Tuyển chọn chủng bacillus subtilis ứng dụng trong phòng và trị bệnh đường tiêu hóa trên gà tt

Đề tài “Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong phòng bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa trên gà” được thực hiện nhằm nghiên cứu tìm giải pháp mới thay thế sử dụng kháng sinh tro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Bệnh lý học & Chữa bệnh vật nuôi

Mã ngành: 62 64 01 02

LÊ THỊ HẢI YẾN

TUYỂN CHỌN CHỦNG BACILLUS SUBTILIS

ỨNG DỤNG TRONG PHÒNG VÀ TRỊ BỆNH

ĐƯỜNG TIÊU HÓA TRÊN GÀ

Cần Thơ - 2018

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS NGUYỄN ĐỨC HIỀN

Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường Họp tại:………., Trường Đại học Cần Thơ Vào lúc … giờ … ngày …… tháng … năm ………

Phản biện 1:

Phản biện 2:

Phản biện 3:

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

1 Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ

2 Thư viện Quốc gia Việt Nam

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

1 Lê Thị Hải Yến và Nguyễn Đức Hiền, 2015 Phân lập vi khuẩn Bacillus

subtilis ứng dụng làm probiotic từ đất và phân gà tại TP Cần Thơ Tạp

chí Khoa học kỹ thuật Thú y, số 6, trang 55-62

2 Lê Thị Hải Yến và Nguyễn Đức Hiền, 2015 Khảo sát đặc tính prbiotic của

một số chủng Bacillus phân lập tại một số trại gà thành phố Cần Thơ

Báo cáo khoa học Hội nghị khoa học toàn quốc Chăn nuôi – Thú y 2015 ISBN 978-604-60-2019-6 Nhà xuất bản Nông nghiệp, trang 485-491

3 Le Thi Hai Yen and Nguyen Duc Hien, 2016 Isolation and identification of

Bacillus subtilis isolated from soil and feces on chicken farms in the

Mekong delta, Vietnam Proceedings of The 19th Federation of Asian Veterinary Associations Congress, Ho Chi Minh city, September 6-9th,

2016 Vietnam National University-Ho Chi Minh city Press, page

143-147

4 Lê Thị Hải Yến và Nguyễn Đức Hiền, 2016 Khảo sát đặc tính probiotic các chủng vi khuẩn phân lập tại các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long ISSN 1859-2333 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ số 2, trang 26-

32

5 Lê Thị Hải Yến và Nguyễn Đức Hiền, 2017 Khảo sát khả năng chịu acid dạ

dày - muối mật và khả năng bám dính của hai chủng vi khuẩn Bacillus

subtilis AG27 và VL28 Báo cáo khoa học Hội nghị khoa học toàn quốc

Chăn nuôi – Thú y 2017 ISBN 978-604-60-2492-7 Nhà xuất bản Nông Nghiệp, trang 341-346

6 Le Thi Hai Yen and Nguyen Duc Hien, 2017 Isolation and characterization

of probiotic Bacillus subtilis VL28 on chicken farms in Vietnam

Proceedings of 33rd World Veterinary Congress, Incheon – Korea, August 27-31, 2016

7 Le,T.H.Y and Nguyen,D.H., 2017 Bacillus subtilis strain VL28 16S

ribosomal RNA gene, partial sequence GenBank: KY346980.1

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KY346980

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Sự phát triển mạnh mẽ của ngành chăn nuôi gà công nghiệp trong những thập niên gần đây đã mang lại nhiều lợi ích kinh tế - xã hội to lớn, nhưng cũng làm nảy sinh nhiều vấn đề cần được quan tâm xem xét Một trong những vấn

đề cần quan tâm giải quyết là việc sử dụng rộng rãi các chất kháng sinh để phòng bệnh và kích thích tăng trưởng trong chăn nuôi Việc này đã làm gia tăng các dòng vi khuẩn kháng thuốc trong tự nhiên, có ảnh hưởng rất lớn tới hiệu quả sử dụng kháng sinh trong điều trị các bệnh viêm nhiễm trên người Do vậy, nhiều nước tiên tiến đã quyết định hạn chế việc sử dụng các chất kháng sinh trong chăn nuôi Để thay thế kháng sinh trong chăn nuôi, các nhà khoa học

đã đưa ra nhiều giải pháp khác nhau trong đó có biện pháp sử dụng probiotic - những vi sinh vật sống hữu ích cho hoạt động tiêu hóa và có tác dụng tăng

cường sức khỏe nói chung cho người và động vật Bacillus subtilis là một vi

khuẩn rất phổ biến trong tự nhiên, hầu như không có độc tính trên người cũng như nhiều loài động vật và có sức đề kháng cao với nhiều tác nhân vật lý và hóa học Do vậy, từ lâu vi khuẩn này được chọn nghiên cứu để làm probiotic

cho người và vật nuôi theo mô hình công nghiệp Tuy nhiên, B subtilis rất đa

dạng về các đặc tính sinh học nên không phải tất cả các chủng đều có thể sử dụng làm probiotic và mỗi chủng probiotic chỉ phù hợp và có hiệu quả khi sử dụng cho một đối tượng nhất định

Đề tài “Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong phòng bệnh

nhiễm khuẩn đường tiêu hóa trên gà” được thực hiện nhằm nghiên cứu tìm giải pháp mới thay thế sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi, nâng cao năng suất, hiệu quả trong chăn nuôi gà công nghiệp và giảm bớt nguy cơ lan rộng các dòng vi khuẩn đề kháng kháng sinh trong tự nhiên

1.2 Mục tiêu:

1 Phân lập được ít nhất 01 chủng Bacillus subtilis tại một số tỉnh ĐBSCL

có các đặc tính probiotic như: khả năng sinh enzyme tiêu hóa (amylase, protease, lipase); chịu được tác động của dịch tiêu hóa (dịch vị, muối mật), có khả năng bám dính vào niêm mạc ruột và đối kháng với một số vi khuẩn gây

bệnh đường ruột (Salmonella, E coli)

- Xác định được liều dùng hiệu quả của chủng probiotic phân lập được

trong phòng bệnh đường ruột ở gà do E coli và S enterica gây ra

1.3 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu

- Đối tƣợng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis

- Phạm vi nghiên cứu: Các chủng Bacillus subtilis được phân lập từ đất

và phân gà ở 7 tỉnh thành thuộc Đồng bằng sông Cửu Long, bao gồm: Cần Thơ, Hậu Giang, An Giang, Vĩnh Long, Đồng Tháp, Sóc Trăng, Kiên Giang

1.4 Những đóng góp mới của luận án

Luận án là công trình nghiên cứu đầu tiên chọn lọc được chủng B subtilis

bản địa có hiệu quả trong phòng bệnh đường tiêu hóa trên gà tại vùng Đồng

bằng sông Cửu Long, đặc biệt là bệnh do S enterica và E coli gây ra

- Đã phân lập và giám định chính xác 21 chủng B subtilis bản địa từ phân

và đất chuồng gà ở khu vực ĐBSCL và tuyển chọn được chủng B subtilis

VL28 có thể sử dụng làm probiotic trên gà

- Đã chứng minh bằng thực nghiệm việc bổ sung chủng B subtilis VL28

107 CFU/g với liều 5g/kg thức ăn có khả năng thay thế kháng sinh ngăn ngừa quá trình nhiễm trùng đường ruột ở đàn gà được gây nhiễm thực nghiệm với

S enterica và E coli, đồng thời làm tăng mức tăng trưởng cũng như giảm hệ số

chuyển hóa thức ăn so với gà đối chứng

- Đã được ngân hàng gen NCBI công nhận trình tự gen 16S rRNA của

B subtilis VL 28 với mã số truy cập KY346980

(có thể truy cập trên trang web

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ky346980)

- Là công trình nghiên cứu, phân lập, tuyển chọn vi khuẩn probiotic một cách hệ thống theo tiêu chuẩn Quốc tế

1.5 Ý nghĩa thực tiễn của luận án

Chọn lọc được chủng B subtilis bản địa có tiềm năng dùng làm probiotic

phù hợp với điều kiện chăn nuôi tại Đồng bằng sông Cửu Long Kết quả nghiên cứu của đề tài dùng ứng dụng trong sản xuất chế phẩm probiotic, phòng chống bệnh đường ruột gia cầm, làm tăng năng suất chăn nuôi đem lại lợi nhuận cao cho người chăn nuôi Tạo cơ sở khoa học để đề xuất hạn chế sử dụng kháng sinh làm chất kích thích tăng trưởng và phòng bệnh trong chăn nuôi Góp phần tạo được nguồn thịt gia cầm sạch, không tồn dư kháng sinh, bảo vệ sức khỏe cộng đồng

Chương III NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đề tài được thực hiện với 3 nội dung:

3.1 Nội dung 1: Phân lập các chủng B subtilis

- Phân lập B subtilis bằng phương pháp truyền thống: dựa vào đặc điểm

khuẩn lạc và quan sát hình thái vi khuẩn dưới kính hiển vi, nhuộm Gram và thử phản ứng sinh hóa

- Định danh chính xác đến loài bằng kit API 50 CHB

- Giám định chính xác giống và loài các chủng Bacillus tuyển chọn bằng

phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA

Phương pháp lấy mẫu

Mẫu đất: Đất được lấy ở tầng mặt, độ sâu từ 4-5 cm Mẫu gộp được lấy từ

5 vị trí khác nhau của 1 trại gà

Mẫu phân: Lấy phân tươi trên nền chuồng Mẫu gộp được lấy từ 5 vị trí khác nhau trong chuồng gà (4 mẫu ở 4 góc và 1 mẫu ở trung tâm)

Lượng đất và phân lấy mỗi lần từ 30-50 g Mẫu được đựng trong túi nilon (polypropylen) đã được khử trùng Sau khi lấy mẫu, tiến hành ghi nhãn địa điểm và thời gian lấy, sau đó tất cả các mẫu được bảo quản bằng thùng trữ lạnh

và đưa về phòng thí nghiệm

Số lượng mẫu

Chọn mẫu theo phương pháp định ngạch (phi ngẫu nhiên), mỗi địa phương

20 mẫu (10 mẫu đất + 10 mẫu phân) Tổng cộng: 140 mẫu/ 7 tỉnh, thành phố ĐBSCL

Tiến hành giám định các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn B subtilis theo phương pháp của Cowan and Steel (2004) với một số cải tiến Các phản ứng

sinh hóa bao gồm: lecithinase (-), catalase (+), VP (+), amylase (+), khả năng phát triển ở 50oC và celluslase (+) được thực hiện lần lượt theo trình tự để sàng

lọc sơ bộ được nhóm vi khuẩn thuộc loài B subtilis Các chủng đạt yêu cầu,

sau đó sẽ được định danh bằng bộ kit API 50 CHB, chủng nào có kết quả là

B subtilis sẽ được giải trình tự gen 16S RNA để khẳng định lại

Sau khi ly trích DNA của các chủng vi khuẩn, tiến hành phản ứng PCR

với cặp mồi phổ biến mã hóa cho đoạn gen 16S rRNA (Saminathan and

Narayanan, 2015) có trình tự như sau:

27F: (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') 1492R: (5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'27F)

Qui trình phân lập và giám định vi khuẩn B subtilis được trình bày tóm

tắt theo sơ đồ sau:

Chủng vi khuẩn thuần

↓ Test Lecithinase: (-)

↓ Test Catalase: (+)

↓ Test VP: (+)

↓ Test Amylase: (+)

↓ Khả năng phát triển ở 50ºC

↓ Test Cellulase: (+)

↓ API CH50B

↓ Giải trình tự gen 16S rRNA

Hình 3.1 Sơ đồ sàng lọc, định danh vi khuẩn B subtilis

3.2 Nội dung 2: Tuyển chọn các chủng B subtilis có đặc tính probiotic

Gồm 7 chỉ tiêu như sau:

3.2.1 Tính chịu nhiệt Tính chịu nhiệt của vi khuẩn được khảo sát theo

phương pháp của Barbosa et al (2000) có cải tiến Cấy chủng vi khuẩn cần

kiểm tra trên đĩa thạch TSA và ủ ở 50C, 55C và 60C trong 24 giờ Kết thúc thời gian ủ, kiểm tra khả năng sống của vi khuẩn

3.2.2 Khả năng nhạy kháng sinh (9 loại kháng sinh đang được dùng phổ

biến trên gia cầm: erythromycin, gentamycin, neomycin, oxytetracyclin, doxycyclin, colistin, sulfadimidin - trimethoprim, norfloxacin, enrofloxacin) Tính nhạy cảm kháng sinh của các vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đĩa khuếch tán kháng sinh theo hướng dẫn của Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng và

xét nghiệm (Clinical and Laboratoty Standards Institude - CLSI, 2015)

(Wayne, 2015)

3.2.3 Khả năng sinh enzyme tiêu hóa (amylase, protease, lipase): Thực

hiện định tính và định lượng các chủng vi khuẩn khảo sát, sau đó chọn những chủng có khả năng sinh cả 3 loại enzyme

3.2.4 Khả năng đối kháng vi khuẩn gây bệnh

Thử nghiệm khả năng đối kháng theo phương pháp vạch thẳng vuông góc:

Khảo sát trên môi trường Starch agar (SA) Các bước tiến hành theo phương

pháp của Sertaç et al (2014): cấy vi khuẩn B subtilis dọc theo một đường

thẳng trên đĩa thạch SA, ủ ở 37oC trong 24 giờ, tiến hành cấy vi khuẩn gây

bệnh (S enterica, E.coli) theo các vạch ngang vuông góc với vạch vi khuẩn đã

mọc, tiếp tục ủ ở 37o

C trong 24 giờ Khả năng kháng khuẩn được xác định

bằng cách đo khoảng cách vùng kháng khuẩn theo đơn vị mm dựa theo Hutt et

al (2006)

Thử nghiệm khả năng đối kháng theo phương pháp đối kháng trực tiếp:

Thực hiện theo phương pháp của Moore et al (2013): Vi khuẩn gây bệnh và

B subtilis được hoạt hóa trong môi trường TSB và ủ ở nhiệt độ thích hợp trong

24 giờ Huyền phù vi khuẩn B subtilis được điều chỉnh sao cho mật số đạt 105

,

106 và 107 CFU/mL tương ứng với nồng độ vi khuẩn gây bệnh để tiến hành thử khả năng đối kháng Bơm 100 µL huyền phù vi khuẩn gây bệnh lên các đĩa

thạch và dùng que tran trải đều; sau đó, bơm 10 µL dịch vi khuẩn B subtilis

tương ứng với các nồng độ khảo sát lên những vị trí xác định trên bề mặt thạch,

và đem ủ ở 37oC trong 24 giờ Khả năng đối kháng được đo bằng đường kính vòng ức chế vi khuẩn gây bệnh theo đơn vị mm Đánh giá khả năng đối kháng

theo Sumathi and Reetha (2012)

3.2.5 Khả năng chịu acid và muối mật.Thực hiện theo phương pháp của

Corcoran et al (2005) và Dunne (2001) Vi khuẩn B subtilis được cấy ria trên

môi trường DSM, ủ từ 24 - 48 giờ ở 30ºC Sau đó, tạo huyền phù sinh khối vi khuẩn trong dung dịch đệm PBS pH 7,2, pha loãng để đạt mật số vi khuẩn trong dịch huyền phù là 107 CFU/mL Sau đó chủng 1 mL dịch huyền phù vào

9 mL dung dịch dạ dày mô phỏng gồm Glucose (3,5 g/L), NaCl (2,05 g/L), KH2PO4 (0,6 g/L), CaCl2 (0,11 g/L), và KCl (0,37 g/L) được chuẩn độ về các

pH 2, 3, 4, 5 bằng dung dịch HCl 1M và lọc bằng màng lọc 0,2 μm Sau đó Pepsin (13,3 mg/L) và dịch mật (0,05 g/L) được cho vào dịch gốc trước khi tiến hành thí nghiệm Trộn đều và ủ dịch hỗn hợp ở 37ºC trong máy lắc 90 phút, đồng thời tiến hành kiểm tra mật số vi khuẩn ở các thời điểm 0; 10; 30; 60, 90

phút Tính tỉ lệ phần trăm sống sót của vi khuẩn B subtilis

ở nhiệt độ phòng Sau mỗi giờ, lấy 0,1 mL dịch nổi phía trên cho vào 1 ống nghiệm khác chứa 3,9 mL PBS và xác định mật độ quang của dung dịch ở bước sóng 600 nm (OD600) Kết quả được tính theo công thức sau:

Khả năng tự bám dính (%) = (Ao - At)/Ao × 100 Trong đó:Ao: OD600 của dung dịch tế bào ở thời điểm t = 0 giờ At: OD600 dung dịch tế bào ở các thời điểm t = 1, 2, 3, 4 và 5 giờ

- Khả năng bám dính giữa các chủng vi sinh vật khác nhau: xác định theo

mô tả của Kos et al (2003) và Anwar et al (2014) Phương pháp chuẩn bị mẫu

tương tự như phương pháp thử nghiệm khả năng tự bám dính, tuy nhiên sử dụng vi khuẩn phân lập được lần lượt với hai chủng vi khuẩn thử nghiệm là

E coli và S enterica Khả năng bám dính giữa các chủng vi sinh vật khác nhau

được tính toán theo công thức:

Khả năng bám dính giữa các chủng khác nhau (%) = [(Ax + Ay)/2 - A(x+y)]/[(Ax+Ay)/2]×100 Trong đó: Ax là OD600 của chủng vi khuẩn x ở ống đối chứng

Ay là OD600 của chủng vi khuẩn y ở ống đối chứng

A(x+y) là OD600 của hỗn hợp 2 chủng vi khuẩn x và y

- Khả năng bám dính với biểu mô ruột Tiến hành theo phương pháp của

Piatek et al (2012): Chủng vi khuẩn B subtilis được tăng sinh bậc 2 trong

20 mL dung dịch NB, ủ ở 37oC trong 24 giờ, và được điều chỉnh với mật số

108 CFU/mL Mẫu biểu mô ruột gà được cắt thành những đoạn ngắn khoảng 1cm, và nhúng vào dung dịch đệm PBS trong 30 phút ở 4oC Sau đó, mẫu được ngâm trong dung dịch vi khuẩn cần kiểm tra, tiếp tục ủ ở 37o

C, trong 30 phút Dung dịch vi khuẩn được loại bỏ, mẫu được cố định trong formalin, và tiến hành làm tiêu bản mô

3.2.7 Khả năng sống của vi khuẩn trong đường ruột gà

Thực hiện theo phương pháp của Cartman et al (2008): gà con 1 ngày tuổi được cho uống bào tử B subtilis liều 0,1 mL canh khuẩn chứa 1x109

CFU/mL Sau đó, vào các mốc thời gian 24, 48, 72, 96 và 120 giờ, chọn 3 gà ngẫu nhiên,

mổ và thu mẫu ở hồi tràng, manh tràng và ruột già Tiến hành rửa mẫu, xử lý nhiệt ở 80oC, trong 20 phút để tiêu diệt tế bào sinh dưỡng và các vi khuẩn khác

Sau đó, tiến hành trải mẫu kiểm tra mật số vi khuẩn B subtilis ở các mốc thời

gian như trên Giá trị trung bình được tính theo số lượng bào tử/g ruột non, manh tràng và ruột già

3.3 Nội dung 3: Thử nghiệm, đánh giá tác dụng của chế phẩm probiotic

chứa B subtilis trên gà

3.3.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu trong 3 thí nghiệm là chủng B subtilis được phân lập

và tuyển chọn trong đề tài

Gà thí nghiệm: là gà 1 ngày tuổi, thuộc giống gà ta Greenfeed GF168 nuôi tại công ty chăn nuôi Vemedim

Thức ăn và các qui trình tiêm chủng vaccine thực hiện theo qui trình của công ty chăn nuôi

3.3.2 Chuồng trại thí nghiệm

Gà được nuôi trên chuồng lồng, đáy lồng và vách được làm bằng khung kẽm kích thước 0,6 x 1 x 2 m Diện tích mỗi ô chuồng là 2m2

ngăn làm 2 ngăn, mỗi ngăn là 15 con Máng ăn và máng uống được bố trí riêng cho mỗi ngăn chuồng

3.3.3 Thí nghiệm 1: Xác định liều sử dụng B subtilis hiệu quả

Mục đích: đánh giá tính an toàn và xác định liều hiệu quả của sản phẩm đối

với gà

Bố trí thí nghiệm:

Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 4 nghiệm

thức, trong đó có 3 nghiệm thức tương ứng với 3 liều bổ sung B subtilis và 1 nghiệm thức đối chứng không bổ sung B subtilis Mỗi nghiệm thức gồm 30 gà

và lặp lại 3 lần

Bảng 3.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1

B subtilis bổ sung, CFU/g (*) 107 106 5x105 - Lượng bổ sung, g/kg thức ăn 5 5 5 -

Số ngày chuẩn bị thí nghiệm 7 7 7 7

Ghi chú: (*): Liều tham khảo từ thí nghiệm của Knap et al (2011) và Teo et al (2006)

Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm

Lượng thức ăn đưa vào: xác định bằng cách cân tổng lượng thức ăn cho ăn

và thức ăn thừa hàng ngày của từng lô trong thời gian thí nghiệm

Số gà chết: ghi nhận số gà chết hàng ngày và tổng kết mỗi 2 tuần

Tăng trọng: gà được cân khối lượng khi bắt đầu thí nghiệm, sau đó mỗi 2 tuần cân một lần đến khi kết thúc thí nghiệm, tính khối lượng chung cho cả lô Tăng khối lượng toàn kỳ (g) = Khối lượng cuối kỳ (g) - Khối lượng đầu kỳ (g)

Tăng khối lượng bình quân (g/ngày) =

Hệ số chuyển hóa thức ăn =

Tăng khối lượng toàn kỳ

Số ngày thí nghiệm Tổng lượng thức ăn đưa vào (g) Tổng tăng trọng của gà (g)

3.3.4.2 Thí nghiệm 2 Mục đích: Đánh giá khả năng bảo vệ của probiotic so với kháng sinh ở gà

khi gây nhiễm với S enterica

Bố trí thí nghiệm: gồm 5 nghiệm thức bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu

nhiên theo phương pháp của Knap et al (2011): 2 nghiệm thức đối chứng (ĐC

âm, ĐC dương) cho ăn khẩu phần ăn bình thường của trại trong suốt quá trình

nuôi Các nghiệm thức thí nghiệm (bổ sung probiotic hoặc kháng sinh) được bố

trí như sau:

NT1: Bổ sung B subtilis 5g/kg thức ăn, cho ăn liên tục trong suốt thời

gian thí nghiệm

NT2: Bổ sung oxytetracycline 50 mg/kg thức ăn, liên tục 5 ngày bắt đầu

từ ngày gây nhiễm

NT3: Bổ sung enrofloxacine 15 mg/kg thức ăn, liên tục 5 ngày bắt đầu

từ ngày gây nhiễm

Gây nhiễm S enterica cho các nghiệm thức NT1, NT2, NT3, và ĐC (+)

vào ngày thứ 18, mỗi nghiệm thức gồm 30 gà và lặp lại 3 lần

Bảng 3.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2

Tuổi gà thí nghiệm, ngày 1 1 1 1 1

Tuổi gây nhiễm, ngày

S enterica gây nhiễm (1), CFU/mL

18 7,5x104

18 7,5x104

18 7,5x104

18 7,5x104

(1) S enterica phân lập từ gà bệnh, gây nhiễm qua đường uống 0,5ml/con (Knap et al., 2011)

(2) Liều B subtilis hữu dụng được chọn ở thí nghiệm 1 (10 7

nghiệm kiểm tra vi khuẩn gây bệnh

- Ghi nhận các biểu hiện bệnh lý của gà, tỉ lệ chết ở các nghiệm thức

- Các chỉ tiêu lượng thức ăn đưa vào, tăng trọng, tăng khối lượng toàn

kỳ, hệ số chuyển hóa thức ăn ghi nhận giống thí nghiệm 1

3.3.4.3 Thí nghiệm 3:

Mục đích: Đánh giá khả năng bảo vệ của probiotic so với kháng sinh ở gà

gây nhiễm với E coli

Bố trí thí nghiệm: gồm 5 nghiệm thức bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu

nhiên theo phương pháp của Teo and Tan (2006): 2 nghiệm thức đối chứng (ĐC

âm, ĐC dương) cho ăn khẩu phần ăn bình thường của trại trong suốt quá trình nuôi Các nghiệm thức thí nghiệm (bổ sung probiotic hoặc kháng sinh) được bố trí như sau:

NT1: Bổ sung B subtilis 5g/kg thức ăn, cho ăn liên tục trong suốt thời

gian thí nghiệm

NT2: Bổ sung oxytetracycline 50 mg/kg thức ăn, liên tục 5 ngày bắt đầu

từ ngày gây nhiễm

NT3: Bổ sung enrofloxacine 15 mg/kg thức ăn, liên tục 5 ngày bắt đầu

từ ngày gây nhiễm

Gây nhiễm E coli cho các nghiệm thức NT1, NT2, NT3, và ĐC (+) vào

ngày thứ 18, mỗi nghiệm thức gồm 30 gà và lặp lại 3 lần

18 5x106

18 5x106

18 5x106

-

-

B subtilis bổ sung (2), g/kg thức ăn 5

Oxtetracyclin, mg/kg thức ăn (3) - 50 - - - Enrofloxacin, mg/kg thức ăn (4)

E coli phân lập từ gà bệnh, gây nhiễm qua đường uống 0,5ml/con (Teo and Tan,2006)

(2) Liều B subtilis hữu dụng được chọn ở thí nghiệm 1 (10 7

- Ghi nhận các biểu hiện bệnh lý của gà, tỉ lệ chết ở các nghiệm thức

- Các chỉ tiêu lượng thức ăn đưa vào, tăng trọng, tăng khối lượng toàn kỳ,

hệ số chuyển hóa thức ăn ghi nhận giống thí nghiệm 1