềukiện”

- Hiện nay miễn dịch được định nghĩa: “Miễn dịch là khả năng phòng vệ của toàn bộ cơthể đối với các yếu tố mang thông tin di truyền ngoại lai (thông tin lạ)”

 Vậy Miễn dịch học (immunology) là một ngành khoa học nghiên cứu về khả năngphòng vệ của cơ thể sinh vật Những nội dung chính của ngành học bao gồm:

- Nghiên cứu các quy luật, cơ chế bảo vệ của cơ thể trong quá trình sống

- Nghiên cứu quá trình hoạt động của hệ miễn dịch trong cơ thể, sự tương tác và điềuhoà miễn dịch

- Nghiên cứu những thay đổi của hoạt động miễn dịch trong trường hợp miễn dịch bệnhlý

- Ứng dụng các quy luật của hoạt động miễn dịch vào việc chẩn đoán, phòng và trịbệnh Lý luận của khoa học miễn dịch có liên quan chặt chẽ tới nhiều môn học như:sinh lý học, sinh hoá học, tế bào học, bệnh lý học, sinh học phân tử, vi sinh vật học,

- Hệ miễn dịch tự nhiên (còn gọi là miễn dịch bẩm sinh) bao gồm các cơ chế đề kháng

đã tồn tại trong cơ thể khi chưa có nhiễm trùng và sẵn sàng đáp ứng rất nhanh khi visinh vật xâm nhập Miễn dịch tự mang tính di truyền trong các cơ thể cùng một loài.Nói một cách khác đó là khả năng tự bảo vệ của một cá thể có ngay từ lúc mới sinh,không đòi hỏi phải có sự tiếp xúc trước của cơ thể với kháng nguyên của vật lạ (tức làkhông cần phải có giai đoạn mẫn cảm)

- Cơ chế này phát huy tác dụng dù là kháng nguyên xâm nhập lần đầu hay những lầnsau, nhưng nó có vai trò quan trọng ở lần đầu tiên vì lúc này đáp ứng miễn dịch thuđược chưa phát huy tác dụng Các cơ chế này chủ yếu phản ứng chống lại vi sinh vật

chứ không phản ứng với các vật lạ không phải là vi sinh vật; đồng thời chúng phảnứng theo một cơ chế giống hệt nhau khi vi sinh vật xâm nhập tái đi tái lại.

 Các thành phần chính của miễn dịch tự nhiên bao gồm:

(1) Các hàng rào vật lý và hoá học như da, niêm mạc, các chất kháng khuẩn đượctiết ra trên các bề mặt này;

(2) Các tế bào thực bào (tế bào trung tính, đại thực bào) và tế bào NK (tế bào giết

Ngược với hệ miễn dịch tự nhiên, có những đáp ứng miễn dịch khác được kíchthích bởi sự tiếp xúc với vi sinh vật và tạo ra cường độ tăng dần nếu sự tiếp xúc nàyđược lặp đi lặp lại Bởi vì dạng đáp ứng này chỉ xuất hiện sau khi vi sinh vật xâmnhập cơ thể nên nó được gọi là miễn dịch thu được

- Tính chất đặc biệt của đáp ứng miễn dịch thu được là tính đặc hiệu đối với từng phân

tử và khả năng “nhớ” khi phân tử đó xâm nhập trở lại cơ thể để tạo ra một đáp ứngmạnh hơn nhiều so với lần xâm nhập đầu tiên Hệ miễn dịch thu được có khả năngnhận diện và phản ứng lại với nhiều vật lạ có bản chất nhiễm trùng hoặc không nhiễmtrùng Ngoài ra, nó còn có khả năng tuyệt vời trong việc phân biệt sự khác nhau rấtnhỏ giữa các vật lạ này và vì vậy mà nó còn được gọi là miễn dịch đặc hiệu Các thànhphần của miễn dịch thu được là tế bào lymphô và các sản phẩm của chúng Nhữngchất lạ tạo ra đáp ứng miễn dịch đặc hiệu hoặc chịu tác động của hệ miễn dịch nàyđược gọi là kháng nguyên Theo thói quen, các thuật ngữ “đáp ứng miễn dịch” và “hệ

thống miễn dịch” thường dùng cho đáp ứng miễn dịch thu được, trừ khi có nhữngnhấn mạnh riêng khác đến miễn dịch tự nhiên

Có hai kiểu đáp ứng miễn dịch thu được, đó là đáp ứng thể dịch và đáp ứng quatrung gian tế bào Cả hai kiểu này đều có sự tham gia của rất nhiều thành phần của hệthống miễn dịch với mục đích là loại trừ nhiều loại vi sinh vật khác nhau ra khỏi cơthể

• Miễn dịch dịch thể

Miễn dịch dịch thể được thực hiện qua trung gian của những phân tử hiện diệntrong máu và dịch niêm mạc có tên là kháng thể, được sản xuất bởi tế bào lymphô B(còn gọi là tế bào B) Kháng thể có khả năng nhận diện kháng nguyên vi sinh vật,trung hoà tính gây bệnh và tác động lên vi sinh vật để loại trừ nó qua nhiều cơ chếhiệu quả khác nhau

Miễn dịch dịch thể là cơ chế đề kháng chủ yếu chống lại các vi sinh vật ngoại bàocũng như độc tố của chúng theo cơ chế kháng thể liên kết với các vi sinh vật hoặc độc

tố để xúc tiến việc loại trừ Bản thân kháng thể là những phân tử được chuyên mônhoá, những tuýp kháng thể khác nhau có thể tạo ra nhiều cơ chế loại bỏ kháng nguyênkhác nhau Một số tuýp kháng thể có khả năng xúc tiến hoạt động thực bào, một sốkhác lại kích thích tế bào bạch cầu sản xuất ra các chất trung gian của phản ứng viêm

• Miễn dịch qua trung gian tế bào

Miễn dịch qua trung gian tế bào (còn gọi là miễn dịch tế bào) là kiểu đáp ứng đượcthực hiện qua trung gian của tế bào lymphô T (còn gọi là tế bào T) Các vi sinh vật nộibào như virus và một số vi khuẩn có khả năng sống và nhân lên trong đại thực bàocũng như một số tế bào chủ khác, vì thế chúng không chịu tác động trực tiếp củakháng thể lưu động trong máu Sự đề kháng chống lại những vi sinh vật kiểu này làchức năng của miễn dịch tế bào

Hình 1 Miễn dịch qua trung gian tế bào.

• Các thành phần tế bào của hệ thống miễn dịch thu được

Các tế bào chính của hệ miễn dịch là tế bào lymphô, tế bào trình diện khángnguyên, và tế bào hiệu quả

Tế bào lymphô là những tế bào có khả năng nhận diện một cách đặc hiệu khángnguyên lạ và tạo phản ứng chống lại chúng Do vậy, lymphô bào là tế bào trung giancủa cả miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào

o Tế bào lymphô B là tế bào duy nhất có thể sản xuất kháng thể Chúng nhận diện

kháng nguyên ngoại bào (kể cả kháng nguyên trên bề mặt tế bào) và biệt hoá thành tếbào tiết kháng thể, do đó chúng tác dụng như tế bào trung gian của miễn dịch dịch thể

o Tế bào lymphô T nhận diện kháng nguyên của vi sinh vật nội bào và có chức năng

tiêu diệt những vi sinh vật này hoặc những tế bào bị nhiễm trùng Thụ thể khángnguyên của chúng là những phân tử màng khác với kháng thể nhưng có cấu trúc liênquan Tế bào T có tính đặc hiệu rất chặt chẽ đối với kháng nguyên Chúng chỉ nhậndiện những phân tử peptid gắn với một protein bản thân được mã hoá bởi những gentrong phức hệ hòa hợp mô chủ yếu (MHC) và được thể hiện trên bề mặt của những tếbào khác Như vậy, tế bào T nhận diện và phản ứng với kháng nguyên gắn trên bề mặt

tế bào chứ không phải kháng nguyên hoà tan Tế bào T có nhiều nhóm mang chứcnăng khác nhau Được biết nhiều nhất là tế bào T giúp đỡ, T gây độc

 Khi đáp ứng với kháng nguyên, tế bào T giúp đỡ tiết ra những protein gọi làcytokin có chức năng kích thích sự tăng sinh và biệt hoá của tế bào T và một số tế bàotrong đó có tế bào B, đại thực bào và các bạch cầu khác Tế bào T gây độc giết các tếbào sản xuất ra kháng nguyên lạ như các tế bào bị nhiễm virus hay những vi khuẩn nộibào khác Một số tế bào T được gọi là T điều hoà có chức năng ức chế đáp ứng miễndịch Bản chất và vai trò sinh lý của tế bào T điều hoà chưa được biết đầy đủ Có mộtnhóm tế bào lymphô thứ ba là tế bào giết (NK), đây là những tế bào tham gia vào hệthống miễn dịch bẩm sinh chống lại nhiễm trùng virus và các vi sinh vật nội bào khác

Sự khởi động và phát triển đáp ứng miễn dịch thu được bao giờ cũng đòi hỏi khángnguyên phải được bắt giữ và trình diện cho tế bào lymphô Tế bào chịu trách nhiệmlàm việc này được gọi là tế bào trình diện kháng nguyên (APC) Tế bào trình diệnkháng nguyên được chuyên môn hoá cao nhất là tế bào hình sao (dendritic), chúng bắtgiữ những vi sinh vật từ bên ngoài xâm nhập vào, vận chuyển những kháng nguyênnày đến các cơ quan lymphô và trình diện kháng nguyên cho những tế bào T để khởiđộng đáp ứng miễn dịch

 Các giai đoạn của đáp ứng miễn dịch thu được

Quá trình đáp ứng miễn dịch thu được có thể chia thành nhiều giai đoạn khácnhau:

- Nhận diện kháng nguyên

- Hoạt hoá tế bào lymphô

- Giai đoạn hiệu quả (loại trừ kháng nguyên)

Sau đó là sự trở lại hằng định nội môi và duy trì tính nhớ miễn dịch (Hình 1.6)

Hình 2 Các giai đoạn của đáp ứng miễn dịch thu được

1.2 Hệ Thống Các Cơ Quan Và Tế Bào Tham Gia Vào Đáp Ứng Miễn Dịch

Hệ thống miễn dịch gồm nhiều cơ quan và nhiều loại tế bào nằm rãi rác khắp cơthể, tác động qua lại nhau để dẫn đến đáp ứng miễn dịch cuối cùng

Ngay cả trước khi khái niệm miễn dịch được hình thành, nhiều thầy thuốc cổ đại

đã mô tả những cơ quan mà về sau người ta chứng minh được là thuộc hệ miễn dịch.Các cơ quan chính của hệ miễn dịch gồm tuyến ức, lách, tủy xương, các mạchlympho, hạch lympho và các mô lympho thứ cấp (như các hạch amiđan, V.A.) và da.Các cơ quan chính, tuyến ức và lách, đã được nghiên cứu đơn thuần về mặt mô học

qua các tử thiết Ngoài ra, có thể dùng phẫu thuật lấy ra các hạch lympho và một số

mô lympho thứ cấp để nghiên cứu khi bệnh nhân còn sống (sinh thiết)

Nhiều tế bào thuộc hệ miễn dịch không liên kết với một cơ quan đặc biệt nào, màchỉ tập trung hoặc lưu chuyển giữa nhiều mô trong khắp cơ thể

Tất cả các tế bào tham gia vào đáp ứng miễn dịch (ĐƯMĐ) đều có nguồn gốcchung là tế bào gốc ở tủy xương; chúng được biệt hóa để tạo thành các dòng tế bàokhác nhau

Trong hệ thống miễn dịch có 2 loại tế bào chính là: Các tế bào lympho và các đạithực bào

Dòng tạo máu biệt hóa thành các tế bào mono (monocyte, tiếng Hy Lạp: mono =đơn, cyte = tế bào), từ tế bào này tạo ra đại thực bào và tế bào tua, tức là các tế bàođơn nhân; các tế bào đa nhân (granulocyte) còn gọi là bạch cầu nhân đa hình (PMN)bao gồm bạch cầu trung tính, bạch cầu kiềm, bạch cầu axit; dòng hồng cầu tạo hồngcầu; dòng tế bào nhân khổng lồ tạo tiểu cầu

Tế bào chủ chốt tham gia vào đáp ứng miễn dịch là tế bào lympho, tổ chức có chứa

tế bào lympho và tham gia vào đáp ứng miễn dịch gọi là tổ chức lympho

Lympho có nguồn gốc từ các tế bào nguồn, còn gọi là tế bào gốc, không biệt hóa,

ở tuỷ xương Từ tế bào nguồn, nhiều dòng tế bào có chức năng khác nhau được biệthóa rồi sau đó trải qua một quá trình thành thục hay chín khi kết hợp với các tổ chứcchuyên hóa

Dòng lympho được tạo thành do các tế bào nguồn biệt hóa ở các cơ quan lymphotrung tâm Nếu vào tuyến ức sẽ tạo thành các tế bào T (từ chữ thymus = tuyến ức), cònnếu vào túi Bursa Fabricius thì sẽ tạo thành tế bào B Ở động vật có vú không có túiFabricius thì tế bào B được hình thành trong tủy xương hoặc gan bào thai

Hình 3 Các tế bào tham gia vào ĐƯMĐ - (Theo L.M.Prescott, J.P.Harley,

D.A.Klein, 2005)

Đại thực bào (ĐTB)

ĐTB là các tế bào đơn nhân có nguồn gốc từ tủy xương Thường có kích thước lớn

có khả năng thức bào, tức là bắt và nuốt các phân tử lạ, kể cả các vi sinh vật ĐTB cónhững hình thái khác nhau và cư trú ở nhiều nơi khác nhau Trong huyết tương chúng

ở dạng lưu động, đó là ĐTB thực sự, đóng vai trò trung tâm trong ĐƯMĐ Trong tếbào chất có nhiều lyzoxom chứa các enzym tiêu hóa, dễ bắt màu thuốc nhuộm dànhcho esteaz không đặc hiệu, các peroxitaz và hydrolaz axit

- ĐTB tiết ra các sản phẩm sau:

• Các thành phần của bổ thể C1, C2, C3, C4, C5, và các yếu tố B, D, propecdin, I,H.

• Các proteaz trung tính (collagenaz, elastaz, chất hoạt hóa plasminogen)

• Cytokin: Interleukin IL-1, -6, -8, -10, -12, yếu tố hoại tử ung thư α (TNF-α), yếu

tố kích thích quần lạc (CSF), interferon α (IFN-α)

• Các yếu tố gây đông tụ: tromboplastin mô, yếu tố V, VII, IX, X

• Prostaglandin (PGE2, PGF2α)

- Trên bề mặt Đại Thực Bào có các thụ thể:

• Dành cho Fc của KT (phần Fab của KT gắn với KN)

• Dành cho C3b (để rồi C3b lại gắn vào KN)

• Dành cho lectin gắn vào đường mannoza trên thành tế bào vi khuẩn

ĐTB được biệt hóa từ tế bào mono Khi di chuyển tới các mô trở thành ĐTB cốđịnh Tùy theo từng loại mô mà có các tên gọi khác nhau Ở phế nang thì gọi là ĐTBphế nang (alveolar), ở ổ bụng là ĐTB phúc mạc, ở dưới da là Langerhans (một dạng tếbào tua), ở gan là Kupffer, ở hạch lympho và lách là tế bào tua, ở mô thân kinh là tếbào hình sao

Bạch cầu đa nhân (PML-polymorphonuclear leukocyte)

Bạch cầu (BC) đa nhân hay BC hạt có nguồn gốc từ tủy xương, chiếm 60-70%.Trong máu ngoại vi, chúng có khả năng bám dính và xuyên mạch Chúng bao gồm

BC trung tính, BC ưa kiềm, BC ưa axit Chúng không có tính đặc hiệu với KN nhưngđóng vai trò quan trọng trong viêm cấp

Bạch Cầu trung tính (neutrophil)

Gọi là BC trung tính là vì trong tế bào chất chứa nhiều bọng (hạt) nhỏ không bắtmàu thuốc nhuộm kiềm hay axit, nhân tế bào có cấu tạo nhiều thùy

• Có khả năng thực bào mạnh

• Trên bề mặt có chứa các thụ thể dành cho lectin, Fc, C3b của bổ thể C3

• Trong bọng chứa các enzym myeloperoxitaz, Lyzozym, hydrolaz axit (ví dụ glucuronidaz, photphataz), peptit dạng cation (defensin).

β-• Có các bọng nhỏ chứa lactoferrin, lyzozym, histaminaz

• BC trung tính cũng tiết ra các sản phẩm khác: như cytokin [IL-1, -6, -8, TNF-α,yếu tố kích thích quần lạc-(CSF), IFN-α], leukotrien [LTC4, LTD4, LTE4 (SRS)],prostaglandin (PGE2), yếu tố hoạt hóa tiểu cầu (PAF)

Khả năng giết của thực bào

ĐTB và BC trung tính đều có khả năng tiết ra các chất diệt khuẩn theo hai cơ chế:phụ thuộc oxy và không phụ thuộc oxy

Cơ chế phụ thuộc oxy bao gồm:

(1) O2oxitaz màng 2O2- (superoxit)

(2) 2O2- + 2H+ superoxitaz, dismutaz H2O2 + 1O2 (singlet oxy)

(3) H2O2 + O2- OH + OH- + 1O2 (oxy đơn gốc hydroxyl)

(4) H2O2 + Cl- (hoặc I-) myeloperoxitaz OCl- (hoặc OI-) + H2O (OCl- = hapohalite)

(5) OCl- +H2O2O2 + Cl- + H2O

Oxit nitơ là hợp chất gây độc tế bào khác được tạo thành từ cơ chất là L-acginin và

O2 với sự xúc tác bởi syntetaz của oxit nitơ

2 acginin + 2O2 + 3NADPH + 3H+ 2citrulin + 2NO + 2HCl + 3NADP

-Cơ chế không phụ thuộc oxy bao gồm

Hình 4 Cơ chế opsonin hóa của ĐTB với các chất opsonin là: a) thụ thể không đặc hiệu, b) là KT, c) C3b, d) phối hợp cả KT và C3b - (Theo L.M.Prescott,

 Tiết ra các chất hóa học trung gian để diệt khuẩn và gây viêm

 Các tế bào này khi nhận được tín hiệu hóa học (các chất hóa ứng động) sẽ tậptrung ở ổ nhiễm để gây viêm

 Nhận diện tế bào đích nhờ các thụ thể bề mặt dành cho Fc của KT, lectin vàC3b.

 Tiêu diệt vi khuẩn nhờ tạo thành phagolyzoxom hoạt hóa cơ chế diệt phụ thuộc

và không phụ thuộc oxy

Bạch cầu ưa kiềm (basophil leukocyte)

Tế bào có tỷ lệ thấp (0-2%) trong máu Trong sinh chất chứa các hạt khác nhau vềkích thước bắt màu thuốc nhuộm kiềm (xanh metylen) Các hạt này chứa các aminhoạt mạnh Các chất này được giải phóng ra ổ viêm và vị trí xảy ra quá mẫn Trên bềmặt tế bào kiềm có các thụ thể dành cho Fc của IgE Về mặt miễn dịch học tế bàokiềm giống như tế bào mast

Bạch cầu ưa axit (eosinophil leukocyte)

Có trong máu ngoại vi chiếm 1-5% tổng số bạch cầu (ở người Việt là 6-10%).Trong tế bào chất chứa các hạt bắt màu thuốc nhuộm axit (eosin) Khi bị nhiễm kýsinh (giun, sán) hoặc khi bị dị ứng thì số lượng BC axit tăng lên

BC ưa axit được hấp dẫn bởi các chất hóa ứng động [C5a, ECF (eosinophilchemotactic factor do tế bào mast tiết ra] đi đến nơi có KN Trên bề mặt BC axit cócác thụ thể dành cho Fc của IgE hoặc IgG và C3b Các KT và C3b lại gắn với KN trên

bề mặt ký sinh (giun, sán) BC axit được hoạt hóa, tiết các chất hóa học trung gian đểtiêu diệt vật ký sinh

Các sản phẩm của BC ưa axit

• Có nhiều hạt đặc hiệu chứa protein chính, protein dạng cation, neurotoxin,peroxitaz

• Các hạt nhỏ chứa các enzym aryl sulphataz, photphataz

• Các chất hóa học trung gian gồm: H2O2, superoxit, leukotrien (LTB4, LTC4),prostaglandin (PGE2), yếu tố hoạt hó tiểu cầu; các cytokin (ví dụ IL-1α, -3, -5, -6, -8),yếu tố kích thích quần lạc của tế bào hạt và ĐTB (GM-CSF-granulocyte-macrophage

colony-stimulating factor), yếu tố hoại tử ung thư α (TNF-α); các enzym histaminaz,photpholipaz và β-glucuronidaz

1.3 Kháng nguyên (Antigen)

- Kháng nguyên (Antigen) có nguồn gốc từ nấm mốc, vi khuẩn, virus hay các loạiprotein ngoại lai, các yếu tố lạ đối với cơ thể, mà khi vào cơ thể có khả năng đáp ứngmiễn dịch (tính sinh miễn dịch) và sau đó kết hợp đặc hiệu với sản phẩm của đáp ứngnày (Tính đặc hiệu) Không phải tất cả các yếu tố lạ khi vào cơ thể đều là khángnguyên, chúng phải có kích cỡ ít nhất bằng

- Tính sinh kháng thể ( tính sinh miễn dịch)

Tính sinh kháng thể là khả năng của một kháng nguyên tạo ra một đáp ứng miễndịch Đáp ứng này có thể là tế bào hay dịch thể, có thể là dương tính (cơ thể mẫn cảmsinh kháng thể) hoặc âm tính ( cơ thể dung nạp và không sinh kháng thê)

- Tính đặc hiệu

Tính đặc hiệu của kháng nguyên là đặc tính mà kháng nguyên chỉ được nhận biếtbởi đáp ứng miễn dịch (kháng thể đặc hiệu) do nó gây ra, chứ không phải những đápứng miễn dịch do các kháng nguyên khác Như thế một kháng thể chống A chỉ phảichỉ phản ứng với kháng nguyên A Ngược lại kháng nguyên A chỉ được nhận biết bởimột kháng thể chống A

Tính đặc hiệu của kháng nguyên rất chặt chẽ, bởi vì nếu có một thay đổi nhỏ vềcấu trúc hóa học của kháng nguyên cũng làm mất tính đặc hiệu, kháng nguyên đã thayđổi không còn khả năng kết hợp với kháng thể do nó kích thích sinh ra trước nó Vídụ: đối với kháng nguyên là protein chỉ cần thay đổi một axit amin hoặc axit amindạng D thay thế cho dạng L đã làm thay đổi tính đặc hiệu của kháng nguyên đượcnhận biết bởi hệ thống miễn dịch được gọi là nhóm quyết định kháng nguyên hayEpitope Đó là phần kháng nguyên kết hợp đặc hiệu với kháng thể

- Tính đa trị kháng nguyên

Kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể, các tế bào trình diện kháng nguyên bắt giữ vàbiến chúng thành các Epitope khác nhau, vì thế mà kích thích cơ thể sinh ra nhiềukháng thể tương ứng Điều này giải thích tại sao khi tiêm chủng vacxin và khuẩn

nhược độc A sẽ thu được huyết thanh chứa nhiều loại kháng thể chống lại A được gọi

• - Kháng nguyên không hoàn toàn (hapten) còn gọi là bán kháng nguyên: Lànhững kháng nguyên chỉ có tính đặc hiệu, không có tính kháng nguyên Những khángnguyên này tự than chúng không có khả năng kích thích cơ thể sinh kháng thể, nhưng

có khả năng kết hợp đặc hiệu với kháng thể tương ứng

Để trở thành kháng nguyên hoàn toàn, kháng nguyên không hoàn toàn này phảigắn với một chất mang (Carrier), tạo thành phức hợp hapten-carier, phức hợp này kíchthích cơ thể sinh kháng thể Carier là những chất có trọng lượng phân tử lớn như: BSA(Bovine Serum Albumin)… Dung để kết hợp với hapten tạo ra kháng nguyên hoàntoàn

- Kháng nguyên phải có kích thước phân tử lớn ( ngưỡng tối thiểu của trọng lượngphân tử là 1000 Dalton) Tuy nhiên có chất có trọng lượng phân tử nhỏ nhưng chúngtìm cách gắn với protein khác để trở thành kháng nguyên hoàn chỉnh, ngược lại một

số chất có trọng lượng phân tử lớn như Dextran tới 200000 Dalton nhưng không cótính sinh miễn dịch hoặc có nhưng rất yếu

- Kháng nguyên phải có ít nhất một Epitope khác loài vì hệ thống miễn dịch khôngphản ứng với Epitope cùng loại Epitope là những cấu trúc trên bề mặt tác nhân gâybệnh, có khả năng tác dụng tương hỗ riêng biệt với những thụ thể đặc hiệu trên bề mặtcủa một số tế bào lympho Như vậy toàn bộ cấu trúc (tác nhân gây bệnh, những hạtphân tử) mà trên đó những epitope hiện diện được gọi là kháng nguyên

1.4 Kháng thể và phản ứng kháng nguyên – kháng thể

Kháng thể là các phân tử globulin miễn dịch nên được gọi là immunoglobulin (cóbản chất là glycoprotein), do các tế bào lympho b cũng như các tương bào ( biệt hóa

từ lympho B ) tiết ra để hệ miễn dịch nhận biết và vô hiệu hóa các tác nhân lạ, chẳnghạn các vi khuẩn hoặc virus Mỗi kháng thể chỉ nhận diện đặc hiệu một kháng nguyênduy nhất

- Phân tử kháng thể đặc hiệu có nhiều lớp khác nhau: IgG, IgM, IgA, IgE, IgD Trongcác lớp globulin miễn dịch có IgG chiếm khaorng 75 -85 % tổng số globulin miễndich trong cơ thể

- Phân tử kháng thể cấu tạo từ 4 chuỗi polypeptide gồm gồm hai chuỗi nặng ( H,heavy) giống hệt nhau và hai chuỗi nhẹ (L, light) cũng giống hệt nhau Có hai loạichuỗi nhẹ k (kappa) và λ (lamda), do đó hai chuỗi nhẹ của mỗi phân tửimmunoglobulin chỉ có thể cùng là k hoặc λ

- Các chuỗi của immunoglobulin liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfide và có độđàn hồi nhất định Một phần cấu trúc của các chuỗi thì cố định nhưng phần đầu củahai “cánh tay” chữ Y thì rất biến thiên giữa các kháng thể khác nhau, để tạo nên các vịtrí kết hợp có khả năng phản ứng đặc hiệu với các kháng nguyên tương ứng, điều nàytương tự như một enzyme của nó Có thể tạm so sánh sự đặc hiệu của phản ứng khángthể - kháng thể như ổ khóa với chìa khóa

Hình 5 Cấu trúc của một phân tử kháng thể

- Hoạt hóa các tế bào miễn dịch: Sau khi gắn vào kháng nguyên ở đầu biến thiên (Fab),kháng thể có thể liên kết với các tế bào miễn dịch ở đầu hằng định (Fc) Những tươngtác này có tầm quan trọng đặc biệt trong đáp ứng miễn dịch Như vậy, các kháng thểgắn với một vi khuẩn có thể liên kết với một đại thực bào và khởi động hiện tượngthực bào Các tế bào lympho NK (Natural Killer) có thể thực hiện chức năng độc tếbào và ly giải các vi khuẩn bị opsonine hóa bởi kháng thể

Hình 6 Hoạt hóa các tế bào miễn dịch

- IgG trong hệ thống miễn dịch có nhiệm vụ kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên Đây làmột trong những chức năng quan trọng nhất bên cạnh các chức năng khác như hoạthóa bạch cầu, bổ thể, hoạt hóa cơ chế vận chuyển qua màng tế bào…

- Khả năng kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên có được là do cấu trúc đặc hiệu củaphân tử globulin miễn dịch là: đoạn F(ab) sẽ kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên, bấthoạt nó ( hay còn gọi là trung hòa kháng nguyên) mà kết quả của sự kết hợp này đượcứng dụng rất nhiều trong các kỹ thuật miễn dịch Đoạn F(c) có chức năng kết hợp với

các thụ thể có trên bề mặt của tế bào và hoạt hóa các cơ chế hoạt động đáp ứng miễndịch.

- Phản ứng in-vitro diễn ra giữa kháng nguyên kháng thể hay còn được gọi là cácphương pháp huyết học ( serological assays) đã và đang được sử dụng rộng rãi trongchuẩn đoán bệnh

- Sự kết hợp giữa kháng nguyên – kháng thể chính là kết quả của hàng loạt các phảnứng tủa, phản ứng ngưng kết, phản ứng cố định bổ thể và phản ứng miễn dịch đánhdấu Sản phẩm hóa lý của sự kết hợp kháng nguyên với kháng thể mà cụ thể là kết quảcủa phản ứng trung hòa kháng nguyên có ý nghĩa rất lớn và được ứng dụng nhiềutrong các kỹ thuật miễn dịch chuẩn đoán bệnh Người ta chia kỹ thuật này làm 2hướng cơ bản sau: phản ứng định tính và phản ứng định lượng

Những kháng nguyên – kháng thể quan sát được như: quan sát kết tủa hay cácphép đinh tính, định lượng kĩ thuật, kĩ thuật đo độ đục, kĩ thuật miễn dịch khuếch tánkép, kĩ thuật khuếch tán vòng…

Những kháng nguyên – kháng thể không nhìn thấy được thì phải dung các kĩ thuậtdánh dấu phát hiện:

• Dùng enzyme gắn với kháng thể rồi cho kết hượp với kháng nguyên, sau đó dung cơchất hiện màu thích hợp để phát hiện đánh giá đo màu sử dụng quang phổ kế hoặcquang kế (máy đo mật độ quang học…) Phương pháp này gọi là phương pháp miễndịch đánh dấu enzyme (phản ứng ELISA)

Dùng thuốc nhuộm huỳnh quang để nhuộm kháng thể cho kết hợp với khángnguyên (trực tiếp hay gián tiếp) và phát hiện phức hợp kháng nguyên – kháng thểbằng kính hiển vi huỳnh quang Phương pháp này được gọi là phương pháp miễn dịchhuỳnh quang (FIA)

2 Chuột nhắt trắng Mus Musculus Var Albino.

Với đặc trưng của chuột nhắt trắng là tính hiền, được nuôi và nhân đàn một cách

dễ dàng và quan trọng hơn là do tính tương đồng cao trong bộ gene của chuột và bộgene của người nên hiện nay chuột bạch được coi là đối tượng quan trọng cho cácnghiên cứu Y sinh học Y sinh học cũng là lĩnh vực nghiên cứu sử dụng chuột bạchlàm mẫu thí nghiệm nhiều nhất Các gene của chuột bạch được giải mã để làm

giàu ngân hàng gene nhưng với mục đích chính là phục vụ cho con người Chuột bạchcòn được dùng để thử tác dụng bảo hộ và tác dụng phụ của vac-xin, thử tác dụng chữabệnh của thuốc, của các tia xạ, tác dụng và ảnh hưởng của một loại thức ăn.

Bảng 1: Đặc điểm của chuột nhắt trắng.

Đặc điểm

Số lượng tinh trùng/ 1 lần phóng tinh

Số trứng rụng tự nhiên

Siêu rụng trứng băng hormone

Khoảng 5x10 7

Khoảng 10 Khoảng 30 Đời sống sinh sản con đực

Đời sống sinh sản con cái

Khoảng 1,5 năm Khoảng 8 lứa đẻ

Trọng lượng mới sinh Trọng lượng con đực trưởng thành

Trọng lượng con cái trưởng thành

Khoảng 1,25g Khoảng 35g Khoảng 30g Thể tích máu ( trưởng thành) Khoảng 2ml

Thể tích nước tiểu (ngày) Khoảng 2ml

Thức ăn tiêu thụ (ngày) Khoảng 4,5 g

Số lượng bộ NST DNA tổng số Gen

2n = 40 Khoảng 6pg Khoảng 10 5

Chuột nhắt trắng (Mus Musculus Var Albino) được nuôi trong điều kiện tiêuchuẩn ở khu chăn nuôi của Viện Công nghệ sinh học

3 Vaccine

Vaccine là chế phẩm có tính kháng nguyên dùng để tạo miễn dịch đặc hiệu chủđộng, nhằm tăng sức đề kháng của cơ thể đối với một (số) tác nhân gây bệnh cụ thể.Các nghiên cứu mới còn mở ra hướng dùng vaccine để điều trị một số bệnh (vaccineliệu pháp, một hướng trong các miễn dịch liệu pháp) Thuật ngữ vaccine xuất phát từvaccinia, loại virus gây bệnh đậu bò nhưng khi đem chủng cho người lại giúp ngừađược bệnh đậu mùa (tiếng Latinh vacca nghĩa là "con bò cái") Việc dùng vaccine đểphòng bệnh gọi chung là chủng ngừa hay tiêm phòng hoặc tiêm chủng, mặc dùvaccine không những được cấy (chủng), tiêm mà còn có thể được đưa vào cơ thể quađường miệng

- Cơ chế hoạt động: Hệ miễn dịch nhận diện vaccine là vật lạ nên hủy diệt chúng và

"ghi nhớ" chúng Về sau, khi tác nhân gây bệnh thực thụ xâm nhập cơ thể, hệ miễndịch đã ở tư thế sẵn sàng để tấn công tác nhân gây bệnh nhanh chóng hơn và hữu hiệuhơn (bằng cách huy động nhiều thành phần của hệ miễn dịch, đặc biệt là đánh thứccác tế bào lympho nhớ) Đây chính là các ưu điểm của đáp ứng miễn dịch đặc hiệu

- Một số loại vaccine thường được sử dụng:

• Vaccine bất hoạt là các vi sinh vật độc hại bị giết bằng hóa chất hoặc bằng nhiệt Thídụ: các vaccine chống cúm, tả, dịch hạch và viêm gan siêu vi A Hầu hết các vaccineloại này chỉ gây đáp ứng miễn dịch không hoàn toàn và ngắn hạn, cần phải tiêm nhắcnhiều lần

• Vaccine sống, giảm độc lực là các vi sinh vật được nuôi cấy dưới những điều kiện đặcbiệt nhằm làm giảm đặc tính độc hại của chúng Vaccine điển hình loại này thườnggây được đáp ứng miễn dịch dài hạn và là loại vaccine được ưa chuộng dành chongười lớn khỏe mạnh Các vaccine ngừa bệnh sốt vàng, sởi, bệnh ban đào và quai bịđều thuộc loại này

• Các "toxoid" là các hợp chất độc bị bất hoạt trích từ các vi sinh vật (trong trường hợpchính các độc chất này là phương tiện gây bệnh của vi sinh vật) Thí dụ: các vaccinengừa uốn ván và bạch hầu

- Các loại vaccine đang được nghiên cứu

• Sử dụng các phụ gia (adjuvant) mới, nhằm gây ra loại đáp ứng miễn dịch mong muốn.Thí dụ, chất nhôm phosphate và các oligonucleotide chứa CpG demethyl hóa đưa vàovaccine khiến đáp ứng miễn dịch phát triển theo hướng dịch thể (tạo kháng thể) thay

vì tế bào

• Vaccine khảm: sử dụng một sinh thể quen biết để hạn chế hiện tượng "phản tác dụng",thí dụ dùng virus vaccinia mang một số yếu tố của virus viêm gan B hay virus dại

• Vaccine polypeptidique: tăng cường tính sinh miễn dịch nhờ liên kết tốt hơn với các

phân tử MHC: peptide nhân tạo 1/2 giống virus, 1/2 kia gắn MHC; đoạn peptide môphỏng 1 quyết định kháng nguyên (epitope)

• Anti-idiotype: idiotype là cấu trúc không gian của kháng thể tại vị trí gắn khángnguyên, đặc hiệu với kháng nguyên tương ứng Anti-idiotype là các kháng thể đặchiệu đối với idiotype, do đó anti-idiotype xét về mặt đặc hiệu lại tương tự với khángnguyên Vậy, thay vì dùng kháng nguyên X làm vaccine, người ta dùng idiotype anti-anti-X