Nghiên cứu đặc điểm lâm học và nhân giống trà hoa vàng (camellia chrysantha (hu) tuyama) bằng phương pháp giâm hom

Theo "Camellia International Journal" – tạp chí chuyên nghiên cứu về Trà hoa vàng của thế giới, các hợp chất của Trà hoa vàng có khả năng kiềm chế sự sinh trưởng của các khối u đến 33,8

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của riêng tôi, công trình được thực hiện trong thời gian từ tháng 5 đến tháng 10 năm 2016 Các số liệu, kết quả nghiên cứu trình bày trong luận án là trung thực và chưa được công

bố trong bất kỳ công trình nào khác

Hà nội, ngày 29 tháng 10 năm 2016

Người viết cam đoan

Phan Đặng Hoàng

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được luận văn này, tôi đã nhận được sự chỉ bảo, giúp đỡ rất tận tình của TS Nguyễn Văn Việt và TS Trần Việt Hà Cùng với sự giúp đỡ, động viên của các thầy cô giáo trong khoa Lâm học, Phòng đào tạo Sau đại học – Trường Đại Học Lâm Nghiệp – Hà Nội, Hạt Kiểm lâm huyện Ba Chẽ, Trường Cao Đẳng Nông lâm Đông bắc – Quảng ninh

Nhân dịp này cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS Nguyễn Văn Việt và TS Trần Việt Hà, đã chỉ bảo, giúp đỡ tận tình trong thời gian qua

Tôi xin chân thành cảm ơn đến lãnh đạo, cán bộ Hạt Kiểm lâm huyện Ba chẽ, Trường Cao Đẳng Nông lâm Đông bắc – Quảng ninh, đã tạo điều kiện giúp

đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và các bạn đồng nghiệp động viên, giúp

đỡ trong quá trình thực hiện luận văn!

Hà nội, ngày 29 tháng 10 năm 2016

Người viết luận văn

Phan Đặng Hoàng

MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC VÀ CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3

1.1 Giới thiệu về Trà hoa vàng (Camellia chrysantha (Hu) Tuyama) 3

1.1.1 Hệ thống phân loại và phân bố 3

1.1.2 Đặc điểm sinh học 3

1.1.3 Giá trị sử dụng 3

1.2 Tổng quan về mã vạch ADN (DNA barcode) 5

1.2.1 Trên Thế Giới 6

1.2.2 Ở Việt Nam 6

1.3 Nghiên cứu đặc điểm lâm học loài cây 8

1.3.1.Trên thế giới 8

1.3.2 Ở trong nước 12

1.4 Cơ sở khoa học của nhân giống bằng hom 14

1.4.1 Cơ sở của phương pháp giâm hom 15

1.4.2 Nhu cầu sinh lý của cành đã cắt rời 16

1.5 ngh a của nhân giống bằng hom 16

1.6 Những nghiên cứu về chi Camellia 17

1.6.1 Những nghiên cứu về chi Camellia trên Thế Giới 17

1.6.2 Những nghiên cứu về chi Camellia ở Việt Nam 19

Chương 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Mục tiêu nghiên cứu 24

2.2 Đối tượng nghiên cứu 24

2.3 Địa điểm nghiên cứu 24

2.4 Nội dung nghiên cứu 24

2.5 Phương pháp nghiên cứu 24

2.5.1 Nghiên cứu mã vạchADN (DNA barcode) cho cây Trà hoa vàng Ba Chẽ 24

2.5.2 Nghiên cứu một số đặc điểm Lâm học Trà hoa vàng 26

2.5.3 Thí nghiệm giâm hom Trà hoa vàng 29

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32

3.1 Kết quả xác định mã vạch AND (DNA barcode) 32

3.1.1 Tách chiết ADN và khuyếch đại PCR (Polymerase Chain Reaction) 32

3.1.2 Phân tích trình tự nucleotide từ ba vùng ADN 33

3.2 Một số đặc điểm Lâm học Trà hoa Vàng 36

3.2.1 Đặc điểm hình thái loài cây Trà hoa vàng Ba chẽ 36

3.2.2 Đặc điểm sinh thái và phân bố loài cây Trà hoa vàng tại Ba chẽ 39

3.2.3 Đặc điểm cấu trúc hoàn cảnh rừng nơi có loài cây Trà hoa vàng phân bố tự nhiên 40

3.3 Nhân giống Trà hoa vàng Ba chẽ bằng phương pháp giâm hom 46

3.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng sống và khả năng ra rễ của hom 46

3.3.4 Ảnh hưởng của giá thể ruột bầu đến hiệu quả giâm hom 53

3.3.5 Ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng sống của hom 54

KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC VÀ CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT

1 ABT Indol acetic acid

2 ADN Axit đêoxiribonucleic

14 IBA Indol butiric acid

15 IV % Importance Value (Giá trị quan trọng)

17 NAA Napthalen acetic acid

19 OTC Ô tiêu chuẩn

20 pH Chỉ số đo độ hoạt động của các ion hiđrô (H+) trong dung dịch

21 QXTV Quần xã thực vật

DANH MỤC CÁC BẢNG

3.2 Kích thước cây Trà hoa vàng tại Ba chẽ, Quảng ninh 36

3.5 Cấu trúc tổ thành ở các OTC tính theo số cây 41 3.6 Mật độ tầng cây cao của lâm phần với cây Trà hoa vàng 43 3.7 Thành phần loài cây gỗ đi kèm với Trà hoa vàng ở các OTC 44

3.8 Thành phần loài cây bụi, thảm tươi nơi Trà hoa vàng phân bố ở

3.9 Đặc điểm về độ tàn che của tầng cây cao ở các trạng thái rừng 45 3.10 Ảnh hưởng của nồng độ các chất ĐHST thực vật đến tỷ lệ sống 47 3.11 Ảnh hưởng của nồng độ các chất ĐHST thực vật đến khả năng ra rễ 50 3.12 Ảnh hưởng của loại hom đến hiệu quả giâm hom 52 3.13 Ảnh hưởng của giá thể ruột bầu đến hiệu quả giâm hom 53 3.14 Ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng sống của hom 54

DANH MỤC CÁC BIỂU

3.1 Ảnh hưởng của nồng độ các chất ĐHST thực vật ABT đến tỷ lệ sống 47 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ các chất ĐHST thực vật IBA đến tỷ lệ sống 48 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ các chất ĐHST thực vật NAA đến tỷ lệ sống 48 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ các chất ĐHST thực vật đến khả năng ra rễ 50 3.5 Ảnh hưởng của loại hom đến hiệu quả giâm hom 52 3.6 Ảnh hưởng của giá thể ruột bầu đến hiệu quả giâm hom 53 3.7 Ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng sống của hom 54

DANH MỤC CÁC HÌNH

3.2 Sản phẩm PCR với vùng rbcL từ 06 mẫu nghiên cứu 33

3.3 So sánh trình tự nucleotide vùng matK giữa Trà hoa vàng Sơn

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây Trà hoa vàng thuộc chi trà (Camellia) là một chi thực vật có hoa trong

họ Chè (Theaceae), trên thế giới và Việt Nam có rất nhiều loài thuộc chi Camellia

có hoa đẹp với đủ các màu sắc khác nhau như trắng, đỏ, hồng và nhiều màu sắc lạ mắt, độc đáo được lai tạo đã thu hút sự quan tâm của nhiều nhà chơi cảnh trong đó

có người chơi cảnh Việt Nam Trong số đó, các loài Trà hoa vàng là loài hiện mới chỉ phát hiện tại Việt Nam và Trung Quốc Cũng như nhiều loài khác trong chi Camellia, giá trị đầu tiên dễ nhận thấy nhất của Trà hoa vàng là làm cảnh Màu vàng của Trà hoa vàng rất đặc trưng, Khó có thể tạo ra được bằng phương pháp lai hữu tính (Trần Ninh – Hakoda Naotoshi, 2010) Trà hoa vàng còn có giá trị kinh tế và y dược cao như: Sử dụng để lấy gỗ, có thể làm cây trồng tầng dưới ở các đai rừng phòng hộ, lá và hoa làm đồ uống cao cấp, có tác dụng phòng và chống các bệnh huyết áp, tim mạch, tiểu đường, u bướu (Zhu Ji Yu et al…, 2006) Các nhà thực vật thế giới xem các loài Trà hoa vàng là nguồn gen quý hiếm cần được bảo vệ nghiêm ngặt (Trần Ninh và cs, 2010)[25]

Trong hơn 10 năm qua, các nhà khoa học đã phát hiện tại Việt Nam có tới 24 loài Trà hoa vàng Tuy vậy, hiện nay Trà hoa vàng đang bị đe dọa nghiêm trọng do mất môi trường sống bị thu hẹp cũng như việc thu lượm cây giống thái quá dẫn đến suy giảm rất nhanh về số lượng cá thể ngoài tự nhiên

Theo quy hoạch của tỉnh Quảng Ninh, Ba Chẽ là một trong ba vùng dược liệu của tỉnh Để chủ động cho hướng phát triển, huyện Ba Chẽ đã xây dựng quy hoạch vùng trồng dược liệu hơn ba nghìn ha, trong đó trà hoa vàng được trồng với tổng diện tích hơn 500 ha trên địa bàn các xã, thị trấn Đến nay, toàn huyện đã trồng được hơn 100ha trà hoa vàng từ nguồn vốn các doanh nghiệp và các hộ dân trên địa bàn Công ty cổ phần Phú Khang HT hiện đã lập dự án trồng 250 ha trà hoa vàng tập trung ở xã Thanh Sơn, kết hợp chế biến dược liệu tại chỗ và phát triển du lịch sinh thái[57]

Vì thế việc nghiên cứu các phương pháp nhân giống, chăm sóc để bảo tồn và phát triển các loài Trà hoa vàng là một việc làm cần thiết Tuy nhiên cho tới nay

những nghiên cứu về các loài Trà hoa vàng còn rất hạn chế Trong số các loài Trà

hoa vàng quý hiếm tại tỉnh Quảng Ninh thì loài Trà hoa vàng Camellia chrysantha

là một trong những loài trà quý cần đƣợc quan tâm, bảo tồn và phát triển

Từ những lý do trên, tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu đặc điểm

Lâm học và nhân giống Trà hoa vàng (Camellia chrysantha (Hu) Tuyama) bằng phương pháp giâm hom Nhằm phục vụ công tác bảo tồn và phát triển cây dƣợc liệu

quý này

Chương 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 Giới thiệu về Trà hoa vàng (Camellia chrysantha (Hu) Tuyama)

1.1.1 Hệ thống phân loại và phân bố

Trà hoa vàng hay con gọi là Kim hoa trà (Camellia chrysantha (Hu) Tuyama) là một loài thực vật hạt kín trong họ Theaceae Nó được tìm thấy ở Trung

Quốc (tây nam tỉnh Quảng Tây) và Việt Nam (tỉnh Quảng Ninh), V nh Phúc (Tam Đảo)

1.1.2 Đặc điểm sinh học

Cây gỗ nhỏ hay cây bụi; nhánh mảnh, không lông Lá có phiến thuôn, dài 9 –

12 cm, rộng 4 – 5 cm, không lông, mép có khía răng cưa nhỏ, gân bên khoảng 10 đôi; cuống lá dài 6–7 mm Hoa mọc đơn độc trên cuống dài 7 – 10 mm; lá bắc 4 Lá đài 5; cánh hoa 8 - 10, màu vàng đậm, cao 3 cm; nhị nhiều; bầu nhụy không lông, vòi nhụy

3 - 4, dính nhau một phần Quả nang to có đường kính 3 cm, vỏ quả dày 3 mm Sinh

sống trong các khu rừng ẩm có độ cao dưới 500 mét so với mặt nước biển

1.1.3 Giá trị sử dụng

Trà hoa vàng là loài cây quý hiếm, có nhiều giá trị để sử dụng như lấy gỗ, có thể làm cây trồng tầng dưới ở các đai rừng phòng hộ, trồng làm cây cảnh, làm đồ

uống cao cấp và chế biến dược liệu, có tác dụng phòng và chống các bệnh huyết áp, tim mạch, tiểu đường, u bướu[14]

Theo "Camellia International Journal" – tạp chí chuyên nghiên cứu về Trà

hoa vàng của thế giới, các hợp chất của Trà hoa vàng có khả năng kiềm chế sự sinh trưởng của các khối u đến 33,8% trong khi chỉ cần đạt đến ngưỡng 30% đã có thể xem là thành công trong điều trị ung thư; giúp giảm đến 35% hàm lượng cholesterol trong máu, trong khi dùng các loại thuốc khác thì mức độ giảm chỉ là 33,2%… [49]

Một số công trình nghiên cứu cho thấy Trà hoa vàng giảm triệu chứng xơ vữa động mạch do máu nhiễm mỡ, điều hòa huyết áp, hạ đường huyết, chữa kiết lỵ, đại tiện ra máu…

Lá Trà hoa vàng có thể uống, điều chỉnh các chất béo trong cơ thể, lượng đường trong máu, giải độc gan và thận, theo y học Trung Quốc công bố, Trà hoa vàng có 9 tác dụng chính:

- Trong lá trà có những hoạt chất làm giảm tổng hàm lượng lipit trong huyết thanh máu, giảm lượng cholesterol mật độ thấp (cholesterol xấu) và tăng lượng cholesterol mật độ cao (cholesterol tốt);

- Nước sắc lá trà có tác dụng hạ huyết áp rõ ràng và tác dụng được duy trì trong thời gian tương đối dài;

- Nước sắc lá trà có tác dụng ức chế sự tụ tập của tiểu cầu, chống sự hình thành huyết khối gây tắc nghẽn mạch máu;

- Phòng ngừa ung thư và ức chế sự phát triển của các khối u khác;

- Hưng phấn thần kinh;

- Lợi tiểu mạnh;

- Giải độc gan và thận, ngăn ngừa xơ vữa động mạnh máu;

- Ức chế và tiêu diệt vi khuẩn

Ngoài ra, lá chè còn có tác dụng chống viêm, chống dị ứng và duy trì trạng thái bình thường của tuyến giáp

PGS, TS Trần Văn Ơn, Trường Đại học Dược Hà Nội nghiên cứu về loại thảo dược này Đến nay, đã có kết luận: hoa và lá cây trà hoa vàng bao hàm hơn 400

thành phần hóa học, không có độc và tác dụng phụ, trong đó phải kể tới Saponin, các hợp chất phenolic, amio acid, axit folic, protein, vitamin B1, B2, C, E, axit béo,… cùng rất nhiều các thành phần dinh dưỡng tự nhiên; trà hoa vàng có vài chục loại axitamin, rất nhiều các nguyên tố vi lượng Ge, Se, Mo, Zn, V,… có tác dụng bảo vệ sức khỏe, nâng cao sức đề kháng, ngăn ngừa bệnh tật”[57].

1.2 Tổng quan về mã vạch ADN (DNA barcode)

Phương pháp phân loại hình thái có lịch sử phát triển lâu đời và đã xây dựng được một hệ thống phân loại sinh vật nói chung và thực vật nói riêng tương đối đầy đủ và toàn diện Phương pháp phân loại này chủ yếu dựa vào sự khác biệt

về hình thái của các cơ quan trong cơ thể thực vật, đặc biệt là cơ quan sinh sản (hoa) Tuy nhiên, phương pháp này cũng gặp rất nhiều khó khăn khi cần xác định những mẫu vật đang trong giai đoạn phát triển (chưa ra hoa), những mẫu có đặc điểm giống nhau do cùng thích nghi với điều kiện môi trường, hoặc khó nhận biết

do có nhiều điểm tương đồng ở bậc phân loại thấp như loài và dưới loài Từ giữa những năm 1990, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, một phương pháp nghiên cứu mới trong l nh vực phân loại học đã hình thành và được gọi là phương pháp phân loại học phân tử Phương pháp này dựa trên các dữ liệu thông tin về hệ gen (ADN) trong và ngoài nhân hoặc các sản phẩm của chúng (protein) Tùy mục đích hoặc đối tượng nghiên cứu, người ta có thể lựa chọn các gen (đoạn ADN) khác nhau hoặc các sản phẩm khác nhau của hệ gen

Năm 2003, Paul Hebert [48], nhà nghiên cứu tại Đại học Guelph ở Ontario, Canada, đề xuất "mã vạch DNA" (DNA Barcode) như là một cách để xác định loài Mã vạch được sử dụng là một đoạn ADN ngắn từ một phần của hệ gen và được dùng giống như cách một máy quét ở siêu thị phân biệt được các sản phẩm bằng cách nhận diện được các sọc màu đen đặc chưng của từng sản phẩm Trong công nghệ mã vạch, có thể hai mặt hàng trông rất giống nhau và không phân biệt được bằng mắt thường, song qua mã vạch, máy quét có thể phân biệt được Một

mã vạch ADN điển hình phải đáp ứng được các yêu cầu sau :

- Có tính phổ biến cao để có thể thực hiện trên nhiều loài thực vật;

- Trình tự có tính đặc hiệu cao và có hiệu suất nhân bản cao;

- Có khả năng phân biệt đồng thời được nhiều loài

1.2.1 Trên Thế Giới

Việc sử dụng DNA trong nghiên cứu định loại không phải ý tưởng quá mới, bởi loài người đã biết đến DNA từ năm 1953 Đột phá của mã vạch DNA nằm ở tính chuẩn hóa và đồng bộ của nó Ngh a là với một sinh vật bất kỳ, chỉ cần giải mã đoạn gene Co1(hoặc một số lượng gene rất ít và xác định trước), so sánh với các thư viện DNA hiện có là có thể xác định danh tính loài và xác định loài mới

Tháng 2/2005, tại hội nghị về xây dựng mã vạch sự sống ở Bảo tàng Lịch sử

tự nhiên London, Anh, các nhà khoa học đã thống nhất thực hiện dự án "Sáng kiến xây dựng mã vạch sự sống" với tham vọng nhanh chóng lưu trữ thông tin của

khoảng 10 triệu loài sinh vật trên Trái đất bằng mã vạch DNA

Trong giai đoạn 2003-2010, có tới 411 bài báo khoa học chứa "mã vạch DNA" trong tiêu đề và công cụ này được sử dụng trong rất nhiều l nh vực Đến 2011

mới có 145.298 loài được mô tả mã vạch hợp lệ.[60]

1.2.2 Ở Việt Nam

Xây dựng cơ sở dữ liệu mã vạch ADN là hướng nghiên cứu mới Nhận thấy vai trò, ý ngh a và sự cần thiết của việc xây dựng ngân hàng mã vạch ADN, ở Việt Nam các nhà khoa học cũng như các nhà quản lý cũng đã bắt đầu tiếp cận và quan tâm đến hướng nghiên cứu này, nhằm hướng tới xây dựng một ngân hàng dữ liệu

mã vạch ADN quốc gia cho các loài sinh vật (Động vật, thực vật, vi sinh vật, virut, ) phục vụ phân loại, giám định, chẩn đoán bệnh, bảo tồn và quản lý thương mại nguồn tài nguyên sinh vật ở Việt Nam Theo Hà Văn Huân tổng hợp trên Ngân hàng dữ liệu AND Việt Nam:

Kết hợp phương pháp sinh học phân tử và hình thái trong nghiên cứu phân

loại các họ Thiên lý (Asclepiadaceae) và Trúc đào (Apocynaceae) ở Việt Nam

(2009-2010, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật); Nghiên cứu đánh giá đa dạng

di truyền của cây dó bầu tại Việt Nam bằng kỹ thuật chỉ thị ADN nhằm bảo tồn, hỗ trợ và nâng cao hiệu quả sản xuất trầm hương (2010-2011, Viện Công nghệ sinh học); Định loại phân tử để giám sát thương mại và thương mại hóa các lâm sản ngoài gỗ ở Campuchia, Lào và Việt Nam (2010-2012, Viện Công nghệ sinh học, Viện nghiên cứu hệ gen); Nghiên cứu xây dựng mã vạch ADN (DNA barcode) phục

vụ cho việc định danh sâm Ngọc Linh và cây Bá bệnh (2012-2013, Viện Công nghệ sinh học) (Nguyễn Thị Thu Hiền, 2012; Đinh Thi Phòng, 2011, 2014) Bước đầu, một số kết quả công bố đã chỉ ra có thể sử dụng gen 18S rRNA để phân loại các loài

thuộc chi Bình vôi (Stephania) (Huỳnh Thị Thu Huệ et al., 2003), để xác định mức

độ quan hệ họ hàng giữa Sa mộc (Cunninghamia lanceolata Lamb.) nhập từ Trung Quốc và Sa mộc dầu (Cunninghamia konishii Hayata) mọc tự nhiên (Nguyễn Thị Phương Trang et al., 2009), để phân loại 9 loài thuộc họ Hoàng đàn (Cupressaceae)

ở Việt Nam (Nguyễn Minh Tâm, et al., 2012) Nguyễn Đức Thành và nhóm nghiên

cứu (2007) đã sử dụng một số gen ở lục lạp để nghiên cứu đa dạng di truyền và xuất

xứ một số loài cây lâm nghiệp Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra, các chỉ thị gen lục lạp

là công cụ hữu hiệu trong nghiên cứu đa dạng di truyền và xuất xứ các loài cây lâm nghiệp

Đề tài giám định phân tử và di truyền quần thể của các rừng gỗ Pơ Mu

(Fokienia hodginsii) tại Việt Nam (2010-2011, Trường Đại học Công nghệ - Đại

học Quốc gia Hà Nội); Đánh giá đa dạng di truyền của chi Lan huệ ở Việt Nam bằng chỉ thị phân tử (2010-2011, Trường Đại học Nông nghiệp I); Nghiên cứu hệ

thống phân loại và bảo tồn các loài cây thuộc họ Dầu (Dipterocarpaceae) tại Việt

Nam (2010-2012, Trường Đại học Lâm nghiệp) Trần Hoàng Dũng và cộng sự đã tiến hành xác định một số đoạn ADN đặc trưng để làm mã vạch cho một số nhóm thực vật quý hiếm, đặc hữu, có giá trị kinh tế và dược tính như: Lan Hài

(Paphiopedilum), Hoàng Thảo (Dendrobium), Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis), Củ Hoài Sơn (Discorea persimilis), Ngải sậy hoang An Giang họ Gừng Zingiberaceae, hoặc nấm dược liệu như Linh Chi (Ganoderma), nấm gây

bệnh (Phytothphora); động vật quý hiếm đặc hữu Việt Nam (Nguyễn Hoàng Dũng,

2014) Nguyễn Thị Thanh Nga và cộng sự (2012) đã tiến hành nghiên cứu đánh giá

đa dạng di truyền một số loài cây dược liệu Việt Nam thuộc chi Đảng Sâm

(Codonopsissp) bằng kỹ thuật ADN mã vạch Nghiên cứu đã ứng dụng mã vạch ADN trong phân tích đa dạng di truyền các loài Codonopsis ở Việt Nam Hoàng

Đăng Hiếu và cộng sự (2012), đã sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phân

tích đa dạng cà định dạng của tập đoàn cây Dó Bầu (Aquilaria SP.) tại Hà T nh Hà

Văn Huân (2013, 2014) đã triển khai nghiên cứu „„Xây dựng cơ sở dữ liệu chỉ thị

phân tử ADN mã vạch cho loài Sến mật (Madhuca pasquierii) phục vụ giám định loài„„ và phân lập đoạn DNA barcoding cho loài Trà hoa vàng Tam đảo (Camellia tamdaoensis Hakoda et Ninh) phục vụ bảo tồn và phát triển loài Trà đặc hữu, quý

hiếm của Việt Nam

Các nghiên cứu trên đã tạo tiền đề quan trọng cho hướng nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử vào việc phân loại, giám định, đánh giá đa dạng di truyền, bảo tồn và quản lý thương mại nguồn tài nguyên sinh vật ở nước ta.[56]

1.3 Nghiên cứu đặc điểm lâm học loài cây

1.3.1.Trên thế giới

a) Nghiên cứu đặc điểm sinh học loài cây

Nghiên cứu sinh học loài cây trong đó có các đặc điểm hình thái và vật hậu

đã được thực hiện từ lâu trên thế giới Làm tiền đề cho các môn khoa học khác có liên quan Có rất nhiêu công trình liên quan đến hình thái và phân loại các loài cây Những nghiên cứu này đầu tiên tập trung vào mô tả và phân loại các loài, nhóm loài, Có thể kể đến một vài công trình rất quen thuộc liên quan đến các nước lân cận như: Thực vật chí Hong Kong (1861), Thực vật chí Australia (1866), Thực vật chí rừng Tây Bắc và trung tâm Ấn độ (1874), Thực vật chí Ấn độ 7 tập (1872 - 1897), Thực vật chí Miến Điện (1877), Thực vật chí Malaysia (1892 - 1925), Thực vật chí Hải Nam (1972 - 1977), Thực vật chí Vân Nam (1977), Thực vật chí Quảng Đông, Trung Quốc (9 tập) Sự ra đời của các bộ thực vật chí đã góp phần làm tiền

đề cho công tác nghiên cứu về hình thái, phân loại cũng như đánh giá tính đa dạng

của các khu vực, các vùng khác nhau

Ở Nga, từ 1928 đến 1932 được xem là thời kỳ mở đầu cho thời kỳ nghiên cứu hệ thực vật cụ thể Tolmachop A.I.[49] cho rằng “Chỉ cần điều tra trên một diện tích đủ lớn để có thể bao chùm được sự phong phú của nơi sống nhưng không có sự phân hoá mặt địa lý” Ông gọi đó là hệ thực vật cụ thể Tolmachop đã đưa ra một nhận định là số loài của một hệ thực vật cụ thể ở vùng nhiệt đới ẩm thường là 1500

- 2000 loài

Về vật hậu học, hoạt động sinh học có tính chất chu kỳ của các cơ quan sinh dưỡng và cơ quan sinh sản Chu kỳ vật hậu của cùng 1 loài phân bố ở các vùng sinh thái khác nhau sẽ có sự sai khác rõ rệt Điều này có ý ngh a cần thiết trong nghiên cứu sinh thái cá thể loài và công các chọn tạo giống Các công trình như nêu trên cũng đã ít nhiều nêu ra các đặc điểm về chu kỳ hoa, quả và các đặc trưng vật hậu của từng loài, nhóm loài

b) Nghiên cứu đặc điểm sinh thái học

Nghiên cứu đặc điểm sinh thái của loài làm cơ sở đề xuất biện pháp kỹ thuật lâm sinh tác động phù hợp nhằm nâng cao hiệu quả trong kinh doanh rừng rất được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Theo đó, các lý thuyết về hệ sinh thái, cấu trúc, tái sinh rừng được vận dụng triệt để trong nghiên cứu đặc điểm của một loài cụ thể nào đó

Odum E.P (1971)[27] đã hoàn chỉnh học thuyết về hệ sinh thái, trên cơ sở

thuật ngữ hệ sinh thái (ecosystem) của Tansley A.P (1935) Ông đã phân chia ra

sinh thái học cá thể và sinh thái học quần thể Sinh thái học cá thể nghiên cứu từng

cá thể sinh vật hoặc từng loài, trong đó chu kỳ sống, tập tính cũng như khả năng thích nghi với môi trường được đặc biệt chú ý

Lacher W (1978) đã chỉ rõ những vấn đề cần nghiên cứu trong sinh thái thực vật như: Sự thích nghi với các điều kiện dinh dưỡng khoáng, ánh sáng, độ nhiệt, độ

ẩm, nhịp điệu khí hậu (Nguyễn Thị Hương Giang, 2009).[16]

Tái sinh là một quá trình sinh học mang đặc thù của hệ sinh thái rừng, đó là

sự xuất hiện một thế hệ cây con của những loài cây gỗ ở những nơi còn hoàn cảnh

rừng Hiệu quả của tái sinh rừng được xác định bởi mật độ, tổ thành loài, cấu trúc tuổi, chất lượng cây con, đặc điểm phân bố

Baur G.N (1962) [2] cho rằng, trong rừng nhiệt đới sự thiếu hụt ánh sáng đã làm ảnh hưởng đến phát triển của cây con, còn đối với sự nảy mầm thì ảnh hưởng

đó thường không rõ ràng Đối với rừng nhiệt đới, số lượng loài cây trên một đơn vị diện tích và mật độ tái sinh thường khá lớn Vì vậy, khi nghiên cứu tái sinh tự nhiên cần phải đánh giá chính xác tình hình tái sinh rừng và có những biện pháp tác động phù hợp

Cấu trúc rừng là hình thức biểu hiện bên ngoài của những mối quan hệ qua lại bên trong giữa thực vật rừng với nhau và giữa chúng với môi trường sống Nghiên cứu cấu trúc rừng để biết được những mối quan hệ sinh thái bên trong của quần

xã, từ đó có cơ sở để đề xuất các biện pháp kỹ thuật tác động phù hợp

Hiện tượng thành tầng là một trong những đặc trưng cơ bản về cấu trúc hình thái của quần thể thực vật và là cơ sở để tạo nên cấu trúc tầng thứ Phương pháp vẽ biểu đồ mặt cắt đứng của rừng do David và P.W Risa (1933- 1934) đề sướng và sử dụng lần đầu tiên ở Guyan, đến nay phương pháp đó vẫn được sử dụng nhưng nhược điểm là chỉ minh hoạ được cách sắp xếp theo hướng thẳng đứng trong một diện tích có hạn Cusen (1951) đã khắc phục bằng cách vẽ một số dải kề nhau và đưa lại một hình tượng về không gian 3 chiều

Richards P.W (1952) [28] đã đi sâu nghiên cứu cấu trúc rừng mưa nhiệt đới

về mặt hình thái Theo tác giả, đặc điểm nổi bật của rừng mưa nhiệt đới là tuyệt đại

bộ phận thực vật đều thuộc thân gỗ và thường có nhiều tầng Ông nhận định: "Rừng mưa thực sự là một quần lạc hoàn chỉnh và cầu kỳ nhất về mặt cấu tạo và cũng phong phú nhất về mặt loài cây"

Như vậy, nghiên cứu về tầng thứ theo chiều cao còn mang tính cơ giới, nên chưa phản ánh được sự phân tầng phức tạp của rừng tự nhiên nhiệt đới Việc nghiên cứu về cấu trúc rừng đã và đang được chuyển từ mô tả định tính sang định lượng với sự hỗ trợ của thống kê toán học và tin học Rollet B.L (1971) đã biểu diễn mối quan hệ giữa chiều cao và đường kính bằng các hàm hồi quy, phân bố đường kính

ngang ngực, đường kính tán bằng các dạng phân bố xác suất

Từ việc vận dụng các lý luận về sinh thái, tái sinh, cấu trúc rừng trên, nhiều nhà khoa học trên thế giới đã vận dụng vào nghiên cứu đặc điểm sinh học, sinh thái cho từng loài cây Một vài công trình nghiên cứu có thể kể tới như:

Trung tâm Nông lâm kết hợp thế giới (World Agroforestry Centre, 2006), Anon (1996), Keble và Sidiyasa (1994) đã nghiên cứu đặc điểm hình thái của loài

Vối thuốc (Schima wallichii) và đã mô tả tương đối chi tiết về đặc điểm hình thái

thân, lá, hoa, quả, hạt của loài cây này, góp phần cung cấp cơ sở cho việc gây trồng

và nhân rộng loài Vối thuốc trong các dự án trồng rừng (Hoàng Văn Chúc, 2009)[8]

Tian - XiaoRui trong công trình nghiên cứu về khả năng chịu lửa của một số

loài cây trồng rừng đã rút ra kết luận, Vối thuốc (S wallichii), Castanopsis hystrix và Myrica rubra có sức chống lửa tốt nhất trong tổng số 12 loài cây nghiên cứu

Vối thuốc là loài cây tiên phong ưa sáng, biên độ sinh thái rộng, phân bố rải rác ở các khu vực phía Đông Nam Châu Á Vối thuốc xuất hiện ở nhiều vùng rừng thấp (phía Nam Thái Lan) và cả ở các vùng cao hơn (Nepal) cũng như tại các vùng

có khí hậu lạnh Là cây bản địa của Brunei, Trung Quốc, ấn Độ, Lào, Myanmar, Nepal, Papua New Guinea, Phillipines, Thailand và Việt Nam (World Agroforestry Centre, 2006) Vối thuốc thường mọc thành quần thụ từ nơi đất thấp đến núi cao, phân bố ở rừng thứ sinh, nơi đồng cỏ, cây bụi và ngay cả nơi ngập nước có độ mặn nhẹ Vối thuốc có thể mọc trên nhiều loại đất với thành phần cơ giới và độ phì khác nhau, từ đất cằn cỗi, khô cằn đến đất phì nhiêu, tươi tốt, có thể thấy Vối thuốc xuất hiện nơi đầm lầy Vối thuốc là loài cây tiên phong sau nương rẫy (Laos tree seed project, 2006) (Hoàng Văn Chúc, 2009)[8]

Theo Khamleck (2004) Họ Dẻ có phân bố khá rộng, với khoảng 900 loài chúng được tìm thấy ở vùng ôn đới Bắc bán cầu, cận nhiệt đới và nhiệt đới, song chưa có tài liệu nào công bố chúng có ở vùng nhiệt đới Châu Phi Hầu hết các loài phân bố tập trung ở Châu Á, đặc biệt ở Việt Nam có tới 216 loài và ít nhất là Châu Phi và vùng Địa Trung Hải chỉ có 2 loài (Trần Hợp, 2002) [18]

Như vậy, với các công trình nghiên cứu về lý thuyết sinh thái, tái sinh, cấu

trúc rừng tự nhiên cũng như nghiên cứu đặc điểm sinh học, sinh thái đối với một số loài cây như trên đã phần nào làm sáng tỏ những đặc điểm cấu trúc, tái sinh của

rừng nhiệt đới nói chung

1.3.2 Ở trong nước

a) Những nghiên cứu về đặc điểm sinh học cây rừng

Ngoài những tác phẩm cổ điển về thực vật như “Flora Cochinchinensis“ của Loureiro (1790) và “Flore Forestière de la Cochinchine” của Pierre (1879- 1907), thì từ đầu những năm đầu thế kỷ 20 đã xuất hiện một công trình nổi tiếng, là nền tảng cho việc nghiên cứu về hình thái phân loại thực vật, đó là Bộ thực vật chí Đông Dương do

H Lecomte chủ biên (1907-1952) Trong công trình này, các tác giả người pháp đã thu mẫu, định tên và lập khóa mô tả các loài thực vật bậc cao có mạch trên toàn bộ lãnh thổ Đông Dương, trong đó hệ thực vật Việt Nam có 7004 loài, 1850 chi và 289 họ

Đối với mỗi miền có những tác phẩm lớn khác nhau như ở miền Nam Việt Nam

có công trình thảm thực vật Nam Trung Bộ của Schmid (1974), trong đó tác giả đã chỉ

rõ những tiêu chuẩn để phân biệt các quần xã khác nhau là sự phân hóa khí hậu, chế độ thoát nước khác nhau Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật đã xuất bản bộ sách “Cây cỏ thường thấy ở Việt Nam” gồm 6 tập do Lê Khả Kế chủ biên và ở miền nam Phạm Hoàng Hộ (1970-1972) cũng cho ra đời công trình đồ sộ 2 tập về “Cây cỏ miền Nam Việt Nam”, trong đó giới thiệu 5326 loài, trong đó có 60 loài thực vật bậc thấp và 20 loài rêu, còn lại là 5246 loài thực vật có mạch, và sau này là “Cây cỏ Việt Nam”.[17]

Ngoài ra, còn rất nhiều các bộ sách chuyên khảo khác, tuy không tách riêng cho vùng Tây Nam Bộ nhưng cũng đã góp phần vào việc nghiên cứu đa dạng sinh học thực vật chung, như các bộ về Cây gỗ rừng Việt Nam (Viện điều tra qui hoạch, 1971-1988), Cây thuốc Việt Nam (Viện dược liệu, 1990), Cây tài nguyên (Trần Đình lý và cs, 1993), Cây gỗ kinh tế ở Việt Nam (Trần Hợp & Nguyễn Bội Quỳnh, 1993), 100 loài cây bản địa (Trần Hợp & Hoàng Quảng Hà, 1997), Cây cỏ có ích ở Việt Nam (Võ Văn chi và Trần Hợp, 1999), Tài nguyên cây gỗ Việt Nam (Trần Hợp, 2002), v.v Gần đây Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật cũng đã xây dựng và biên soạn được 11 tập chuyên khảo đến họ riêng biệt Đây là những tài

liệu vô cùng quý giá góp phần vào việc nghiên cứu về thực vật của Việt Nam.

b) Nghiên cứu đặc điểm sinh thái loài cây

Ở nước ta, nghiên cứu về đặc điểm sinh thái học của các loài cây bản địa chưa nhiều, tản mạn, có thể tổng hợp một số thông tin có liên quan đến vấn đề nghiên cứu như sau:

Nguyễn Bá Chất (1996)[7] đã nghiên cứu đặc điểm lâm học và biện pháp gây trồng nuôi dưỡng cây Lát hoa, ngoài những kết quả nghiên cứu về các đặc điểm phân bố, sinh thái, tái sinh, tác giả cũng đã đưa ra một số biện pháp kỹ thuật gieo ươm cây con và trồng rừng đối với Lát hoa

Trần Minh Tuấn (1997) [41] đã nghiên cứu một số đặc tính sinh vật học loài Phỉ ba mũi làm cơ sở cho việc bảo tồn và gây trồng tại Vườn Quốc gia Ba Vì - Hà Tây (cũ), ngoài những kết quả về các đặc điểm hình thái, tái sinh tự nhiên, sinh trưởng và phân bố của loài, tác giả còn đưa ra một số định hướng về kỹ thuật lâm sinh để tạo cây con từ hạt và trồng rừng đối với loài cây này

Vũ Văn Cần (1997) [6] đã tiến hành nghiên cứu một số đặc điểm sinh vật học của cây Chò đãi làm cơ sở cho công tác tạo giống trồng rừng ở Vườn Quốc gia Cúc Phương, ngoài những kết luận về các đặc điểm phân bố, hình thái, vật hậu, tái sinh tự nhiên, đặc điểm lâm phần có Chò đãi phân bố, tác giả cũng đã đưa ra những kỹ thuật tạo cây con từ hạt đối với loài cây Chò đãi

Nguyễn Thanh Bình (2003) [4] đã nghiên cứu một số đặc điểm lâm học của loài Dẻ ăn quả phục hồi tự nhiên tại Bắc Giang Với những kết quả nghiên cứu đạt được, tác giả đã đưa ra nhiều kết luận, ngoài những đặc điểm về hình thái, vật hậu, phân bố, cấu trúc và tái sinh tự nhiên của loài, tác giả còn cho rằng phân bố N - H và N - D đều có một đỉnh; tương quan giữa Hvn và D1,3 có dạng phương trình Logarit

Lê Phương Triều (2003)[38] đã nghiên cứu một số đặc điểm sinh vật học của loài Trai lý tại Vườn Quốc gia Cúc Phương, tác giả đã đưa ra một số kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái, vật hậu và sinh thái của loài, ngoài ra tác giả còn kết luận là: có thể dùng hàm khoảng cách để biểu thị phân bố N - D1,3, N - Hvn, các mối quan hệ H - D1,3, Dt - D1,3

Vương Hữu Nhị (2003)[23] đã nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và kỹ thuật tạo cây con Căm xe góp phần phục vụ trồng rừng ở Đắc Lắc - Tây Nguyên, từ kết quả nghiên cứu với những kết luận về đặc điểm hình thái, phân bố, cấu trúc, tái sinh tự nhiên, tác giả còn đưa ra những kỹ thuật gây trồng đối với loài cây này

Ly Meng Seang (2008)[30] đã nghiên cứu một số đặc điểm lâm học của rừng Tếch trồng ở Kampong Cham Campuchia, đã kết luận: ở các độ tuổi khác nhau: Phân bố N - D1,3 ở các tuổi đều có dạng một đỉnh lệch trái và nhọn, phân bố N - H thường có đỉnh lệch phải và nhọn, phân bố N - Dt đều có đỉnh lệch trái và tù Giữa

D1.3 hoặc Hvn so với tuổi cây hay lâm phần luôn tồn tại mối quan hệ chặt chẽ theo

mô hình Schumacher Ngoài ra, tác giả cũng đề nghị trong khoảng 18 năm đầu sau khi trồng rừng Tếch nên chặt nuôi dưỡng 3 lần theo phương pháp cơ giới, với kỳ dãn cách là 6 năm 1 lần

Nguyễn Toàn Thắng (2008)[31] đã nghiên cứu một số đặc điểm lâm học của

loài Dẻ anh (Castanopsis piriformis) tại Lâm Đồng Tác giả đã có những kết luận rõ

ràng về đặc điểm hình thái, vật hậu, phân bố, giá trị sử dụng, về tổ thành tầng cây

gỗ biến đổi theo đai cao từ 17 đến 41 loài, với các loài ưu thế là Dẻ anh, Vối thuốc răng cưa, Du sam,

Hoàng Văn Chúc (2009)[8] trong công trình “Nghiên cứu một số đặc điểm tái sinh tự nhiên loài Vối thuốc (Schima wallichii Choisy) trong các trạng thái rừng

tự nhiên phục hồi ở tỉnh Bắc Giang” đã mô tả một cách chi tiết về đặc điểm hình thái, vật hậu, tái sinh, phân bố,… của loài cây này ở khu vực tỉnh Bắc Giang Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần nhân rộng loài cây bản địa có giá trị này

1.4 Cơ sở khoa học của nhân giống bằng hom

Nhân giống bằng hình thức giâm hom là hình thức nhân giống sinh dưỡng (vô tính), là hình thức dùng một bộ phận sinh dưỡng của thực vật để tạo thành cây mới

Nhân giống bằng hom là một phương thức nhân giống dựa trên cơ sở của phân bào nguyên nhiễm Cây hom không những giữ được đặc điểm di truyền mong muốn mà còn có khả năng sinh trưởng nhanh và năng suất cao Vì thế, nhân giống

bằng hom là công cụ có hiệu quả cao cho việc nhân giống cây rừng là phương thức

áp dụng phổ biến để nhân giống các dòng vô tính năng xuất chất lượng cao

Thông thường nói đến giâm hom là nói đến hom cành và hom thân là chủ yếu và trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành giâm hom bằng cành, do đó việc làm cho hom ra rễ là vấn đề quyết định đến hiệu quả giâm hom Nhưng sự ra rễ của hom lại phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: đặc điểm di truyền, thời vụ, đặc điểm xuất

xứ, đặc điểm của hom, chất điều hòa sinh trưởng, đặc điểm cây mẹ, các điều kiện môi trường

1.4.1 Cơ sở của phương pháp giâm hom

a) Cơ sở của sự hành thành rễ bất định

Rễ bất định là rễ sinh ra ở bất kỳ bộ phận nào của cây ngoài hệ rễ của nó Có hai loại rễ bất định là rễ tiềm ẩn và rễ mới sinh Rễ tiềm ẩn có nguồn gốc tự nhiên trong cây nhưng chỉ phát triển khi đoạn thân hay đoạn cành tách rời khỏi thân, rễ mới sinh hình thành khi cắt hom và là hậu quả của phản ứng với vết cắt Khi hom bị cắt rời khỏi cây mẹ, các tế bào sống ở vết cắt bị tổn thương và các tế bào dẫn truyền

đã chết của mô gỗ bị hở và gián đoạn, sau đó xảy ra quá trình tái sinh theo 3 bước:

- Các tế bào bị tổn thương ở mặt ngoài bị chết và hình thành một lớp tế bào

bị thối trên bề mặt, vết thương được bọc một lớp Bần, mạch gỗ được đậy lại bằng lớp keo, lớp bảo vệ này giúp cho mặt cắt không bị thoát nước

- Các tế bào sống ở ngay dưới lớp bảo vệ đó bắt đầu phân chia sau khi bị cắt vài ngày và có thể hình thành lớp mô mềm Các tế bào ở vùng lân cận của tượng tầng và libe bắt đầu hình thành rễ bất định

- Cây gỗ có một hoặc nhiều lớp mô gỗ thứ cấp và libe thì rễ bất định thường phát sinh ở tế bào nhu mô còn sống của hom, bắt nguồn từ libe thứ cấp còn non Tuy vậy, đôi khi rễ bất định cũng phát sinh từ mạch rây, tượng tầng, libe, bì khổng

b) Các nhân tố ảnh hưởng tới khả năng ra rễ của hom

Việc làm cho hom ra rễ là vấn đề quyết định đến hiệu quả giâm hom Nhưng khả năng ra rễ của hom lại phụ thuộc vào nhiều yếu tố, các yếu tố được chia 2 nhóm chính:

- Nhóm 1: Yếu tố nội sinh bao gồm đặc điểm di truyền của loài; đặc điểm di truyền của xuất xứ từng cá thể; tuổi cây mẹ lấy hom; vị trí hom và tuổi hom; sự tồn tại của lá trên hom và các chất điều hòa sinh trưởng nội sinh v.v

- Nhóm 2: Yếu tố ngoại sinh bao gồm các yếu tố như: Điều kiện sống của cây mẹ; các điều kiện môi trường vô sinh; thời vụ; giá thể; chất điều hòa sinh

trưởng ngoại sinh;

1.4.2 Nhu cầu sinh lý của cành đã cắt rời

Cây muốn sống thì cần có quang hợp và thoát hơi nước Khi cành còn trên cây mẹ thì việc thoát hơi nước không phải là trở ngại, nhưng khi hom được cắt rời khỏi cây mẹ thì nó trở thành vấn đề quan trọng vì khi đó hom không được cây mẹ cung cấp nước, mặt khác hom lại chưa có rễ để tự hút nước Do đó việc giữ nước cho hom luôn ở trong môi trường không khí ẩm là việc cần thiết

Mặc dù hom được cắt khỏi cây mẹ nhưng chúng vẫn sống, vật chất dự trữ trong hom được cung cấp để nuôi sống hom Nhưng chúng vẫn cần phải quang hợp

để tăng tổng hợp vật chất nên lá để lại trên hom cho chúng quang hợp cũng hết sức cần thiết

Giai đoạn đầu giâm hom, hom giâm không thể hút được chất dinh dưỡng từ đất do chưa có rễ vì vậy dinh dưỡng ở giai đoạn này chủ yếu là do cây mẹ cung cấp Bởi vậy công tác chăm sóc và trẻ hóa cây mẹ để chuẩn bị cho lấy vật liệu làm hom

là việc làm cần thiết

1.5 nghĩa của nh n giống ằng hom

Nhân giống bằng hom là phương pháp nhân giống sinh dưỡng có ý ngh a lớn

mà trong đó có thể giữ được các biến dị di truyền tốt của cây mẹ truyền lại cho thế

được ưu thế lai của đời F1 mà còn khắc phục được hiện tượng phân ly ở đời F2 Cây hom vừa sinh trưởng nhanh như cây hạt đời F1 vừa giữ được tính đồng đều của cây lai F1 về hình thái và sinh trưởng

Nhân giống hom làm rút ngắn chu kỳ sinh sản, một phương thức nhân nhanh các loài cây quý hiếm đang bị cạn kiệt, là phương thức góp phần bảo tồn nguồn gen cây rừng

1.6 Những nghiên cứu về chi Camellia

1.6.1 Những nghiên cứu về chi Camellia trên Thế Giới

Những năm gần đây, các loại lâm sản ngoài gỗ có giá trị cao về dược liệu,

làm cảnh đã được nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu, trong đó có chi Camellia Chi Camellia bắt đầu được nghiên cứu từ đầu thế kỷ 17, tên Camellia do nhà thực

vật học nổi tiếng của Thụy Điển tên là Line đặt Trong cuốn "Genera plantarum" để tưởng nhớ vị cha cố kính yêu là "Camellus Job" và gần 20 năm sau mới có một số

loài được nghiên cứu và mô tả Loài đầu tiên được nghiên cứu và mô tả là Camellia japonica, sau đó là loài Camellia sinensis Mặc dù những nghiên cứu về các loài

thuộc chi này còn ít và chưa sâu Đồng thời lịch sử nghiên cứu về các loài trong chi

Camellia có rất nhiều thay đổi và chi Camellia mới thực sự được các nhà thực vật

học chú ý nghiên cứu kỹ từ khoảng cuối thế kỷ 17 nhưng nó đã đánh dấu một bước

khởi đầu và là tiền đề cho các nghiên cứu về chi Camellia sau này

 Những nghiên cứu ở Ch u Âu

Từ những năm đầu của thế kỷ XX (1904 - 1931) nhà sưu tập thực vật học G

Forest (người Anh) đã đến Vân Nam - Trung Quốc và thu thập các loài Camellia reticulata, Camellia saluenensis về trồng tại Vườn thực vật hoàng gia Anh Và nhà thực vật học Robert Sealy cũng đã đi sâu và nghiên cứu kỹ chi Camellia, trong cuốn

"Revesion of the genus Camellia" năm 1958 ông đã giới thiệu và mô tả 82 loài, trong đó có 62 loài ông đã căn cứ vào những đặc điểm cần thiết để phân loại chúng thành 12 nhánh, còn lại 20 loài không được xếp vào nhánh nào có lẽ vì thiếu những đặc điểm cần thiết[49]

 Những nghiên cứu ở Trung Quốc

Các nhà thực vật học Trung Quốc đã phát hiện ra loài Camellia hoa vàng đầu tiên tại Quảng Tây vào năm 1964, đó là loài Camellia chrysantha (Hu) Tuyama, kể

từ đó đến nay việc nghiên cứu về chi Camellia ở Trung Quốc được đặc biệt chú ý

Theo Trương Hồng Đạt (1998)[45] đã có 16 loài Camellia hoa vàng được

phát hiện tại Trung Quốc và họ đã nhanh chóng tìm ra tác dụng nhiều mặt của nó

Có thể nói Trung Quốc là nước đi đầu trong việc nghiên cứu ứng dụng và khai thác

các nguồn lợi từ các loài trong chi Camellia đặc biệt trong nghệ thuật làm cây cảnh Việc nghiên cứu về chi Camellia ở Trung Quốc đã được thực hiện một cách nghiêm

túc, bài bản và có hệ thống từ cuối thế kỷ 19 cho tới hiện nay như nghiên cứu của

Cheng Jin Shui và các cộng sự đã tiến hành phân loại các loài trong chi Camellia,

tiến hành nhân chéo, lai tạo giống mới Chỉ sau 20 năm họ đã tạo ra được hơn 300 loài cho hoa khác nhau

Khi tiến hành phân loại chi Camellia hai tác giả Trình Kim Thuỷ (1998)[36]

và Trương Hồng Đạt (1998)[45] đã phân thành 4 chi phụ là: Protocamellia, Camellia, Metacamellia và Thea Trong các chi phụ này lại được chia ra thành các

nhóm loài và các loài khác nhau Sau này nghiên cứu của Chang Hung Ta một nhà thực vật học Trung Quốc trong cuốn "Camellias" xuất bản năm 1981 ông cũng

thống nhất chia chi Camellia thành 4 chi phụ và 20 nhánh Trong công trình nghiên cứu của ông cho thấy sự phân bố của chi Camellia rất tập trung ở một số tỉnh miền

nam Trung Quốc như: Quảng Tây, Quảng Đông, Vân Nam và kéo xuống miền bắc Việt Nam Quan điểm và kết luận đó rất giống với quan điểm của một số nhà thực vật học Trung Quốc như: Xia Lijang, Quan Kaiyun Khi giới thiệu về những loài

thuộc chi Camellia hoa vàng trong cuốn "An introduction to the yellow Camellia",

đồng thời trong cuốn "Camellias" ông cũng đưa ra một số đặc điểm quan trọng để

có thể phân biệt với 3 chi lớn khác trong họ như:

- Các thành phần của hoa thường nhiều và ít có sự phân hoá

- Sự phân bố của nhị thường tập trung và liên tục do vậy số loài trên một đơn

vị diện tích có thể là lớn hơn hẳn so với các chi trong họ

- Chi Camellia gồm nhiều nhóm rất phức tạp, với mối quan hệ trong hệ thống

phát sinh chủng, loại, giống, loài rõ ràng hơn so với các chi khác trong họ

- Trong chi Camellia có rất nhiều loài có giá trị kinh tế

Việc nghiên cứu về các loài trong chi Camellia được bắt đầu ở Trung Quốc

từ những năm 40 của thế kỷ XX Bằng kết quả của việc chọn giống, nhân giống, gây tạo đã đưa số chủng loại từ 20 lên 120 loài Đầu những năm 1950 ở Côn Minh -

Trung Quốc đã đưa việc nghiên cứu các loài trong chi Camellia thành trọng điểm và

cũng đi sâu vào nghiên cứu nguồn giống, phân loại, lai tạo ra các giống mới để phát triển và thiết lập các nguồn giống, xây dựng thành ngân hàng gen phục vụ cho các mục tiêu sản xuất nguyên liệu công nghiệp, đồ uống và cây cảnh

Trong một công trình nghiên cứu về Trà hoa vàng, hai nhà khoa học của Trung Quốc là Chen Jihui và Wu Shurong đã đưa ra các kết luận và bằng chứng, chứng minh tác dụng chữa bệnh của Trà hoa vàng dựa trên các kiểm nghiệm lâm sàng được tiến hành trong một thời gian dài Công trình của hai nhà nghiên cứu đã được báo cáo tại hội nghị UNESCO thế giới về hóa sinh học vô cơ ứng dụng Vào năm 1994, hơn 120 học giả chuyên ngành của thế giới đã công nhận công trình này tại hội nghị toàn cầu về Trà được tổ chức tại Nam Ninh - Trung Quốc

Như vậy, ở Trung Quốc các loài cây trong chi Camellia đã được các nhà

khoa học, các nhà chuyên môn nghiên cứu một cách nghiêm túc và có bài bản Trung Quốc là nước đi đầu trong việc nghiên cứu ứng dụng, khai thác các loài trà hoa trong nghệ thuật cây cảnh, làm thuốc, đồ uống và có bề dày trong sử dụng các loài cây này

1.6.2 Những nghiên cứu về chi Camellia ở Việt Nam

Những năm trước đây đã có một số công trình nghiên cứu về các loài trong

họ Theaceae và trong chi Camellia, nhưng việc nghiên cứu mới chỉ tập trung vào

một số loài cây lấy lá làm dược liệu, chế biến nước giải khát còn việc nghiên cứu

chi Camellia với mục đích phân loại, thống kê, bảo tồn loài, bảo tồn đa dạng sinh học còn ít, chưa sâu, chưa toàn diện Trong những năm gần đây chi Camellia đã

thực sự được các nhà thực vật học Việt Nam quan tâm

Người đầu tiên nghiên cứu chi Camellia ở Việt Nam là L Pierre, nhà thực

vật học nổi tiếng người Pháp, sau khi nghiên cứu hệ thực vật ở một số nơi như: Biên Hoà, Hà Tây, và đầu nguồn sông Đồng Nai, năm 1887 ông đã giới thiệu một số loài

của chi Camellia trong cuốn: "Flore forestiere de la cochinchine" dưới tên chi Thea như: Thea dormoyana, Thea piquetiana, Thea drupifera, Thea caudata

Năm 1910, nhà thực vật học người Pháp là Pitard đã nghiên cứu thực vật ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam như: Hà Nội, V nh Phúc, Hoà Bình và cho ra cuốn:

"Flora Générale de L' Indochine" đã giới thệu 3 loài mới đều lấy tên chi Thea đó là: Camellia tonkinensis dưới tên Thea tonkinensis, Camellia flava dưới tên Thea flava,Camellia amplexicaulis dưới tên Thea amplexicaulis

Hơn 30 năm sau, vào năm 1943 nhà thực vật học Gagnepain đã nghiên cứu,

hệ thống và mô tả chi tiết 30 loài thuộc chi Camellia, nhưng khi tiến hành so sánh

và đối chiếu với tài liệu của Sealy và Chang thì có một số loài có tên đồng ngh a, nên số loài mà nhà thực vật học Gagnepain công bố chỉ còn lại 28 loài Ngoài ra, qua các cuộc khảo sát thực vật ở các vùng khác nhau của các chuyên gia thực vật

hai nước Việt Nam và Trung Quốc, một số loài mới được công bố như: Camellia aurea, Camellia vietnamensis, Camellia indochinensis

Tháng 2 năm 1923, Alfred Petelot thầy thuốc người Pháp đã tiến hành thu thập một số loài thực vật của vùng núi Tam Đảo nay trở thành Vườn quốc gia Tam Đảo Dựa trên mẫu vật mang số hiệu 848 lưu giữ tại phòng tiêu bản thuộc trường đại học California (UC) nhà thực vật người Pháp Elmer Drew Merrill đã công bố

loài mới và đặt tên là Thea petelotii vào năm 1924 Theo luật danh pháp quốc tế, Robert Sealy một nhà thực vật người Anh đổi thành Camellia petelotii (Merr) Sealy

vào năm 1958 trong tác phẩm “Revesion of the genus Camellia” Đây là loài

Camellia đầu tiên ghi nhận có ở VQG Tam Đảo (Sealy, 1958).[47]

Từ năm 1990 đến 1998 nhiều cuộc khảo sát của các nhà nghiên cứu thuộc Viện điều tra quy hoạch rừng, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Trường Đại học Lâm nghiệp Trong các bảng danh lục có đề cập đến một số loài thuộc chi

Camellia mà các nhà thực vật người Pháp đã thu được ở các vùng khác nhau trên

lãnh thổ Việt Nam

Ngoài ra, còn có một số công trình nghiên cứu về các loài trong chi Camellia

ở Việt Nam như sau:

Nghiên cứu của tác giả Ngô Quang Đê bằng phương pháp điều tra theo tuyến

đã điều tra phát hiện khu vực phân bố, đặc điểm hình thái, sinh thái của một số loài Trà hoa tại Vườn quốc gia Ba Vì – Hà Tây (nay là Hà Nội) đã cho thấy ở Vườn

quốc gia Ba Vì có hai loài Camellia có triển vọng thuần hóa làm cây cảnh Phần lớn

những loài này đều phân bố ở độ cao trên 600m, nơi có tầng đất dày, xốp ẩm, hơi chua dưới tán rừng, là các loài sinh trưởng chậm, chịu bóng nhạy cảm với điều kiện ngoại cảnh nên cần có kỹ thuật tốt Hơn nữa, tác giả Ngô Quang Đê đã di thực thuần

hóa thành công 2 loài: Trà hoa thơm Ba Vì (Camellia vietnamensis) và Trà hoa vàng Ba Vì (Camellia tonkinensis (Pitard) Cohen Stuart), hai loài này sinh trưởng

phát triển tốt đồng thời cho hoa đẹp vào dịp xuân về Đó cũng là một trong số rất nhiều loài Trà hoa mà tác giả đã thuần hóa trồng thành công tại vườn Trà của mình (Ngô Quang Đê, 1996).[10]

Với nghiên cứu khảo sát điều kiện sống của Trà hoa vàng tại Ba Vì – Hà Tây

và Sơn Động – Bắc Giang nhóm tác giả: Ngô Quang Đê, Ngô Quang Hưng và Lê

Sỹ Doanh đã đánh giá được điều kiện sống cũng như các đặc điểm hình thái sinh

thái đặc trưng của hai loài Trà hoa vàng Ba Vì (Camellia tonkinensis (Pitard) Cohen Stuart) và Trà hoa vàng Sơn Động (Camellia euphlebia Merret Sealy var

microphylla) (Ngô Quang Đê và cộng sự, 2009).[13]

Đặc điểm hình thái, sinh thái, sinh trưởng của hai loài Camellia hoa trắng và Camellia hoa vàng tại Vườn quốc gia Ba Vì – Hà Tây đã được hai tác giả Hoàng

Minh Chúc (1996)[9] và Bùi Văn Khánh (1996)[20] quan tâm nghiên cứu Tuy nhiên, tác giả mới chỉ dừng lại ở việc điều tra tổ thành loài cây, xác định quan hệ của loài với môi trường sống thông qua yếu tố khí hậu tại khu vực phân bố của loài nghiên cứu

Năm 1995, Trần Thị Phương Anh (1995)[1] đã nghiên cứu phân loại chi

Camellia ở Vườn quốc gia Cúc Phương Tuy rằng chỉ nghiên cứu ở một địa điểm là

Vườn quốc gia Cúc Phương với những loài đã nghiên cứu trước đây, song cũng đã

phần nào góp phần vào việc làm chi tiết hơn sự đa dạng của chi Camellia Cũng vào

năm 1995, trong tạp chí: "Di truyền và ứng dụng" PGS.TS Trần Ninh công bố hai

loài Camellia hoa vàng thu được ở Vườn quốc gia Cúc Phương, trong đó loài Camellia cucphuongensis là loài mới cho khoa học

Tác giả Lê Xuân Trường (1997)[39] đã nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh

thái, sinh trưởng của loài Camellia hoa vàng tại Sơn Động – Bắc Giang Kết quả

nghiên cứu đã chỉ ra được các đặc điểm hình thái, sinh thái cũng như các điều kiện môi trường tác động trực tiếp tới loài Trà hoa vàng Tuy nhiên, đề tài chưa xác định chính xác được tên khoa học của đối tượng nghiên cứu, khả năng ứng dụng thực tiễn cũng như các biện pháp nhân giống bảo tồn, phát triển bền vững

Trà hoa vàng (Camellia petelotii) xuất hiện ở núi Tam Đảo, độ cao từ 800m

trở lên, khu vực khí hậu á nhiệt đới, nơi có nhiệt độ bình quân năm là 18,2oC, nhiệt

độ cao nhất 25,1oC, nhiệt độ thấp nhất - 0,2oC, lượng mưa bình quân năm khoảng 2.630mm, lượng mưa tháng cao nhất 507,8mm, tháng thấp nhất 42mm, độ cao không khí cao từ 82 – 92%, lượng bốc hơi thấp (khoảng 561,5mm/ năm) Không có tháng khô, tháng hạn, tháng kiệt Đất feralit nâu vàng phát triển trên đá mẹ Rhyolit,

độ dốc từ 20 – 30o, độ dày tầng đất > 60cm Đất hơi chua, mùn ở mức trung bình, đạm ở mức trung bình, P2O5 nghèo, K2O dễ tiêu ở mức trung bình Đất có thành phần cơ giới từ thịt nhẹ đến thịt trung bình, đất ẩm, xốp, tỉ lệ đá lẫn từ 10 – 30% Trạng thái rừng IVa, trữ lượng từ 159,6 – 203,0m3/ha; tổ thành rừng chủ yếu là Phân mã tuyến nổi, Kháo, Trọng đũa, Gội, Re, Trắc vàng…; rừng được bảo vệ tốt, hầu như không bị tác động, tổ thành loài khá phong phú Trà hoa vàng là cây chịu bóng, phân bố ở tầng dưới của tầng cây cao và có quan hệ mật thiết với các loài Phân mã tuyến nổi, Kháo, Gội, Re, Trâm,…(Đỗ Đình Tiến, 2000).[37]

Cũng theo Đỗ Đình Tiến, khả năng nhân giống bằng hom loài Trà hoa vàng

là hiện thực Khả năng ra rễ của hom phần nào có chịu ảnh hưởng của việc xử lý chất điều hoà sinh trưởng, đồng thời chịu ảnh hưởng rõ rệt của yếu tố mùa vụ lấy hom

Theo Nguyễn Thị Thu phương (2011)[29], so sánh kết quả nghiên cứu về tỉ

lệ sống, tỉ lệ hom ra rễ và chất lượng rễ của hai loại trà nhận thấy rằng Trà hoa vàng

Ba vì có khả năng nhân giống bằng hom cao hơn Trà hoa vàng Tam đảo Các chỉ tiêu cho các thí nghiệm được tổng hợp như sau: Trà hoa vàng Tam đảo có 82,7% tỉ

lệ hom sống, 50,8% tỉ lệ hom ra rễ và chỉ số ra rễ là 10,12% Kết quả tương ứng cho Trà hoa vàng Ba vì như sau: 84,76%; 58,73% và 15,34%

Chương 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Mục tiêu nghiên cứu

- Xây dựng được cơ sở dữ liệu ADN mã vạch Trà hoa vàng loài

C.chrysantha;

- Xác định được một số đặc điểm lâm học Trà hoa vàng tại khu vực Ba Chẽ;

- Xây dựng được kỹ thuật nhân giống vô tính bằng phương pháp giâm hom; Nhằm phục vụ công tác bảo tồn và phát triển loài thực vật quý hiếm này

2.2 Đối tượng nghiên cứu

- Đối tượng: Cây Trà hoa vàng tại huyện Ba chẽ, tỉnh Quảng Ninh

- Vật liệu: Cành bánh tẻ của cây Trà hoa vàng

2.3 Địa điểm nghiên cứu

- Địa điểm thu mẫu: tại huyện Ba Chẽ tỉnh Quảng Ninh

- Địa điểm bố trí thí nghiệm: Vườn ươm trường Cao đẳng Nông lâm Đông Bắc – Quảng Ninh

2.4 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được các mục tiêu, các nội dung nghiên cứu được tiến hành bao gồm:

- Nghiên cứu xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch cho cây Trà hoa vàng Ba

Chẽ: Thu mẫu, tách chiết AND, điện di kiểm tra độ tinh sạch của AND, thực hiện nhân bản đoạn gen bằng k thuật PCR-RAPD, đọc trình tự, phân tích cơ sở dữ liệu

AND mã vạch;

- Nghiên cứu một số đặc điểm lâm học của Trà hoa vàng (C chrysantha):

Xác định phân bố, đặc điểm sinh trưởng, đặc điểm sinh học, sinh thái học;

- Nghiên cứu kỹ thuật giâm hom Trà hoa vàng: Ảnh hưởng của nồng độ các

chất ĐHST thực vật đến tỉ lệ sống, ra rễ; giá thể; loại hom, ánh sáng

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Nghiên cứu mã vạchADN (DNA barcode) cho cây Trà hoa vàng Ba Chẽ

a) Công tác chuẩn bị:

Mẫu phân tích ADN: 06 mẫu lá tươi từ 03 cá thể mỗi loài được thu lấy từ khu rừng tự nhiên Sơn Động (Bắc Giang) và Ba Chẽ (Quảng Ninh) Các mẫu lá được ký

hiệu lần lượt là: CeBG1, CeBG2, CeBG3, CeQN1, CeQN2 và CeQN3 Mẫu lá tươi

ngay sau đó được cho vào túi Ziplock chứa silica gel và vận chuyển về Phòng thí nghiệm lưu trữ ở -800C cho đến khi ADN được tách chiết

b) Phân tích mã vạch AND

- Tách chiết ADN hệ gen

AND hệ gen được tách chiết theo phương pháp CTAB (Cetyl

trimethylammonium bromide) của Saghai Maroof et al., 1984 Khoảng 100 mg mô

lá được nghiền trong cối bằng chày sứ trong 600 ml đệm CTAB (2% CTAB, 20

mM EDTA, 1,4 M NaCl, 1% beta-mercaptoethanol, 100 mM Tris-HCl pH 8.0) Mẫu được chuyển vào ống ly tâm 1,5 ml và ủ ở 650C trong bể ổn nhiệt 30 phút, sau

đó được chiết xuất với cùng một thể tích với chlorophorm Các mẫu được ly tâm ở 10.000 vòng/phút Pha dung dịch được chuyển sang ống ly tâm 1,5 ml mới ADN được kết tủa bằng cách thêm 500 l isopropanol lạnh và ly tâm ở 10.000 vòng/phút ADN tủa sau đó được rửa sạch bằng cồn 70% Làm khô và hòa tan ADN trong 50

C trong 3 phút; (950C: 30 giây, 570

C-620C: 30 giây, 720C: 1 phút) lặp lại 40 chu kỳ; 720C trong 7 phút; bảo quản sản

phẩm PCR ở 040C Sản phẩm PCR được được di trên gel agarose 1,2% Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ Kit của hãng Norgen biotek, Canada Trình tự nucleotide được đọc trên máy ABI PRISM®3730xl DNA Analyzer (ABI, Foster City, CA, USA)

- Phân tích dữ liệu mã vạch ADN (DNA barcode)

Trình tự thu được được xử lý bằng các phần mềm Bioedit version 7.2.5, và công

cụ BLAST (Bagic local Alignment Search Tool) trên NCBI (National Center for Biotechnology Information) tại địa chỉ website: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

2.5.2 Nghiên cứu một số đặc điểm Lâm học Trà hoa vàng

- Phương pháp kế thừa tài liệu:

Trong quá trình nghiên cứu đề tài có áp dụng phương pháp kế thừa tài liệu,

đề tài sử dụng những kết quả các công trình nghiên cứu về đặc điểm sinh học của Trà hoa vàng Kế thừa có chọn lọc về điều kiện tự nhiên, kinh tế - xã hội huyện Ba Chẽ - Quảng Ninh

- Phương pháp điều tra theo tuyến:

Để nghiên cứu đặc điểm phân bố tự nhiên của Trà hoa vàng, đề tài căn cứ vào bản đồ hiện trạng rừng, tiến hành điều tra sơ thám theo tuyến, các tuyến điều tra

đi qua những dạng địa hình chính của huyện Ba Chẽ - Quảng Ninh Trên các tuyến, nghiên cứu tiến hành quan trắc sự xuất hiện của Trà hoa vàng, tại mỗi vị trí có phân

bố cây trà chúng tôi tiến hành xác định ranh giới khu vực điều tra và lập các ô tiêu chuẩn

Đề tài chọn ô tiêu chuẩn diện tích 1000m2

(20m x 50m) Nội dung điều tra tại mỗi vị trí có phân bố Trà hoa vàng gồm vị trí tương đối,

độ cao, độ dốc mặt đất, kích thước cây Trà hoa vàng, độ tàn che tầng cây cao, nghiên cứu tổ thành loài cây đi kèm bằng phương pháp ô tiêu chuẩn 6 cây của Thomasius, nghiên cứu độ che phủ của các cây bụi thảm tươi

- Điều tra ô tiêu chuẩn:

Khu vực được chọn phải mang tính chất đại diện, OTC cố định được đặt tại các vị trí có tính đại diện cao cho rừng Địa hình trong ô tương đối đồng nhất, cây

rừng phân bố tương đối đồng đều, sinh trưởng bình thường, OTC không được đặt vắt qua khe, qua đỉnh hay qua đường mòn, diện tích OTC được cải bằng tùy theo độ dốc nơi đặt ô

- Phương pháp lập OTC:

OTC được lập bằng thước dây và địa bàn cầm tay với sai số khép kín ≤ 1/200, diện tích ô thiêu chuẩn được xác định là 1000 m2 (20m x 50m) Căn cứ vào điền kiện địa hình và mục đích nghiên cứu đề tài lập 6 ô tiêu chuẩn nơi có Trà hoa vàng phân bố

- Phương pháp điều tra cây:

Cây tiêu chuẩn được chọn để đo đếm các chỉ tiêu như: Hình thái, thân, rễ, lá, hoa, quả và lấy hom để nhân giống vô tính cây tiêu chuẩn điển hình được xác định theo nguyên tắc dưới đây:

+ Cây tiêu chuẩn phải có đặc trưng cần nghiên cứu

+ Cây tiêu chuẩn có cấu trúc, hình thái thân thẳng đẹp, có sức sinh trưởng tốt Dung lượng điều tra cho các phương pháp nghiên cứu cụ thể: Do có nhiều chỉ tiêu để nghiên cứu đặc tính sinh vật học nên một phương pháp nghiên cứu cụ thể

có thể là phù hợp cho nội dung nghiên cứu này nhưng không phù hợp cho nội dung nghiên cứu khác Do đó phải sử dụng nhiều phương pháp nghiên cứu cụ thể khác nhau nên dung lượng mẫu quan sát cho từng phương pháp cũng khác nhau, nhưng đều phải đảm bảo độ tin cây cần thiết của phương pháp nghiên cứu đặt ra, về nguyên tắc thì: Dung lượng mẫu quan sát n ≥ 30 rút ngẫu nhiên không lặp

- Điều tra tầng cây cao:

Tầng cây cao theo quan điểm lâm học đó là những cây có tán tham gia vào tầng tán rừng, có D1.3 ≥ 6 cm

Các chỉ tiêu đo đếm tầng cây cao:

+ Đo D1.3 bằng thước kẹp kính có khắc vạch tới cm

+ Đo Hvn, HDC, DT bằng sào đo cao Về các chỉ tiêu D1,3, Hvn, HDC, DT và đánh

giá phẩm chất từng cây Kết quả ghi vào biểu điều tra tầng cây cao

- Biểu điều tra tầng cây tái sinh:

Trong OTC lập 5 ODB, 4 góc lập 4 ODB và 1 ODB ở giữa OTC, có diện tích

25 m2, kích thước 5m x 5m Trong các ODB tiến hành đo đếm số lượng cá thể, kích thước, tình hình sinh trưởng, nguồn gốc tái sinh của các cây thân gỗ Kết quả điều tra được ghi vào biểu điều tra cây tái sinh

- Điều tra cây bụi thảm tươi:

Điều tra cây bụi theo các chỉ tiêu: tên loài chủ yếu, số lượng khóm (bụi), chiều cao bình quân, độ che phủ trung bình của từng loài trên ODB, kết quả ghi vào

phiếu điều tra cây bụi

Trong quá trình đi điều tra thực địa tiến hành thu hái mẫu và tiêu bản về giám định tên loài

- Nội nghiệp:

+ Tổ thành tầng cây gỗ

Hệ số tổ thành của các loài cây thường được xác định theo số cây hoặc theo tiết diện ngang Trên quan điểm sinh thái người ta thường xác định tổ thành tầng cây cao theo số cây còn trên quan điểm sản lượng, người ta lại xác định tổ thành thực vật theo tiết diện ngang hoặc theo trữ lượng

Để xác định tổ thành tầng cây cao, đề tài sử dụng phương pháp xác định giá trị (độ) quan trọng (Important Value - IV %) của Daniel Marmillod:

Trong đó:

IVi% là tỷ lệ tổ thành (độ quan trọng) của loài i Ni% là % theo số cây của loài i trong QXTV rừng Gi% là % theo tổng tiết diện ngang của loài i trong QXTV rừng Theo Thái Văn Trừng loài cây có IV% ≥ 5% mới thực sự có ý ngh a về mặt sinh thái trong QXTV rừng Những loài cây xuất hiện trong công thức tổ thành là loài có IV% ≥ giá trị bình quân của tất cả các loài tham gia trong QXTV rừng

Cấu trúc mật độ là chỉ tiêu biểu thị số lượng cá thể của từng loài hoặc của tất cả các loài tham gia trên một đơn vị diện tích (thường là 1ha), phản ánh mức

độ tận dụng không gian dinh dưỡng và vài trò của loài trong QXTV rừng

Công thức xác định mức độ thường gặp của một loài như sau:

Trong đó:

r là số cá thể của loài i trong QXTV rừng

R là tổng số cá thể điều tra của QXTV rừng

Nếu Mtg > 50%: Rất hay gặpMtg = 25 - 50%: Thường gặp Mtg < 25%: ít gặp

+ Mức độ thân thuộc

Mức độ thân thuộc thể hiện mức độ gắn bó của các loài với nhau trong QXTV rừng Để xác định mức độ thân thuộc của hai loài, đề tài sử dụng chỉ số thân thuộc q của Sorensen (1948):

c là số lần lấy mẫu gặp cả loài A và B

Nếu: q = 0 hoặc gần bằng 0, A và B không có quan hệ thân thuộc

q = 1, A và B có quan hệ thân thuộc và sự chung sống của chúng trong QXTV rừng là thực chất chứ không phải do ngẫu nhiên

0 < q < 1, A và B do ngẫu nhiên mà cùng cư trú ở một nơi

2.5.3 Thí nghiệm giâm hom Trà hoa vàng

a) Công tác chuẩn bị

Hom được lấy từ cây mẹ sinh trưởng và phát triển tốt, không sâu bệnh hại, cắt những cành cấp 1 và chồi vượt tại huyện Ba Chẽ - Quảng Ninh Cành để cắt hom và hom được cắt vào buổi sáng, cắt xong để vào nước để giữ ẩm cho hom

- Dụng cụ cắt hom: Để tránh hiện tượng hom dập nát, trầy xước cần cắt cẩn thận bằng kéo bằng dụng cụ chuyên dụng như dao, kéo loại sắc, mới

- Giá thể giâm hom là nơi giâm hom đã được xử lý chất điều hòa sinh trưởng, Trong trường hợp này giá thể được chuẩn bị là đất rừng tầng B và trấu hun theo các tỷ lệ pha trộn khác nhau Giá thể được đóng vào bầu PE màu đen (7x10cm) đặt vào luống được xây trong nhà lưới có mái che, đảm bảo độ chiếu sáng 25-75% Nhà giâm hom đủ tiêu chuẩn đặt tại trường Cao đẳng Nông Lâm Đông Bắc- Quảng Ninh

- Hóa chất: Chất điều hòa sinh trưởng gồm 3 loại (ABT, IBA, NAA) với các nồng độ khác nhau từ: 0,5%, 1%, 1,5%, 2% dạng bột trong thời gian 5 phút Hóa chất xử lý nấm là Benlat 0,5%

b) Các thí nghiệm

- h nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến

khả năng sống và khả năng ra rễ của hom

Chúng tôi lựa chọn được loại hom, kích thước hom và diện tích lá để lại trên hom phù hợp ở các công thức thí nghiệm Sử dụng với 3 chất điều hòa sinh trưởng ABT, IBA, NAA dạng bột nồng độ 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm và 200 ppm để theo dõi khả năng sống và khả năng ra rễ của hom Thời gian xử lý chất ĐHST là 5 phút

- h nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của loại hom đến khả năng sống của

hom

Trong thí nghiệm này, dùng vật liệu là cành để cắt thành 2 loại hom (hom 1:

là hom có đỉnh sinh trưởng, hom 2: là hom phía dưới kế cận hom 1) Kích thước của hom khoảng 10 cm đến 15 cm Sau khi cắt, hom được xử lý qua bằng thuốc diệt nấm sau đó đều được xử lý bằng cách chấm mặt cắt phía cực gốc của hom và thuốc

kích thích ra rễ là công thức tốt nhất của thí nghiệm 1

- h nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến khả năng ra rễ của

hom Trà hoa vàng

Thí nghiệm này lựa chọn giá thể là đất tầng B và trấu hun

- h nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian che vòm bằng lưới đen

đến tỷ lệ sống của cây hom

Thí nghiệm này chúng tôi cũng lựa chọn công thức tốt nhất ở thí nghiệm 1 để tiếp tục thí nghiệm với thời gian che vòm bằng lưới đen đến tỷ lệ sống của cây hom

c) Bố trí thí nghiệm

- Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên theo khối với 3 lần lặp lại

- Tất cả các công thức thí nghiệm được bố trí với số lượng mẫu ≥ 30 và đo đếm cây tại vườn ươm

- Chăm sóc thí nghiệm: Điều chỉnh ánh sáng phù hợp (độ chiếu sáng từ 75%); tưới phun đủ ẩm 2 lần/ngày cho tất cả các công thức thí nghiệm

25-d) Thu thập số liệu, xử lý số liệu

- Sau khi thu thập, số liệu được phân tích bằng phần mềm Microsoft Excel

2013, dùng hàm ANOVA (analysis of variance) để kiểm tra sự sai khác về chỉ tiêu nghiên cứu giữa các công thức thí nghiệm

- Trình tự nucleotide của gen được phân tích bằng các phần mềm chuyên dụng như: DNA Club, BioEdit, Clustal X Dựa trên trình tự của gen đặc hiệu ở cây dược liệu, sử dụng công cụ Blast và Blas Tree View trong NCBI dể tạo cây quan hệ

di truyền với các loài khác đã được công bố trên NCBI

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết quả xác định mã vạch AND (DNA barcode)

3.1.1 Tách chiết ADN và khuyếch đại PCR (Polymerase Chain Reaction)

ADN hệ gen của các mẫu nghiên cứu được tách chiết theo phương pháp

CTAB của Saghai Maroof et al., 1984[50] đã chứng tỏ sự hiệu quả (hình 3.1) Băng

ADN thu được tương đối gọn, tập trung phía trên đầu giếng và cũng không xuất hiện vệt sáng trong giếng của bản gel agarose 0,8% Những đặc điểm này chứng minh rằng ADN tổng số thu được có kích thước lớn, không lẫn protein, đủ điều kiện làm ADN khuôn cho khuyếch đại PCR (phản ứng chuỗi trùng hợp)

Về nhân dòng PCR, kết quả cho thấy tất cả các đoạn mã vạch ADN đều được khuyếch đại thành công ở tất cả 06 mẫu nghiên cứu (hình 3.2) Tỷ lệ thành công cho khuyếch đại PCR cho ba đoạn mã vạch là 100% Tỷ lệ thành công trình tự hai chiều đạt được từ sản phẩm PCR là 100% cho ba đoạn mã vạch ADN (bảng 3.1) Kết quả này khẳng định thêm chất lượng ADN được tách chiết, hàm lượng và kích thước đủ lớn cũng như không lẫn các tạp chất gây ảnh hưởng đến nhân dòng PCR Hơn nữa, sản phẩm PCR đặc hiệu (xuất hiện 01 băng ADN với kích thước đúng theo tính toán

lý thuyết) của cả ba đoạn mã vạch ở tất cả các mẫu nghiên cứu chứng tỏ sự hiệu quả trong tối ưu hóa quy trình PCR

Hình 3.1: ADN tổng số từ 06 mẫu nghiên cứu