Nghiên cứu đặc điểm hóa mô miễn dịch mảng sinh thiết tủy ở bệnh nhân đa u tủy xương

Hóa mô miễn dịch là sự kết hợp giữa hai ngành mô bệnh học Histopathology và miễn dịch học Immunology, cho phép phát hiện những đặc tính kháng nguyên có mặt trong tế bào màng tế bào, bào

*****_*****

TRẦN BẢO TRÂM

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÓA MÔ MIỄN DỊCH MẢNH SINH THIẾT TỦY Ở BỆNH NHÂN

ĐA U TỦY XƯƠNG

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA

Khoá 2011 – 2015

HÀ NỘI - 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

*****_*****

TRẦN BẢO TRÂM

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÓA MÔ MIỄN DỊCH MẢNH SINH THIẾT TỦY Ở BỆNH NHÂN

ĐA U TỦY XƯƠNG

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA

Khoá 2011 – 2015

Người hướng dẫn khoa học: ThS Phạm Hải Yến

HÀ NỘI - 2015

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu để hoàn thành khóa luận, tôi

đã nhận được sự hỗ trợ, giúp đỡ nhiệt tình từ các thầy cô, gia đình và bạn bè

Trước hết, tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc tới ThS Phạm Hải Yến, Phó trưởng khoa Tế bào - Tổ chức học Viện Huyết học - Truyền máu Trung Ương, người đã trực tiếp dìu dắt, hướng dẫn tôi thực hiện đề tài nghiên cứu cũng như đưa ra những ý kiến quý báu, sửa chữa tỉ mỉ, giúp tôi hoàn thiện khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn GS.TS Phạm Quang Vinh - Chủ nhiệm bộ môn Huyết học - Truyền máu trường Đại học Y Hà Nội, cùng các thầy cô giáo trong bộ môn Huyết học - Truyền máu trường Đại học Y Hà Nội đã nhiệt tình dạy dỗ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

Tôi xin cảm ơn Ban Giám đốc, Phòng Kế hoạch - Tổng hợp Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương đã tạo điều kiện cho tôi trong quá trình nghiên cứu tại bệnh viện

Tôi xin cảm ơn ThS Nguyễn Ngọc Dũng - Trưởng khoa Tế bào - Tổ chức học và các anh chị cán bộ nhân viên trong khoa đã nhiệt tình giúp đỡ tôi thực hiện và hoàn thành khóa luận

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới bố mẹ và những người thân yêu trong gia đình cũng như bạn bè đã luôn ở bên, động viên và ủng hộ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

Hà Nội, tháng 6 năm 2015

Sinh viên

Trần Bảo Trâm

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của ThS Phạm Hải Yến và sự giúp đỡ của các anh chị trong khoa Tế bào

- Tổ chức học Viện Huyết học - Truyền máu Trung Ương, tất cả số liệu trong khóa luận này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất cứ nghiên cứu nào khác

Hà Nội, tháng 6 năm 2015

Người viết khóa luận

Trần Bảo Trâm

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

LỜI CAM ĐOAN

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC BIỂU ĐỒ, ẢNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Kỹ thuật hóa mô miễn dịch 3

1.1.1 Lịch sử hình thành và phát triển 3

1.1.2 Nguyên lý 4

1.1.3 Nhuộm hóa mô miễn dịch 7

1.2 Bệnh đa u tủy xương 10

1.2.1 Sơ lược về bệnh đa u tủy xương 10

1.2.2 Nguồn gốc phát triển và sự ác tính hóa của tương bào 11

1.2.3 Tiêu chuẩn chẩn đoán xác định 11

1.2.4 Các giai đoạn của ĐUTX 13

1.3 Đặc điểm tiêu bản nhuộm HMMD mảnh sinh thiết tủy ở bệnh nhân đa u tủy xương 14

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.2 Phương pháp nghiên cứu 18

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 18

2.2.2 Nội dung nghiên cứu 18

2.2.3 Các tiêu chuẩn đánh giá 19

2.2.4 Vật liệu nghiên cứu 20

2.2.5 Các kỹ thuật xét nghiệm được sử dụng trong nghiên cứu 23

2.2.6 Xử lý số liệu 25

2.2.7 Sơ đồ nghiên cứu 26

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 27

3.1 Đặc điểm chung của nhóm nghiên cứu 27

3.2 Đặc điểm hóa mô miễn dịch mảnh sinh thiết tủy xương 29

Chương 4: BÀN LUẬN 36

4.1 Đặc điểm chung của nhóm nghiên cứu 36

4.1.1 Đặc điểm về tuổi, giới 36

4.1.2 Đặc điểm về tỷ lệ tế bào dòng plasmo trong tủy xương 37

4.1.3 Đặc điểm về phân loại giai đoạn bệnh theo hệ thống phân loại giai đoạn quốc tế ISS 38

4.2 Đặc điểm hóa mô miễn dịch mảnh sinh thiết tủy xương 39

4.2.1 Các dấu ấn đặc trưng của tương bào 39

4.2.2 Đặc điểm các dấu ấn KN khác 40

KẾT LUẬN 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

CD: Cluster of Differentiation

(Nhóm biệt hóa) DAB: 3,3- diaminobeziden tetrahydrochlorid ĐUTX: Đa u tủy xương

HMMD: Hóa mô miễn dịch H&E: Hematoxylin and Eosin HRP: Horseradish Peroxidase

(Globulin miễn dịch) ISS: International Staging System

(Hệ thống phân loại giai đoạn quốc tế) KN: Kháng nguyên

MUM1: Multiple myeloma oncogen 1

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Hệ thống phân độ giai đoạn Durie - Salmon 13

Bảng 1.2 Hệ thống phân loại giai đoạn quốc tế ISS và thời gian sống thêm trung bình tương ứng 14

Bảng 3.1 Phân bố theo tuổi của nhóm nghiên cứu 27

Bảng 3.2 Tỷ lệ tế bào dòng plasmo trong tủy xương 28

Bảng 3.3 Phân bố nhóm nghiên cứu theo giai đoạn bệnh theo ISS 29

Bảng 3.4 Đặc điểm về các dấu ấn đặc trưng của dòng plasmo 29

Bảng 3.5 Đặc điểm của dấu ấn miễn dịch CD20 31

Bảng 3.6 Đặc điểm CD20 và tỷ lệ TB dòng plasmo trong tủy xương 32

Bảng 3.7 Đặc điểm Cyclin D1 và giai đoạn bệnh 33

Bảng 3.8 Đặc điểm Cyclin D1 và tỷ lệ TB dòng plasmo trong tủy xương 34

Bảng 4.1 Tỷ lệ nam/nữ trong bệnh ĐUTX của một số tác giả tại Việt Nam 36 Bảng 4.2 Tỷ lệ tế bào dòng plasmo (tương bào) trong tủy xương 38

Bảng 4.3 Tỷ lệ % bệnh nhân theo giai đoạn bệnh ISS 39

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Phân bố theo giới của nhóm nghiên cứu 27

Biểu đồ 3.2 Sự biểu hiện của CD20 và giai đoạn bệnh 31

Biểu đồ 3.3 Đặc điểm dấu ấn miễn dịch kappa, lambda 32

Biểu đồ 3.4 Cyclin D1 và CD20 34

Biểu đồ 3.5 Đặc điểm Cyclin D1 và đột biến di truyền kiểu đa bội 35

DANH MỤC ẢNH Ảnh 3.1 Nhuộm H&E đánh giá tỷ lệ tế bào dòng plasmo trong tủy xương 28 Ảnh 3.2 CD38 dương tính trên tiêu bản STTX 30

Ảnh 3.3 CD138 dương tính trên tiêu bản STTX 30

Ảnh 3.4 Kappa dương tính trên tiêu bản STTX 33

Ảnh 3.5 Cyclin D1 dương tính trên tiêu bản STTX 35

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây, xét nghiệm giải phẫu bệnh ngày càng đóng vai trò không thể thiếu, là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán ung thư và các bệnh nhiễm khuẩn Nhiều kỹ thuật giải phẫu bệnh ra đời phục vụ cho công tác chẩn đoán vi thể như H&E (Hematoxylin and Eosin), P.A.S, đặc biệt là kỹ thuật hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry) Hóa mô miễn dịch là sự kết hợp giữa hai ngành mô bệnh học (Histopathology) và miễn dịch học (Immunology), cho phép phát hiện những đặc tính kháng nguyên có mặt trong

tế bào (màng tế bào, bào tương, nhân) bằng cách dùng các kháng thể đánh dấu đặc hiệu Như vậy, các nhà giải phẫu bệnh có thể quan sát và đánh giá được

cả hai phương diện hình thái học và miễn dịch học của tế bào Kỹ thuật này rất có ích trong việc chẩn đoán, phân loại, điều trị và tiên lượng bệnh [1]

Đa u tủy xương (ĐUTX, bệnh Kahler) là một bệnh tăng sinh ác tính của tương bào trong tủy xương, dẫn đến tăng sản xuất các paraprotein trong máu và/hoặc trong nước tiểu gây tổn thương thận và các cơ quan khác [2] Bệnh chiếm 1% các bệnh ác tính nói chung và 10% bệnh máu ác tính, ở nam cao hơn ở nữ (6,5:4,2/100000 dân) Độ tuổi trung bình ở thời điểm được chẩn đoán là 65 tuổi [3], [4], [5]

Hiện nay, ĐUTX chủ yếu được chẩn đoán nhờ các xét nghiệm huyết học (huyết tủy đồ), sinh hóa - miễn dịch (điện di protein huyết thanh/ nước tiểu, định lượng chuỗi nhẹ kappa/ lambda tự do huyết thanh), X-quang xương

và giải phẫu bệnh (nhuộm H&E và nhuộm hóa mô miễn dịch mảnh sinh thiết tủy xương) Việc sử dụng các kỹ thuật giải phẫu bệnh, đặc biệt là nhuộm hóa

mô miễn dịch để chẩn đoán và tiên lượng ĐUTX đã được nghiên cứu nhiều trên thế giới, đem lại giá trị to lớn cho người bệnh

Ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào về nhuộm hóa mô miễn dịch trên mảnh sinh thiết tủy ở bệnh nhân Đa u tủy xương, do đó chúng tôi tiến hành đề

tài: “Nghiên cứu đặc điểm hóa mô miễn dịch mảnh sinh thiết tủy ở bệnh nhân

Đa u tủy xương” với mục tiêu sau:

Mô tả đặc điểm một số dấu ấn miễn dịch trên tiêu bản mảnh sinh thiết tủy ở bệnh nhân Đa u tủy xương

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Kỹ thuật hóa mô miễn dịch

Hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry, viết tắt là HMMD) là kỹ thuật nhuộm sử dụng các kháng thể đặc hiệu, nhờ các phản ứng kháng nguyên

- kháng thể và hóa chất để làm hiện rõ các kháng nguyên có mặt trong tổ chức hoặc mô [6]

1.1.1 Lịch sử hình thành và phát triển

Năm 1941, Coons và cộng sự là những người đầu tiên đánh dấu kháng thể (KT) bằng chất nhuộm huỳnh quang và dùng chúng để xác định kháng nguyên (KN) trên mặt cắt mô Năm 1966, Nakane và Pierce đã báo cáo về việc sử dụng KT được gắn enzym peroxidase chiết xuất từ cây cải ngựa cùng với chất nền như DAB (3,3- diaminobeziden tetrahydrochlorid), cho phép quan sát cả hình thái học cùng với sự thể hiện KN Từ năm 1966, nhiều kỹ thuật gắn enzyme đã được phát triển Năm 1970, Sterberger và cộng sự đã

mô tả kỹ thuật PAP (Peroxidase-anti-peroxidase) Năm 1971, Engwall và Ash đã đề nghị sử dụng phức hợp Avidin - biotin cho miễn dịch huỳnh quang Năm 1984, Cordell và cộng sự đã mô tả kỹ thuật APAAP (Alkaline phosphatase anti alkaline phosphatase) Năm 1982, Straus đã đề nghị thêm Imidazol, Hsu và Soban thêm kim loại nặng vào chất nền Năm 1988, theo Bobrow, độ nhạy có thể tăng lên bằng việc sử dụng Tyramin được biotin hóa

và khử peroxidase tại vị trí xảy ra phản ứng miễn dịch Năm 1997, King và cộng sự cho rằng sử dụng chất nền DAB có độ nhạy tăng lên nhiều so với kỹ thuật Avidin-biotin [7]

Cùng với hệ thống nhận biết, việc sản xuất KT cũng có nhiều phát triển Năm 1975, Kohler và Milstein đã mô tả một phương pháp cải tiến lớn trong sản xuất KT đơn dòng Những năm gần đây, sự phát triển mạnh mẽ trong lĩnh vực sinh học phân tử cho phép tăng khả năng sản xuất peptid tổng hợp cả KT đơn dòng và KT đa dòng

Trong giai đoạn phát triển sớm của HMMD, người ta đã nghĩ rằng quá trình cố định, chuyển đúc thông thường đã phá hủy hoặc che lấp một số epitop Năm 1970, Huang và cộng sự đã mô tả việc sử dụng enzym trypsin trên mảnh cắt paraffin để bộc lộ một số KN đã bị che lấp trong quá trình cố định và chuyển đúc Năm 1991, Shi lần đầu tiên mô tả về quá trình tiền xử lý nhiệt (Heat pre-treatment) bằng lò vi sóng để xử lý mảnh cắt đã khử paraffin trong một dung dịch kim loại nặng Năm 1993, Cattoretti đã đề nghị thay thế dung dịch kim loại nặng thành dung dịch Citrate buffer pH 6 Năm 1994, Norton cho rằng việc sử dụng nồi áp suất hiệu quả hơn lò vi sóng trong việc bộc lộ một số KN Sau đó, một vài tác giả đã đưa ra một vài phương pháp bộc lộ khác như: để tủ ấm qua đêm ở 70-80oC trong Citrat, trong Tris EDTA hay trong acid boric, [7]

1.1.2 Nguyên lý

Chìa khóa của HMMD là sự kết hợp đặc hiệu giữa KN và KT, dựa trên nguyên lý cơ bản là: khi phủ KT đặc hiệu lên mô, nếu trong mô có KN cần tìm sẽ xảy ra phản ứng kết hợp KN - KT Phức hợp KN - KT này được gắn với hệ thống nhận biết một cách trực tiếp hoặc gián tiếp và có thể quan sát dưới kính hiển vi quang học (hoặc huỳnh quang) [8]

1.1.2.1 Kháng nguyên:

Kháng nguyên thường có bản chất là protein, cũng có thể là lipid, carbonhydrat, nằm trên màng tế bào, trong bào tương hoặc trong nhân tế

bào, cũng có thể là thành phần của mô như các sợi trung gian (Keratin, Vimentin, Neurofilament,…), các thụ thể hormon (Estrogen - Re, Progestron - Re,…), các protein là sản phẩm của đột biến gen (p53, p63), hoặc từ ngoài vào như vi khuẩn, virus, [1] Mỗi KN đều mang một hoặc nhiều vị trí gắn với KT gọi là epitop - vị trí quyết định KN Đây là những vùng có tính đặc hiệu cao với từng loại KT nhưng có thể bị che lấp trong quá trình cố định bằng formol và chuyển đúc paraffin Do vậy, cần bộc lộ epitop của KN trước khi cho tiếp xúc với KT

độ với epitop thì các lực này mới xuất hiện và đủ giá trị kết hợp [7], [9]

Kháng thể đa dòng (polyclonal antibody) là một hỗn hợp không đồng

nhất các KT có nhiều vị trí kết hợp KN Chúng được sản xuất bằng cách gây miễn dịch trên động vật thường là thỏ, chuột lang, dê, bò, lợn với KN đặc hiệu cần quan tâm [10], [11], [12]

Kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody) là một quần thể đồng nhất

của globulin miễn dịch chống lại một epitop của KN KT đơn dòng thường được sản xuất ở chuột hoặc thỏ bằng kỹ thuật u lai Đây là một kỹ thuật được phát triển bởi Kohler và Milstein (1975), đã tạo nên một cuộc cách mạng cho HMMD [13] Nó làm tăng nhanh cả về chất lượng và số lượng KT Bằng sự sàng lọc cẩn thận, KN gốc không cần phải tinh khiết vì những sản phẩm lai từ những KN hay epitop không mong muốn sẽ được loại bỏ Kết quả là một KT

tinh khiết với độ đặc hiệu cao được tạo ra [11]

So với KT đơn dòng, KT đa dòng dễ sản xuất hơn và nhạy hơn nhưng lại không đặc hiệu bằng Do KT đa dòng chứa các KT không đặc hiệu được sinh ra khi động vật chống lại sự nhiễm trùng trong một dịp nào đó, ngay cả khi được làm tinh khiết nên gây khả năng nhuộm nền cao hơn [14] Về giá thành, KT đơn dòng đắt hơn nhưng ngày càng được sử dụng rộng rãi vì tính

đặc hiệu cao

Trong kỹ thuật gián tiếp ta thường sử dụng 2 loại KT: KT1 (hay KT chính) và KT2 (hay KT liên hợp, KT bắc cầu) KT1 là kháng thể gắn đặc hiệu với KN cần tìm trong mô, thường là KT của thỏ hoặc chuột kháng người, nó có thể là KT đơn dòng hoặc đa dòng KT2 liên hợp với enzym (Peroxidase, Alkalin phosphatase), chất huỳnh quang (FITC, Qdot, ), hoặc phức hợp Biotin

- avidin, và hoạt động như là cầu nối giữa KT1 với hệ thống đánh dấu KT2 thực chất là kháng thể chống globulin miễn dịch (IgG) của động vật sản xuất ra KT1 nên phải có sự tương đồng với KT1 Ví dụ, nếu KT1 thuộc loại IgG của chuột, thì KT2 là KT của thỏ hoặc của dê chống IgG của chuột [11], [13]

1.1.2.3 Hệ thống nhận biết:

Phức hợp KN - KT hình thành không thể quan sát được bằng kính hiển

vi quang học nên cần có một hệ thống tín hiệu để nhận biết vị trí xảy ra phản ứng KN - KT Hệ thống này có thể gắn trực tiếp vào KT1 (kỹ thuật trực tiếp) hay thông qua một hoặc nhiều hệ thống KT phụ (kỹ thuật gián tiếp) Có nhiều hệ thống nhận biết ứng dụng trong HMMD như: nhận biết bằng enzym, đánh dấu huỳnh quang, đánh dấu bằng kim loại gắn keo hoặc bằng đồng vị phóng xạ

Nhận biết phản ứng KN - KT bằng enzym được sử dụng rộng rãi nhất trong HMMD Bằng phản ứng enzym - cơ chất sẽ tạo ra một sản phẩm màu ổn

định và có thể quan sát dưới kính hiển vi quang học Có nhiều loại enzym và chất màu thích hợp cho phép người dùng lựa chọn màu cho sản phẩm phản ứng cuối cùng sao cho tạo ra sự tương phản nhất

Trong đó, Peroxidase chiết xuất từ cây cải ngựa (HRP: Horseradish Peroxidase) là loại enzym được sử dụng rộng rãi nhất và kết hợp với chất màu thích hợp nhất là DAB Nó tạo ra sản phẩm phản ứng cuối cùng màu nâu sẫm

rõ nét, ổn định trong nhiều năm và không tan trong rượu và các dung môi hữu

cơ khác (Graham và Karnovsky, 1966) [15] DAB là một chất độc gây ung thư tiềm năng (Weisburger và cộng sự, 1978)

1.1.3 Nhuộm hóa mô miễn dịch

1.1.3.1 Các kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn dịch:

a Kỹ thuật trực tiếp:

- Kỹ thuật trực tiếp truyền thống: Các KT chính liên kết trực tiếp với

chất đánh dấu (chất màu huỳnh quang, enzyme, )

- Kỹ thuật trực tiếp mới (Phương pháp nhuộm một bước được tăng cường polymer - EPOS: Enhanced Polymer One-step Staining): Một lượng

lớn các KT chính gắn enzym peroxidase được gắn vào một “xương sống” polymer dextran [16]

b Kỹ thuật gián tiếp:

- Kỹ thuật gián tiếp truyền thống: KT1 gắn với hệ thống nhận biết

thông qua một kháng kháng thể (KKT) hay KT2 Chất đánh dấu thường sử dụng là huỳnh quang hoặc enzyme

- Kỹ thuật gián tiếp mới: Dựa trên công nghệ Dextran trong hệ thống

nhận biết EPOS, thay thế KT chính bằng một KT thứ cấp Đây là kỹ thuật

được áp dụng trong đề tài, trong đó chất đánh dấu là enzyme peroxidase chiết xuất từ cây cải ngựa và chất màu là DAB

- Kỹ thuật không đánh dấu KT (Kỹ thuật PAP và APAAP)

- Kỹ thuật Avidin (Streptavidin) - Biotin (Kỹ thuật ABC):

KN - KT1 - KT2 biotin hóa - avidin (streptavidin) liên hợp với enzym - chất nền

1.1.3.2 Quy trình nhuộm HMMD trên mảnh sinh thiết tủy xương:

a Xử lý bệnh phẩm mảnh sinh thiết tủy xương:

Quá trình xử lý bệnh phẩm mảnh sinh thiết tủy xương gồm các bước sau:

- Lấy bệnh phẩm: đúng vùng tổn thương và đủ thành phần, thể tích

- Cố định mảnh sinh thiết trong dung dịch Helly

- Rửa nước chảy nhẹ, khử canxi qua đêm

- Chuyển mẫu trong máy xử lý mô tự động

- Đúc nến bệnh phẩm, làm lạnh và ghi thông tin mẫu lên cassette

- Cắt bệnh phẩm sau khi đúc nến, gắn vào lam kính bằng chất dính

- Sấy khô trong tủ ấm 40ºC

Xử lý bệnh phẩm mảnh sinh thiết tủy xương khác các mô khác ở chỗ thời gian khử canxi đối với mảnh sinh thiết tủy dài hơn do lượng canxi ở đây nhiều hơn các mô khác

b Nhuộm hóa mô miễn dịch:

Quy trình nhuộm hóa mô miễn dịch tại khoa Tế bào - Tổ chức học Viện Huyết học - Truyền máu Trung Ương áp dụng theo kỹ thuật gián tiếp mới, trong đó phức hợp KN - KT gắn với enzyme peroxidase đã được gắn trên xương sống “Dextran” thông qua KT thứ chính (KT2) Kỹ thuật này được

công bố đầu tiên bởi hãng Dako dưới tên thương mại là Dako EnVisionTM, sau đó được nhiều hãng phát triển và cải tiến

Kỹ thuật hiện nay được sử dụng tại khoa là của hãng Cell Marque với quy trình gồm những bước sau:

- Nhuộm bằng Hematoxylin trong 5 phút; rửa nước chảy nhẹ 5 phút

- Đẩy nước trong tiêu bản bằng cồn tuyệt đối

- Đẩy cồn bằng Toluen: 5 phút

- Gắn lamen, sấy khô, đọc kết quả

1.2 Bệnh đa u tủy xương

Đa u tủy xương (ĐUTX) là một bệnh tăng sinh ác tính dòng tương bào (Plasma cells) chủ yếu trong tủy xương Những tế bào (TB) này được biệt hóa

từ các tế bào lympho B và có khả năng sản xuất ra các globulin miễn dịch (Ig) gây ra những rối loạn đặc trưng của bệnh [17]

1.2.1 Sơ lược về bệnh đa u tủy xương

Giữa thế kỷ XIX, các tác giả John Dalrymple, Henry Bence - Jones và William Mac Intyre lần đầu tiên mô tả bệnh ĐUTX ở một bệnh nhân (BN)

46 tuổi bị đau xương và một loại protein niệu bất thường được tìm thấy ở

BN này [18] Năm 1889, Kahler đã mô tả triệu chứng lâm sàng và hình ảnh tổn thương trên X-quang của bệnh Năm 1900, Wright thông báo mối liên hệ mật thiết giữa các tế bào u tủy với tương bào Vào những năm 1930, kỹ thuật chọc hút tủy xương ra đời thì bệnh ĐUTX mới được làm sáng tỏ [19]

Năm 1972, trong danh pháp của Tổ chức Y tế Thế giới, Mathé và Rappaport định nghĩa bệnh ĐUTX là một bệnh “ung thư hóa hệ thống tương bào”, gây ra u có tính chất khu trú hoặc thâm nhiễm lan tỏa, chủ yếu vào tủy xương Bệnh thường kết hợp với hiện tượng tăng Ig đơn dòng (IgG, IgA, IgD) hoặc protein chuỗi nhẹ trong huyết thanh và nước tiểu Tiếp đó,

có nhiều bằng chứng khẳng định các Ig tham gia vào quá trình sinh bệnh học của bệnh, gây ra rối loạn bệnh lý ở nhiều cơ quan như thận, hệ thần kinh, hệ miễn dịch [17]

Các nghiên cứu dịch tễ học cho thấy có một số yếu tố nguy cơ của bệnh như: tỷ lệ bệnh tăng theo tuổi (chủ yếu từ 40-70 tuổi, hiếm gặp ở người dưới 40 tuổi), gặp ở nam nhiều hơn nữ (từ 1,1 đến 2 lần), và người da đen nhiều hơn người da trắng [20] Nhiều tác giả cho rằng tia xạ, sự tiếp xúc với hóa chất như benzen, amian hay chất độc công nghiệp và nông nghiệp có thể

là yếu tố gây bệnh

1.2.2 Nguồn gốc phát triển và sự ác tính hóa của tương bào

Tương bào là tế bào trưởng thành nhất của lympho dòng B Tế bào gốc lympho bắt nguồn từ tế bào gốc vạn năng trải qua các giai đoạn biệt hóa như giai đoạn tế bào B sớm, B chín, B trưởng thành cuối cùng biệt hóa thành tương bào có khả năng tổng hợp các globulin miễn dịch [21], [22] Trong cơ thể có 2 loại tương bào: Tương bào có đời sống ngắn (3 ngày) là giai đoạn biệt hóa cuối cùng của nguyên tương bào; Tương bào có đời sống dài (30 ngày) được biệt hóa từ lympho B theo quá trình: lympho B đi vào trung tâm mầm, được kích thích trở thành tế bào hoạt động nhưng vẫn đi vào chu kỳ chết theo chương trình trừ khi có sự tác động trở lại của KN, khi tế bào này xâm lấn vào tủy xương và có sự tương tác với tế bào đệm thì biệt hóa thành tế bào có đời sống dài [22]

Sự tăng sinh ác tính của các tương bào sẽ làm tăng tổng hợp Ig và do

đó lượng protein toàn phần trong máu cũng tăng lên rất nhiều, thường là cao hơn 80g/l và có thể vượt quá 100g/l [23] Tuy nhiên lượng protein bình thường cũng không loại trừ ĐUTX, đặc biệt là trường hợp chuỗi nhẹ ĐUTX typ IgG chiếm khoảng 50% trường hợp, IgA chiếm 25% và loại chuỗi nhẹ đơn thuần chiếm 20% ĐUTX typ IgD chỉ chiếm 1%, IgE rất hiếm gặp Hậu quả của tăng Ig bệnh lý bao gồm: Rối loạn đông máu, ứ đọng của protein M, suy thận, thoái hóa dạng tinh bột, dễ nhiễm trùng [17]

1.2.3 Tiêu chuẩn chẩn đoán xác định

a Tiêu chuẩn của Bart Barlogie 1995:

Tiêu chuẩn chính:

- Có u tương bào trên sinh thiết tủy hoặc ở một tổ chức

- Các tế bào thuộc dòng tương bào > 30% trong tủy

- Protein M tăng trong máu hoặc nước tiểu:

+ IgG > 35 g/l

+ IgA > 20 g/l

+ Chuỗi nhẹ > 1g/24h trong nước tiểu

Tiêu chuẩn phụ:

- Các tế bào thuộc dòng tương bào 10-30% trong tủy

- Protein M tăng dưới mức trên

- Tổn thương tiêu xương trên X-quang

- Giảm Ig bình thường trong máu (IgM < 0,5 g/l; IgA < 1g/l; IgG < 6g/l) Chẩn đoán xác định khi có ít nhất 1 tiêu chuẩn chính và 1 tiêu chuẩn phụ hoặc ít nhất 3 tiêu chuẩn phụ [24]

b Tiêu chuẩn của hiệp hội Đa u tủy xương quốc tế năm 2009 [25]:

Tất cả các tiêu chuẩn sau:

 Tế bào dòng plasmo trong tủy xương ≥ 10% hoặc sinh thiết chứng minh có u tế bào dòng plasmo và

 Có protein đơn dòng (paraprotein) trong huyết thanh và/hoặc nước tiểu (trừ bệnh nhân ĐUTX thể không tiết) và

 Có tổn thương cơ quan có thể do rối loạn tăng sinh tế bào dòng plasmo: nồng độ Canxi máu cao (> 11,5mg/dl); suy thận (creatinin huyết thanh > 1,73 mmol/l); thiếu máu (Hb < 10g/dl)

và tổn thương xương (tiêu xương, gãy xương bệnh lý nghiêm trọng)

1.2.4 Các giai đoạn của ĐUTX

a Hệ thống phân độ giai đoạn Durie - Salmon (1975) [26]:

Bảng 1.1 Hệ thống phân độ giai đoạn Durie - Salmon

Giai đoạn I

- Hb > 10g/dl

- Hàm lượng canxi huyết thanh bình thường

- Hình ảnh X-quang xương bình thường hoặc tổn thương đơn độc dạng u tương bào

- Hàm lượng canxi huyết thanh cao >12mg/dl

- Hình ảnh X-quang xương: Nhiều hơn 3 tổn thương tiêu xương

- Tỷ lệ protein M cao:

a- Hàm lượng IgG > 7g/dl

b- Hàm lượng IgA > 5g/dl

- Thành phần chuỗi nhẹ protein M niệu trên điện di > 12g/24h

Phân đoạn phụ cho tất cả các giai đoạn:

A: Nồng độ creatinin huyết thanh < 2mg/dl (< 177 μmol/l)

B: Nồng độ creatinin huyết thanh > 2mg/dl (> 177 μmol/l)

b Hệ thống phân loại giai đoạn quốc tế (ISS, 2005) [27]:

Bảng 1.2 Hệ thống phân loại giai đoạn quốc tế ISS và thời gian sống thêm

44 tháng

Trong đó β2M: β2 Microglobulin

Hệ thống phân loại giai đoạn quốc tế (ISS) chỉ sử dụng cho bệnh nhân

đã được chẩn đoán xác định ĐUTX

1.3 Đặc điểm tiêu bản nhuộm HMMD mảnh sinh thiết tủy ở bệnh nhân

đa u tủy xương

Tế bào ung thư trong ĐUTX tương ứng với tương bào có đời sống dài Những tương bào ác tính chủ yếu khu trú trong tủy có mối liên quan chặt chẽ với tổ chức đệm tủy xương Ngược lại với các tương bào bình thường, tế bào

ác tính trong ĐUTX kém biệt hóa và có thể có hình thái nguyên tương bào Theo một số nghiên cứu về kiểu hình của tương bào, cả tương bào bình thường và ác tính đều biểu hiện CD38 và CD138 Mức độ biểu hiện của chúng là khác nhau và cho phép phân biệt tương bào bình thường và tương bào ác tính: tế bào u biểu hiện mạnh CD138 và yếu CD38 hơn tương bào bình thường Không có trường hợp nào cho thấy tế bào u âm tính với CD138 nhưng có trường hợp tế bào u âm tính với CD38 Ngoài ra, CD38 biểu hiện trên bề mặt của rất nhiều loại tế bào: Ở tế bào T, CD38 biểu hiện do một bộ

phận đặc biệt của tế bào tuyến ức, chủ yếu ở giai đoạn dương tính với cả CD4

và CD8; Ở tế bào B, sự biểu hiện được điều hòa chặt chẽ trong suốt quá trình phát triển của tế bào, biểu hiện ở mức cao ở tế bào tiền thân tủy xương và tương bào biệt hóa giai đoạn cuối; Ở thực bào lưu thông (không biểu hiện ở đại thực bào cư trú), tế bào diệt tự nhiên (NK) và bạch cầu hạt cả lưu thông và

cư trú, [28], [29] CD138 là kháng nguyên bề mặt chủ yếu biểu hiện ở các tế bào biểu mô song cũng có thể tìm thấy ở các giai đoạn biệt hóa của tế bào bạch huyết bình thường (tiền B), tế bào trung mô trong suốt quá trình phát triển và ở tương bào trưởng thành [29]

MUM1 (IRF4) biểu hiện chủ yếu ở các tế bào máu (tế bào T, B, đại thực bào) Sự biểu hiện của MUM1 ở tế bào T và tế bào B gây ra bởi tín hiệu thụ thể kháng nguyên MUM1 có thể là một dấu ấn được sử dụng để nhận diện sự chuyển tiếp từ BCL-6 dương tính (tế bào B trung tâm mầm) sang CD138 dương tính (nguyên bào miễn dịch và tương bào) Gen mã hóa MUM1

có khả năng là gen hoán vị ở các chromosome bất thường có ý nghĩa quan trọng trong ĐUTX Sự hoán vị globulin miễn dịch chuỗi nặng (IgH) nằm ở chromosome 14 (14q32) được tìm thấy ở > 60% số ca ĐUTX [30] Nhiều nghiên cứu cho thấy sự hoán vị t(6;14)(p25;q32) làm cho gen phiên mã MUM1 chuyển đến gần vùng điều hòa của IgH Điều đó gây ra sự biểu hiện quá mức của protein MUM1 ở ĐUTX, lymphoma loại lymphocyte - bào tương (LPL), u lympho tế bào B lớn lan tỏa (DLBCL), và tế bào T hoạt hóa [31] MUM1 (IRF4) được phát hiện một cách ổn định trong tất cả các giai đoạn biệt hóa của tương bào Sự biểu hiện dương tính rõ rệt ở tế bào u trong bệnh ĐUTX

CD20 là kháng nguyên bề mặt trên tất cả các tế bào B bắt đầu từ giai đoạn tiền B và tăng dần nồng độ cho đến khi trưởng thành Tế bào u ở một số nhỏ bệnh nhân ĐUTX vấn biểu hiện vài marker của tế bào B, hoặc CD19

hoặc CD20 Đa số các trường hợp ĐUTX dương tính với CD19 hoặc CD20 thì cũng dương tính với CD27 Sự biểu hiện của CD20 thường gặp hơn là CD19 Một vài nghiên cứu về sự biểu hiện HMMD của CD20 trên tế bào u bệnh ĐUTX: Robillard et al báo cáo sự biểu hiện CD20 ở 12 (18%) trên 66 bệnh nhân [32] Sự biểu hiện của CD20 ở tế bào u là không đồng nhất và chỉ

có thể phát hiện trên khoảng 13-22% số bệnh nhân Nghiên cứu này cũng chỉ

ra rằng bệnh ổn định ở 50-57% những bệnh nhân CD20+ sau khoảng 10-27 tháng Mateo et al báo cáo sự biểu hiện CD20 ở 17% số ca ĐUTX trong đó

đa số bệnh nhân chỉ có tương bào CD20+ [33] Irfan Yavasolu và cộng sự (2014) báo cáo 30/61 bệnh nhân (49,2%) có dương tính với CD20 với ngưỡng 10% và 28,7% số ca bệnh với ngưỡng 20%; không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa sự dương tính của CD20 trên tiêu bản nhuộm HMMD với loại globulin miễn dịch và giai đoạn bệnh Sự biểu hiện của CD20 được phát hiện

ở xấp xỉ 15-20% số ca bệnh ĐUTX, tuy nhiên ý nghĩa của sự biểu hiện này vẫn chưa rõ ràng (Kapoor et al, 2008) Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng sự biểu hiện của CD20 có thể dẫn đến một tiên lượng xấu, tuy nhiên ý nghĩa tiên lượng đối với bệnh nhân ĐUTX còn cần nghiên cứu sâu hơn [34]

Sự biểu hiện quá mức Cyclin D1 do hoán vị gen t(11;14)(q13;q32) hoặc sự khuếch đại gen là một dấu hiệu sớm chủ yếu trong lymphoma tế bào

vỏ (MCL) và ĐUTX Padhi et al (2013) báo cáo sự biểu hiện của Cyclin D1

ở 14 bệnh nhân ĐUTX sử dụng kỹ thuật HMMD; 8/14 ca (57%) dương tính với Cyclin D1; nhóm này có lượng huyết sắc tố thấp hơn nhóm âm tính với Cyclin D1 (giữa hai nhóm không có khác biệt về tuổi, giới, giai đoạn bệnh theo Durie - Salmon, mức độ tổn thương xương, kiểu hình chuỗi nhẹ, nồng độ Creatinin, Canxi, LDH, số lượng BC, TC và tủy đồ) [35] Nghiên cứu về mối liên hệ giữa sự khuếch đại Cyclin D1 và biểu hiện của protein kháng thuốc (MDR1) của Eman M Sewify và cộng sự cho thấy 20% số ca bệnh có

khuếch đại gen Cyclin D1, những trường hợp này có tỷ lệ tế bào plasmo trong tủy cao hơn đồng thời tăng nguy cơ đa tồn thương tiêu xương 40% số

ca bệnh dương tính với MRD1 Sự biểu hiện của MRD1 có liên quan đến tăng tỷ lệ tế bào plasmo trong tủy xương Những bệnh nhân Cyclin D1 dương tính có tiên lượng tiến triển bệnh xấu hơn và mức độ MDR1 cao hơn

so với những bệnh nhân Cyclin D1 âm tính (P < 0.0001) [36] Vasef MA et

al (1997) báo cáo tỷ lệ dương tính với Cyclin D1 khi nhuộm HMMD cho 54

ca CD20 dương tính, điều này được khẳng định ở nghiên cứu lớn hơn năm

2005 (Robillard et al, 2003; Mateo et al, 2005) [32], [33] Sau đó, những nghiên cứu về HMMD trên mảnh sinh thiết tủy bệnh nhân ĐUTX (Ely et al, 2005) và các thí nghiệm biểu hiện gen (Zhan et al, 2006) cũng nhận thấy sự liên quan giữa Cyclin D1, t(11;14) và sự biểu hiện của CD20 Trong nghiên cứu của Quinn và cộng sự (2010), 24/96 (25%) số ca bệnh có dương tính với CD20 trong đó 10 ca dương tính với Cyclin D1 (41,7%); 11 ca dương tính với Cyclin D2 (45,8%); 3 ca âm tính với cả Cyclin D1 và D2 (12,5%) [38]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

31 bệnh nhân vào viện điều trị lần đầu tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung Ương tháng 1 năm 2014 đến tháng 2 năm 2015, thỏa mãn tiêu chuẩn:

- Chẩn đoán xác định Đa u tủy xương theo tiêu chuẩn hiệp hội Đa u tủy xương quốc tế 2009

- Bệnh nhân được sinh thiết tủy xương và nhuộm hóa mô miễn dịch trên tiêu bản sinh thiết tủy

- Bệnh nhân ≥ 16 tuổi

- Bệnh nhân đồng ý tham gia nghiên cứu

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu: nghiên cứu mô tả cắt ngang

2.2.2 Nội dung nghiên cứu

Nhóm tham gia nghiên cứu được đánh giá về:

 Các dấu ấn đặc trưng cho tế bào dòng plasmo: CD138, CD38, MUM1

 Sự biểu hiện của CD20 với giai đoạn bệnh, tỷ lệ tế bào dòng plasmo trong tủy xương

 Sự biểu hiện của dấu ấn kappa, lambda

 Đặc điểm của Cyclin D1 và giai đoạn bệnh, sự biểu hiện của CD20, tỷ

lệ tế bào dòng plasmo trong tủy xương, đột biến di truyền kiểu đa bội

2.2.3 Các tiêu chuẩn đánh giá

Tiêu chuẩn của hiệp hội Đa u tủy xương quốc tế năm 2009:

Tất cả các tiêu chuẩn sau:

 Tế bào dòng plasmo trong tủy xương ≥ 10% hoặc sinh thiết chứng minh có u tế bào dòng plasmo và

 Có protein đơn dòng (paraprotein) trong huyết thanh và/hoặc nước tiểu (trừ bệnh nhân ĐUTX thể không tiết) và

 Có tổn thương cơ quan có thể là do rối loạn tăng sinh tế bào dòng plasmo: nồng độ Canxi máu cao (> 11,5mg/dl), suy thận (creatinin huyết thanh > 1,73 mmol/l), thiếu máu (Hb < 10g/dl)

và tổn thương xương (tiêu xương, gẫy xương bệnh lý nghiêm trọng)

Hệ thống phân loại giai đoạn quốc tế (ISS, 2005):

Giai đoạn I β2M < 3.5 mg/l, albumin ≥ 3.5 g/dl

Giai đoạn II β2M < 3.5 mg/l và albumin < 3.5 g/dl; hoặc

β2M 3.5–5.5 mg/l và nồng độ albumin huyết thanh bất kỳ Giai đoạn III β2M ≥ 5.5 mg/l

Đánh giá kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch:

- Dương tính: Nếu có sự hiện diện KN trên tế bào, phức hợp

KN-KT-DAB Chromogen sẽ cho màu vàng nâu trên nguyên sinh chất của tế bào

- Âm tính: Trên kính hiển vi quan sát thấy nhân của các tế bào bắt màu xanh tím của hematoxylin, nguyên sinh chất không có biểu hiện

2.2.4 Vật liệu nghiên cứu:

Bệnh phẩm: mảnh sinh thiết tủy của bệnh nhân nghi ngờ ĐUTX

Dụng cụ:

- Máy xử lý mô tự động Medite, máy đúc bệnh phẩm Medite, máy cắt bán tự động Thermo H325 và H355S, tủ ấm, bàn sấy mẫu tiêu bản

- Các bể thủy tinh đựng hóa chất, dung dịch nhuộm

- Giá để tiêu bản, khay, cassette, panh, đèn cồn, giấy thấm, que tãi

- Pipet tự động, pipet paster, ống nghiệm thủy tinh

Khi cố định pha thành dung dịch Helly theo tỷ lệ: 20ml dung dịch

Zencơ với 1ml dung dịch Formon 40% và 1ml dung dịch acid acetic, cho vào lọ nhỏ lắc đều, bỏ miếng sinh thiết vào lắc nhẹ để miếng sinh thiết chìm trong dung dịch

- Dung dịch khử canxi:

Dung dịch I: 50 ml acid formic 85 - 95% và 35ml nước cất

Dung dịch II: 17g Tri-natricitrat (C6H5O7Na3.2H2O) và 85ml nước cất

→ Cách pha: Pha dung dịch acid Formic theo tỷ lệ