Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong phòng và trị bệnh đường tiêu hóa trên gà (Luận án tiến sĩ)Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong phòng và trị bệnh đường tiêu hóa trên gà (Luận án tiến sĩ)Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong phòng và trị bệnh đường tiêu hóa trên gà (Luận án tiến sĩ)Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong phòng và trị bệnh đường tiêu hóa trên gà (Luận án tiến sĩ)Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong phòng và trị bệnh đường tiêu hóa trên gà (Luận án tiến sĩ)Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong phòng và trị bệnh đường tiêu hóa trên gà (Luận án tiến sĩ)Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong phòng và trị bệnh đường tiêu hóa trên gà (Luận án tiến sĩ)Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong phòng và trị bệnh đường tiêu hóa trên gà (Luận án tiến sĩ)Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong phòng và trị bệnh đường tiêu hóa trên gà (Luận án tiến sĩ)Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong phòng và trị bệnh đường tiêu hóa trên gà (Luận án tiến sĩ)
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ LÊ THỊ HẢI YẾN TUYỂN CHỌN CHỦNG BACILLUS SUBTILIS ỨNG DỤNG TRONG PHÕNG BỆNH NHIỄM KHUẨN ĐƯỜNG TIÊU HÓA TRÊN GÀ LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI MÃ SỐ: 62 64 01 02 CẦN THƠ, 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ LÊ THỊ HẢI YẾN TUYỂN CHỌN CHỦNG BACILLUS SUBTILIS ỨNG DỤNG TRONG PHÕNG BỆNH NHIỄM KHUẨN ĐƢỜNG TIÊU HÓA TRÊN GÀ LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI MÃ SỐ: 62 64 01 02 HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS NGUYỄN ĐỨC HIỀN Cần Thơ, 2018 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành nội dung luận văn tốt nghiệp, cố gắng học hỏi thân, nhận giúp đỡ nhiều từ quý thầy cô, bạn bè Tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến: PGS TS Nguyễn Đức Hiền động viên, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi học tập, nghiên cứu hồn thành luận án Q thầy Bộ mơn Thú y, khoa Nơng nghiêp Sinh học Ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ dạy dỗ, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu cho suốt thời gian học tập trường Ban lãnh đạo Vemedim Corporation, Trung tâm nghiên cứu phát triển Vemedim tạo điều kiện thuận lợi để học tập, nghiên cứu nâng cao trình độ thời gian qua Cty TNHH chăn nuôi thành viên Vemedim tạo điều kiện thuận lợi cho tơi thực thí nghiệm Xin chân thành cảm ơn tất bạn bè, bạn đồng nghiệp, anh, chị, em phòng Sản phẩm sinh học, Trung Tâm nghiên cứu phát triển Vemedim hỗ trợ, chia sẻ cung cấp thông tin giúp tơi hồn thành luận án Cảm ơn gia đình người thân động viên, chia sẻ sát cánh bên tơi suốt q trình học tập thực đề tài ii TÓM LƢỢC Đề tài “Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng phòng bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa gà” thực với mục đích phân lập chủng vi khuẩn B subtilis có tiềm probiotic thích hợp cho gia cầm từ đất phân trại gà Nghiên cứu nhằm tìm biện pháp thay kháng sinh phòng trị bệnh, nâng cao suất, hiệu chăn nuôi gà công nghiệp, giảm bớt nguy lan rộng dòng vi khuẩn kháng kháng sinh tự nhiên Đề tài phân lập 296 chủng vi khuẩn từ 70 mẫu đất 70 mẫu phân gà thu thập trại gà thuộc tỉnh, thành vùng ĐBSCL Các chủng vi khuẩn chọn lọc qua kiểm định sinh lý, sinh hóa với tiêu như: âm tính với lecithinase, dương tính với catalase, amylase, cellulase, VP (VogesProskauer), chịu nhiệt cao (phát triển 50oC); định danh kít API CH50B (Biomerieux-France) kết hợp với kỹ thuật sinh học phân tử giải trình tự gen 16S rRNA (sử dụng phần mềm BLAST so sánh trình tự gen sở liệu NCBI) Kết phân tích cho thấy chọn 21 chủng vi khuẩn đạt tiêu mặt sinh lý, sinh hóa theo yêu cầu mặt định danh có mức độ tương đồng gene 16S rRNA cao (≥ 99%) với B subtilis Nhằm tuyển chọn chủng vi khuẩn có tiềm probiotic, 21 chủng B subtilis tuyển chọn khảo sát đặc điểm đặc trưng cho vi khuẩn probiotic như: tính nhạy cảm kháng sinh (erythromycin, gentamycin, neomycin, oxytetracyclin, doxycyclin, colistin, sulfadimidin - trimethoprim, norfloxacin, enrofloxacin), tính chịu nhiệt (phát triển nhiệt độ từ 50-60oC), khả sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease, lipase), khả ức chế vi khuẩn gây bệnh (E coli, S enterica, Staphylococcus spp., Streptococcus spp.), khả chịu pH acid dày (pH 2,0), khả chịu muối mật 0,3%, khả bám dính (tự bám dính, bám dính với vi khuẩn gây bệnh, bám dính tế bào biểu mơ ruột) khả sống đường tiêu hóa gà Kết cho thấy 21 chủng vi khuẩn khảo sát, B subtilis VL28 thể tốt đặc tính probiotic, chủng chọn để sử dụng thử nghiệm thức ăn bổ sung probiotic cho gà Vi khuẩn B subtilis VL28 mật độ 107 CFU/g với liều lượng g/kg thức ăn bổ sung vào thức ăn cho gà độ tuổi 1-56 ngày cho thấy hiệu tăng trọng gà đạt 11,7%, đồng thời lượng thức ăn sử dụng giảm 16,8% so với đối chứng nuôi thức ăn không bổ sung vi khuẩn Bên cạnh đó, gà 18 ngày tuổi lây nhiễm với S enterica (liều 7,5x104 CFU/mL/gà) E coli (liều 5,0x106 CFU/mL/gà), ni với thức ăn có bổ sung B subtilis VL28 với liều có khả tăng trọng tỉ lệ sống tương đương với điều trị kháng sinh enrofloxacin iii oxytetracyclin Các kết cho thấy chủng B subtilis VL28 phân lập tuyển chọn đề tài có tiềm probiotic lớn, chủng sử dụng để thay cho kháng sinh việc phòng trị bệnh đường tiêu hóa gia cầm Trình tự gen 16S rRNA B subtilis VL28 đăng ký ngân hàng gen NCBI với mã số truy cập KY346980 Từ khóa: B subtilis, gà, phân lập, định danh, probiotic iv ABSTRACT The dissertation “Isolation of Bacillus subtilis and its application on the prevention of intestinal diseases in chicken” was carried out to isolate the B subtilis strains with probiotic potential from soil and fecal samples at intensive chicken farms This study aimed to find out alternatives for antibiotics in the prevention and treatment of intestinal diseases as well as to increase productivity and effectiveness in poultry industry and also to reduce the risks of spreading antibiotic resistant bacteria in nature From 70 soil samples and 70 fecal samples of chicken farms from provinces in the Mekong Delta, 296 similarly B subtilis bacteria were isolated These isolates were analyzed further for B subtilis characteristics by physiobiological tests with the following criteria such as: negative in lecithinase, positive in catalase, amylase, cellulase, VP (Voges-Proskauer), and temperature tolerance (being able to grow at 50oC); and identified by the API CH50B kit (Biomerieux-France) in combination with the bio-molecular technique namely partial sequencing of 16S rRNA (using BLAST alignment with the known sequences on the NCBI genbank) The results showed that there were 21 isolates which satisfied the required physio-biochemical criteria, and the strain identification revealed that the similarity of gene 16S rRNA was high (≥ 99%) with B subtilis In order to select the B subtilis strain with probiotic capabilities, 21 selected B subtilis isolates were investigated further on the susceptibility to antibiotics (erythromycin, gentamycin, neomycin, oxytetracyclin, doxycyclin, colistin, sulfadimidin - trimethoprim, norfloxacin, enrofloxacin), temperature tolerance (being able to grow at 50-60oC), extracellular enzyme production (amylase, protease, lipase), bacterial pathogen inhibition properties (E coli, S enterica, Staphylococcus spp., Streptococcus spp.), tolerance to acidity of the gastric juice (pH 2,0) and 0.3% bile salts, adherence ability (autoaggregation, coaggregation, adherence to epithelial cells) and survival rate in gastrointestinal environment The results showed that among 21 isolates observed, the strain B subtilis VL28 exposed the best probiotic capabilities Consequently, this strain was chosen to use as a supplement for chicken feed The B subtilis VL28 (the density of 107 CFU/g and the dosage at g/kg of feed) was supplemented in feed for the 1-56 day old chicken The results showed that chicken growth increased by 11,7% and feed usage decreased by 16,8%, compared with the control groups without supplementing B subtilis VL28 Furthermore, the 18 day old chicken, infected by S enterica (with the dosage of 7,5x104CFU/mL/chicken) and by E coli (with the dosage of 5,0x106 CFU/mL/chicken), then fed with v B subtilis VL28 (supplemented in feed with the above described dosage), had growth ability and mortality rate equivalent to control groups treated with enrofloxacin and oxytetracyclin These results showed that the selected B subtilis VL28 strain in our study has great probiotic potential and could be used to replace antibiotics for prevention and treatment of intestinal diseases in poultry The 16S rRNA partial sequence of the new B subtilis VL28 was registered in the Genbank of NCBI with the access code KY346980 Key words: B subtilis, chicken, isolation, identification, probiotic vi MỤC LỤC Lời cam kết kết i Lời cảm ơn ii Tóm lược iii Abstract v Danh sách bảng x Danh sách hình xii Danh mục từ viết tắt xv CHƢƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu 1.3 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 1.4 Những đóng góp luận án 1.5 Ý nghĩa thực tiễn luận án CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU …………………………… 2.1 Tổng quan probiotic 2.1.1 Lịch sử probiotic 2.1.2 Các định nghĩa probiotic 2.1.3 Xu hướng sử dụng probiotic 2.1.4 Vai trò chế tác động probiotic 2.1.5 Cơ chế tác động probiotic gia cầm 2.1.6 Các chủng vi khuẩn thường dùng làm probiotic 12 2.1.7 Các tiêu để chọn vi sinh vật làm probiotic 13 2.1.8 Yêu cầu an toàn chủng vi sinh vật probiotic 14 2.2 Tổng quan Bacillus subtilis 15 2.2.1 Đặc điểm chung giống Bacillus 15 2.2.2 Đặc điểm loài Bacillus subtilis 16 vii 2.2.3 Dinh dưỡng tăng trưởng 22 2.2.4 Các chất B subtilis sinh 23 2.2.5 Tính đối kháng B subtilis 25 2.2.6 Một số phương pháp nghiên cứu tính đối kháng B subtilis vi sinh vật gây bệnh 26 2.3 Hệ tiêu hóa vi sinh vật đƣờng ruột 27 2.3.1 Hệ tiêu hóa gia cầm khác biệt so với động vật hữu nhũ 27 2.3.2 Vi sinh vật đường ruột tác động chúng đến vật nuôi 30 2.4 Một số vi khuẩn gây bệnh đƣờng tiêu hóa thƣờng gặp gà 31 2.4.1 Salmonella 31 2.4.2 E coli 36 2.4.3.Clostridium perfringens 39 2.5 Một số nghiên cứu probiotic giới Việt Nam 42 2.5.1 Trên giới 42 2.5.2 Tại Việt Nam 43 2.6 Một số nghiên cứu ứng dụng B subtilis 44 2.6.1 B subtilis ứng dụng cho người vật nuôi 44 2.6.2 B subtilis sử dụng cho gia cầm 45 CHƢƠNG PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 47 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 47 3.2 Phƣơng tiện nghiên cứu 47 3.2.1 Vật liệu 47 3.2.2 Dụng cụ 47 3.2.3 Thiết bị 47 3.2.4 Hóa chất mơi trường phân lập nuôi cấy vi khuẩn 48 3.3 Nội dung nghiên cứu phƣơng pháp nghiên cứu 49 3.3.1 Nội dung nghiên cứu 49 3.3.2 Phân lập chủng Bacillus subtilis 50 viii ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ LÊ THỊ HẢI YẾN TUYỂN CHỌN CHỦNG BACILLUS SUBTILIS ỨNG DỤNG TRONG PHÕNG BỆNH NHIỄM KHUẨN ĐƢỜNG TIÊU HÓA TRÊN GÀ LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH BỆNH LÝ HỌC VÀ... thực đề tài ii TÓM LƢỢC Đề tài Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng phòng bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa gà thực với mục đích phân lập chủng vi khuẩn B subtilis có tiềm probiotic thích... sử dụng làm probiotic chủng probiotic phù hợp có hiệu sử dụng cho đối tượng định Đề tài Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng phòng bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa gà thực nhằm nghiên