Đang tải... (xem toàn văn)
Điện di mao quản là phương pháp được các nhà nghiên cứu chú ý, nhất là trong lĩnh vực tách các đồng phân quang học với nhiều lý do: lượng mẫu sử dụng rất ít, dung môi sử dụng trong quá trình phân tích chỉ là dung dịch đệm do đó không ảnh hưởng môi trường, sự phân tách các thành phần quang học đạt được chỉ cần thêm một lượng nhỏ tác nhân đối quang vào dung dịch điện ly nền. Các tác nhân đối quang thường được sử dụng là các dạng , , cyclodextrin, các dẫn chất của cyclodextrin, protein, ….Trong bài báo này chúng tôi giới thiệu kết quả phân tách hỗn hợp racemic của propranolol bằng phương pháp điện di mao quản với tác nhân đối quang là cyclodextrin và dẫn chất hydroxyalkyl cyclodextrin: 2O(hydroxypropyl)cyclodextrin (HPCD), 2O(2hydroxybutyl)cycylodextrin (HBCD).
ỨNG DỤNG CÁC TÁC NHÂN ĐỐI QUANG HYDROXYALKYL BETACYCLODEXTRIN TRONG PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC PROPRANOLOL BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN Lê Thị Thu Cúc1, Nguyễn Ngọc Vinh1, Trần Nguyễn Quỳnh Trang , Đặng Văn Tịnh2, Nguyễn Đức Tuấn2* Viện Kiểm nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh Khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Đặt vấn đề Điện di mao quản phương pháp nhà nghiên cứu ý, lĩnh vực tách đồng phân quang học với nhiều lý do: lượng mẫu sử dụng ít, dung mơi sử dụng q trình phân tích dung dịch đệm khơng ảnh hưởng môi trường, phân tách thành phần quang học đạt cần thêm lượng nhỏ tác nhân đối quang vào dung dịch điện ly Các tác nhân đối quang thường sử dụng dạng α, β, γ -cyclodextrin, dẫn chất cyclodextrin, protein, ….Trong báo giới thiệu kết phân tách hỗn hợp racemic propranolol phương pháp điện di mao quản với tác nhân đối quang β-cyclodextrin dẫn chất hydroxyalkyl β-cyclodextrin: 2-O-(hydroxypropyl)-βcyclodextrin (HP-β-CD), 2-O-(2-hydroxybutyl)-β-cycylodextrin (HB-β-CD) Nguyên liệu phương pháp 2.1 Chất đối chiếu, trang thiết bị, dung mơi hóa chất 2.1.1 Chất đối chiếu Propranolol hydroclorid - Số lô: QT118010903 - Viện Kiểm nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh, hàm lượng 99,75%; độ ẩm 0,13% 2.1.2 Trang thiết bị Máy điện di mao quản Hewlett Packard3DCE, đầu dò dãy diod quang Cột mao quản silica nung chảy, đường kính 50 µm, chiều dài tổng cộng 64 cm, chiều dài hiệu 55,5 cm 2.1.3 Dung mơi hóa chất 2-O-(2-hydroxypropyl)-β-cyclodextrin (HP-β-CD) 2-O-(2-hydroxybutyl)-β-cycylodextrin (HB-β-CD) tổng hợp Viện Kiểm nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh, betacyclodextrin (β-CD) (Merck) Methanol đạt tiêu chuẩn dùng cho sắc ký lỏng (Merck) Tris (hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS) acid phosphoric đậm đặc đạt tiêu chuẩn phân tích (Merck) 2.2 Đối tượng nghiên cứu Viên nén APO propranolol (propranolol hydroclorid 40 mg), số lô: HN1684, hạn dùng: 10/2012, nhà sản xuất: Canada 2.3 Phương pháp nghiên cứu • Trong đề tài này, để tách đồng phân propranolol hỗn hợp racemic, ứng dụng β-CD, HP-β-CD, HB-β-CD làm tác nhân đối quang thêm vào dung dịch điện ly khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình tách pH nồng độ dung dịch điện ly nền, nồng độ tác nhân đối quang, nồng độ dung môi hữu thêm vào dung dịch điện ly • Xây dựng quy trình tách đồng phân propranolol • Khảo sát tính tương thích hệ thống thẩm định qui trình phân tích qua việc khảo sát độ đúng, độ lặp lại, tính tuyến tính tính đặc hiệu Chuẩn bị mẫu Dung dịch mẫu đối chiếu: cân xác khoảng 50 mg propranolol hydroclorid, cho vào bình định mức 100 ml, hòa tan 20 ml methanol, sau thêm nước cất khử khống vừa đủ thể tích, lắc Lấy xác ml dung dịch trên, cho vào bình định mức 50 ml, thêm nước cất khử khoáng vừa đủ thể tích, lắc Lọc qua màng lọc millipore 0,2 µm Dung dịch mẫu thử: cân 20 viên, xác định khối lượng trung bình viên, nghiền thành bột mịn Cân lượng bột viên tương ứng 50 mg propranolol hydroclorid, cho vào bình định mức 100 ml, thêm 20 ml methanol, lắc kỹ, sau thêm khoảng 70 ml nước cất khử khoáng, siêu âm khoảng 15 phút, để nguội, thêm nước cất khử khoáng vừa đủ thể tích, lắc Lọc qua giấy lọc (loại bỏ 20 ml dịch lọc đầu) Lấy xác ml dịch lọc, cho vào bình định mức 50 ml, thêm nước cất khử khống vừa đủ thể tích, lắc Lọc qua màng lọc millipore 0,2 µm Dung dịch mẫu trắng: chuẩn bị tương tự mẫu thử chất khảo sát Kết bàn luận 3.1 Khảo sát điều kiện phân tích 3.1.1 Ảnh hưởng pH nồng độ dung dịch điện ly Hình Ảnh hưởng pH dung dịch điện ly độ phân giải đồng phân propranolol Điều kiện điện di: cột mao quản 64 cm (55,5 cm) x 50 µm, 25oC, 20 kV, 50 mbar x giây, 214 nm, 10 mM HB β-CD, dung dịch điện ly TRIS 50 mM có giá trị pH khác Hình Ảnh hưởng nồng độ dung dịch điện ly độ phân giải đồng phân propranolol Điều kiện điện di: cột mao quản 64 cm (55,5 cm) x 50 µm, 25oC, 20 kV, 50 mbar x giây, 214 nm, 10 mM HB β-CD, dung dịch điện ly TRIS pH 2,5 có nồng độ khác 3.1.2 Ảnh hưởng nồng độ tác nhân đối quang nồng độ dung môi hữu Khảo sát ảnh hưởng nồng độ HB β-CD (trong dung dịch TRIS 50 mM, pH 2,5) giá trị 10 mM, 20 mM, 30 mM hiệu tách có diện methanol Hình Ảnh hưởng nồng độ HB β-CD độ phân giải đồng phân propranolol Điều kiện điện di: cột mao quản 64 cm (55,5 cm) x 50 µm, 25oC, 20 kV, 50 mbar x 5giây, 214 nm, dung dịch điện ly TRIS 50 mM pH 2,5 Hình Ảnh hưởng nồng độ methanol độ phân giải đồng phân propranolol Điều kiện điện di: cột mao quản 64 cm (55,5 cm) x 50 µm, 25oC, 20 kV, 50 mbar x 5giây, 214 nm, 20mM HB β-CD, dung dịch điện ly TRIS 50 mM pH 2,5 có nồng độ methanol khác Nhận xét: • Khi pH dung dịch điện ly tăng độ phân giải giảm Khả tách đạt cao dung dịch điện ly có pH 2,5 (hình 1) nồng độ TRIS 50 mM (hình 2) • Methanol thêm vào dung dịch điện ly để tăng độ phân giải hai pic đồng phân 3.1.3 Ảnh hưởng β-CD, HP-β-CD, HB-β-CD khả tách hỗn hợp racemic propranolol 26 ,2 13 a c 21, 21, 063 357 b 26, 597 0, Hình Ảnh hưởng tác nhân đối quang độ phân giải đồng phân propranolol Điều kiện điện di: cột mao quản 64 cm (55,5 cm) x 50 µm, 25oC, 20 kV, 50 mbar x giây, 214 nm, dung dịch điện ly TRIS 50 mM có giá trị pH 2,5: (a) 20 mM β-CD (Rs = 0), (b) 20 mM HP β-CD (Rs = 0,94), (c) 20 mM HB β-CD (Rs = 1,21) 3.1.4 Khả tách đồng phân propranolol với tác nhân HP β-CD diện methanol Rs =1, 73 c Rs =1, 39 b a Rs =1, 08 Hình Ảnh hưởng nồng độ HP β-CD độ phân giải đồng phân propranolol Điều kiện điện di: cột mao quản 64 cm (55,5 cm) x 50 µm, 25oC, 20 kV, 50 mbar x giây, 214 nm, dung dịch điện ly TRIS-phosphat 50 mM giá trị pH 2,5 20% methanol (a) 10mM HP β-, (b) 20 mM HP β-CD (c) 30 mM HP β-CD 3.1.5 methanol Khả tách đồng phân propranolol với tác nhân β-CD diện Hình Ảnh hưởng nồng độ β-CD độ phân giải đồng phân propranolol Điều kiện điện di: cột mao quản 64 cm (55,5 cm) x 50 µm, 25oC, 20 kV, 50 mbar x 5giây, 214 nm, dung dịch điện ly TRIS 50 mM pH 2,5 có 10% methanol Hình Ảnh hưởng nồng độ β-CD độ phân giải đồng phân propranolol Điều kiện điện di: cột mao quản 64 cm (55,5 cm) x 50 µm, 25oC, 20 kV, 50 mbar x 5giây, 214 nm, dung dịch điện ly TRIS 50 mM pH 2,5 có 20% methanol Nhận xét: • Với tác nhân β-CD khả tách đồng phân propranolol • Sự thay đổi hóa học nhóm 2-hydroxy β-CD với nhóm hydroxyalkyl làm cho khoang sơ nước β-CD linh động Do đó, tính chọn lọc đồng phân propranolol tác nhân HP β-CD, HB β-CD cao β-CD • Qua khảo sát, chọn hai điều kiện tách đồng phân với hai tác nhân HP β-CD, HB β-CD Điều kiện điện di 1: cột mao quản 64 cm (55,5 cm) x 50 µm, 25oC, 20 kV, 50 mbar x 5giây, 214 nm, dung dịch điện ly TRIS 50 mM pH 2,5 có 20% methanol, 20 mM HB β-CD Điều kiện điện di 2: cột mao quản 64 cm (55,5 cm) x 50 µm, 25oC, 20 kV, 50 mbar x 5giây, 214 nm, dung dịch điện ly TRIS 50 mM pH 2,5 có 20% methanol, 30 mM HP β-CD Pr opr an olo Pr o pr a n ol ol l Pr opr an olo l mAU Pr o pr a n ol ol 3838 ,8 ,1 2072 38,38 78 ,1 30 mAU 2 0 10 15 20 25 30 40 35 10 15 20 25 30 40 35 min l Pr opr an olo 2 0 10 15 20 25 30 35 40 Hình 11 Điện di đồ hỗn hợp racemic propranolol đối chiếu Điều kiện điện di l Pr o pr a n ol ol mAU Pr opr an olo 38 38 ,3 ,7 25 41 mAU Hình 10 Điện di đồ hỗn hợp racemic propranolol mẫu thử Điều kiện điện di 3938 ,1 ,5 7560 Hình Điện di đồ hỗn hợp racemic propranolol đối chiếu Điều kiện điện di 10 15 20 25 30 35 Pr o pr a n ol ol 40 Hình 12 Điện di đồ hỗn hợp racemic propranolol mẫu thử Điều kiện điện di 3.2 Khảo sát tính tương thích hệ thống Bảng Kết khảo sát tính tương thích hệ thống phương pháp (n=6) HP β-CD HB β-CD Đồng phân RSD (%) Độ RSD (%) Độ Mẫu propranolol Thời gian CorrArea phân Thời gian CorrArea phân giải di chuyển giải di chuyển Pic đồng phân 0,863 0,239 0,553 0,721 Chuẩn 1,73 1,83 Pic đồng phân 0,867 0,476 0,553 0,308 Pic đồng phân 0,239 0,206 0,728 0,390 Thử 1,76 1,82 Pic đồng phân 0,241 0,167 0,735 0,319 Kết thống kê cho thấy, sau lần điện di thông số CorrArea thời gian di chuyển có RSD < 2%; giá trị độ phân giải lớn 1,5 Vậy phương pháp đạt tính tương thích hệ thống 3.3 Thẩm định phương pháp 3.3.1 Tính đặc hiệu Tiến hành điện di mẫu trắng, mẫu đối chiếu mẫu thử theo điều kiện điện di Kết cho thấy mẫu trắng khơng có pic trùng với pic chất phân tích Điện di đồ mẫu thử giống điện di đồ mẫu đối chiếu Khi thêm chất đối chiếu propranolol vào mẫu thử diện tích pic chất thêm vào tăng Phổ tử ngoại thời gian lưu pic mẫu thử giống phổ tử ngoại mẫu đối chiếu Độ tinh khiết pic lớn 99% Hai pic hai dạng đồng phân có phổ UV-Vis giống Vậy phương pháp có tính đặc hiệu 3.3.2 Độ đúng, độ lặp lại khoảng tuyến tính Bảng Kết khảo sát độ đúng, độ lặp lại khoảng tuyến tính Phương trình hồi qui HP β-CD Khoảng tuyến tính (µg/ml) Độ lặp lại (n=6) Độ (n=9) Phương trình hồi qui HB CD β- Khoảng tuyến tính (µg/ml) Độ lặp lại (n=6) Độ (n=9) Pic đồng phân Pic đồng phân y = 0,0024x + 0,0018 R2 = 0,9990 y = 0,0024x + 0,0015 R2 = 0,9991 1- 200 (hỗn hợp racemic) RSD = 0,215% RSD = 0,172% RTB = 98,36% RTB = 99,59% y = 0,0024x – 0,0003 R2 = y = 0,0024x – 0,0007 R2 = 0,9999 1- 200 (hỗn hợp racemic) RSD = 0,404% RSD = 0,323% RTB = 98,83% RTB = 99,64% RTB: tỷ lệ hồi phục trung bình Kết thống kê cho thấy tỷ lệ hồi phục nằm giới hạn cho phép tỷ lệ hồi phục lý thuyết (98% - 102%) RSD < 3% độ lặp lại Qui trình phân tích có khoảng tuyến tính rộng với hệ số tương quan cao Kết luận Bằng phương pháp điện di mao quản, khảo sát số điều kiện ảnh hưởng đến trình tách hai dạng đồng phân hỗn hợp racemic propranolol với việc ứng dụng β-CD hydroxyalkyl β-CD (HP β-CD, HB β-CD) làm tác nhân đối quang Đã xây dựng quy trình xác định hai dạng đồng phân quang học propranolol với hai tác nhân HP β-CD HB β-CD Qui trình có tính đặc hiệu, cho kết xác có tính lặp lại Tài liệu tham khảo United States Pharmacopoeia XXVI NF 21 – CD-Rom Hiroyuki Nishi (1996),”Enantiomer separation of basic drugs by capillary electrophoresis using ionic and neutral polysacchaides as chiral selectors”, Journal of chromatography A.735, pp 345- 351 Kevin D.Altria and Manus M.Rogan (1994), “Introduction to the Theory and Applications of chiral Capillary Electrophoresis”, Beckman, pp.24 -30 Salvatore Fanali (1996),”Identification of chiral drug isomers by capillary electrophoresis” Journal of Chromatography A, 735, pp.77 - 121 Yunhe Wei, Jian Li, Chenfu Zhu, Aiyou Hao, and Minggang Zhao (2005),”2-O-(2Hydroxybutyl)-β-cyclodextrin as a Chiral selector for the Capillary Electrophoretic Separation of Chiral Drugs”, ... HP β-CD 3.1.5 methanol Khả tách đồng phân propranolol với tác nhân β-CD di n Hình Ảnh hưởng nồng độ β-CD độ phân giải đồng phân propranolol Điều kiện điện di: cột mao quản 64 cm (55,5 cm) x 50... Khả tách đồng phân propranolol với tác nhân HP β-CD di n methanol Rs =1, 73 c Rs =1, 39 b a Rs =1, 08 Hình Ảnh hưởng nồng độ HP β-CD độ phân giải đồng phân propranolol Điều kiện điện di: cột mao. .. tính chọn lọc đồng phân propranolol tác nhân HP β-CD, HB β-CD cao β-CD • Qua khảo sát, chọn hai điều kiện tách đồng phân với hai tác nhân HP β-CD, HB β-CD Điều kiện điện di 1: cột mao quản 64 cm