Tuyển chọn chủng bacillus subtilis ứng dụng trong phòng và trị bệnh đường tiêu hóa trên gà tt

30 153 0
Tuyển chọn chủng bacillus subtilis ứng dụng trong phòng và trị bệnh đường tiêu hóa trên gà  tt

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Bệnh lý học & Chữa bệnh vật nuôi Mã ngành: 62 64 01 02 LÊ THỊ HẢI YẾN TUYỂN CHỌN CHỦNG BACILLUS SUBTILIS ỨNG DỤNG TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH ĐƢỜNG TIÊU HĨA TRÊN Cần Thơ - 2018 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN ĐỨC HIỀN Luận án bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường Họp tại:…………………………………., Trường Đại học Cần Thơ Vào lúc … … ngày …… tháng … năm ……… Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ Thư viện Quốc gia Việt Nam DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Lê Thị Hải Yến Nguyễn Đức Hiền, 2015 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis ứng dụng làm probiotic từ đất phân TP Cần Thơ Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, số 6, trang 55-62 Lê Thị Hải Yến Nguyễn Đức Hiền, 2015 Khảo sát đặc tính prbiotic số chủng Bacillus phân lập số trại thành phố Cần Thơ Báo cáo khoa học Hội nghị khoa học tồn quốc Chăn ni – Thú y 2015 ISBN 978-604-60-2019-6 Nhà xuất Nông nghiệp, trang 485-491 Le Thi Hai Yen and Nguyen Duc Hien, 2016 Isolation and identification of Bacillus subtilis isolated from soil and feces on chicken farms in the Mekong delta, Vietnam Proceedings of The 19th Federation of Asian Veterinary Associations Congress, Ho Chi Minh city, September 6-9th, 2016 Vietnam National University-Ho Chi Minh city Press, page 143147 Lê Thị Hải Yến Nguyễn Đức Hiền, 2016 Khảo sát đặc tính probiotic chủng vi khuẩn phân lập tỉnh Đồng sơng Cửu Long ISSN 1859-2333 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ số 2, trang 2632 Lê Thị Hải Yến Nguyễn Đức Hiền, 2017 Khảo sát khả chịu acid dày - muối mật khả bám dính hai chủng vi khuẩn Bacillus subtilis AG27 VL28 Báo cáo khoa học Hội nghị khoa học tồn quốc Chăn ni – Thú y 2017 ISBN 978-604-60-2492-7 Nhà xuất Nông Nghiệp, trang 341-346 Le Thi Hai Yen and Nguyen Duc Hien, 2017 Isolation and characterization of probiotic Bacillus subtilis VL28 on chicken farms in Vietnam Proceedings of 33rd World Veterinary Congress, Incheon – Korea, August 27-31, 2016 Le,T.H.Y and Nguyen,D.H., 2017 Bacillus subtilis strain VL28 16S ribosomal RNA gene, partial sequence GenBank: KY346980.1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KY346980 CHƢƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết đề tài Sự phát triển mạnh mẽ ngành chăn nuôi công nghiệp thập niên gần mang lại nhiều lợi ích kinh tế - xã hội to lớn, làm nảy sinh nhiều vấn đề cần quan tâm xem xét Một vấn đề cần quan tâm giải việc sử dụng rộng rãi chất kháng sinh để phòng bệnh kích thích tăng trưởng chăn nuôi Việc làm gia tăng dòng vi khuẩn kháng thuốc tự nhiên, có ảnh hưởng lớn tới hiệu sử dụng kháng sinh điều trị bệnh viêm nhiễm người Do vậy, nhiều nước tiên tiến định hạn chế việc sử dụng chất kháng sinh chăn nuôi Để thay kháng sinh chăn nuôi, nhà khoa học đưa nhiều giải pháp khác có biện pháp sử dụng probiotic vi sinh vật sống hữu ích cho hoạt động tiêu hóa có tác dụng tăng cường sức khỏe nói chung cho người động vật Bacillus subtilis vi khuẩn phổ biến tự nhiên, độc tính người nhiều lồi động vật có sức đề kháng cao với nhiều tác nhân vật lý hóa học Do vậy, từ lâu vi khuẩn chọn nghiên cứu để làm probiotic cho người vật ni theo mơ hình cơng nghiệp Tuy nhiên, B subtilis đa dạng đặc tính sinh học nên khơng phải tất chủng sử dụng làm probiotic chủng probiotic phù hợp có hiệu sử dụng cho đối tượng định Đề tài “Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng phòng bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa gà” thực nhằm nghiên cứu tìm giải pháp thay sử dụng kháng sinh chăn nuôi, nâng cao suất, hiệu chăn nuôi công nghiệp giảm bớt nguy lan rộng dòng vi khuẩn đề kháng kháng sinh tự nhiên 1.2 Mục tiêu: Phân lập 01 chủng Bacillus subtilis số tỉnh ĐBSCL có đặc tính probiotic như: khả sinh enzyme tiêu hóa (amylase, protease, lipase); chịu tác động dịch tiêu hóa (dịch vị, muối mật), có khả bám dính vào niêm mạc ruột đối kháng với số vi khuẩn gây bệnh đường ruột (Salmonella, E coli) - Xác định liều dùng hiệu chủng probiotic phân lập phòng bệnh đường ruột E coli S enterica gây 1.3 Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu - Đối tƣợng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis - Phạm vi nghiên cứu: Các chủng Bacillus subtilis phân lập từ đất phân tỉnh thành thuộc Đồng sông Cửu Long, bao gồm: Cần Thơ, Hậu Giang, An Giang, Vĩnh Long, Đồng Tháp, Sóc Trăng, Kiên Giang 1.4 Những đóng góp luận án Luận án cơng trình nghiên cứu chọn lọc chủng B subtilis địa có hiệu phòng bệnh đường tiêu hóa vùng Đồng sông Cửu Long, đặc biệt bệnh S enterica E coli gây - Đã phân lập giám định xác 21 chủng B subtilis địa từ phân đất chuồng khu vực ĐBSCL tuyển chọn chủng B subtilis VL28 sử dụng làm probiotic - Đã chứng minh thực nghiệm việc bổ sung chủng B subtilis VL28 10 CFU/g với liều 5g/kg thức ăn có khả thay kháng sinh ngăn ngừa trình nhiễm trùng đường ruột đàn gây nhiễm thực nghiệm với S enterica E coli, đồng thời làm tăng mức tăng trưởng giảm hệ số chuyển hóa thức ăn so với đối chứng - Đã ngân hàng gen NCBI cơng nhận trình tự gen 16S rRNA B subtilis VL 28 với mã số truy cập KY346980 (có thể truy cập trang web https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ky346980) - Là công trình nghiên cứu, phân lập, tuyển chọn vi khuẩn probiotic cách hệ thống theo tiêu chuẩn Quốc tế 1.5 Ý nghĩa thực tiễn luận án Chọn lọc chủng B subtilis địa có tiềm dùng làm probiotic phù hợp với điều kiện chăn nuôi Đồng sông Cửu Long Kết nghiên cứu đề tài dùng ứng dụng sản xuất chế phẩm probiotic, phòng chống bệnh đường ruột gia cầm, làm tăng suất chăn nuôi đem lại lợi nhuận cao cho người chăn nuôi Tạo sở khoa học để đề xuất hạn chế sử dụng kháng sinh làm chất kích thích tăng trưởng phòng bệnh chăn ni Góp phần tạo nguồn thịt gia cầm sạch, không tồn dư kháng sinh, bảo vệ sức khỏe cộng đồng Chƣơng III NỘI DUNG PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đề tài thực với nội dung: 3.1 Nội dung 1: Phân lập chủng B subtilis - Phân lập B subtilis phương pháp truyền thống: dựa vào đặc điểm khuẩn lạc quan sát hình thái vi khuẩn kính hiển vi, nhuộm Gram thử phản ứng sinh hóa - Định danh xác đến lồi kit API 50 CHB - Giám định xác giống loài chủng Bacillus tuyển chọn phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA Phƣơng pháp lấy mẫu Mẫu đất: Đất lấy tầng mặt, độ sâu từ 4-5 cm Mẫu gộp lấy từ vị trí khác trại Mẫu phân: Lấy phân tươi chuồng Mẫu gộp lấy từ vị trí khác chuồng (4 mẫu góc mẫu trung tâm) Lượng đất phân lấy lần từ 30-50 g Mẫu đựng túi nilon (polypropylen) khử trùng Sau lấy mẫu, tiến hành ghi nhãn địa điểm thời gian lấy, sau tất mẫu bảo quản thùng trữ lạnh đưa phòng thí nghiệm Số lƣợng mẫu Chọn mẫu theo phương pháp định ngạch (phi ngẫu nhiên), địa phương 20 mẫu (10 mẫu đất + 10 mẫu phân) Tổng cộng: 140 mẫu/ tỉnh, thành phố ĐBSCL Chuẩn bị mẫu Cân 10 g mẫu + 90 mL nước muối sinh lý vơ trùng cho vào bình tam giác, lắc Gia nhiệt 80ºC 20-25 phút để chọn vi khuẩn có khả Bacillus spp (Eman, 2013) Phân lập vi khuẩn Sau gia nhiệt, mẫu tiến hành pha lỗng trải đĩa mơi trường TSA, ủ 30ºC 24 Kết thúc thời gian ủ, chọn khuẩn lạc riêng rẽ, khác biệt tiến hành cấy phân lập, kết hợp với quan sát, ghi nhận hình thái vi khuẩn kính hiển vi để thu chủng vi khuẩn Tiến hành giám định đặc điểm sinh hóa vi khuẩn B subtilis theo phương pháp Cowan and Steel (2004) với số cải tiến Các phản ứng sinh hóa bao gồm: lecithinase (-), catalase (+), VP (+), amylase (+), khả phát triển 50oC celluslase (+) thực theo trình tự để sàng lọc sơ nhóm vi khuẩn thuộc lồi B subtilis Các chủng đạt yêu cầu, sau định danh kit API 50 CHB, chủng có kết B subtilis giải trình tự gen 16S RNA để khẳng định lại Sau ly trích DNA chủng vi khuẩn, tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi phổ biến mã hóa cho đoạn gen 16S rRNA (Saminathan and Narayanan, 2015) có trình tự sau: 27F: (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') 1492R: (5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'27F) Qui trình phân lập giám định vi khuẩn B subtilis trình bày tóm tắt theo sơ đồ sau: Chủng vi khuẩn ↓ Test Lecithinase: (-) ↓ Test Catalase: (+) ↓ Test VP: (+) ↓ Test Amylase: (+) ↓ Khả phát triển 50ºC ↓ Test Cellulase: (+) ↓ API CH50B ↓ Giải trình tự gen 16S rRNA Hình 3.1 Sơ đồ sàng lọc, định danh vi khuẩn B subtilis 3.2 Nội dung 2: Tuyển chọn chủng B subtilis có đặc tính probiotic Gồm tiêu sau: 3.2.1 Tính chịu nhiệt Tính chịu nhiệt vi khuẩn khảo sát theo phương pháp Barbosa et al (2000) có cải tiến Cấy chủng vi khuẩn cần kiểm tra đĩa thạch TSA ủ 50oC, 55oC 60oC 24 Kết thúc thời gian ủ, kiểm tra khả sống vi khuẩn 3.2.2 Khả nhạy kháng sinh (9 loại kháng sinh dùng phổ biến gia cầm: erythromycin, gentamycin, neomycin, oxytetracyclin, doxycyclin, colistin, sulfadimidin - trimethoprim, norfloxacin, enrofloxacin) Tính nhạy cảm kháng sinh vi khuẩn xác định phương pháp đĩa khuếch tán kháng sinh theo hướng dẫn Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng xét nghiệm (Clinical and Laboratoty Standards Institude - CLSI, 2015) (Wayne, 2015) 3.2.3 Khả sinh enzyme tiêu hóa (amylase, protease, lipase): Thực định tính định lượng chủng vi khuẩn khảo sát, sau chọn chủng có khả sinh loại enzyme 3.2.4 Khả đối kháng vi khuẩn gây bệnh Thử nghiệm khả đối kháng theo phương pháp vạch thẳng vng góc: Khảo sát môi trường Starch agar (SA) Các bước tin hnh theo phng phỏp ca Sertaỗ et al (2014): cấy vi khuẩn B subtilis dọc theo đường thẳng đĩa thạch SA, ủ 37oC 24 giờ, tiến hành cấy vi khuẩn gây bệnh (S enterica, E.coli) theo vạch ngang vng góc với vạch vi khuẩn mọc, tiếp tục ủ 37oC 24 Khả kháng khuẩn xác định cách đo khoảng cách vùng kháng khuẩn theo đơn vị mm dựa theo Hutt et al (2006) Thử nghiệm khả đối kháng theo phương pháp đối kháng trực tiếp: Thực theo phương pháp Moore et al (2013): Vi khuẩn gây bệnh B subtilis hoạt hóa mơi trường TSB ủ nhiệt độ thích hợp 24 Huyền phù vi khuẩn B subtilis điều chỉnh cho mật số đạt 105, 106 107 CFU/mL tương ứng với nồng độ vi khuẩn gây bệnh để tiến hành thử khả đối kháng Bơm 100 µL huyền phù vi khuẩn gây bệnh lên đĩa thạch dùng que tran trải đều; sau đó, bơm 10 µL dịch vi khuẩn B subtilis tương ứng với nồng độ khảo sát lên vị trí xác định bề mặt thạch, đem ủ 37oC 24 Khả đối kháng đo đường kính vòng ức chế vi khuẩn gây bệnh theo đơn vị mm Đánh giá khả đối kháng theo Sumathi and Reetha (2012) 3.4 Xử lý số liệu: Số liệu thí nghiệm xử lý sơ bảng tính Microsoft Excel 2010, sau phân tích phương sai (ANOVA) theo mơ hình tuyến tính tổng qt (General Linear Model) phần mềm Minitab 16.1 Chƣơng IV KẾT QUẢ THẢO LUẬN 4.1 Phân lập định danh vi khuẩn B subtilis 4.1.1 Kết phân lập vi khuẩn Bacillus spp Từ 70 mẫu đất 70 mẫu phân trại tỉnh thành, mẫu xử lí nhiệt, pha lỗng, cấy tran ủ 30ºC 24 giờ, kết thúc thời gian ủ, dựa vào hình dạng khuẩn lạc, tiến hành chọn riêng dòng vi khuẩn cấy chuyển nhiều lần Kết thu tổng cộng 296 chủng vi khuẩn có hình que, gram dương có khả sinh bào tử quan sát sau 48 Các khuẩn lạc 296 chủng tách ròng phương pháp cấy ria trữ dung dịch NB (nutrient broth) có chứa 16% glycerol, bảo quản tủ âm sâu 86oC 4.1.2 Kết định danh Bacillus spp 4.1.2.1 Định danh phản ứng sinh hóa Từ 296 chủng, tiến hành kiểm tra tiêu sinh hóa theo trình tự: âm tính với lecithinase, dương tính với catalase, VP, amylase, cellulase có khả phát triển 50oC (Cowan and Steel, 2003) Các phân lập vi khuẩn không đạt yêu cầu loại bỏ dần, cuối cùng, chủng vi khuẩn tương đồng với đặc điểm sinh hóa B subtilis định danh kit API CH50B Kết kiểm tra sinh hóa trình bày Bảng 4.2 Bảng 4.2: Kết sàng lọc vi khuẩn test sinh hóa Chỉ tiêu Số lượng chủng Kết Dương tính Âm tính Lecithinase 296 66 230 Catalase 230 230 VP 230 169 61 Amylase 169 91 78 Phát triển 50ºC 91 49 42 Cellulase 49 29 20 Theo qui trình chọn lọc, phản ứng sinh hóa thực lecithinase, tiêu quan trọng giúp loại bỏ lồi Bacillus có độc tính Kết kiểm tra cho thấy 66/296 chủng dương tính với lecithinase, 66 chủng loại bỏ, khơng kiểm tra tiêu sinh hóa Tiếp tục thực 11 phản ứng sinh hóa thứ (catalase) với 230 chủng lại, tất cho kết dương tính nghĩa chủng phát triển điều kiện hiếu khí Tiếp theo phản ứng VP, B subtilis dương tính với phản ứng nên thực phản ứng VP giúp loại bớt chủng B subtilis, kết có 169/230 chủng dương tính, 61 chủng âm tính loại bỏ Phản ứng sinh hóa thứ amylase Kết có 78 chủng âm tính, 91 chủng dương tính Kết khảo sát cho thấy có 49/91 chủng có khả phát triển 50oC Cuối cùng, phản ứng cellulase tiến hành nhằm xác định khả thủy phân cellulose vi khuẩn Trong 49 chủng khảo sát, có 29 chủng dương tính với cellulase, 29 chủng vi khuẩn tiếp tục định danh kit API CH50B để xác định loài 4.1.2.2 Định danh kit API CH50B Sau tiến hành kiểm tra đặc tính sinh hóa, có 29 chủng thỏa đặc tính B subtilis Trong 29 chủng định danh kit API, có 23 chủng xác định B subtilis/B amyloliquefaciens với phần trăm xác từ 90,7% - 99,9%; chủng lại thuộc loài B licheniformis 23 chủng tiến hành giải trình tự gen để xác định xác đến loài B subtilis 4.1.2.3 Định danh PCR giải trình tự gen 16S rRNA Kết điện di sản phẩm PCR 23 chủng vi khuẩn cho thấy khuếch đại thành cơng đoạn gen với kích thước 1500bp (Hình 4.4) M ST10 DT11 DT26 DT29 DT30 KG12 KG22 KG29 KG36 C 1500 bp M CT11 AG07 AG17 AG19 AG60 VL16 ST06 ST08 C 1500 bp M VL05 VL28 VL41 KG09 AG27 AG49 C Hình 4.4 Sản phẩm PCR chủng vi khuẩn B subtilis nghiên cứu (M: thang chuẩn 100bp; ST10, DT11,…: sản phẩm PCR 23 chủng VK khảo sát; C: đối chứng âm) 1500 bp Giải trình tự gen 16S rRNA Sau giải trình tự xử lý phần mềm BLAST so sánh kết NCBI, kết cho thấy có 21 23 chủng xác định B subtilis với mức độ tương đồng cao (99%-100%), chủng lại B amyloliquefaciens 12 Tóm lại, từ 296 chủng vi khuẩn phân lập, sau tiến hành bước chọn lọc kiểm tra phản ứng sinh hóa, định danh kit API, cuối ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen 16S rRNA, có 21 chủng vi khuẩn xác định B subtilis 21 chủng B subtilis thực bước tuyển chọn probiotic để chọn chủng tối ưu có khả phòng bệnh đường tiêu hóa 4.2 Kết khảo sát đặc tính probiotic 4.2.1 Kết khảo sát khả chịu nhiệt độ cao Theo Sottnik (2002) gia cầm có thân nhiệt khoảng 41,5oC, cao lồi động vật hữu nhũ, đó, ứng viên probiotic sử dụng chăn nuôi gia cầm phải có khả phát triển cao nhiệt độ bình thường (30-37oC) Bảng 4.6 Kết khảo sát khả chịu nhiệt chủng B subtilis Chủng VK KG36, AG19, VL05 AG07, AG27, AG49, AG60, VL16, VL28, VL41, ST08, DT30, KG09, KG12, KG22 CT 11, AG17, ST06, ST10, DT29, KG29 Tổng cộng Số lƣợng chủng 50oC + Nhiệt độ khảo sát 55oC 60oC + + 12 + + - + - - 21 21 15 Ghi : + có khả sống mơi trường nhiệt độ khảo sát - khơng có khả sống môi trường nhiệt độ khảo sát Kết trình bày Bảng 4.6 cho thấy tất 21 chủng vi khuẩn phát triển mốc nhiệt độ 50oC Vậy 21 chủng B subtilis phân lập có khả chịu nhiệt, hồn tồn đáp ứng dung nạp vào thể gia cầm Như tiêu chịu nhiệt 21 chủng B subtilis khảo sát chọn làm probiotic 4.2.2 Khả nhạy/ kháng kháng sinh Khả nhạy kháng sinh vi khuẩn probiotic xem tiêu chí quan trọng tiêu chuẩn chọn lọc vi khuẩn probiotic (Hummel et al., 2007), theo Gueimonde et al (2013), vi khuẩn probiotic nhạy với kháng sinh an tồn mặt sinh học, khơng chứa plasmid gen kháng kháng sinh 13 Hình 4.6 Mức độ mẫn cảm kháng sinh 21 chủng vi khuẩn B subtilis Một điều đáng ghi nhận có đến 95% chủng B subtilis khảo sát kháng với kháng sinh colistin, điều colistin kháng sinh sử dụng phổ biến điều trị bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa Hình 4.7 Kết kháng sinh đồ chủng B subtilis AG27 VL28 Qua khảo sát 21 chủng B subtilis phân lập chúng tơi nhận thấy 50% chủng nhạy với nhiều kháng sinh 21 chủng nhạy với nhiều kháng sinh so với chủng đối chứng Kết cho thấy tiêu nhạy với kháng sinh 21 chủng B subtilis khảo sát có khả chọn làm probiotic 4.2.3 Kết khảo sát khả sinh enzyme ngoại bào 4.2.3.1 Khả sinh enzyme amylase, protease lipase Kết khảo sát khả sinh loại enzyme trình bày Bảng 4.7 Bảng 4.7: Khả sinh enzyme ngoại bào 21 chủng B subtilis Vi khuẩn Amylase Protease Lipase ĐC1 + + ĐC2 + + AG27, AG60, VL05, VL28, VL41, + + + DT29, KG09, KG12, KG22, KG36 CT11, AG07, AG17, AG19, AG49, VL16, ST06, ST08, ST10, DT30, + + KG29 Ghi (+) : Có khả sinh enzyme, (-): khơng có khả sinh enzyme 14 Theo Parsons (2004) enzyme ngoại bào amylase, protease, lipase đóng vai trò quan trọng việc tiêu hóa thức ăn, giúp thức ăn hấp thu dễ dàng Do đó, để trở thành probiotic chủng B subtilis phải có khả sinh nhiều loại enzyme Kết cho thấy 21 chủng B subtilis khảo sát có 10 chủng (AG27, AG60, VL05, VL28, VL41, DT29, KG09, KG12, KG22, KG36) có khả sinh loại enzyme, 10 chủng tiến hành kiểm tra khả đối kháng với chủng vi khuẩn gây bệnh 4.2.4 Khả đối kháng với chủng vi sinh vật gây bệnh 4.2.4.1 Khả đối kháng B subtilis với loài vi khuẩn gây bệnh theo phƣơng pháp kẻ vạch vng góc Kết Bảng 4.9 cho thấy 10 chủng B subtilis thể hoạt tính kháng khuẩn mức độ khác Bảng 4.9: Khoảng cách kháng khuẩn chủng B subtilis phương pháp kẻ vạch vuông góc Vi khuẩn ĐC1 ĐC2 AG27 AG60 VL05 VL28 VL41 KG12 KG22 KG09 KG36 DT29 SEM P a,b,c,d E coli 5,47c 6,10c 8,00b 6,00c 6,00c 10,00a 6,00c 4,00d 6,00c 0,184 0,00 Khoảng cách kháng khuẩn (mm) S enterica Staphylococcus Streptococcus 6,27c 7,00bc 7,00bc 6,23c 12,00a 10,00a 10,00b c bc 6,00 7,00 4,00d b b 10,00 8,00 6,00c a a 13,00 10,00 12,00a b a 10,00 10,00 9,00b 10,00a 4,00d 6,00c 6,00c b 10,00 9,00b 6,00c 8,00b 0,275 0,281 0,167 0,00 0,00 0,00 giá trị mang số mũ khác cột khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.01) Từ kết đối kháng theo phương pháp kẻ vạch vng góc, chủng vi khuẩn B subtilis AG27, AG60, VL05 VL28 thể hoạt tính đối kháng với vi khuẩn bệnh, chủng có hoạt tính kháng khuẩn mạnh tiếp tục khảo sát khả kháng khuẩn phương pháp đối kháng trực tiếp để kiểm tra so sánh hoạt tính đối kháng nồng độ vi khuẩn khác 4.2.4.2 Khả đối kháng B subtilis với E coli S.enterica theo phƣơng pháp đối kháng trực tiếp 15 Đối với E coli Kết đối kháng trực tiếp chủng B subtilis (AG27, AG60, VL05 VL28) E coli nồng độ 105 CFU/mL, 106 CFU/mL, 107 CFU/mL trình bày qua Bảng 4.10 Kết cho thấy chủng AG27, AG60, VL05, VL28 thể hoạt tính đối kháng với E coli tất nồng độ 105 CFU/mL, 106 CFU/mL 107 CFU/mL Điều cho thấy chủng B subtilis có tiềm việc phòng điều trị bệnh E coli cho gia cầm Bảng 4.10: Kết đối kháng trực tiếp B subtilis AG27, AG60, VL05 VL28 E coli Vi khuẩn phân lập Đƣờng kính đối kháng (mm) Nồng độ Nồng độ E.coli Nồng độ E coli Nồng độ E coli Chủng (CFU/ mL) (105 CFU/mL) (106 CFU/mL) (107 CFU/mL) bc a AG27 14,43 14,00 12,07b c c AG60 14,20 11,00 10,33c 105 a b VL05 15,53 13,00 10,27c ab a VL28 15,27 14,00 13,50a SEM 0,204 0,166 0,214 P 0,005 0,00 0,00 AG27 16,57a 16,00b 12,30b AG60 15,23b 12,00d 12,57b 106 a c VL05 16,57 14,00 11,23c VL28 17,43a 17,00a 16,83a SEM 0,251 0,180 0,178 P 0,002 0,00 0,00 AG27 18,57ab 16,00b 14,23bc AG60 17,40b 14,00c 13,57c 107 VL05 19,07ab 16,00b 15,17b VL28 20,20a 19,00a 17,17a SEM 0,449 0,194 0,301 P 0,014 0,00 0,00 a,b,c,d giá trị mang số mũ khác cột khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.01) Đối với S enterica Bảng 4.11: Kết đối kháng trực tiếp B subtilis AG27, AG60, VL05 VL28 S enterica Vi khuẩn phân lập Nồng độ (CFU/ mL) 10 Chủng AG27 AG60 VL05 VL28 Đƣờng kính đối kháng (mm) Nồng độ Nồng độ Nồng độ S enterica S enterica S enterica (105 CFU/mL) (106 CFU/mL) (107CFU/mL) a 20,23 20,00a 15,50a a b 19,33 16,00 12,30b a b 19,17 15,00 11,03b a a 20,17 19,00 16,83a 16 SEM P AG27 AG60 VL05 VL28 SEM P AG27 AG60 VL05 VL28 SEM P 106 107 a,b,c,d 0,331 0,109 22,83a 20,50a 21,17a 22,2a 0,676 0,143 25,33a 21,57b 23,17ab 25,83a 0,702 0,009 0,255 0,00 21,00a 17,00b 18,00b 20,00a 0,303 0,00 25,00a 21,00b 20,00b 24,00a 0,338 0,00 0,302 0,00 16,50b 13,90c 12,93c 18,50a 0,352 0,000 17,67b 15,50c 14,33c 20,17a 0,323 0,00 giá trị mang số mũ khác cột khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.01) Bảng 4.11 cho thấy chủng B subtilis thể hiệu đối kháng S enterica, AG27 VL28 thể hiệu đối kháng vượt trội tất nồng độ khảo sát 4.2.5 Khả chịu acid dày muối mật Ở gà, pH dày (dạ dày tuyến mề) dao động khoảng từ 2,5-3,5 (Gauthier, 2002) Với mật số ban đầu vi khuẩn B subtilis điều chỉnh 4,5x106 CFU/mL, khảo sát khả chịu từ pH 4, 3, pH dịch dày mô muối mật Sau kết khảo sát pH Bảng 4.16: Kết khảo sát acid-muối mật pH Chủng vi khuẩn ĐC1 ĐC2 AG27 AG60 VL05 VL 28 SEM P a,b,c,d phút log CFU/mL d 0,00 4,76c 5,43b 0,00d 0,00d 6,62a 0,027 0,00 % 72 82 99 Lƣợng vi khuẩn % sống thời điểm 10 phút 30 phút 60 phút log CFU/mL d 0,00 4,69c 5,39b 0,00d 0,00d 6,58a 0,017 0,00 % 70 81 99 log CFU/mL d 0,00 4,58c 5,31b 0,00d 0,00d 6,54a 0,035 0,00 % 69 80 98 log % CFU/mL d 0,00 4,24c 5,21b 0,00d 0,00d 6,48a 0,062 0,00 64 78 97 90 phút log CFU/mL d 0,00 3,67c 5,19b 0,00d 0,00d 6,46a 0,037 0,00 % 55 78 97 giá trị mang số mũ khác cột khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.01) ĐC1: chủng đối chứng B subtilis (ATCC ® 19659™) ĐC2: chủng đối chứng (sản phẩm thị trường) Bảng 4.16 cho thấy AG60, VL05 ĐC1 hồn tồn khơng thể chịu pH 2, từ thời điểm phút, mật số AG60, VL05 ĐC1 giảm Trong đó, AG27 VL28 có khả chịu đựng cao, VL28 17 trì tỉ lệ sống gần không giảm suốt 90 phút khảo sát (ở phút 99% sau 90 phút 97%), AG27 thời điểm phút 82%, giảm 78% thời điểm 90 phút Hai chủng vi khuẩn thực ứng viên tiềm năng, tiếp tục kiểm tra tiêu probiotic 4.2.6 Khả bám dính 4.2.6.1 Khả tự bám dính Kết cho thấy tỉ lệ bám dính chủng B subtilis có xu hướng tăng dần theo thời gian Sau ủ nhiệt độ phòng, mức độ bám dính chủng gần tăng gấp đôi so với thời điểm (Bảng 4.17) Bảng 4.17: Kết khảo sát khả tự bám dính Chủng vi khuẩn ĐC1 ĐC2 AG27 VL28 SEM P a,b Vi khuẩn bám dính thời điểm (%) giờ giờ 43,9a 62,5a 66,4 72,2 30,2ab 57,8ab 65,0 66,1 24,3b 62,1a 63,3 69,8 36,8ab 40,9b 61,9 74,5 3,51 4.02 2,11 2,13 0,021 0,016 0,508 0,106 73,8ab 76,7ab 70,2b 82,0a 2,13 0,024 giá trị mang số mũ khác cột khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.01) 4.2.6.2 Khả bám dính với vi khuẩn gây bệnh Kết trình bày Bảng 4.18 cho thấy chủng AG27, VL28, chủng đối chứng có khả gắn kết với vi khuẩn E coli S enterica Tuy nhiên, tỉ lệ phần trăm bám dính VL28 cao so với AG27 chủng đối chứng Bảng 4.18 Kết khảo sát khả bám dính với E coli S enterica Thời gian giờ a,b,c,d chủng VK ĐC ĐC AG 27 VL28 SEM P ĐC ĐC AG 27 VL28 SEM P Tỉ lệ bám dính với vi khuẩn gây bệnh (%) E coli S enterica 8,60b 25,75a b 10,14 12,62c c 4,76 16,15bc a 24,82 20,79ab 0,627 1,37 0,00 0,00 26,30c 59,51b 41,35b 46,14c c 19,33 36,40d a 60,98 65,64a 2,56 1,22 0,000 0,001 giá trị mang số mũ khác cột khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.01) 18 4.2.6.3 Khả bám dính với biểu mơ ruột Khả bám dính chủng AG27, VL28 quan sát qua tiêu vi thể biểu mơ ruột thí nghiệm, nhuộm HE Quan sát tiêu kính hiển vi quang học độ phóng đại 400 1000 lần trình bày Hình 4.21 Hình 4.21 Khả bám dính chủng VL28 (bên trái) AG27 (bên phải) biểu mô ruột (400X 1000X) Kết cho thấy chủng B subtilis có khả bám dính với màng tế bào biểu mô ruột Sau kiểm tra đặc tính bám dính chủng VL28 AG27 nhận thấy có khả tự bám dính cao, có khả bám dính với tế bào biểu mô ruột gà, nhiên khả kết dính AG27 vi khuẩn gây bệnh thấp, dù AG27 ghi nhận mang nhiều đặc điểm probiotic có lợi, khả tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh dung nạp vào hệ tiêu hóa Do chọn chủng VL28 để khảo sát khả sống đường ruột 4.2.7 Khả sống vi khuẩn đƣờng ruột Kết khảo sát khả sống vi khuẩn đường ruột thể thông qua mật số bào tử B subtilis VL28 phần trăm bào tử diện ghi nhận qua mốc thời gian theo Bảng 4.19 Bảng 4.19 Khả sống B subtilis VL28 đường ruột Lƣợng vi khuẩn % diện thời điểm 24 48 72 96 120 Mẫu log % log % log % log % log % CFU/g CFU/g CFU/g CFU/g CFU/g 4,40 49 3,96 44 3,28 36 2,85 32 2,59 29 Ruột non 48 3,61 40 3,1 34 2,8 31 2,5 28 Manh Tràng 4,32 3,94 44 3,32 37 3,07 34 2,69 30 2,26 25 Ruột già Ghi chú: Liều B subtilis VL28 cho uống ban đầu 109CFU/ml, 1ml 19 Kết Bảng 4.19 cho thấy bào tử vi khuẩn B subtilis VL28 tồn đường tiêu hóa gà, với mật số giảm dần theo thời gian Tóm lại, qua q trình phân lập, tuyển chọn xác định xác 21 chủng B subtilis Sau thực khảo sát đặc tính probiotic 21 chủng B subtilis này, chúng tơi chọn chủng B subtilis VL28 chủng nhạy với nhiều kháng sinh, có khả chịu nhiệt, có loại enzyme amylase, protease lipase với hoạt tính cao Hơn nữa, chủng có khả đối kháng cao với E coli S enterica, chịu acid dày muối mật, có tính bám dính cao sống đường tiêu hóa gia cầm Chúng tiến hành thử nghiệm để xác định liều sử dụng hiệu khả phòng bệnh đường tiêu hóa chủng B subtilis VL28 4.3 Kết thí nghiệm, đánh giá tác dụng chế phẩm 4.3.1 Kết thí nghiệm 1: Xác định liều sử dụng B subtilis Thí nghiệm với nghiệm thức NT1 bổ sung B subtilis VL28 vào thức ăn với liều 107 CFU/g (5 g/kg thức ăn), NT2 với liều 106 CFU/g (5g/kg thức ăn), NT3 với liều 5x105 CFU/g (5 g/kg thức ăn), ĐC nghiệm thức đối chứng sử dụng thức ăn trại Kết theo dõi tăng trọng, lượng thức ăn tiêu thụ hệ số chuyển hóa thức ăn (FCR) qua tuần thí nghiệm trình bày qua Bảng 4.20 Bảng 4.20: Tăng trọng, thức ăn tiêu thụ FCR qua tuần thí nghiệm Chỉ tiêu theo dõi Giai đoạn 1- 28 ngày KL đầu kỳ, g/con KL lúc 28 ngày, g/con Tăng trọng, g/con Thức ăn sử dụng, g/con FCR Giai đoạn 29-56 ngày KL lúc 56 ngày, g/con Tăng trọng, g/con Thức ăn sử dụng, g/con FCR Giai đoạn 1-56 ngày Tăng trọng, g/con Thức ăn sử dụng, g/con FCR a,b,c,d Nghiệm thức NT2 NT3 SEM P 69,43 69,55 69,57 69,50 423,63 392,35 381,77 369,2 354,20a 322,80b 312,20c 299,70d 653,70 671,20 669,60 695,00 1,85c 2,08b 2,14b 2,32a 0,09 1,09 1,14 9,39 0,03 0,000 0,000 0,000 0,079 0,000 1061,7 638,1a 1721b 2,69b 970,5 962,0 582,6b 556,3c 1776b 1745b 3,05a 3,14a 938,0 590,8b 1944a 3,29a 5,24 4,844 34,80 0,02 0,000 0,000 0,007 0,001 992,2a 2370c 2,39c 900,9b 868,5c 2587b 2548bc 2,87b 2,94b 892,5b 2851a 3,19a 5,245 45,83 0,054 0,000 0,001 0,001 NT1 ĐC giá trị mang số mũ khác hàng khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.01) KL : khối lượng 20 Kết Bảng 4.20 cho thấy bổ sung B subtilis VL28 (107CFU/g) NT1 có ý nghĩa thúc đẩy tăng trưởng không vào giai đoạn nhỏ (1-28 ngày), mà thích hợp với giai đoạn lớn (29-56 ngày), đó, tăng trọng toàn kỳ NT1 đạt giá trị cao (992,2g), tăng 11,17% lượng thức ăn sử dụng (2370g) giảm 16,87%, ra, số FCR ghi nhận thấp (2,39), giảm 25% so sánh với ĐC Qua thí nghiệm cho thấy liều bổ sung 0,5% B subtilis VL28 mật số 107 CFU/g vào phần ăn thích hợp cho phát triển từ giai đoạn đến 56 ngày tuổi Từ kết trên, thí nghiệm đánh giá khả bảo vệ probiotic gây nhiễm với S enterica E coli sử dụng liều bổ sung 0,5% B subtilis VL28 mật số 107CFU/g vào phần ăn 4.3.2 Kết thí nghiệm 2: Đánh giá khả bảo vệ probiotic gây nhiễm với S enterica so với kháng sinh Thí nghiệm 2, gây nhiễm S enterica vào ngày tuổi thứ 18, bổ sung B subtilis VL28 (NT1) vào phần ăn để so sánh với nghiệm thức sử dụng kháng sinh Kết thí nghiệm qua giai đoạn trình bày sau Bảng 4.21: Tỉ lệ chết, tăng trọng FCR qua tuần thí nghiệm Chỉ tiêu NT1 Giai đoạn 1-14 ngày Trọng lượng đầu kỳ, g/con 68.71 Tăng trọng, g/con 129,7a Thức ăn sử dụng, g/con 248,9bc FCR 1,92b Tỉ lệ chết , % 2,2 Giai đoạn 15-28 Ngày Tăng trọng, g/con 252,8a Thức ăn sử dụng, g/con 548,2ab FCR 2,17c Tỉ lệ chết , % 1,1b Giai đoạn 29-56 ngày Tăng trọng, g/con 542,3a Thức ăn sử dụng, g 1877a FCR 3,46c Tỉ lệ chết , % 1,11b Nghiệm thức NT2 NT3 ĐC (+) ĐC (-) SEM P 69.40 68.42 125,1bc 127,5ab 255,7ab 258,7a 2,02a 2,03a 3,3 4,4 68.32 124,7c 247,2c 1,98a 2,2 67.69 125,4bc 248,9bc 1,99a 2,2 0.41 0,59 1,78 0,01 0,98 0.118 0,000 0,004 0,000 0,452 234,4ab 239,2ab 572,2a 588,6a 2,44b 2,46b b 5,7 7,0b 122,2c 450,7c 3,69a 72,7a 226,0b 508,0b 2,25bc 1,1b 4,66 8,88 0,06 1,959 0,00 0,00 0,00 0,00 493,5c 496,8bc 1956a 1999a 3,96b 4,02b b 4,8 7,4b 307,5d 1480c 4,81a 20,37a 518,2b 1738b 3,35c 2,30b 5,04 27,98 0,06 2,00 0,00 0,00 0,00 0,00 a,b,c giá trị mang số mũ khác hàng khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.01) NT1: Bổ sung B subtilis VL28 107 CFU/g (5 g/kg thức ăn) NT2: Bổ sung oxytetracyclin 50 mg/kg thức ăn NT3: Bổ sung enrofloxacin 15 mg/kg thức ăn ĐC (+): Gây nhiễm S enterica không điều trị, ĐC (-): không gây nhiễm 21 Giai đoạn - 14 ngày tuổi: Đây giai đoạn chưa gây bệnh, kết ghi nhận Bảng 4.21 cho thấy tỉ lệ chết khơng có khác biệt nghiệm thức mức thống kê Tuy nhiên tiêu tăng trọng, nghiệm thức NT1 có mức tăng trọng cao đạt 129,7g, khác biệt mức ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức lại Giai đoạn 15 - 28 ngày: Sau gây nhiễm S enterica ngày thứ 18, lô ĐC (+) bắt đầu có biểu bệnh chết vào ngày thứ sau gây nhiễm chết nhiều vào giai đoạn 5-7 ngày sau gây nhiễm, đến ngày thứ 10 lô ĐC (+) lại 5-7 con/30con Các nghiệm thức NT1, NT2, NT3 ĐC (-) có tỉ lệ chết 1,1%; 5,7%, 7,0% 1,1%; tỉ lệ chết nghiệm thức khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê Các ghi nhận cho thấy B subtilis VL28 kháng sinh oxytetracylin, enrofloxacin có hiệu điều trị bệnh vi khuẩn S enterica, tỉ lệ chết nghiệm thức NT1, NT2 NT3 thấp nhiều so với ĐC (+) Thức ăn tiêu thụ FCR NT tương đương, chứng minh VL28 có khả điều trị bệnh với hiệu tương đương so với kháng sinh Tiến hành mổ khám bệnh, bệnh tích ghi nhận gồm: gan lách sưng, xung huyết, mật sưng to, ruột tiền mề xuất huyết, dấu hiệu bệnh tích phù hợp với bệnh tích gây vi khuẩn Salmonella (Hình 4.26) Gan lách sưng, xung huyết Mật sưng to Ruột xuất huyết Tiền mề xuất huyết Hình 4.26 Bệnh tích thí nghiệm gây nhiễm S enterica Kết giải trình tự gen xác nhận trình tự gen vi khuẩn phân lập có tỉ lệ đồng hình 100% với S enterica Giai đoạn 29 - 56 ngày: tỉ lệ chết NT1, NT2, NT3 ĐC (-) khác biệt không ý nghĩa thống kê, nghiệm thức lại khác biệt có ý nghĩa so với ĐC (+) Điều cho thấy nghiệm thức sử dụng probiotic kháng sinh khống chế bệnh, tỉ lệ chết giảm hẳn, tăng trọng cao so với ĐC (+) Khi đánh giá toàn kỳ (1-56 ngày), nhận thấy NT1 có khả điều trị bệnh nhiễm khuẩn S enterica, với hiệu chứng minh qua thông 22 số như: tỉ lệ chết, tăng trọng qua giai đoạn, lượng thức ăn tiêu thụ, số FCR Điều trị B subtilis VL28 có hiệu điều trị kháng sinh, tỉ lệ chết, FCR tiêu tốn thức ăn thấp hơn, tăng trọng cao nghiệm thức sử dụng kháng sinh 4.3.3 Kết thí nghiệm 3: Đánh giá khả bảo vệ probiotic gây nhiễm với E coli so với kháng sinh Trong thí nghiệm này, bổ sung B subtilis VL28 vào thức ăn cho thực gây nhiễm E coli 18 ngày tuổi để so sánh với nghiệm thức điều trị kháng sinh enrofloxacin oxytetracyclin Ở giai đoạn đầu thí nghiệm, tỉ lệ chết lượng thức ăn sử dụng nghiệm thức không khác biệt Tuy nhiên, tăng trọng FCR nghiệm thức NT1 có cải thiện NT1 có tăng trọng cao (130,3g) khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức lại, NT2 (126,2g) NT3 (124,8g) ĐC (+) 123,5g ĐC (-) 124,2g Bên cạnh đó, hệ số chuyển hóa thức ăn (FCR) NT1 ghi nhận thấp (1,89), khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức lại (Bảng 4.25) Bảng 4.25: Tỉ lệ chết, tăng trọng FCR qua tuần thí nghiệm Chỉ tiêu Giai đoạn 1-14 ngày Tỉ lệ chết , % Tăng trọng, g/con Thức ăn sử dụng, g FCR Giai đoạn 15-28 ngày Tỉ lệ chết , % Tăng trọng, g/con Thức ăn sử dụng, g FCR Giai đoạn 29-56 ngày Tỉ lệ chết , % Tăng trọng, g/con Thức ăn sử dụng, g FCR a,b Nghiệm thức NT3 ĐC (+) ĐC(-) SEM P 2,22 123,5c 247,1 2,00a 2,22 124,2bc 246,6 1,97a 0,96 0,527 2,00 0,018 0,74 0,00 0,04 0,00 8,05b 240,6a 552,5a 2,30b 35,25a 119,1b 477,5b 4,01a 1,11b 238,2a 521,8ab 2,19b 1,95 0,00 4,28 0,00 11,35 0,004 0,037 0,00 6,18 502,7bc 1864a 3,71b 6,57 283,3d 1258c 4,44a 4,48 480,8c 1666b 3,47c 2,01 0,356 4,826 0,00 22,73 0,00 0,035 0,00 NT1 NT2 2,22 130,3a 246,6 1,89b 3,33 126,2b 255,2 2,02a 3,33 124,8bc 251,7 2,02a 4,56b 246,9a 551,9a 2,24b 5,75b 242,2a 544,4a 2,25b 1,15 545,6a 1791a 3,28d 6,04 513,1b 1816a 3,54c giá trị mang số mũ khác hàng khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.01) NT1: Bổ sung B subtilis VL28 107 CFU/g (5 g/kg thức ăn) NT2: Bổ sung oxytetracyclin 50 mg/kg thức ăn NT3: Bổ sung enrofloxacin 15 mg/kg thức ăn ĐC (+): Gây nhiễm E coli mà không điều trị, ĐC (-): không gây nhiễm 23 Kết giai đoạn 1-14 ngày tuổi cho thấy sử dụng probiotic B subtilis VL28 giúp tăng trọng cải thiện số FCR Kết phù hợp với nghiên cứu Gao et al., (2017), nghiên cứu B subtilis giúp cải thiện tăng trọng FCR đáng kể không quan sát thấy cải thiện lượng thức ăn sử dụng Giai đoạn 15-28 ngày Sau gây nhiễm E coli ngày thứ 18, lô ĐC (+) bắt đầu có biểu bệnh chết vào ngày thứ sau gây nhiễm chết nhiều vào giai đoạn 5-10 ngày sau gây nhiễm, đến ngày thứ 10 lơ ĐC (+) lại 15 con/30con Tỉ lệ chết NT1 4,56%, NT2 5,75%, NT3 8,05%, điều cho thấy B subtilis VL28 kháng sinh enrofloxacin oxytetracyclin có khả làm giảm tỉ lệ chết nhiễm E coli hay nói cách khác có khả điều trị bệnh Lơ sử dụng B subtilis VL28 có tỉ lệ chết, tăng trọng FCR tương đương với lô sử dụng kháng sinh tương đương với ĐC (-) khơng bệnh Mổ khám bệnh, bệnh tích ghi nhận gồm: Viêm màng bao tim tích nước, màng bụng có dịch viêm, gan có đốm trắng hoại tử, ruột tích nước sưng phồng, cắt bên ruột có bọt khí (Hình 4.32) Các dấu hiệu bệnh tích phù hợp với bệnh tích gây vi khuẩn E coli Viêm màng bao tim, tích nước Gan sung hoại tử huyết, Ruột tích nước sưng phồng Có bọt khí ruột Hình 4.32 Bệnh tích thí nghiệm gây nhiễm E coli Kết xác định phản ứng sinh hóa phù hợp với đặc tính sinh hóa E coli Kết giải trình tự gen cho kết vi khuẩn E coli, với tỉ lệ đồng hình 100 % phù hợp với vi khuẩn E coli gây nhiễm Giai đoạn 29-56 ngày Khi chuyển sang giai đoạn lớn hơn, tỉ lệ chết giảm tất lô gây nhiễm, cho thấy phục hồi sau bị nhiễm bệnh Tuy nhiên, lô ĐC (+) chịu ảnh hưởng bệnh E coli nên tỉ lệ chết giảm 24 tăng trọng không đáng kể so với giai đoạn trước, với số FCR cao NT lại Có thể thấy, sử dụng liên tục probiotic B subtilis VL28 mang lại nhiều lợi ích cho phát triển không phát triển khỏe mạnh mà hệ miễn dịch tăng cường, có khả đối kháng lại với vi khuẩn gây bệnh 4.4 Đăng ký trình tự B subtilis VL28 Genbank Từ kết chúng tơi tiến hành đăng ký trình tự gen B subtilis VL28 ngân hàng gen NCBI ngân hàng gen cơng nhận trình tự gen 16S rRNA B subtilis VL 28 với mã số truy cập: KY346980 Có thể truy cập trang web https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ky346980 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận - Đã phân lập xác định xác trình tự gen 21 chủng B subtilis từ đất phân - Tuyển chọn chủng B subtilis VL28 có đặc tính probiotic phù hợp để sử dụng cho gà: nhạy với nhiều kháng sinh, có khả chịu nhiệt, có khả sinh tổng hợp amylase, protease lipase với hoạt tính cao, có khả đối kháng cao với E coli S enterica, chịu acid dày muối mật, có tính bám dính cao ổn định tốt đường tiêu hóa gia cầm - Thực nghiệm cho thấy bổ sung chủng B subtilis VL28 107 CFU/g với liều g/kg thức ăn có khả thay kháng sinh ngăn ngừa trình nhiễm trùng đường ruột đàn gà, đồng thời nâng cao tăng trọng số FCR 5.2 Đề nghị - Mở rộng nghiên cứu ứng dụng chủng B subtilis VL28 phòng trị bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa Salmonellosis, Colibacillosis, Necrotic Enteritis, … thực địa qui mô công nghiệp - Tối ưu hóa qui trình lên men thu sinh khối B subtilis VL28 với mật độ cao, giá thành thấp - Tối ưu hóa qui trình bảo quản giống B subtilis VL28 sản xuất chế phẩm probiotic góp phần tăng suất vật nuôi tạo nguồn thịt gia cầm sạch, không tồn dư kháng sinh, bảo vệ sức khỏe cộng đồng 25 ... cuối ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen 16S rRNA, có 21 chủng vi khuẩn xác định B subtilis 21 chủng B subtilis thực bước tuyển chọn probiotic để chọn chủng tối ưu có khả phòng bệnh đường tiêu hóa. .. trình nghiên cứu chọn lọc chủng B subtilis địa có hiệu phòng bệnh đường tiêu hóa gà vùng Đồng sơng Cửu Long, đặc biệt bệnh S enterica E coli gây - Đã phân lập giám định xác 21 chủng B subtilis địa... B subtilis đa dạng đặc tính sinh học nên khơng phải tất chủng sử dụng làm probiotic chủng probiotic phù hợp có hiệu sử dụng cho đối tượng định Đề tài Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng

Ngày đăng: 11/05/2018, 16:25

Từ khóa liên quan

Tài liệu cùng người dùng

  • Đang cập nhật ...

Tài liệu liên quan