Điện di mao quản là phương pháp được các nhà nghiên cứu chú ý, nhất là trong lĩnh vực tách các đồng phân quang học với nhiều lý do: lượng mẫu sử dụng rất ít, dung môi sử dụng trong quá trình phân tích chỉ là dung dịch đệm do đó không ảnh hưởng môi trường, sự phân tách các thành phần quang học đạt được chỉ cần thêm một lượng nhỏ tác nhân đối quang vào dung dịch điện ly nền. Các tác nhân đối quang thường được sử dụng là các dạng , , cyclodextrin, các dẫn chất của cyclodextrin, protein, ….Trong bài báo này chúng tôi giới thiệu kết quả phân tách hỗn hợp racemic của propranolol bằng phương pháp điện di mao quản với tác nhân đối quang là cyclodextrin và dẫn chất hydroxyalkyl cyclodextrin: 2O(hydroxypropyl)cyclodextrin (HPCD), 2O(2hydroxybutyl)cycylodextrin (HBCD).
Trang 1ỨNG DỤNG CÁC TÁC NHÂN ĐỐI QUANG HYDROXYALKYL BETA-CYCLODEXTRIN TRONG PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC PROPRANOLOL BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN
Lê Thị Thu Cúc 1 , Nguyễn Ngọc Vinh 1 , Trần Nguyễn Quỳnh Trang 2 Đặng Văn Tịnh 2 , Nguyễn Đức Tuấn 2*
1 Viện Kiểm nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh
2 Khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh
1 Đặt vấn đề
Điện di mao quản là phương pháp được các nhà nghiên cứu chú ý, nhất là trong lĩnh vực tách các đồng phân quang học với nhiều lý do: lượng mẫu sử dụng rất ít, dung môi sử dụng trong quá trình phân tích chỉ là dung dịch đệm do đó không ảnh hưởng môi trường, sự phân tách các thành phần quang học đạt được chỉ cần thêm một lượng nhỏ tác nhân đối quang vào dung dịch điện ly nền
của cyclodextrin, protein, ….Trong bài báo này chúng tôi giới thiệu kết quả phân tách hỗn hợp racemic của propranolol bằng phương pháp điện di mao quản với tác nhân đối quang là β-cyclodextrin và dẫn chất hydroxyalkyl β-cyclodextrin: 2-O-(hydroxypropyl)-β-cyclodextrin (HP-β-CD), 2-O-(2-hydroxybutyl)-β-cycylodextrin (HB-β-CD)
2 Nguyên liệu và phương pháp
2.1 Chất đối chiếu, trang thiết bị, dung môi và hóa chất
2.1.1 Chất đối chiếu
Propranolol hydroclorid - Số lô: QT118010903 - Viện Kiểm nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh, hàm lượng 99,75%; độ ẩm 0,13%
2.1.2 Trang thiết bị
nung chảy, đường kính trong 50 µm, chiều dài tổng cộng 64 cm, chiều dài hiệu quả 55,5 cm
2.1.3 Dung môi và hóa chất
(HB-β-CD) đã được tổng hợp tại Viện Kiểm nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh, beta-cyclodextrin (β-CD) (Merck) Methanol đạt tiêu chuẩn dùng cho sắc ký lỏng (Merck) Tris (hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS) và acid phosphoric đậm đặc đạt tiêu chuẩn phân tích (Merck)
2.2 Đối tượng nghiên cứu
Viên nén APO propranolol (propranolol hydroclorid 40 mg), số lô: HN1684, hạn dùng: 10/2012, nhà sản xuất: Canada
2.3 Phương pháp nghiên cứu
dụng β-CD, HP-β-CD, HB-β-CD làm tác nhân đối quang thêm vào dung dịch điện ly nền và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách như pH và nồng độ dung dịch điện ly nền, nồng độ tác nhân đối quang, nồng độ dung môi hữu cơ thêm vào dung dịch điện ly nền
đúng, độ lặp lại, tính tuyến tính và tính đặc hiệu
Trang 2Dung dịch mẫu đối chiếu: cân chính xác khoảng 50 mg propranolol hydroclorid, cho vào bình
định mức 100 ml, hòa tan trong 20 ml methanol, sau đó thêm nước cất khử khoáng vừa đủ thể tích, lắc đều Lấy chính xác 5 ml dung dịch trên, cho vào bình định mức 50 ml, thêm nước cất khử khoáng vừa đủ thể tích, lắc đều Lọc qua màng lọc millipore 0,2 µm
Dung dịch mẫu thử: cân 20 viên, xác định khối lượng trung bình của một viên, nghiền thành
bột mịn Cân một lượng bột viên tương ứng 50 mg propranolol hydroclorid, cho vào bình định mức 100 ml, thêm 20 ml methanol, lắc kỹ, sau đó thêm khoảng 70 ml nước cất khử khoáng, siêu âm khoảng 15 phút, để nguội, thêm nước cất khử khoáng vừa đủ thể tích, lắc đều Lọc qua giấy lọc (loại bỏ 20 ml dịch lọc đầu) Lấy chính xác 5 ml dịch lọc, cho vào bình định mức 50 ml, thêm nước cất khử khoáng vừa đủ thể tích, lắc đều Lọc qua màng lọc millipore 0,2 µm
Dung dịch mẫu trắng: được chuẩn bị tương tự mẫu thử nhưng không có chất khảo sát.
3 Kết quả và bàn luận
3.1 Khảo sát điều kiện phân tích
3.1.1 Ảnh hưởng pH và nồng độ của dung dịch điện ly nền
Hình 1 Ảnh hưởng pH dung dịch điện ly nền
trên độ phân giải đồng phân propranolol.
Điều kiện điện di: cột mao quản 64 cm (55,5
ly nền TRIS 50 mM có giá trị pH khác nhau.
Hình 2 Ảnh hưởng nồng độ dung dịch điện
ly nền trên độ phân giải đồng phân
propranolol Điều kiện điện di: cột mao
các dung dịch điện ly nền TRIS pH 2,5 có
nồng độ khác nhau
3.1.2 Ảnh hưởng nồng độ tác nhân đối quang và nồng độ dung môi hữu cơ
Khảo sát ảnh hưởng nồng độ HB β-CD (trong dung dịch TRIS 50 mM, pH 2,5) ở các giá trị
10 mM, 20 mM, 30 mM và hiệu quả tách khi có sự hiện diện của methanol
Trang 3Hình 3 Ảnh hưởng nồng độ HB β-CD trên độ
phân giải đồng phân propranolol Điều kiện
điện di: cột mao quản 64 cm (55,5 cm) x 50
µm, 25oC, 20 kV, 50 mbar x 5giây, 214 nm,
dung dịch điện ly nền TRIS 50 mM pH 2,5.
Hình 4 Ảnh hưởng nồng độ methanol trên độ
phân giải đồng phân propranolol Điều kiện
điện di: cột mao quản 64 cm (55,5 cm) x 50
µm, 25oC, 20 kV, 50 mbar x 5giây, 214 nm, 20mM HB β-CD, các dung dịch điện ly nền TRIS 50 mM pH 2,5 có nồng độ methanol khác nhau
Nhận xét:
dung dịch điện ly nền có pH 2,5 (hình 1) và nồng độ TRIS 50 mM (hình 2)
phân
3.1.3 Ảnh hưởng của β-CD, HP-β-CD, HB-β-CD trên khả năng tách hỗn hợp racemic của propranolol.
Hình 5 Ảnh hưởng các tác nhân đối quang trên độ phân giải của đồng phân propranolol Điều kiện điện di: cột mao quản 64 cm (55,5 cm) x 50 µm, 25oC, 20 kV, 50 mbar x 5 giây,
214 nm, các dung dịch điện ly nền TRIS 50 mM có giá trị pH 2,5: (a) 20 mM β-CD (Rs = 0), (b) 20 mM HP β-CD (Rs = 0,94), (c) 20 mM HB β-CD (Rs = 1,21)
3.1.4 Khả năng tách đồng phân propranolol với tác nhân HP β-CD và sự hiện diện của methanol
21,
357
26, 597 2
0, 7 1 2
26 ,2 13
Trang 4Hình 6 Ảnh hưởng nồng độ HP β -CD trên độ phân giải của đồng phân propranolol Điều
kiện điện di: cột mao quản 64 cm (55,5 cm) x 50 µm, 25oC, 20 kV, 50 mbar x 5 giây, 214 nm, dung dịch điện ly nền TRIS-phosphat 50 mM giá trị pH 2,5 và 20% methanol (a) 10mM HP
3.1.5 Khả năng tách đồng phân propranolol với tác nhân β-CD và sự hiện diện của methanol
Hình 7 Ảnh hưởng nồng độ β-CD trên độ
phân giải đồng phân propranolol Điều kiện
điện di: cột mao quản 64 cm (55,5 cm) x 50
µm, 25oC, 20 kV, 50 mbar x 5giây, 214 nm,
dung dịch điện ly nền TRIS 50 mM pH 2,5 có
10% methanol
Hình 8 Ảnh hưởng nồng độ β-CD trên độ
phân giải đồng phân propranolol Điều kiện
điện di: cột mao quản 64 cm (55,5 cm) x 50
µm, 25oC, 20 kV, 50 mbar x 5giây, 214 nm,
dung dịch điện ly nền TRIS 50 mM pH 2,5 có
20% methanol Nhận xét:
khoang sơ nước của β-CD linh động hơn Do đó, tính chọn lọc đối với đồng phân propranolol của tác nhân HP β-CD, HB β-CD cao hơn β-CD
Điều kiện điện di 1: cột mao quản 64 cm (55,5 cm) x 50 µm, 25oC, 20 kV, 50 mbar x 5giây,
Điều kiện điện di 2: cột mao quản 64 cm (55,5 cm) x 50 µm, 25oC, 20 kV, 50 mbar x 5giây,
Trang 5Hình 9 Điện di đồ hỗn hợp racemic của
propranolol đối chiếu Điều kiện điện di 1
Hình 10 Điện di đồ hỗn hợp racemic của propranolol trong mẫu thử Điều kiện điện
di 1
Hình 11 Điện di đồ hỗn hợp racemic của
propranolol đối chiếu Điều kiện điện di 2
Hình 12 Điện di đồ hỗn hợp racemic của propranolol trong mẫu thử Điều kiện điện
di 2 3.2 Khảo sát tính tương thích hệ thống
Bảng 1 Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống của phương pháp (n=6)
Mẫu propranolol Đồng phân
phân giải
phân giải
Thời gian
di chuyển CorrArea Thời gian di chuyển CorrArea
min
5 15 20 25 30 35 40
0
2
4
6
8
Pr op r
an olo
l
Pr o pr a
n ol ol
72
10
38 ,8 20
min
5 15 20 25 30 35 40 0
2 4 6 8
Pr op
r an olo
l
Pr o pr
a n ol ol
mAU
38 ,5 60
10
39 ,1 75
5 15 20 25 30 35 40
0
2
4
6
8
Pr op
r an olo
l
Pr o pr
a n ol ol
41
10
38 ,3 25
min
min
5 15 20 25 30 35 40 0
2 4 6 8
Pr op r an olo
l
Pr o pr a n ol ol
30 38, 78 2
10
Trang 6Kết quả thống kê cho thấy, sau 6 lần điện di thông số CorrArea và thời gian di chuyển có RSD
< 2%; giá trị độ phân giải lớn hơn 1,5 Vậy phương pháp đạt tính tương thích hệ thống
3.3 Thẩm định phương pháp
3.3.1 Tính đặc hiệu
Tiến hành điện di mẫu trắng, mẫu đối chiếu và mẫu thử theo điều kiện điện di 1 và 2 Kết quả cho thấy mẫu trắng không có pic trùng với pic chất phân tích Điện di đồ mẫu thử giống điện
di đồ mẫu đối chiếu Khi thêm chất đối chiếu propranolol vào mẫu thử thì diện tích pic của chất thêm vào tăng Phổ tử ngoại tại thời gian lưu của các pic trong mẫu thử giống phổ tử ngoại của mẫu đối chiếu Độ tinh khiết của các pic lớn hơn 99% Hai pic của hai dạng đồng phân có phổ UV-Vis giống nhau Vậy phương pháp có tính đặc hiệu
3.3.2 Độ đúng, độ lặp lại và khoảng tuyến tính
Bảng 2 Kết quả khảo sát độ đúng, độ lặp lại và khoảng tuyến tính
Pic đồng phân 1 Pic đồng phân 2
HP β-CD
R 2 = 0,9990
y = 0,0024x + 0,0015
R 2 = 0,9991
HB β
-CD
R 2 = 1
y = 0,0024x – 0,0007
R 2 = 0,9999
R TB : tỷ lệ hồi phục trung bình.
Kết quả thống kê cho thấy tỷ lệ hồi phục nằm trong giới hạn cho phép của tỷ lệ hồi phục lý thuyết (98% - 102%) và RSD < 3% đối với độ lặp lại Qui trình phân tích có khoảng tuyến tính rộng với hệ số tương quan cao
4 Kết luận
Bằng phương pháp điện di mao quản, chúng tôi đã khảo sát được một số điều kiện ảnh hưởng đến quá trình tách hai dạng đồng phân trong hỗn hợp racemic của propranolol với việc ứng dụng β-CD và hydroxyalkyl β-CD (HP β-CD, HB β-CD) làm tác nhân đối quang Đã xây dựng quy trình xác định hai dạng đồng phân quang học của propranolol với hai tác nhân HP β-CD và HB β-CD Qui trình này có tính đặc hiệu, cho kết quả chính xác và có tính lặp lại
Tài liệu tham khảo
1 United States Pharmacopoeia XXVI NF 21 – CD-Rom
electrophoresis using ionic and neutral polysacchaides as chiral selectors”, Journal of
chromatography A.735, pp 345- 351.
Applications of chiral Capillary Electrophoresis”, Beckman, pp.24 -30.
electrophoresis” Journal of Chromatography A, 735, pp.77 - 121.
Trang 75 Yunhe Wei, Jian Li, Chenfu Zhu, Aiyou Hao, and Minggang Zhao
Separation of Chiral Drugs”,