Xây dựng quy trình thu nhận, nuôi cấy In Vitro và cấy chuyển phôi trên chuột nhắt trắng (Mus Musculus VAR. Albino)

Xây dựng quy trình thu nhận, nuôi cấy In Vitro và cấy chuyển phôi trên chuột nhắt trắng (Mus Musculus VAR. Albino)Xây dựng quy trình thu nhận, nuôi cấy In Vitro và cấy chuyển phôi trên chuột nhắt trắng (Mus Musculus VAR. Albino)Xây dựng quy trình thu nhận, nuôi cấy In Vitro và cấy chuyển phôi trên chuột nhắt trắng (Mus Musculus VAR. Albino)Xây dựng quy trình thu nhận, nuôi cấy In Vitro và cấy chuyển phôi trên chuột nhắt trắng (Mus Musculus VAR. Albino)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN CON BAO CAO NGHIEM THU ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CẤP TRƯỜNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH THU NHẬN, NUOI CAY IN VITRO VA CẤY CHUYỂN PHOI TREN CHUOT NHAT TRANG (MUS MUSCULUS VAR ALBINO) Ma sé: T2004 — 46 Chủ nhiệm để tài : TRẦN THỊ VIỆT HỒNG Nhóm CB thực : _ NGUYỄN THỊ THƯƠNG HUYỆN PHAN KIM NGỌC LÊ THÚY ANH Tp Hồ Chí Minh Tháng 04 năm 2005 nh i [.1 Sơ lược lịch sử nghiên cứu hG tro sinh sda cc een [.2 Sinh lý sinh sẵn chuột nhat trang vues musculus var ALBINO Joc H.2.1, Đặc điểm CHUN cuc H2 nh H2 n2 H2 nh tt xe L.2.2, Cơ quan sinh dục đực hình thành EHO TỪ cá chu re 1.2.3, Cơ quan sinh dục hình thành g1AO TỬ cuc cty ED nh g6 na ố t3 Quy 2.5 Sự phát triển phÔi, cv chua trình nuồi phơi ống Hình 3.1 Thành phần mơi trường ni cấy phôi chuột Ð £3.2 Quy tink mudi Ce eve ¬ cnsietcteens iG [.4 Cơng nghệ cấy truyền phÔI cuc cuc nu ch n2 ga HH 2u LƠ Năng Hii(ci::aai)liiaiậìẳẳiiaaain 10 {.4.2 Quy trình chuyển phƠI Lá ch n2 Hào iG H.1 Đôi tượng nghiÊn CỨU cu cuc nh H.2 Dụng cụ, thiết bị hóa chẤ uc cuc ch 1ï nh HH HH H22 Hà ho nà nan 22H22se 12 co 13 1.3.1 Phương phấp tha nhận phối VÀ BUỔI ĐỔI cuc chàng rxe 13 1L3.2 Phương pháp chuyển phôi chuột vào chuột mang thái hộ 16 Hid Két qua audi phd: HH.E.E, Nuôi phôi HHE.1.2, Nuôi phôi EH1.E.3, Nuôi phôi 1H1.E.4, So sánh Kết VR cde mi trating khde nh ee 20 môi trường TVE cu cuc nh anh khtedkesee 20 môi trường VI TỶ  cuc cu Ha 21 mơi trường RSOAM, ¬" ¬¬NN 2d ni phơi môi tị tưởng: RSOM, IVE VA ee 1H.2 Kết chuyển phôi ẨNG L1 110111111501 111 01 501111115011 0t rn 27 VEZ Chuyển phôi trực tiếp vào cấi mang từ nguồn phÔI ie vive 27 1H1.2.2 Chuyến phơi vào nhĩpg từ nguồn DhƠI H1 VHO cu cu ceceesee 28 IVE Ket ane ¬ iieseitomcritntesarraOe À9 u:aaầđa "¬———— BA Tad Gu thant KAO gS CÁC TỪ VIẾT TẮT SỬ DỤNG TRONG BÀI IVF: In Vitro Fertilization RNA: Ribonucleic acid GnRH: Gonadotropin Releasing Hormone-Hormonephong thich kich duc t6 FSH : Follide Stimulating Hormone-Hormone kich thich nang tring phat trién LH: Luteinizing Hormone-Hormone kich thich rụng trứng DNA: Deoxyribonucleic acid ZP: Zona Pellucidase Dal: Dalton BSA: Bovine Serum Albumin-albumine huyét bò PVA: Polyviny alcohol EDTA: Ethylenediamine tetra-acetic acid PMSG: Pregnant mare`s serum gonadotropin-kích dục tố thu từ huyết ngựa chửa OV: Oviduct SP: Spermary 2-cell block: ức chế tế bào KSOM: môi trường SOM-Simplex Opimized Medium-tăng nồng độ KCI NaCl Dpc: days postcoitum-ngay tudi M: morula B: blastocyst a: mute ¥ nghia ~ Ì LÄi mĩ tiếu Lời mở đâu Ông nghệ chung hỗ HỢ sinh sản (Assisted Reproducuve Cỏne Tecbnology nghề cấy chuyến phôi Technology) (Embryo oi Transfer ) động vật nói riêng thực mang lại nhiều giá trị kinh tế to lớn cho quốc gia có ngành chăn ni phái triển (Mỹ, Canada, New Zealand, Nhật ) Từ công nghệ này, fpHỜI lạ CÓ thể chủ động tạo hàng loạt nguồn động vật ni có đặc điểm truyền mong muốn; đồng thời tạo điều kiện cho nghiên cứu thuộc lĩnh vực phôi thai học động vẬI người, Tuy nhiền, lĩnh vực mẻ nước ta Hiện nghiên cứu lĩnh vực hỗ trợ sinh sản Việt Nam mức đơn giản tập trung vào đối tượng động vật trọng lớn người, bị Một khó khăn nhà khoa học lĩnh vực cầu an nguồn kinh phí lớn đề thực nghiên cứu, Chính vậy, nhiều nghiên cứu hiển chuột rắng chọn số lý sau: €1) đối tượng sứ dụng phế biến, (2) động vật nhỏ có độ tưởng đồng với người cao, (3) để thực biện x phịng thí nghiệm, (4) chủ kỳ động dục ngắn (3-4 ngày), (Š) việc fim nguon cung cấp để dàng (6) Giá thành tưởng đổi rẻ Trên sở đó, chúng tơi tiến hành để tài “Xây dựng quy trìmh thu nhận, ne ĐI ^“ « « Ð Nụ Ai Cấy ứi tứroa cấy chuyến /ar, A/Đ2xø`, Đầy mo phơi ~ sở cho chuột nghiên “4 nhat cứu x trang Mus sâu chuyển gen, nhân phôi, tạo sẵn phẩm phục vụ cho y học Musculus kỹ thuật TỔNG QUAN TAI LIEU Tang quan Tải tiện 1.1 SƠ LƯỢC LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU HỖ TRỢ SINH SẲN [5], (81,141, 119] Năm 1890, Walter Heape Min thực thó, năm 1930 thu chan thành cơng trứng bị năm thành cơng bị, Mặc dù bước khởi đầu cho phôi chuyển sang nhận phơi nhà khoa học Đến năm + chuyển phỏi thành công 1951 thực chuyển phôi thu phôi trực ĐIẾp từ mở hướng cho 1959, tha TYP (in Vitro Fertilization} du kiện đánh đấu bước ngoặi Điền đối Mỹ, to lớn can thiệp khoa học vào chế sinh sẵn tự nhiên động vật hữu nhũ nói Sg va cOa ngudt nd: riéng IVE da phat ién va JA nén ting cho công nghệ hỗ trợ s áu bao gồm; nuồi trứng, chin QVM — fn Vitro (iCS] Intracytoplasmic Embryo Transfer), Maturation}, Sperm chuyén giao tiếm Injection), tĩnh nhan ‘ing ban td vao vor tf cung Hợp tử phất triển thành phối: thỏ (16: » Phối phái triển thành atone chuyén noan phéi (AT_ Intra-Fallopian intra-fallopian Transfer}, hỗ trợ sinh sản đánh giá hai niức độ: trắng (1068), người (1969), bị (19§0), (3) (Cloning), bào (GIFT _Gamete Yransfer), chu n phối vào vịi trứng GZ2IFT Zygote Thành cơng công nghệ ao thể: thỏ cừu (1259), chuột ding ; (1963), chuột ngựa (1989), soy người (1978), gia súc lớn (1983 1997) Ở Việt Nam vào Quốc gia bắt đầu [904 chuột, năm kỹ thuật IVE năm 1978, Trung tâm Khoa Học Tự Nhiên Và Công nghệ nghiên cứu cấy truyền phổi thố, năm 1980 bò, năm 2002 heo, Ngày 30/4/1998, ba trẻ sơ sinh đời Bệnh viện Phụ sản Từ Dũ mổ nhiều uiển vọng tò lớn, Đến nay, số trẻ đời kỹ thuật hơa 1000 số nầy ngầy căng tang [194 Những kết đạt tạo SỞ cho việc ứng dụng công& nghệ hỗ trợ sinh sản chung cơng nghệ phơi nói nêng chương trình lớn cải tạo nhân giống vật nuôi, bảo vệ ởa dạng sinh bọc động vật phát cơng nghệ sinh học, phục vụ chăm sóc sức khỏe cộng đãẳng thời gian tới, SINH SẲN Ở CHUỘT 12.1 ĐẶC BIEM CHU NÓ [2311321 NHAT TRANG VAR thành Thời gian rang thai chủng (sưraim) Chuột thời gian bú sửa mẹ Chuột Quái To ca An Xã tới chóp đi), nặng từ 18: a) | | | ` MUSCULUS 134] Sự phát triển chuột bất đầu rừ hợp tứ hình chuột từ 19-21 ngày, điểu côn tùy thuộc vào sinh nặng từ í-1,2 gram, tăng trưởng nhanh Ao ae TẠM ge fer ` we trưởng thành (3-12 tuần tuổi) đài 12-L5 cm (ính từ mũi 35 2gram Chu kỳ động dục chuột 3-4 ngày, | MUS | LÝ | 12 SINH ALBINO — — Tổng quan tải liệu — — 1.2.2, CO QUAN SINH DUC BUC VÀ SỰ HÌNH THÀNH GIAO TU 1.2.2.1 Cau tạo chức Cơ quan sinh dục đực chuột nói riêng động vật hữu nhũ nói chung chủ yếu gồm phận sau:(Hz Tỉnh hoàn Ở 7) [32] (Tesus) cấu tạo ống sinh tỉnh.Các ống có nhiệm vụ sản xuất tỉnh trùng Các tế bào kẽ tiết hormone sinh dục đực (chủ yếu testosteron) (Hink 1.2) [31], 1321 [33] Mào tỉnh (Epididymis) trưởng thành từ tinh hồn [23] Hình 1.1: Co quan sinh duc ditc chuột hệ thống ống cực nhỏ chứa tỉnh trùng Ống dẫn tỉnh (Ductuc deferens) dẫn tinh dịch chứa tỉnh trùng đến dương vật để thực chức sinh sản Túi tỉnh (Spermary) nơi chứa tỉnh trùng tiết dịch trộn với tỉnh trùng tạo tỉnh dịch Dương vật (Penis) nơi xuất tính tiết nước tiểu Bên cạnh cịn có tuyến tiền liệt, tuyến Cowper túi tỉnh địch hỗ trợ cho sinh sản tỉnh trùng Các tuyến có nhiệm vụ bổ sung emzyme chất dinh dưỡng cho tính trùng I.2.2.2 Sự phát sinh giao tử đực |3] [5] [9], [13], [20, [23] [27] Sự hình thành tinh tring Khi chuột Š tuần tuổi, tỉnh trùng biệt hóa từ tế bào mầm (sterm cell) với số lượng ngày tăng Khác với trình sinh trứng, trình sinh tỉnh phụ thuộc vào lượng tế bào mầm thực tế có tế bào có khả tự phục hồi tốt (self renewal) Ở giai đoạn đầu trình sinh tỉnh, tỉnh nguyên bào nằm sát màng đáy sọi tỉnh nguyên bao loai A (type A spermatogonia) sé bién déi thinh uinh nguyén bao loa B (type B spermatogonia) Tinh nguyên bào loại B chuyển xa dan khói màng đáy để hướng khoang ống sinh tỉnh, chuyển đổi thành tỉnh bào sơ cấp (nh bào cấp I) bắt đầu bước vào phân chia giảm nhiễm (meiosis) tạo nên tỉnh bào thứ cấp (tỉnh bào cấp II) có nhân chứa 20 nhiễm sắc thể kép [23] Tiếp trình giảm phân II cho tỉnh tứ (spermatides) hay tiền tỉnh trùng với số lượng nhiễm sắc thể đơn bội (haploid genome) Các tỉnh tử từ từ chuyển dạng biệt hóa thành tỉnh trùng trưởng thành (mature sperms) phóng thích vào khoang ống sinh tình (Hình 1.2) Tổng tan tải liệu ứvo “G 5w Tinh hoạu Tinh nguyên bao a \ Tinh bao so cap 53 ' @! %° @ } 6@®® » \ / Tinh bao 2 Tình có Ì thư cấp } ; Ỷ L | Tinh mơng | Hình 1.2: Cac giai doan hinh tinh tring Giống tỉnh trùng động vật hữu nhũ, tỉnh trùng chuột có phần Z ` a n À tA NA AG là: đầu, cổ (phần giữa) Sự kích hoạt tình trùng trước thụ tỉnh Khi phóng thích vào quan sinh dục cái, tỉnh trùng phải trải qua hàng loạt bước chuyển hóa mdi thu tinh cho nỗn: phản tng kha hóa (Capacitation), phản ứng tăng động (Hyperactivaton) phản ứng cực đầu (Acrosome reaction) Các yếu tố ảnh hưởng đến sản sinh tỉnh trùng Vai tro cua hormone Hormone [1], [5], [26], [27] phong thich kich duc t6 (GnRH_Gonadotropin Releasing Hormone) pepud có IØ acid amin tế bào thần kinh nội tiết nằm vùng đồi sản xuất GnRH duge giải phóng xào hệ thống mạch máu tới thùy trước tuyến yên siúp tuyến yên tiết FSH (Follide Stimulating Hormone — hormone kich thich nang noãn) LH (Luteinizing Hormone — hormone hoang thé hóa) Cả hai hormone trực tiếp tham gia điều hịa q trình sản sinh tỉnh trùng e© e LH: kích thích tế bào Leydig khoang kẽ tỉnh hoàn tiết testosteron ESH: kích thích phát triển ống sinh tinh va tế bào sertoli tiết dịch chứa nhiều chất dinh dưỡng giúp cho tỉnh trùng trưởng thành Tổng quan tải liệu Vai trò yếu tố khác Nhiệt độ, kháng thể, tia phóng xạ, bệnh lý, chất kích thích, stress, ảnh hưởng đến sức sinh sẵn tỉnh trùng L2.3 CƠ QUAN SINH DỤC CÁI VÀ SỰ HÌNH THÀNH GIAO TỬ 1.2.3.1 Cấu tạo chức [13] [5], [17], [23], [26], [34] Các quan máy sinh sản chuột động vật hữu nhũ, bao gồm hai buồng dẫn trứng, trứng, tử cung hai ống âm (Hình L3) e dạng Buồng trứng (Ovary) Buồng trứng quan cặp buồng Ngồi trứng cịn việc sản tạo noãn, sinh hormone, dic biét la estrogen ° Ộ - SỐ Hình L3: Cơ quan sinh dục chuột Ống dẫn trứng (Oviduct) Ống dẫn trứng có kích thước nhỏ ống tử cung, nằm buồng trứng tử cuns Khi kích thích rụng trứng hormone hướng sinh dục đoạn ống dẫn trứng phình to lên dễ nhìn thấy, người ta gọi đoạn bóng (ampula swollen) Đầu tận ống dẫn trứng có dạng hình phếu với nhiều tua (infundibulum) mở khoang bụng gọi vòi Fallope, tua lùa trứng vào ống dẫn trứng Ông dẫn trứng nơi xảy trình thụ tỉnh e Tu cung (Uterus) [3], [23] Tử cung quan để phôi làm tổ phát triển Tử cung chuột có hình chữ Y_ (ở người số động vật hữu nhũ khác có hình lê) nằm bên hai xương chậu Trong thời gian mang thai, tử nở rộng cho phép bào thai lớn lên, bảo vệ cung cấp chất dinh dưỡng cho bào thai [23] e Am dao (Vagina) va 4m (Vulva) Là quan giao cấu quan sinh nở chuột 1.2.3.2 Su phat sinh giao tu cai [9], [13], [14], [15], [17], [23] Nhìn chung, phát triển trưởng thành giao tử động vật hữu nhũ nói chung chuột nhắt trắng nói riêng cần hội đủ hai điều kiện: (1) phát triển nang noãn (2) trưởng thành noãn Tổng nuan tài liệu Su phat sinh giao tit cai (Oogenesis) Ở chuột, sau sinh ngày tuổi tất nỗn bào (Oocyte) có nhiễm sắc thể trạng thái kép (diplotense) vào kỳ trước (prophase) giảm phân I Vì chúng thường dạng lưỡng bội có hàm lượng DNA lớn gấp lần nhiễm sắc thể đơn bội (4C) Mỗi trứng chứa nang noãn (follicle) Nang noãn cấu tạo tế bao hat (granulosa cell, cumulus cell) Các tế bào hat bao quanh trứng, kết hợp cách chuyên biệt với trứng Tế bào hạt trứng bị ngăn cách hoàn toàn với lớp màng suốt (zona pellucid_ZP) Chuột tuần tuổi thành thục giới tính (tùy vào chủng chuột điểu kiện môi trường) Lúc này, buồng trứng chứa khoảng 10” trứng giai đoạn khác Q trình chín trứng từ nang noãn diễn cách tự động (spontaneusly) đưới điều kiện giàu dinh dưỡng nang noãn Dưới tác động LH màng nhân dần, nang nguyên thuỷ trải qua hàng loạt trình biến đổi, cuối cho nang trưởng thành Lúc trứng chín phóng thích khỏi nang Giảm phân II tiếp tục có thụ tỉnh giai đoạn cuối lần phân chia tạo trứng, kết trứng giữ nguyên kích thước, thể cực tạo lần phân chia thể cực (second polar body) giống lần đầu (Hình 1.4) CÁC NE R NGI|XMEPHXN NC PHAXT PRIEN NANG " NGUYEN Nowx cinn0lvyen hận PHAN ` a TRUCE [an trưởng GIÁ Nolin ví cập CHẾ X TRƯỜNG s # Nung THÀNH ——-: tri tế ng da prophise BUỚNG > - TRƯỜNG - li NHƯNG IHioi vớ xa : PHAN I ae Khử cực Ï ae - prophase prog lì : ` (nung a ‘ {6 ,IVXNTIPHXNH Rung Novag seep - cite : HH tí metznphase Negi EHh Trưng Tinh “ The this + Ngắn thứ cấi x agusear (211192 TP YTĐ + “= , 1111 en Phú^ HO NI ĐỒNG Noor slop tnd ‘sy: Nang ' GIANT pang : BH VN bo bao Trưng ì SINT NOAN Hoon = trang tat gian phán Nẵng Trưng [Ung trinh § = ` i TÍ Irvnye Hình L4: Sự hình thành giao tử rụng trứng - thành IJ ... ta thu tế bào mầm phôi dễ dàng Phôi làm tổ hai nhánh tử cung 1.3 QUY TRINH NUOI PHOI TRONG ONG NGHIEM 1.3.1 Thanh phan chinh môi trường nuôi cấy phôi chuột [28] Việc ni cấy phơi chuột phụ thu? ??c... tha nhận phối VÀ BUỔI ĐỔI cuc chàng rxe 13 1L3.2 Phương pháp chuyển phôi chuột vào chuột mang thái hộ 16 Hid Két qua audi phd: HH.E.E, Nuôi phôi HHE.1.2, Nuôi phôi EH1.E.3, Nuôi phôi 1H1.E.4,... Thu nhận phôi tế bào (dùng để nuôi phôi môi trường khác nhau) Thu nhan phoi morula, blastocyst (dùng để chuyển phôi trực tiếp vào mang) Hình II.3: chuột phối Phương pháp tiêm thu? ??c: Bắt giữ chuột