SO SÁNH KẾT QUẢ ĐỊNH LƢỢNG TỔNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ VÀ COLIFORMS TRONG MẪU THỊT BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY TRÊN MÀNG PETRIFILM VÀ PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY TRUYỀN THỐNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SO SÁNH KẾT QUẢ ĐỊNH LƢỢNG TỔNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ VÀ COLIFORMS TRONG MẪU THỊT BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY TRÊN MÀNG PETRIFILM VÀ PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY TRUYỀN THỐNG Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : NGUYỄN THỊ HỒNG TRÂM Niên khóa : 2008 - 2012 Tháng 7/2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SO SÁNH KẾT QUẢ ĐỊNH LƢỢNG TỔNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ VÀ COLIFORMS TRONG MẪU THỊT BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY TRÊN MÀNG PETRIFILM VÀ PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY TRUYỀN THỐNG Hƣớng dẫn khoa học Sinh viên thực TS NGUYỄN TIẾN DŨNG NGUYỄN THỊ HỒNG TRÂM Tháng 7/2012 LỜI CẢM ƠN Để có điều kiện học tập hồn tất luận vặn tốt nghiệp xin chân thành gửi lời cảm ơn tới: Ban giám hiệu Đại học Nông Lâm TPHCM, ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh học, tất quý thầy cô truyền đạt cho tơi kiến thức bổ ích suốt q trình học tập trƣờng Tiến sĩ Nguyễn Tiến Dũng tận tình hƣớng dẫn tạo điều kiện để thực đề tài cách tốt Thạc sĩ Võ Văn Giàu giúp đỡ nhiều để hồn thành tốt luận văn Thầy viện Công Nghệ Sinh Học Và Môi Trƣờng giúp đỡ, hỗ trợ cho tơi q trình thực đề tài Cùng tất bạn lớp DH08SH nói chung thành viên lớp làm đề tài viện Công Nghệ Sinh Học Môi Trƣờng nói riêng chia sẻ khó khăn, vui buồn giúp đỡ thời gian làm đề tài nhƣ suốt năm học trƣờng Cha mẹ gia đình khơng quản gian khó ni dƣỡng, dạy dỗ, dành điều kiện tốt chỗ dựa tinh thần vững cho Trân trọng NGUYỄN THỊ HỒNG TRÂM i TÓM TẮT Mục tiêu đề tài đánh giá hiệu lực quy trình phân tích tổng số vi sinh vật hiếu khí Coliforms màng petrifilm đƣợc sản xuất công ty 3M - Mỹ Các chủng vi sinh dùng cho việc đánh giá đƣợc phân lập từ mẫu thịt lấy chợ địa bàn quận Thủ Đức Việc đánh giá hiệu lực đƣợc thực theo hƣớng dẫn tiêu chuẩn ISO 16140:2003 Để tạo sƣu tập chủng phục vụ cho việc đánh giá, đề tài phân lập đƣợc 15 chủng Coliforms nhiễm tự nhiên loại thực phẩm Quá trình phân lập định danh đƣợc thực theo quy trình ISO 3832:2006 Những kết đánh giá cho thấy, tiêu Coliforms, độ đặc hiệu phƣơng pháp phân tích màng Petrifilm CC tƣơng đƣơng với phƣơng pháp phân tích truyền thống theo ISO 4833:2003 Sau nuôi cấy 24 giờ, khuẩn lạc Coliforms petrifilm CC có khuẩn lạc màu đỏ đến đỏ đậm, bên cạnh khuẩn lạc có bọt khí Kết xác định giá trị giới hạn định lƣợng (LOQ – limit of quantitation) phƣơng pháp phân tích coliforms sử dụng màng Petrifilm CC tƣơng đƣơng với giới hạn định lƣợng phƣơng pháp nuôi cấy môi trƣờng VRB theo ISO 3832:2006 Đối với tiêu tổng khuẩn hiếu khí, phƣơng pháp ni sử dụng màng Petrifilm có LOQ cao phƣơng pháp nuôi cấy môi trƣờng PCA (Plate Count Agar) theo tiêu chuẩn ISO 4832:2006 Kết đánh giá độ lặp lại định lƣợng coliforms petrifilm CC định lƣợng tổng vi sinh vật hiếu khí petrifilm TPC cho thấy phƣơng pháp có độ lặp lại tốt so với phƣơng pháp nuôi cấy truyền thống Đề tài áp dụng phƣơng pháp dùng màng petrifim TPC song song với phƣơng pháp nuôi cấy truyền thống theo ISO 8432:2006 để phân tích tổng số vi sinh vật hiếu khí 15 mẫu thịt heo thu nhận từ địa bàn quận Thủ Đức Kết nhận đƣợc cho thấy khơng có khác biệt đáng kể hai phƣơng pháp ii SUMMARY The objective of the research was to evaluate the effectiveness of the method that analysis total aerobic bacteria and Coliforms on petrifilm membranes were produced by 3M Company - USA The bacteria strains used for the validation process were isolated from food samples collected from markets in the Thu Duc district The validation process is performed according to instructions by ISO 16140:2003 standard Fifteen strains of Coliforms from naturally infected food samples have been isolated for use in these validation processes The protocol of isolation and identification is followed the ISO 3832:2006 standard For coliforms criteria, the validation results show that, specificity of the methods that using Petrifilm membrane is equivalent to cultural methods according to ISO 4833:2003 After 24 hours culture, Coliforms colonies on Petrifilm membranes are red to dark red with gas bubbles beside The result of validation process show that limit of quantification (LOQ) of the method for coliforms determination using Petrifilm CC is equivalent to quantification limit of the culture method using VRB agar medium according to ISO 3832:2006 For total aerobic bacteria, LOQ of Petrifilm method is higher than LOQ of cultural method using Plate Count Agar (PCA) according to ISO 4832:2006 The results of the evaluation for accuracy by repeatability of the method for determination of coliforms by Petrifilm CC and the method for determination of total aerobic bacteria in food by Petrifilm TPC show that repeatability of these method are better than the culture methods according to ISO 4833:2003 and ISO 4832:2006 This thesis also applied the method using petrifilm TPC as the same time as the cultural method according to ISO 8432:2006 to analyze the total aerobic bacteria on 15 pork samples from markets in Thu Duc District The result showed that there was no difference between two methods iii MỤC LỤC MỤC LỤC iv DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH SÁCH CÁC BẢNG vii DANH SÁCH CÁC HÌNH viii 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu nghiên cứu 1.3 Nội dung cần thực .2 Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 2.1 Tổng quan tổng số vi khuẩn hiếu khí .3 2.2 Tổng quan Coliforms 2.2.1 Định nghĩa Coliforms 2.2.2 Nguồn gốc Coliforms .4 2.2.3 Phân loại Coliforms Ý nghĩa việc kiểm tra tiêu Coliforms 2.2.5 2.3 Phƣơng pháp nuôi cấy truyền thống 2.3.1 Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc 2.3.2 Uớc đoán số lƣợng vi sinh kỹ thuật MPN (Most Probable Number) .7 2.4 Kỹ thuật nuôi cấy màng Petrifilm 2.4.1 Giới thiệu chung màng Petrifilm .8 2.4.2 Giới thiệu test thử nhanh 3M Petrifilm 2.5 Một số khái niệm quy trình xác nhận hiệu lực phƣơng pháp 10 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 3.1 Thời gian địa điểm thực 11 3.2 Nguyên vật liệu 11 3.2.1 Chủng mẫu thực phẩm 11 3.2.2 Thiết bị dụng cụ .11 3.2.3 Mơi trƣờng hóa chất 11 3.2.3.1 Môi trƣờng 11 3.2.3.2 Hóa chất 12 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 12 3.3.1 Phƣơng pháp phân lập Coliforms 12 3.3.2 Phƣơng pháp gây nhiễm chủng Coliforms vào mẫu thực phẩm .13 3.3.3 Phƣơng pháp xác định giới hạn định lƣợng chủng Coliforms 14 iv 3.3.3.1 Giới hạn định lƣợng chủng 14 3.3.3.2 Giới hạn định lƣợng mẫu 15 3.3.4 Phƣơng pháp xác định độ đặc hiệu 16 3.3.5 Phƣơng pháp xác định độ lặp lại 16 3.3.6 Xác định giới hạn định lƣợng tổng số vi khuẩn hiếu khí .17 4.1 Phân lập chủng Coliforms 18 4.2 Độ đặc hiệu phân tích Coliforms 19 4.3 Giới hạn định lƣợng phân tích Coliforms 23 4.3.1 Giới hạn định lƣợng chủng Coliforms 23 4.3.1.1 Với chủng vi khuẩn 23 4.3.1.2 4.3.2 Giới hạn định lƣợng mẫu 24 Giới hạn định lƣợng vi khuẩn hiếu khí 25 4.4 Độ lặp lại phân tích Coliforms 26 4.4.2 Độ lặp lại phân tích vi khuẩn hiếu khí .27 4.5 Thử phân tích đối tƣợng tổng khuẩn hiếu khí .28 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 29 5.1 Kết luận .29 5.2 Đề nghị 29 v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACP Aerobic Count Plate BGBL Brilliant Green Bile Lactose Broth BHI Brain heart infusion CC Coliform Count Plate LSB Lauryl Sulphate Broth MR Phản ứng thử Methyl Red MRVP Methyl Red Voges- Prokauer PCA Plate Count agar SPW Saline Peptone Water TSA Tryptone Soya Agar VP Phản ứng thử Voges- Prokauer VRB Violet Red Bile Agar vi DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Tính chất sinh hóa Coliforms Bảng 3.1 Các phản ứng sinh hóa đặc trƣng Coliforms 14 Bảng 4.1 Kết phân lập chủng Coliforms 24 Bảng 4.2 Đặc điểm khuẩn lạc loại Escherichia coli khác 26 Bảng 4.3 Đặc điểm khuẩn lạc loại Citrobacter khác 26 Bảng 4.3 Đặc điểm khuẩn lạc loại Enterobacter khác 27 Bảng 4.5 Đặc điểm khuẩn lạc loại Klebsiella khác 29 Bảng 4.6 Kết giới hạn định lƣợng hai chủng K2 E2 29 Bảng 4.7 Kết xác định giới hạn định lƣợng mẫu chủng K2 E2 30 Bảng 4.8 Kết giới hạn định lƣợng tổng khuẩn hiếu khí 31 Bảng 4.9 Kết độ lặp lại Coliforms tổng số 32 Bảng 4.10 Kết độ lặp lại tổng khuẩn hiếu khí 34 Bảng 4.11 Kết đếm khuẩn lạc thử phân tích tổng khuẩn hiếu khí 35 vii DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Các bƣớc thao tác với màng 3M Petrifilm 10 Hình 4.1 Một số hình ảnh thử sinh hóa chủng Coliforms 25 Hình 4.2 Hình ảnh khuẩn lạc chủng Coliforms 28 viii Bảng 4.8 Kết giới hạn định lƣợng tổng khuẩn hiếu khí Lần lặp So LC LOD LOQ lại AC PCA AC PCA AC PCA AC PCA 0,816 1,120 3,346 3,748 4,893 5,596 10,16 13,10 0,707 0,516 1,667 1,252 2,833 2,104 7,570 5,520 0,816 0,738 2,346 2,118 3,693 3,335 9,160 8,280 AC Phương pháp nuôi cấy màng petrifilm Aerobic Count Plate PCA Phương pháp nuôi cấy môi trường PCA Qua lần phân tích cho thấy có lần LOQ nuôi cấy màng Petrifilm lớn từ ta kết luận giới hạn định lƣợng phƣơng pháp nuôi cấy môi trƣờng PCA tốt màng Petrifilm 4.4 Độ lặp lại phân tích Coliforms Thí nghiệm đƣợc thực mẫu thịt heo tự nhiên quán bán thức ăn phƣờng Linh Trung, quận Thủ Đức Thành phố Hồ Chí Minh Mỗi mẫu đƣợc chia bao PE, bao PE chứa 10 g, tiến hành đồng mẫu pha loãng tới nồng độ pha loãng thích hợp (10-3), hút ml dịch pha lỗng cấy lên đĩa VRB đĩa Petrifilm Bảng4.9 Kết độ lặp lại của Coliforms tổng số Số khuẩn lạc xuất đĩa stt Mẫu Mẫu Mẫu CC VRB CC VRB CC VRB 12 28 193 132 82 73 12 10 120 115 37 42 14 19 151 120 66 77 20 20 130 148 48 60 16 116 163 74 54 11 11 149 136 84 138 11 10 198 201 97 118 Sr 0,096 0,214 0,093 0,083 0,149 0,184 CC Phương pháp nuôi cấy màng petrifilm Aerobic Count Plate VRB Phương pháp nuôi cấy môi trường VRB 26 Sau lần phân tích cho thấy có lần Sr phƣơng pháp phân tích màng Petrifilm nhỏ phƣơng pháp ni cấy truyền thống từ kết luận phƣơng pháp ni cấy màng Petrifilm có độ lặp lại cao phƣơng nuôi cấy môi trƣờng VRB Do màng Petrifilm đƣợc thiết kế với điều kiện tƣơng đối ổn định, hạn chế đƣợc sai số trình thao tác, thực nhanh hạn chế tế bào vi khuẩn yếu chết Còn mơi trƣờng VRB có sai số q trình thao tác nhƣ nhiệt độ mơi trƣờng nuôi cấy, thời gian nuôi ủ, hút dịch khuẩn vào đĩa petri lâu đổ môi trƣờng 4.4.2 Độ lặp lại phân tích vi khuẩn hiếu khí Qui trình thực mẫu thịt heo sống khác Visan Mỗi mẫu đƣợc cắt nhuyễn, chia nhiều túi PE vô trùng, túi chứa 10 g Thêm 90 g dung dịch SPW vào túi PE, tiến hành thực đồng mẫu, pha loãng tới nồng độ pha lỗng thích hợp (10-3), mẫu cấy lên đĩa Petrifilm đĩa PCA, kết đƣợc thể bảng 4.10 Bảng 4.10 Kết độ lặp lại (Sr) tổng khuẩn hiếu khí Mẫu AC 0,111 0,097 0,217 0,200 0,033 0,077 0,045 0,194 PCA 0,124 0,158 0,337 0,115 0,061 0,071 0,184 0,146 AC Phương pháp nuôi cấy màng petrifilm Aerobic Count Plate PCA Phương pháp nuôi cấy môi trường PCA Sau thực phân tích mẫu cho thấy so sánh kết định lƣợng phƣơng pháp phƣơng pháp nuôi cấy màng Petrifilm phƣơng pháp nuôi cấy đổ đĩa môi trƣờng PCA, kết mẫu phân tích có mẫu độ lặp lại màng Petrifilm cao mẫu độ lặp lại mơi trƣờng PCA cao Từ kết luận độ lặp lại phƣơng pháp nuôi cấy màng Petrifilm cao nuôi cấy môi trƣờng PCA Khi nuôi cấy môi trƣờng PCA phƣơng pháp đổ đĩa hạn chế số vi sinh vật nhạy cảm với nhiệt kết khó chuẩn xác Một số vi sinh vật bi ức chế cạnh tranh lẫn làm hạn chế phát triển số lồi vi sinh Bên cạnh việc nhầm lẫn khuẩn lạc xác thực phẩm gây nên kết dƣơng cao 27 4.5 Thử phân tích đối tƣợng tổng khuẩn hiếu khí Thực phân tích 15 mẫu thịt khác Vissan Các mẫu đƣợc cắt nhuyễn, pha loãng theo dãy thập phân tới mật độ pha lỗng thích hợp (10-3) cách sử dụng dịch pha lỗng SPW Sau tiến hành cấy song song lên màng phân tích nhanh Petrifilm cấy đổ đĩa môi trƣờng PCA Đếm khuẩn lạc mọc đĩa Kết đƣợc trình bày bảng 4.11 Bảng 4.11 Kết đếm khuẩn lạc thử phân tích tổng khuẩn hiếu khí Mẫu 10 11 12 13 14 15 AC 13 15 27 16 52 69 41 40 11 30 12 9 PCA 11 13 27 23 32 39 29 25 11 16 10 11 10 8 AC Phương pháp nuôi cấy màng petrifilm Aerobic Count Plate PCA Phương pháp ni cấy mơi trường PCA Khi phân tích song song tổng khuẩn hiếu khí mơi trƣờng PCA màng Petrifilm nhận thấy có chênh lệch khả định lƣợng phƣơng pháp Trong tổng số 15 mẫu, có mẫu kết định lƣợng màng Petrifilm cao hơn, mẫu kết định lƣợng hai phƣơng pháp mẫu kết định lƣợng phƣơng pháp đổ đĩa môi trƣờng PCA cao Ở phƣơng pháp định lƣợng mơi trƣờng PCA q trình thao tác lâu hút dịch khuẩn vào đĩa chƣa đổ đƣợc môi trƣờng số vi khuẩn yếu bị chết màng Petrifilm dịch khuẩn đƣợc đổ trực tiếp vào môi trƣờng nên nhận đƣợc môi trƣờng dinh dƣỡng để phục hồi phát triển 28 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Qua q trình lấy mẫu, phân tích so sánh phƣơng pháp nuôi cấy truyền thống phƣơng pháp nuôi cấy màng Petrifilm qua đối tƣợng tổng vi khuẩn hiếu khí Coliforms đạt đƣợc kết sau: Đối với độ đặc hiệu, hai phƣơng pháp có độ đặc hiệu tƣơng đƣơng Trên Petrifilm, phân biệt chủng dựa vào kích thƣớc khuẩn lạc, số lƣợng kích thƣớc bọt khí Trên VRB, phân biệt chủng dựa vào màu sắc, kích thƣớc khuẩn lạc Đối với giới hạn định lƣợng, phân tích Coliforms, hai phƣơng pháp có giới hạn định lƣợng (LOQ) tƣơng đƣơng Trên chủng thuần, Klebsiella (K2) có LOQ = 12,12 CFU/ml, E coli (E2) có LOQ = 4,24 CFU/ml Trên mẫu, K2 có LOQ = 12,12 CFU/g , E2 có LOQ = 42,4 CFU/g Trong phân tích tổng khuẩn hiếu khí, 2/3 mẫu phƣơng pháp phân tích mơi trƣờng PCA cho giới hạn định lƣợng tốt Trong tiêu độ lặp lại, Coliforms, kết cho thấy phƣơng pháp ni cấy màng Petrifilm có độ lặp lại tốt so với phƣơng pháp nuôi cấy môi trƣờng VRB (SrCC = 0,115, SrVRB = 0,170) Đối với tổng khuẩn hiếu khí, cho thấy phân tích màng Petrifilm có độ lặp lại tốt so với môi trƣờng PCA (SrAC= 0,139, Sr PCA = 0,170) Về nội dung thử phân tích, 15 mẫu có mẫu định lƣợng màng Petrifilm cho số khuẩn lạc cao hơn, điều có nghĩa so với phƣơng pháp nuôi cấy truyền thống phƣơng pháp màng Petrifilm có khả định lƣợng tốt Từ kết thu đƣợc kết luận phƣơng pháp ni cấy màng Petrifilm có hiệu cao, khả phân tích tốt, sử dụng để phân tích vi khuẩn tiết kiệm thời gian mà đạt đƣợc hiệu cao 5.2 Đề nghị Thực khảo sát đánh giá mở rộng đối tƣợng mẫu thực khác nhƣ: thủy sản, rau, sữa, nƣớc ngọt, nƣớc khoáng Tiến hành đánh giá hiệu lực thứ cấp qui trình phân tích Coliforms, tổng khuẩn hiếu khí phƣơng pháp Petrifilm để đến thống việc sử dụng phòng kiểm nghiệm vi sinh, làm sở để ban hành làm thành Tiêu chuẩn Việt Nam 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Nguyễn Tiến Dũng 2007 Phương pháp kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm Trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Ngọc Hải Nguyễn Thị Kim Loan, Thực hành nghiên cứu vi sinh vật Nhà xuất Nơng nghiệp Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Đức Lƣợng 2006 Thí nghiệm vi sinh vật học Nhà xuất Đại học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh Cao Thị Mai 2008 Đánh giá hiệu phân tích E.coli Coliform thủy hải sản phương pháp nuôi cấy Luận văn tốt nghiệp Kỹ sƣ Công nghệ Sinh học, Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Lê Văn Việt Mẫn 2008 Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm Nhà xuất Đại học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh Trần Cao Sơn 2010 Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh vật Nhà xuất khoa học kỹ thuật Hà Nội Trần Linh Thƣớc 2002 Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm Nhà xuất Giáo dục Trần Minh Tùng 2010 Khảo sát khả nhiễm Coliforms E.coli nước uống, nước uống có gas địa bàn quận Bình Thạnh, TP Hồ Chí Minh Luận văn tốt nghiệp Kỹ sƣ Công nghệ Sinh Học trƣờng Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh Lê Ngọc Bích Vƣơng 2010 Tổng quan vi sinh vật thị biện pháp kiểm soát vi sinh vật thực phẩm Luận văn tốt nghiệp Kỹ sƣ Công nghệ Sinh Học trƣờng Đại học Kỹ Thuật Cơng Nghệ Tp Hồ Chí Minh Tiếng Anh 10 Ashbolt, N.J Grabow, O.K Snozzi, M 2001 Indicators of microbial water quality In Water Quality: Guidelines, Standards and Health, IWA: Publishing London, World Health Organization (WHO), pp 289 – 316 30 11 ISO 16140 (2003), Microbiology of food and animal feeding stuffs – Protocol for the validation of alternative methods Tài liệu Internet 12 Nguyễn Minh Nam 2012 Đo lƣờng độ khơng đảm bảo phân tích vi sinh vật đánh giá hiệu lực phƣơng pháp http://www.docstoc.com/docs/88724803/dokhong-dam-bao-do-trong-pt-visinh-vat-(PowerPoint) 13/05/2012 13 Nguyễn Tiến Dũng 2011 Hướng dẫn phê duyệt phương pháp phân tích vi sinh http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/huong-dan-phe-duyet-phuong-phap-phan-tich-visinh.505424.html 12/04/2012 14 Lê Xuân Phƣơng 2008 Thí nghiệm vi sinh http://www.ntu.edu.vn/canbo/cucntk /privateres/canbo/cucntk/file/thinghiemvisinh.pdf.aspx 11/06/2012 31 PHỤ LỤC Phụ lục Môi trƣờng thuốc thử Dung dịch nƣớc muối pepton SPW (Saline Pepton Water) Dùng pha loãng chứa 8,5 g NaCl 1g pepton 1000 ml nƣớc Dung dịch đƣợc chứa bình chứa 0,5 - 1,0 lít, hấp khử trùng đƣợc phân phối thành thể tích xác ml vào ống nghiệm vô trùng Thành phần gồm g peptone, 8,5 g NaCl, 1000 ml nƣớc cất Môi trƣờng Plate Count agar Môi trƣờng đƣợc pha chế, phân phối vào bình thuỷ tinh hay ống nghiệm hấp khử trùng 121oC 15 phút Các bình ống nghiệm chứa môi trƣờng chƣa sử dụng đƣợc bảo quản tủ lạnh - 8oC Trƣớc sử dụng môi trƣờng phải đƣợc đun chảy làm nguội 45oC bể điều nhiệt Thành phần gồm g tryptone, 2,5 g cao nấm men, g glucose, 15 g agar, nƣớc cất vừa đủ 1000 ml, pH sau trùng 7.0 ± 0.2, hấp trùng 121oC/15 phút Môi trƣờng trypton Soya agar Tryptone Soya Agar ( TSA) đƣợc chuẩn bị bình hay chai thủy tinh, khử trùng nhiệt độ 121oC 15 phút nồi hấp Bảo quản nhiệt độ - 8oC Trƣớc sử dụng, môi trƣờng đƣợc đun chảy làm nguội 45oC bể điều nhiệt Thành phần gồm 15 g Trypticase peptone, g Phytonepeptone, g NaCl , 15 g agar, 1000 ml cƣớc cất Môi trƣờng Violet Red Agar (VRB) Đƣợc chuẩn bị vô trùng chai thủy tinh, đun chảy làm nguội nhiệt độ 45oC bể ủ nhiệt trƣớc sử dụng Có thể sử dụng mơi trƣờng khác nhƣ Deoxycholate agar đƣợc chuẩn bị nhƣ Thành phần: g cao nấm men, g peptone, g NaCl, 1,5 g muối mật , 10 g lactose, 0,03 g Neutral Red, 0,002 g Crystal Violet, 18 g agar, 1000 ml nƣớc cất 32 Môi trƣờng Brilliant Green Bile Lactose Broth (BGBL) Đƣợc phân phối vào ống nghiệm, ống 10 ml có ống Durham đặt ngƣợc bên Khử trùng 121oC 15 phút Sau khử trùng phải đảm bảo khong có bọt khí ống Durham ngƣợc Thành phần: 10 g peptone, 10 g lactose, 20 g mật bò, 0,0133 g Brilliant Green, 1000 ml nƣớc cất Canh trypton: Đƣợc phân phối vào ống nghiệm, ống ml Môi trƣờng khử trùng 121oC 15 phút Thành phần: 20 g tryptone, g NaCl, 1000 ml nƣớc cất Màng 3M Petrifilm cho Coliforms Thành phần: cao men, gelatin, muối mật, pepton, lactose, Natri Chlorua, Crystal Violet, Neutral Red, Guar Gum, 2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride Mô tả: đĩa sẵn có mơi trƣờng Violet Red Bile (VRB), Gel hòa tan nƣớc lạnh Chất thị cho hoạt tính Glucuronodase (5-bromo-4chloro-3indolyl-ß-D Glucoronidase) Tetrazolium, chất thị để đếm khuẩn lạc Thuốc thử Kovac’s Thuốc thử Kovac’s: hoà tan g p-dimethylaminobenzaldehyde hỗn hợp gồm 75 ml amyl alcohol 25 ml H2SO4 đậm đặc Chất thị methyl red Thành phần: 0,2 g methyl red, 600 ml ethanol 95%, 1000 ml nƣớc cất Hòa tan methyl red ethanol 95% Thêm nƣớc cất thể tích quy định 10 Thuốc thử Voges- Prokauer Dung dịch alpha napthol cồn : g alpha napthol vào ethanol 95% Dung dịch KOH: hòa tan 40 g KOH 100 ml nƣớc cất 33 Phụ lục Bảng 4.1 Kết thử sinh hóa chủng Coliforms Stt Indol MR VP Citrate Kết luận - + - + Citrobacter - - + + Enterobacter Chọn Klebsiella - - + + Enterobacter Klebsiella - - + + Enterobacter En1 En3 En2 Klebsiella - - + + Enterobacter Klebsiella + + - - E coli + + - - E coli + + + - Tạp - - + + Enterobacter Klebsiella 10 + + - - E coli 11 + + - - E coli 12 - - + + Enterobacter Klebsiella 13 - - + + Enterobacter K1 Klebsiella 14 + + - - E coli 15 + + - - E coli 16 - - + + Enterobacter Klebsiella 17 + + - - E coli 18 + + - - E coli 19 + + - - E coli 34 K2 Bảng 4.1tt Kết thử sinh hóa chủng Coliforms Stt Indol MR VP Citrate Kết luận 20 - + - - E coli 21 + + - - E coli 22 + + - - E coli 23 + + - - E coli 24 - - + + Enterobacter Chọn K3 Klebsiella 25 - - + + Enterobacter Klebsiella 26 - - + + Enterobacter Klebsiella 27 - - + + Enterobacter K4 Klebsiella 28 + + - - E coli 29 + + - - E coli 30 + + - - E coli 31 - + - + Citrobacter C1 32 + + - + Citrobacter C4 33 - + - + Citrobacter C2 34 + + - + Citrobacter C3 35 + + - - E coli E2 36 - - + + E coli 37 + + - - E coli E3 38 + + - - E coli E1 39 - - + + E coli 40 + + - - E coli 35 E4 Bảng Kết giới hạn định lƣợng vi khuẩn hiếu khí màng Petrifilm môi trƣờng PCA lần ACP PCA (a - )2 b b- 1 -0,9 0,81 0 2,1 4,41 0 1,1 1,21 1 0,1 0,01 0 -0,9 0,81 -1 1 -0,9 0,81 -1 1 -0,9 0,81 1 1,1 1,21 0 0,1 0,01 -1 1 1,1 1,21 a a- a= ∑( a – )2 = = 1,9 ( b - )2 ∑( b – So = 0,816; LC = 3,346 So = 1,120; LC = 3,748 LOD = 4,693; LOQ = 10,16 LOD = 5,596; LOQ = 13,1 )2 = 11,3 ACP phương pháp nuôi cấy màng petrifilm Aerobic Count Plate PCA Phương pháp nuôi cấy môi trường PCA 36 Bảng Kết giới hạn định lƣợng vi khuẩn hiếu khí màng Petrifilm mơi trƣờng PCA lần AC PCA (a – )2 b -0,5 0,25 0,6 0,36 -0,5 0,25 0,6 0,36 -0,5 0,25 -0,4 0,16 1,5 2,25 -0,4 0,16 -0,5 0,25 -0,4 0,16 0,5 0,25 -0,4 0,16 0,5 0,25 0,6 0,36 -0,5 0,25 -0,4 0,16 -0,5 0,25 0,6 0,36 0,5 0,25 -0,4 0,16 a a- = 0,5 ∑(a– )2 = 4,5 (b - )2 b- = 0,4 ∑(b– So = 0,707; LC = 1,667 So = 0,516; LC = 1,252 LOD = 2,833; LOQ = 7,570 LOD = 2,104; LOQ = 5,516 )2 = 2,4 AC Phương pháp nuôi cấy màng petrifilm Aerobic Count Plate PCA Phương pháp nuôi cấy môi trường PCA 37 Bảng Kết giới hạn định lƣợng vi khuẩn hiếu khí màng petrifilm mơi trƣờng PCA lần AC PCA (a - )2 b b- b ( b - )2 0 0,1 0,01 1 -0,9 0,81 0 -0,9 0,81 -1 -0,9 0,81 -1 1 0,1 0,01 0 0,1 0,01 0 0,1 0,01 -1 1,1 1,21 1 0,1 0,01 1 1,1 1,21 a a- =1 ∑ (a – )2 = = 0,9 So = 0,816; LC = 2,346 So = 0,738; LC = 2,118 LOD = 3,693; LOQ = 9,16 LOD = 3,335; LOQ = 8,28 (b – )2 = 4,9 AC Phương pháp nuôi cấy màng petrifilm Aerobic Count Plate PCA Phương pháp nuôi cấy môi trường PCA 38 Bảng Kết độ lặp lại phân tích tổng khuẩn hiếu khí với mẫu 1, mẫu 2, mẫu 3, mẫu Số khuẩn lạc xuất đĩa Mẫu Stt Mẫu Mẫu Mẫu AC PCA AC PCA AC PCA AC PCA 21 20 20 10 84 121 41 19 12 12 18 10 105 105 39 21 12 13 15 10 49 19 46 24 16 15 19 10 32 13 55 37 13 12 22 14 24 18 46 36 16 13 23 25 39 26 54 35 17 20 14 35 21 34 23 11 11 18 16 21 14 21 26 10 10 11 42 23 44 39 10 20 23 16 43 26 52 34 1,158 1,157 1,236 1,050 1,624 1,441 1,622 1,455 ∑(xi - )2 0,110 0,138 0,084 0,224 0,424 1,024 0,129 0,120 Sr 0,111 0,124 0,097 0,158 0,217 0,337 0,200 0,115 AC Phương pháp nuôi cấy màng petrifilm Aerobic Count Plate PCA Phương pháp nuôi cấy môi trường PCA 39 Bảng Kết độ lặp lại phân tích tổng khuẩn hiếu khí với mẫu 5, mẫu 6, mẫu 7, mẫu Số khuẩn lạc xuất đĩa Stt Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu AC PCA AC PCA AC PCA AC PCA 93 79 16 18 31 34 19 16 90 64 19 19 34 34 27 18 80 56 16 14 42 41 19 12 78 58 18 14 39 48 17 14 82 66 24 22 41 47 32 17 87 74 28 16 36 35 26 23 88 70 23 19 37 40 33 17 86 60 19 22 39 57 44 39 98 86 20 17 38 56 24 23 10 97 75 21 20 44 50 44 25 1,943 1,834 1,303 1,253 1,579 1,483 1,312 1,286 ∑(xi - )2 0,01 0,034 0,054 0,046 0,018 0,305 0,338 0,193 Sr 0,033 0,061 0,077 0,071 0,045 0,184 0,194 0,146 AC Phương pháp nuôi cấy màng petrifilm Aerobic Count Plate PCA Phương pháp nuôi cấy môi trường PCA 40 ... thị Coopmart quận Thủ Đức Thành Phố Hồ Chí Minh 3.2.2 Thi t bị dụng cụ Nghiên cứu sử dụng số thi t bị, dụng cụ phòng thí nghiệm vi sinh nhƣ: Thi t bị: tủ ủ Stuart Scientific (Anh), cân phân tích... lọc hay phân biệt nhóm vi sinh vật với 2.4 Kỹ thuật ni cấy màng Petrifilm 2.4.1 Giới thi u chung màng Petrifilm Thi t kế cách cố định môi trƣờng dinh dƣỡng dạng đông khô vào màng mỏng gọi Petrifilm... Giới thi u test thử nhanh 3M Petrifilm 3M petrifilm loại đĩa môi trƣờng đông khô chuẩn bị sẵn để nuôi cấy đếm vi khuẩn, nấm Bao gồm: gel tan đông đặc nhanh nƣớc lạnh, chất dinh dƣỡng cần thi t