tóm tắt luận án tiên sĩ nghiên cứu tổng hợp một số tác nhân quang hoạt từ β-cyclodextrin để ứng dụng trong phân tích các chất quang hoạt bằng phương pháp điện di mao quản

Đặt vấn đề Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu tổng hợp các dẫn chất -CD được công bố sau khi tìm thấy ứng dụng của các dẫn chất này trong nhiều lĩnh vực như bào chế dược p

GIỚI THIỆU LUẬN ÁN

1 Đặt vấn đề

Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu tổng hợp các dẫn chất -CD được công bố sau khi tìm thấy ứng dụng của các dẫn chất này trong nhiều lĩnh vực như bào chế dược phẩm, trong phân tích các chất quang hoạt bằng các phương pháp GC, HPLC, CE,

….Trong lĩnh vực tách đồng phân cũng có nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng phương pháp CE với các kỹ thuật CZE, MEKC, ….và tác nhân quang hoạt thường dùng là các dạng , , -CD tự nhiên hay một số tác nhân quang hoạt chuyên biệt cho các dạng đồng phân, thường là các dẫn chất cyclodextrin Đề tài “Nghiên cứu tổng hợp một số tác nhân quang hoạt từ beta-cyclodextrin để ứng dụng trong phân tích các chất quang hoạt bằng phương pháp điện

di mao quản” được thực hiện với các nội dung nghiên cứu sau:

- Tổng hợp ở qui mô phòng thí nghiệm và tiêu chuẩn hóa hai tác nhân quang hoạt từ -cyclodextrin là 2-O-(2-hydroxypropyl)--

cyclodextrin và 2-O-(2-hydroxybutyl)--cyclodextrin

- Ứng dụng các tác nhân quang hoạt tổng hợp để phân tích một số chế phẩm chứa dược chất quang hoạt bằng phương pháp điện di mao quản

2 Tính cấp thiết của đề tài

Do một số dạng đồng phân quang học của một số hoạt chất có hoạt tính mạnh và ít tác dụng phụ, nên hiện nay ngành công nghiệp dược phẩm đã và đang nghiên cứu đưa ra thị trường nhiều chế phẩm của các dạng đồng phân riêng lẻ Để phân biệt các dạng đồng phân là một điều khó khăn nên việc phân tách các đồng phân quang học ngày càng trở thành vấn đề quan trọng trong lĩnh vực kiểm nghiệm dược phẩm Trong các chuyên luận của

Dược điển (HPLC, GC), để tách các dạng đồng phân đòi hỏi phải có các cột sắc ký chuyên biệt rất đắt tiền Đây là một trở ngại đối với các nhà phân tích, nhất là trong điều kiện còn nhiều khó khăn

ở các phòng thí nghiệm nước ta

CE là kỹ thuật rất hiệu quả trong lĩnh vực phân tích đồng phân quang học, hiện nay đang được phát triển ở các nước trên thế giới, nhưng tại Việt Nam phương pháp này chưa được phổ biến rộng, đặc biệt trong lĩnh vực tách đồng phân cũng chưa được nghiên cứu và phát triển

Trong phân tích các đồng phân quang học, tác nhân quang hoạt là yếu tố quyết định khả năng tách Hiện nay, xu hướng của các nhà nghiên cứu là đi từ tác nhân phổ biến nhất là -CD (tính chọn lọc cao và giá thành rẻ hơn các dạng -CD và -CD) để tổng hợp ra nhiều tác nhân tách đồng phân chuyên biệt có tính chọn lọc cao hơn, tan dễ dàng trong các dung môi, giá thành rẻ nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho các nhà phân tích trong việc lựa chọn tác nhân tách đồng phân thích hợp trong điều kiện số lượng tác nhân quang hoạt được thương mại hóa còn rất ít

Nghiên cứu của đề tài với mong muốn phát triển kỹ thuật điện di mao quản và góp phần ứng dụng kỹ thuật này vào việc phân tích các đồng phân quang học, nhằm tạo điều kiện thuận lợi trong việc kiểm tra chất lượng các thuốc chứa hoạt chất có tính quang hoạt

3 Những đóng góp mới của luận án

- Đã xây dựng được quy trình tổng hợpï tác nhân quang hoạt

2-O-(2-hydroxypropyl)--CD với hiệu suất 62,7%; độ thế trung bình khoảng 6,3 và độ tinh khiết > 97%

- Đã xây dựng được quy trình tổng hợp tác nhân quang hoạt

2-O-(2-hydroxybutyl)--CD với hiệu suất 61,5%; độ thế trung bình khoảng 5,3 và độ tinh khiết > 97%

- Đã tiêu chuẩn hóa hai sản phẩm 2-O-(2-hydroxypropyl)--CD

và 2-O-(2-hydroxybutyl)--CD Trong đó, 2-O-(2-hydroxybutyl)-

-CD hiện nay chưa được thương mại hóa

- Cung cấp đđầy đđủ các dữ liệu phổ NMR để giúp biện giải và xác

định chắc chắn cấu trúc của 2-O-(2-hydroxypropyl)--CD và

2-O-(2-hydroxybutyl)--CD Cho đến nay, trong nước chưa có một công trình nghiên cứu tổng hợp nào về hai chất này được công bố

- Đã ứng dụng hai tác nhân quang hoạt 2-O-(2-hydroxypropyl)-

-CD và 2-O-(2-hydroxybutyl)--CD để xây dựng thành công các quy trình tách các đồng phân quang học của 7 dược chất quang hoạt (amlodipin, nefopam, propranolol, ofloxacin, ketoconazol, miconazol, promethazin) bằng phương pháp điện di mao quản Tất cả quy trình đều được khảo sát đầy đủ và chi tiết tất cả các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách đồng phân

4 Bố cục của luận án

Luận án gồm: 122 trang, đặt vấn đề 3 trang, tổng quan 21 trang, đối tượng và phương pháp 13 trang, kết quả 49 trang, bàn luận 31 trang, kết luận và đề nghị 4 trang, những đóng góp mới của luận án 1 trang Luận án có 42 bảng, 103 hình, 3 sơ đồ, 100 tài liệu tham khảo (5 tiếng Việt, 95 tiếng Anh), và 93 phụ lục

NỘI DUNG LUẬN ÁN CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

Trình bày những vấn đề sau:

1.1 Giới thiệu về đồng phân quang học: độ tinh khiết quang học, các phương pháp xác định độ tinh khiết quang học

1.2 Cyclodextrin: -CD và dẫn chất của -CD

1.3 Tương tác giữa đồng phân với tác nhân quang hoạt

1.4 Giới thiệu về một số dược chất quang hoạt: amlodipin, nefopam, propranolol, ofloxacin, ketoconazol, miconazol, promethazin

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Các dẫn chất của -CD và các chế phẩm chứa đồng phân riêng lẻ hay hỗn hợp racemic của các dược chất có tính quang hoạt như: amlodipin besilat, propranolol hydroclorid, ofloxacin, ketoconazol, miconazol nitrat, promethazin hydroclorid, nefopam hydroclorid

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nguyên liệu - Dung môi, hóa chất - Trang thiết bị

- Dung môi, hóa chất sử dụng loại dùng cho tổng hợp, phân tích và cho các loại thiết bị như: HPLC, CE,

- Các chất chuẩn đối chiếu do Viện Kiểm nghiệm thuốc TP.HCM cung cấp

- Thiết bị tổng hợp và thiết bị phân tích được trang bị tại Viện Kiểm nghiệm thuốc TP.HCM, Viện hóa học - Viện Hàn lâm khoa học Việt Nam

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.2.1 Tổng hợp dẫn chất -CD

Tổng hợp dẫn chất 2-O-(2-hydroxypropyl)--CD: -CD phản ứng với 1,2-propylen oxyd trong môi trường NaOH 0,4 M

Tổng hợp dẫn chất 2-O-(2-hydroxybutyl)--CD: -CD phản ứng với 1,2-butylen oxyd trong môi trường NaOH 0,4 M

Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm tổng hợp

- Tiến hành theo dõi thời điểm kết thúc phản ứng tổng hợp và kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng phương pháp SKLM

trên bản mỏng silicagel F254 với hệ dung môi khai triển: propanol - nước - amoniac đậm đặc (3:1:1) (tt/tt/tt)

- Đo nhiệt độ nóng chảy

- Xác định góc quay cực riêng

Xác định cấu trúc

- Phổ hồng ngoại (IR)

- LC-MS:

Điều kiện: cột Gemini C18 (150 x 4,6 mm; 5 m) Pha động: methanol - nước (7:3) Đầu dò khối phổ: kiểu ion hóa ESI, thế phá mảnh: 50 eV Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút Nhiệt độ cột: 40 oC Khí nitơ (nhiệt độ, tốc độ, áp suất phun hơi): 300 oC, 7 lít/phút, 30 psi Nhiệt độ buồng đốt: 100 oC

- NMR: được đo trong dung môi methanol (CD3-OD), pyridin (C6D5N)

Dựa vào phổ 1H-NMR để xác định độ thế trung bình (DS)

Tính hiệu suất phản ứng

2.2.2.2 Tiêu chuẩn hóa HP--CD và HB--CD tổng hợp

Tính chất: dựa vào cảm quan xác định trạng thái, màu, mùi của

sản phẩm

Độ tan: theo quy định chung của DĐVN IV

Định tính

Phổ IR: tiến hành đo phổ bằng kỹ thuật dập viên KBr

Phổ NMR: phổ 1H-NMR và 13C-NMR

Độ thế (DS)

Dựa vào phổ 1H-NMR để tính độ thế trung bình (DS)

Độ trong và màu sắc: hòa tan 1,0 g chế phẩm trong 2,0 ml nước và

đun nóng Dung dịch sau khi để nguội đến nhiệt độ phòng phải trong và không màu

pH: cân 0,5 g chế phẩm hòa tan trong 50 ml nước không có

carbon dioxyd Đo pH dung dịch sau khi pha

Góc quay cực riêng: cân 0,5 g chế phẩm hòa tan trong 50 ml nước

Đo góc quay cực ở 20 oC

Kim loại nặng: xác định trên 0,5 g chế phẩm

Giảm khối lượng do sấy khô: xác định trên 1,0 g chế phẩm; sấy

120 oC trong 2 giờ

Cắn sau khi nung: xác định trên 1,0 g chế phẩm

Độ tinh khiết: Áp dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và

quy về 100% diện tích pic

- Điều kiện sắc ký: cột Gemini NX RP18 (150 x 4,6 mm; 5 µm) Pha động: nước Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút Đầu dò: RI Nhiệt độ cột: 40 oC Thể tích tiêm: 20 µl Nồng độ đo: 2%

- Đánh giá phương pháp: nội dung đánh giá được tham khảo theo hướng dẫn của ICH (International Conference on Harmonization) ban hành vào tháng 11 năm 2005

2.2.2.3 Khảo sát độ ổn định của HP--CD và HB--CD

Kiểm tra độ ổn định của sản phẩm bằng cách bảo quản ở nhiệt độ

25 oC  2 oC, độ ẩm 75%  5% Sau các thời điểm 3, 6, 9, 12 và 24 tháng kiểm tra lại các chỉ tiêu: tính chất, pH, độ tinh khiết và độ chọn lọc đồng phân

2.2.2.4 Ưùng dụng HP--CD và HB--CD để phân tích các chất quang hoạt bằng phương pháp điện di mao quản

Khảo sát điều kiện tách các hỗn hợp racemic: miconazol,

nefopam, amlodipin, ofloxacin, propranolol, promethazin, ketocanazol Khảo sát pH và nồng độ dung dịch điện ly nền, bản chất và nồng độ tác nhân quang hoạt, bản chất và nồng độ dung

môi hữu cơ thêm vào dung dịch điện ly nền

Đánh giá quy trình

- Tính phù hợp của hệ thống

Yêu cầu: thời gian di chuyển của các pic có RSD  2%; diện tích pic được chuẩn hóa (Corr Area)  3%; độ phân giải giữa hai pic đồng phân RS  1,5; hệ số bất đối 0,8  As  1,5

- Tính đặc hiệu: Điện di đồ của mẫu thử phải có pic có thời gian

di chuyển trùng với pic hoạt chất trong mẫu chuẩn Mẫu trắng không có pic có thời gian di chuyển trùng với thời gian di chuyển của các pic hoạt chất trong dung dịch chuẩn Khi thêm chất chuẩn vào mẫu thử thì diện tích pic của hoạt chất tăng lên Phổ tử ngoại của các pic trong mẩu thử giống phổ tử ngoại của pic trong mẫu chuẩn Phổ tử ngoại của hai pic đồng phân giống nhau Độ tinh khiết của các pic trong các quy trình đều  99,0%

- Tính tuyến tính: R2 > 0,990

- Độ đúng: tỷ lệ phục hồi 98% - 102%

- Độ chính xác: RSD  3%

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Tổng hợp dẫn chất -CD

3.1.1 Tổng hợp 2-O-(2-hydroxypropyl)--CD

3.1.1.1 Tổng hợp 2-O-[(RS)-2-hydroxypropyl]--CD

-CD phản ứng với 1,2-propylen oxyd theo tỷ lệ 1:25 trong môi trường NaOH 0,4 M ở 0 oC - 5 oC trong 5 giờ, sau đó tiếp tục phản ứng ở 25 oC  2 oC Phản ứng được thực hiện trong vòng 24 giờ Hỗn hợp sau phản ứng được trung hòa bằng dung dịch acid hydrocloric 20% Bay hơi nước, cắn được hòa trong một lượng tối thiểu ethanol Lọc loại muối, tủa bằng aceton, loại aceton Tủa được sấy dưới áp suất giảm ở 80 oC Hiệu suất sau khi tinh chế khoảng 62,7% Nhiệt độ nóng chảy: từ 250 oC đến 255 oC  20

D

+125,6o Độ thế khoảng 6,3

Phổ IR (KBr),  (cm -1 ): có các số sóng hấp thu đặc trưng của nhóm

chức O-H (3425), C-H (2932), C-O (1031)

Phổ khối (m/z): 1535

Phổ NMR (CD 3 -OD),  (ppm)): Phổ 1 H-NMR (500 MHz): 1,155

(H9); 3,556 (H4); 3,591-3,790 (H7); 3,765 (H5); 3,850 - 3,877 (H6); 3,887 (H3); 3,974 (H8); 4,020 (H2); 5,012 (H1) Phổ 13 C-NMR (125 MHz): 103,656 (C1); 82,904 (C4); 78,686 (C7); 74,679 (C3); 73,909 (C2); 73,571 (C5); 67,259 (C8); 61,174 (C6); 19,504 (C9)

Hình 3.1 Phổ 1 H-NMR của 2-O-(2-hydroxypropyl)--CD

Hình 3.2 Phổ 13 C-NMR của 2-O-(2-hydroxypropyl)--CD

O

OH

HO OCH2 CHCH 3

O 7 OH

Dữ liệu phổ IR, MS, phổ NMR cho thấy sản phẩm có cấu trúc của

2-O-(2-hydroxypropyl)--CD

3.1.1.2 Tổng hợp 2-O-[(S)-2-hydroxypropyl]--CD

Thực hiện theo mục 3.1.1.1 nhưng thay 1,2-propylen oxyd bằng (S)-(-)-1,2-propylen oxyd Hiệu suất sau khi tinh chế khoảng

61,5% Nhiệt độ nóng chảy: từ 252 oC đến 256 oC  20

D

 : +140,1o

Độ thế: 6,18

3.1.1.3 Tổng hợp 2-O-[(R)-2-hydroxypropyl]--CD

Thực hiện theo mục 3.1.1.1 nhưng thay 1,2-propylen oxyd bằng

(R)-(+)-1,2-propylen oxyd Hiệu suất sau khi tinh chế khoảng

63,2% Nhiệt độ nóng chảy: từ 251 oC đến 256 oC  20

D

 : +110,2o Độ thế: 6,67

3.1.2 Tổng hợp 2-O-(2-hydroxybutyl)--CD

-CD phản ứng với 1,2-butylen oxyd theo tỷ lệ 1:25 trong môi trường NaOH 0,4M và tiến hành như mục 3.1.1 Hiệu suất khoảng 61,5% Nhiệt độ nóng chảy: từ 256 oC - 260 oC  20

D

 = +118,6o Độ thế trung bình khoảng 5,3

Phổ IR (KBr),  (cm -1 ): có các số sóng hấp thụ đặc trưng của

nhóm chức O-H (3405), C-H (2933), C-O (1031)

Phổ khối (m/z): 1477

Phổ NMR (CD 3 -OD,  (ppm))

Phổ 1 H-NMR (500 MHz): 0,982 (H10); 1,437-1,567 (H9); 3,474 (H4); 3,533 (H2), 3,670-3,903 (H7), 3,711 (H8), 3,761 (H5), 3,867-3,950 (H6), 3,885 (H3), 4,992 (H1) Phổ 13 C-NMR (125 MHz): 103,784

(C1); 83,187 (C4); 76,543 (C7); 74,621 (C3); 74,123 (C2); 73,626 (C5); 72,691 (C8); 61,743 (C6); 27,167 (C9); 10,336 (C10)

Từ dữ liệu phổ IR, MS, phổ NMR cho thấy sản phẩm có cấu trúc

của 2-O-(2-hydroxybutyl)--CD

Hình 3.4 Phổ 1 H-NMR của 2-O-(2-hydroxybututyl)--CD

Hình 3.5 Phổ 13 C-NMR của 2-O-(2-hydroxybutyl)--CD

3.2 Tiêu chuẩn hóa dẫn chất HP--CD và HB--CD

Mức chất lượng của các chỉ tiêu trong tiêu chuẩn được xây dựng dựa vào kết quả của nhiều lần thử nghiệm

O

HO OCH2 CHCH 2 CH 3

O 7 OH

OH

1 2

3

6

7 8 9 10

Bảng 3.5 Tóm tắt tiêu chuẩn cơ sở của HP--CD

Chỉ tiêu Mức chất lượng

Tính chất Bột trắng hoặc gần như trắng

Dễ tan trong nước và methanol

Định tính Phải có phổ đặc trưng của

2-O-(2-hydroxypropyl)--CD

Độ trong và màu sắc Dung dịch chế phẩm phải trong và không

màu

Góc quay cực riêng Từ +123 o đến +128 o

Giảm khối lượng do làm khô Không quá 8%

Kim loại nặng Không quá 20 ppm

Cắn sau khi nung Không quá 0,1%

Độ tinh khiết  97,0% tính theo chế phẩm nguyên trạng Độ thế Từ 6,0 đến 7,0

Bảng 3.10 Tóm tắt tiêu chuẩn cơ sở của HB--CD

Chỉ tiêu Mức chất lượng

Tính chất Bột trắng hoặc gần như trắng

Dễ tan trong nước và methanol

Định tính Phải có phổ đặc trưng của

2-O-(2-hydroxybutyl)--CD

Độ trong và màu sắc Dung dịch chế phẩm phải trong và không

màu

Góc quay cực riêng Từ +115 o đến +120 o

Giảm khối lượng do làm khô Không quá 5%

Kim loại nặng Không quá 20 ppm

Cắn sau khi nung Không quá 0,1%

Độ tinh khiết  97,0% tính theo chế phẩm nguyên trạng Độ thế Từ 5,0 đến 6,0

Các tiêu chuẩn đã được thẩm định tại Viện Kiểm nghiệm thuốc

TP.Hồ Chí Minh

3.3 Khảo sát độ ổn định của HP--CD và HB--CD

Sau 24 tháng bảo quản ở điều kiện nhiệt độ 25 oC  2 oC, độ ẩm tương đối 75%  5% chất lượng HP--CD và HB--CD vẫn ổn định và khả năng tách đồng phân đối với các dược chất so với thời điểm ban đầu vẫn không thay đổi

Bảng 3.11 Kết quả khảo sát độ ổn định của HP--CD

Tính chất Đạt yêu cầu thời điểm 0

pH 8,16 8,47 8,44 8,32 8,32 8,26

Độ tinh khiết (%) 98,55 97,97 98,01 98,21 97,85 97,79

Bảng 3.12 Kết quả khảo sát độ ổn định của HB--CD

Bảng 3.13 Kết quả khảo sát độ ổn định của HP--CD và

HB--CD đối với độ chọn lọc đồng phân của một số dược chất quang hoạt

3 tháng

6 tháng

9 tháng

12 tháng

24 tháng

Điều kiện cố định: cột silica nung chảy, đường kính trong 50 µm,

chiều dài tổng cộng 63,5 cm và chiều dài hiệu quả 54 cm Điện thế: 20 kV Nhiệt độ mao quản: 25 oC Phương pháp tiêm: 50