KỸ THUẬT PHÂN TỬ LPA (LINEPROBE ASSAY) TRONG CHẨN ĐOÁN LAO KHÁNG RIFAMPICIN VÀ ISONIAZID

Chính vì thế việc phát hiện những trường hợp lao đa kháng, siêu kháng thuốc là cực kỳ quan trọng để có thể lựa chọn phác đồ điều trị thích hợp, qua đó có thể giảm sự tiến triển bệnh, tỷ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC HUẾ

BỘ MÔN LAO

-o0o -SINH VIÊN THỰC HIỆN: TRƯƠNG MINH TUẤN- Y5N

HUẾ, 04/2018

KỸ THUẬT PHÂN TỬ LPA

(LINE-PROBE ASSAY) TRONG CHẨN ĐOÁN LAO KHÁNG

RIFAMPICIN VÀ ISONIAZID

LỜI CẢM ƠN

Qua hai tuần học tập và rèn luyện lâm sàng tại khoa bênh phổi, Bệnh viện Trung Ương Huế, dưới sự chỉ bảo và giảng dạy tận tình của quý thầy cô đã đem lại cho em nhiều kiến thức về lý thuyết cả thực hành trong suốt thời gian học tập ở đây Hai tuần là là một khoảng thời gian quá ngắn, quá ít để có thể thu nhận được những kiến thức quý báu từ thầy cô và các bác sĩ ở đây Tuy nhiên khoảng thời gian đó cũng đã cho em biết bao kỷ niệm: những lần phát biểu để kiếm từng 0.1 0.2, những tiếng cười trong từng bài giảng, những lần cùng làm việc nhóm với nhau, cùng trải qua những giờ lâm sàng với nhau, và cùng lo sợ làm sao để vượt qua kì thi “dễ rớt mà khó đậu” của bộ môn nhưng chính điều đó đã làm cho chúng em quý trọng những giờ lâm sàng này, nó giúp em biết mình còn thiếu sót rất nhiều, tạo động lực để trau dồi thêm trong tương lai

Em xin chân thành cảm ơn thầy Trần Hùng, cô Nguyễn Thị Bình Nguyên

-Bộ môn Lao trường Đại Học Y Dược Huế, cùng toàn thể các bác sĩ, cán bộ, nhân viên đang làm việc tại khoa lao, bệnh viện Trung Ương Huế đã rất nhiệt tình chỉ bảo, giảng dạy, truyền thụ những kiến thức, kinh nghiệm rất bổ ích cũng như tạo điều kiện tốt nhất cho chúng em học tập, để chúng em trau dồi thêm kiến thức và trang bị thêm nhiều kỹ năng lâm sàng thiết yếu Hình ảnh của thầy Hùng – người thầy luôn tận tụy hết mình vì sự nghiệp giảng dạy, những bài giảng thú vị, những câu nói thân quen, những bài học quý giá của thầy; và hình ảnh cô Nguyên với nụ cười tỏa nắng, luôn thân thiện, nhiệt tình giúp đỡ chúng em Đó sẽ là những kỷ niệm mà em có lẽ sẽ không bao giờ quên và là hành trang theo em trong suốt cuộc đời này.

Cuối cùng, chúng em xin chúc quý thầy cô và các bác sĩ, cán bộ, nhân viên sức khỏe, để tiếp bước cho sự nghiệp truyền đạt những kiến thức cho các thế hệ học sinh tiếp theo và vững bước trên con đường cứu người Chúc thầy luôn khỏe, chúc cô luôn trẻ và chúc bộ môn sớm tìm được người kế tục, một người đủ tài và tâm như thầy cô để có thể tiếp tục sự nghiệp trồng người này.

Em xin chân thành cảm ơn!

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Lao là một vấn đề sức khỏe toàn cầu, hiện nay tỉ lệ mới mắc và tỷ lệ tử vong của lao còn khá cao và hơn nữa vấn đề lao kháng thuốc đang trong tình trạng báo động gây nhiều khó khăn trong việc điều trị và các chương trình chống lao ở các nước đang phát triển Theo báo cáo toàn cầu về bệnh lao và kiểm soát bệnh lao năm 2014 của Tổ chức Y tế thế giới, hiện có 1/3 dân số thế giới đã nhiễm lao Bệnh lao là nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ 2 trong các bệnh nhiễm trùng Tình hình dịch tễ lao kháng thuốc đang có diễn biến phức tạp và xảy ra ở hầu hết các quốc gia

Ước tính năm 2013, trên toàn thế giới có 12 triệu người hiện mắc lao, 9 triệu người mới mắc lao, 13% dân số mắc lao có đồng nhiễm HIV, 1 triệu rưỡi người tử vong do lao, trong đó 0,36 triệu người tử vong có đồng nhiễm HIV, 65.000 người mắc lao đa kháng thuốc

Tỷ lệ lao đa kháng thuốc: 3,5% trong số bệnh nhân mới và 29,5% trong số bệnh nhân đã từng điều trị lao Ước tính có 480.000 người mắc lao đa kháng thuốc (MDR-TB), trong đó có khoảng 9% là lao siêu kháng (XDR-TB) Tỷ lệ điều trị thành công đa kháng trên toàn cầu mới đạt 48% Chính vì thế việc phát hiện những trường hợp lao đa kháng, siêu kháng thuốc là cực kỳ quan trọng để có thể lựa chọn phác đồ điều trị thích hợp, qua đó có thể giảm sự tiến triển bệnh, tỷ lệ tử vong cũng như lan tràn của chủng vi khuẩn lao kháng thuốc

Lao đa kháng thuốc là chủng vi khuẩn lao kháng với ít nhật 2 thuốc chống lao hạng 1 là rifampicin (RIF) and isoniazid (INH), điều này làm cho việc điều trị kém hiệu quả, tốn kém, và có thể dẫn đến thất bại điều trị hoặc tái phát Để có thể kiểm soát hiệu quả MDR-TB, thì pahcs đồ điều trị cần phải tùy theo sự nhạy cảm của chủng vi khuẩn lao với thuốc ở từng bệnh nhân riêng biệt WHO khuyến cáo tiêu chuẩn vàng của điều trị lao kháng thuốc là cần làm kháng sinh đồ đánh giá sự nhạy cảm vi khuẩn lao với thuốc thường quy, tuy nhiên thời gian để có kết quả khá chậm (từ 25 ngày cho đến hơn 2 tháng) Nếu như vậy thì quá trình điều trị cho bệnh nhân sẽ bị trì hoãn từ đó làm tăng nguy cơ thất bại điều trị và kiểm soát sự lây lan chủng vi khuẩn lao kháng thuốc

Chính vì thế cần có một xét nghiệm đơn giản, cho kết quả nhanh chóng, hiệu quả để có thể giúp khắc phục nhưng điều này Dựa trên những bằng chứng và khuyến cáo của các chuyên gia năm 2008, WHO đã chấp thuận việc sử dụng kỹ thuật phân tử LPA (line-probe assays) trong việc chẩn đoán nhanh chủng MDR-TB

ở những bệnh nhân có nguy cơ Đây là những xét nghiệm có thể cho kết quả nhanh chóng sau 8 giờ với độ nhạy và độ đặc hiệu cao Điều này sẽ giúp các bác sĩ lâm sàng lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp, cũng như hữu ích trong việc kiểm soát tình trạng kháng thuốc ngày càng gia tăng

2 GIÁ TRỊ CỦA KỸ THUẬT LPA VÀ CÁC BẰNG CHỨNG

Kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong chẩn đoán lao đã được công nhận rộng rãi giúp chẩn đoán nhanh chóng với độ nhạy độ đặc hiệu cao, đặc biệt có thể thực hiện trực tiếp trên các mẫu bệnh phẩm lâm sàng như đàm Trong sự tiến bộ không ngừng đó, thì kỹ thuật LPA cho thấy những triển vọng và hiệu quả cũng như lợi ích to lớn

Hiện nay, có 2 kỹ thuật LPA đã được thương mại hóa và ứng dụng rộng rãi

là: the INNO-LiPA® Rif TB kit (Innogenetics NV, Gent, Belgium) (Figure 1) and

the GenoType® MTBDRplus assay (Hain Lifescience GmbH, Nehren, Germany)

(Figure 2) Sau khi các kỹ thuật này được giới thiệu thì các nghiên cứu đã được thực

hiện để đánh giá mức hiệu quả cũng như độ chính xác trong chẩn đoán của chúng

Kết quả từ các nghiên cứu hệ thống đối với việc sử dụng kỹ thuật LPA trong chẩn đoán lao kháng thuốc

Trọng tâm

nghiên cứu đánh giá Test Số nghiên cứu phân

tích-tổng hợp

Cỡ mẫu Số nghiên

cứu làm xét nghiệm trực tiếp trên bệnh phẩm lâm sàng

Kết quả và kết luận

Ref

Phát hiện nhanh

kháng Rifampicin INNO-LiPA®

Rif TB

15 3349 4 - 12 trên 14 nghiên cứu áp dụng LiPA trên bệnh

phẩm đã cô lập vi khuẩn lao cho kết quả với độ nhạy của xét nghiệm trên 95%, độ đặc hiệu là 100%.

- 4 nghiên cứu làm xét nghiệm trực tiếp trên bệnh phẩm lâm sàng có độ đặc hiệu là 100%, độ nhạy từ 80-100%

- Nhìn chung kỹ thuật LiPA cho kết quả với độ chính xác rất cao trên bệnh phẩm đã cô lập VK; đối với các nghiên cứu xét nghiệm trực tiếp trên bệnh phẩm lâm sàng cần nhiều bằng chứng hơn

[8]

Phát hiện nhanh

kháng Rifampicin và

Isoniazid

GenoType®

MTBDR và GenoType®

MTBDRplus

14 (Rifampicin)

15 (Isoniazid) 1738 9 (Rifampicin)10 (Isoniazid)

- Kháng Rifampicin: độ nhạy (98.1%; 95% CI: 95.9– 99.1), độ đặc hiệu (98.7%; 95% CI 97.3–99.4) Tỷ lệ phát hiện kháng Rifampicin cao và cố định qua tất cả các nhóm nghiên cứu, các kỹ thuật khác nhau và loại mẫu bệnh phẩm khác nhau.

- Kháng Isoniazid: độ nhạy thấp hơn (84.3%; 95%

CI: 76.6–89.8), độ đặc hiệu (99.5%; 95% CI: 97.5–99.9) vẫn ở mức cao

- Nhìn chung, kỹ thuật GenoType MDTBR có độ chính xác tuyệt vời trong chẩn đoán kháng Rifampicin, ngay cả khi dùng trên bệnh phẩm lâm sàng; trong khi đối với Isoniazid thì độ nhạy thấp hơn và thay đổi, còn

độ đặc hiệu vẫn rất cao

[7]

3 NGUYÊN LÝ

Kỹ thuật Genotype MTBDRplus dựa trên công nghệ LPA (Line Probe Assay) bao gồm kỹ thuật PCR và gắn kết các đoạn gene sau khi được nhân lên vào màng lai (STRIP) đã gắn sẵn các mẫu dò chuyên biệt (oligonucleotide probes) Mẫu dò cho phép xác định vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis complex) có thể liên kết đặc hiệu với các đoạn gene được nhân lên từ các loài thuộc nhóm này

Phát hiện các gene rpoB (mã hóa cho tiểu phần β của RNA polymerase) đột biến mã hóa cho khả năng kháng Rifampicin, gene Kat G (gene mã hóa cho enzyme catalase – peroxidase) đột biến đột biến mã hóa cho khả năng kháng Isoniazid ở mức độ cao trên và gene inhA (mã hóa cho một NADH enoyl ACP reductase) đột biến mã hóa cho khả năng kháng Isoniazid ở mức độ thấp của các chủng M tuberculosis

4 PHÂN TÍCH KẾT QUẢ

Kết quả Phân tích kết quả và hướng xử trí tiếp theo

Không hợp lệ (invalid) Có thể do thực hiện kỹ thuật không đúng, cần làm lại xétnghiệm

Không phát hiện VK lao

(MTB)

Không có VK lao Tuy nhiên, kết quả này không có thể

loại trừ chẩn đoán lao, tuy độ nhạy của MTBDRplus cao

nhưng kết quả có thể âm tính nếu tải lượng vi khuẩn thấp, nên kết quả này có thể là âm tính giả Nếu bệnh cảnh lâm sàng gợi ý cao đến lao, thì cần lặp lại xét nghiệm Để chắc chắn chẩn đoán loại trừ cần kết quả nuôi cấy

Phát hiện VK lao + không

kháng RIF và INH *

Chẩn đoán lao nhạy cảm thuốc Điều trị phác đồ ngắn ngày với 6 tháng, theo khuyến cáo của RNTCP/WHO

Phát hiện VK lao + chỉ

kháng RIF hoặc INH *

Chỉ kháng với RIF/INH kháng đơn thuốc (mono-resistant MTB) - không phải là MDR-TB Tuy nhiên những bệnh nhân này vẫn có tiên lượng hiệu quả điều trị kém hơn và nguy cơ khuếch đại chủng kháng thuốc so với nhóm nhạy cảm Vì vậy cần nuôi cấy và làm KSĐ để lựa chọn thuốc phù hợp

Phát hiện VK lao + kháng

RIF và INH *

Có tính gợi ý cao đến MDR-TB, nhưng cần phân tích trong bối cảnh các nguy cơ của kháng thuốc

Nếu bệnh nhân đã có tiền sử điều trị lao hoặc đã thất bại điều trị với các thuốc kháng lao hạng 1 thì nguy cơ MDR-TB là cao Ở bệnh nhân như vậy, một kết quả kháng rifampin (RIF) là đủ để bắt đầu phác đồ cho lao đa kháng thuốc Đồng thời cần nuôi cấy mẫu trong môi trường lỏng và làm kháng sinh đồ (KSĐ) Sau khi có kết quả KSĐ sau 2-3 tuần, dựa trên kết quả thì có thể thay đổi các thuốc trong phác đồ cho phù hợp

5 MỘT SỐ KHUYẾN CÁO CỦA WHO

- Khuyến cáo áp dụng LPA là phải làm xét nghiệm trên tiêu bản AFB đàm (+) (trực tiếp) hoặc nuôi cấy phân lập được vi khuẩn lao (gián tiếp) từ bệnh phẩm

cả ở phổi và ngoài phổi

- LPA không được khuyến cáo cho xét nghiệm trực tiếp trên tiêu bản AFB đàm (-)

- LPA được áp dụng để phát hiện vi khuẩn lao và chẩn đoán lao đa kháng thuốc Tuy nhiên do độ nhạy của xét nghiệm này đối với phát hiện kháng với Rifampicin và Isoniazid là khác nhau (độ nhạy Isoniazid khoảng 85%) cho nên nhìn chung độ chính xác của nó trong chẩn đoán lao đa kháng thuốc bị giảm bớt

- Kháng sinh đồ vẫn cần thiết để chẩn đoán và kiểm soát sự xuất hiện của kháng thuốc đối với các thuốc kháng lao khác

- Kháng sinh đồ với Isoniazid vầm được dùng để đánh giá bệnh nhân khi LPA cho kết quả không kháng với Isoniazid Điều này đặc biệt quan trọng cho những cộng đồng có tỷ lệ kháng Isoniazid cao

- Những khuyến cáo này vẫn được áp dụng cho việc sử dụng LPA ở trẻ em

6 ƯU - NHƯỢC ĐIỂM

LINE PROBE ASSAY (LPA) trong phát hiện lao kháng thuốc hạng 1

Ưu điểm Nhược điểm

- Phát hiện lao kháng RIF & INH

cùng lúc, trên cùng 1 mẫu bệnh

phẩm

- Thời gian cho kết quả nhanh chóng

khoảng 8h

- Có thể xét nghiệm nhiều mẫu cùng

lúc (lên đến 48 mẫu)

- Đặc hiệu cho VK lao, phát hiện phức

hợp DNA vi khuẩn Giúp chẩn đoán

phân biệt VK lao với các Mycobacteria

khác

- Không dùng để theo dõi kết quả điều trị được

- Không thể dùng để chỉ định thuốc kháng lao hạng 2 cho bệnh nhân MDR-TB

- Vẫn cần kết quả nuôi cấy và kháng sinh đồ

- Phụ thuộc kết quả tiêu bản: Chỉ được làm ở tiêu bản AFB (+) hoặc tiêu bản AFB (-) có nuôi cấy (+)

- Cần yêu cầu phòng thí nghiệm kỹ thuật cao và trình độ kỹ thuật viên

- Phát hiện kháng INH với độ nhạy thấp hơn kỹ thuật nuôi cấy (khoảng 85%)

- Kết quả dương tính giả với kháng RIF/INH

Theo một nghiên cứu phân tích tổng hợp năm 2008, thì kỹ thuật Genotype

MTBDRplus có độ nhạy 98.1% với RIF và 84.3% với INH Điều này cho thấy xét

nghiệm này vẫn có thể cho kết quả âm tính nếu tải lượng vi khuẩn thấp Nên nếu bệnh cảnh lâm sàng hướng đến lao nhiều thì cần làm thêm các xét nghiệm khác để chắc chắn

Vì vậy, kết quả xét nghiệm luôn cần phân tích kết hợp trong từng bối cảnh lâm sàng cụ thể Một kết quả kháng với RIF và INH thì cần đánh giá thêm nguy cơ kháng thuốc của bệnh nhân, tỷ lệ kháng thuốc trong cộng đồng Ở 1 bệnh nhân không có nguy cơ thì đây có thể là dương tính giả và cần phân tích cẩn thận Cũng giống như vậy, nếu bệnh nhân thuộc đối tượng nguy cơ cao khang thuốc hay thất bại điều trị mà kết quả âm tính thì cũng cần đánh giá lại và xác định băng kháng sinh đồ

7 KẾT LUẬN

Kỹ thuật Genotype MTBDRplus dựa trên công nghệ LPA là một kỹ thuật có độ nhạy độ đặc hiệu cao cho kết quả nhanh chóng trong chẩn đoán lao kháng Rifampicin và Isoniazid Cũng dựa trên công nghệ này các kỹ thuật tiên tiến hơn đã được ra đời như SL-LPA (second-line line probe assays) giúp phát hiện các chủng vi khuẩn kháng thuốc kháng lao hạng 2 Đó là những thành tựu to lớn đóng góp có thể lựa chọn phác đồ điều trị thích hợp cho từng bệnh nhân, qua đó có thể giảm sự tiến triển bệnh, tỷ lệ tử vong, cũng như kiểm soát sự lan tràn của chủng vi khuẩn lao kháng thuốc đang hoành hành trên toàn cầu, và cùng giúp sức để đem lại một thế giới tốt đẹp hơn không còn bệnh lao

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Ausie Nkhi Tuberculosis diagnosis and management (2017)

2 Daphne I Ling, Alice A Zwerling and Madhukar Pai Rapid diagnosis

of drug- resistant TB using line probe assays: from evidence to policy (2008)

3 Elina Maharjan, Narayan Dutt Pant, Sanjeev Neupane, Jyoti Amatya

and Bhawana Shrestha Use of Genotype MTBDRplus Assay for

Diagnosis of Multidrug-Resistant Tuberculosis in Nepal (2017)

4 IPAQT Technical FAQs on Hain Genotype MTBDRplus Line Probe

Assay

5 Heidi Albert, FIND The Hain test: new reports from South Africa and

Tanzania

6 Khairunisa Suleiman An ACTIVIST’S guide to Tuberculosis

Diagnostic Tools (2017)

7 Ling DI, Zwerling A, Pai M GenoType MTBDR assays for the

diagnosis of multidrug-resistant tuberculosis: a meta-analysis (2008)

8 Morgan M, Kalantri S, Flores L, Pai M A commercial line probe assay

for the rapid detection of rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis: a systematic review and meta-analysis (2005)

9 World Health Organization Global Tuberculosis report (2014)

10 World Health Organization Molecular Line probe assay for the

dectection of resistance to Isoniazid and Rifampicin