bao cao vi sinh DHYK Pham Ngoc Thach

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y KHOA PHẠM NGỌC THẠCH Khoa Điều dưỡng – Kỹ thuật Y học Bộ môn Xét Nghiệm BÁO CÁO THỰC TẬP Bệnh Viện NGUYỄN TRÃI Môn học: VI SINH Học viên: NGÔ QUANG SANG Lớp: Cử nhân Xét nghiệm 2013 TP.HCM, 01/ 2017 MỤC LỤC Trang Mục lục: .3 Mục tiêu : Phần 1: giới thiệu cấu trúc phòng vi-ký sinh: Đối tượng thực tập: Giới thiệu khoa vi- ký sinh: Các xét nghiệm thực khoa Vật tư trang thiết bị khoa: Phần 2: Quy trình hoạt động khoa xét nghiệm: 14 Giai đoạn trước xét nghiệm: 14 Lấy mẫu xét nghiệm: 14 Tiếp nhận kiểm tra mẫu: 16 Xử lý mẫu trước xét nghiệm: 16 B Giai đoạn xét nghiệm: 17 Khu vực vi sinh- huyết học: 17 Khu vực vi ký sinh- soi nhuộm : 25 Khu vực nuôi cấy định danh, kháng sinh đồ : 28 Khu vực sinh học phân tử : 42 Khu vực môi trường : 42 A Phần : An tồn sinh học phòng xét nghiệm vi sinh : 45 I II III Hướng dẫn xử lý tràn đỗ tác nhân gây bệnh tủ an toàn sinh học : 45 Hướng dẫn xử lý tràn đỗ tác nhân sinh học tủ an toàn sinh học : 45 Quy trình ứng phó khẩn cấp : 46 Tự đánh giá : 47 Tài liêu tham khảo : 47 MỤC TIÊU HỌC TẬP - Trang bị cho học sinh kiến thức xét nghiệm vi sinh, ký sinh bối cảnh thực tế bệnh viện từ khâu tổ chức; phân luồng làm - việc; lấy, nhận, chuyển bệnh nhân Giao tiếp ứng xử thích hợp với bệnh nhân, đồng nghiệp, với lãnh - đạo bệnh viện khoa phòng ban Rèn luyện kỹ thực kỹ thuật chuyên ngành Vi sinh, Ký sinh trùng, biết giữ an toàn, chống lây nhiễm cho cá nhân - cộng đồng Tạo điều khiển cho học sinh tích lũy kinh nghiệm, áp dụng kiến thức chuyên ngành y đức học vào thực tiễn PHẦN GIỚI THIỆU VỀ CẤU TRÚC PHÒNG XÉT NGHIỆM VI – KÝ SINH Đối tượng thực tập - Thời gian: 05 tuần thực tập phòng xét nghiệm Vi – Ký Sinh: Từ 28/ 11/ 2016 đến 30/ 12/ 2016 - Thành viên thực tập: Sv: Ngô Quang Sang; lớp cnxn- 2013 Giới thiệu khoa xét nghiệm vi sinh bệnh viện Nguyễn Trãi: - Phó giám đốc phụ trách mãn xét nghiêm:TS BS Trần Phủ Mạnh Siêu Đứng đầu Bác sĩ trưởng Khoa :BS CK1 Nguyễn Thị Thùy Giang Kĩ thuật viên trưởng khoa: CN Nguyễn Thị Ngọc Hạnh Kĩ thuật viên trưởng nhân hành chánh: CN Thái Bình An Kĩ thuật viên trưởng chuyên môn( vi sinh):CN Nguyễn Thị Ngọc Hạnh Tổng cộng nhân phòng gồm: CNXN, kĩ sư sinh học, KTV Y Cơng Sơ đồ phòng vi sinh: Các xét nghiệm phòng vi-ký sinh ST Xét nghiệm T Vi sinh- nuôi cấy Bệnh phẩm 05ml máu vào chai cấy máu Bactec Ped Plus Cấy dịch não tủy 1-2ml (lọ vô trùng) Cấy mủ số dịch khác (dịch 1-2ml, que gòn, đầu khí phế quản, dịch mật, dịch nội khí quản (lọ vơ màng bụng, ) trùng) Cấy nước tiểu 1-2ml (lọ vô trùng) Cấy phân 1-2ml (lọ vô trùng) Vi sinh- soi nhuộm 1-2ml/ que gòn (lọ Nhuộm Giemsa sạch) Nhuộm Z-N tìm AFB 1-2ml dịch (lọ sạch) Soi dịch(não tủy, màng phổi, …) 1-2ml (lọ sạch) tìm tế bào Vi sinh – huyết CRP Latex Reagent 2ml máu (tube Serum) 2ml máu đông (tube 10 Phản ứng ASO Serum) 2ml máu đông (tube 11 Phản ứng RF Serum) 2ml máu đông (tube 12 Test nhanh Dengue NS1 Ag Serum) 2ml máu đông (tube 13 Test nhanh Dengue IgG/IgM Serum) 2ml máu đông (tube 14 Test nhanh Malaria Ag P.f/P.v Serum) 2ml máu đông (tube 15 Phản ứng Widal Serum) 16 Điện di protein 2ml máu ( ống Serum) Sinh học phân tử 8ml máu đông (tube 17 Định lượng HCV-RNA Serum) 8ml máu đông (tube 18 Định lượng HBV-DNA Serum) Ký sinh trùng 19 Soi tươi phân 1-2ml (lọ sạch) Tìm hồng cầu ẩn phân (test 20 1-2ml (lọ vô sạch) nhanh SD FOB ) Cấy máu Thời gian trả kết Tối đa ngày Tối đa ngày Trong ngày 1h 1h 1h 1h 1h 1h (-): 1h (+): 3-5h Trong ngày Trả vào thứ hai thứ năm tuần 1h 1h Vật tư, trang thiết bị khoa Tube thủy tinh chịu nhiệt – 10 ml Ống đong Lò hấp ( Autoclave) Cân điện tử Lò hấp ướt ( Autoclave) Máy khuấy từ Đĩa Petri Lò vi ba dùng đung soi mơi trường Tủ an toàn sinh học cấp Tủ cấy an toàn sinh học Class II Buồn hút Máy cấy máu tự động BCTEC FX/ BACTEC 9120 10 Báo cáo số khuẩn lạc đặc điểm khuẩn lạc Nếu số khuẩn lạc CFU/ml thì trả lời: tên vi khuẩn/vi nấm, ghi nhận “ CFU/ml”, kết kháng sinh đồ o Nếu số khuẩn lạc CFU/ml tùy trường hợp mà báo cáo kết cụ thể số khuẩn lạc, tên vi khuẩn/vi nấm, kết kháng sinh đồ o Cấy âm tính: vi khuẩn không mọc sau 24h < CFU/ml trả lời kết “khơng mọc” o Nếu cấy có loại vi khuẩn khác thì trả lời “Tạp khuẩn” đề nghị lấy lại mẫu bệnh phẩm khác o  Cấy đàm Nguyên tắc: Dùng môi trường dinh dưỡng chọn lọc để nuôi cấy phân lập vi khuẩn / vi nấm gây nhiễm trùng đường hô hấp Việc đánh giá chất lượng mẫu bệnh phẩm qua trọng quy trình phân lập vi khuẩn : mẫu bệnh phẩm có chứng nhiễm dịch tiết miệng, họng (theo tiêu chuẩn Barlett) không tiến hành nuôi cấy phân lập vi khuẩn/ vi nấm gây bệnh Mục đích: ni cấy định danh vi khuẩn gây bệnh đường hô hấp Môi trường nuôi cấy: thạch máu: BA; thạch CA Mẫu bệnh phẩm: Mẫu bệnh phẩm bao gồm đàm, dịch hút khí quản dịch hút nội quản (NTA, ETA), phết mũi, phết mũi họng Nên chuyển bệnh phẩm đén phòng xét nghiệm vòng sau lấy mẫu Quy trình: Pha loãng đàm với nước muối sinh lý tỷ lệ 1:1 Lắc mẫu đàm Tiến hành cấy phân lập: cấy chiều thạch CA, cấy định lượng thạch BA Sang ngày hôm sau: đọc kết cấy phân lập làm định danh sinh hóa kháng sinh đồ Ngày cuối đọc trả kết kháng sinh đồ  Cấy dịch( não tủy, …), mủ- dịch vết thương Mục đích 32 Cấy phân lập tác nhân gây nhiễm trùng da, vết phỏng, vết thương vết mổ; tai (tai giữa, tai ngoài), xoang, kết mạc mắt, phận sinh dục, dịch thể (như dịch màng bụng, dịch màng tim, dịch màng phổi, dịch khớp) Môi trường nuôi cấy - BA: thạch máu (Blood Agar) MC: thạch MC (Mac Conkey Agar) CA: Thạch nân (Chocolate Agar) BHI : môi trường dinh dưỡng lỏng (Brain Heart Infusion) Mẫu bệnh phẩm - Bệnh phẩm dịch thể (như dịch màng bụng, dịch màng tim, dịch màng phổi, dịch khớp), dịch tiết mủ (vết phỏng, vết mổ, bóng nước vết loét ở da; ở vùng mắt, xoang tai; ở vùng âm đạo, niệu đạo) - Bệnh phẩm phải lấy điều kiện vô trùng, phải bịt kín để tránh rò rỉ nhiễm bẩn, dán nhãn gửi đến phòng xét nghiệm sớm tốt Nếu bệnh phẩm không mang đến phòng xét nghiệm thì lưu giữ khơng q 2h ở nhiệt độ phòng Ngun tắc Vi khuẩn/vi nấm gây nhiễm trùng ở quan thể gây phản ứng viêm chỗ huy động tế bào bạch cầu đến để tiêu diệt vi khuẩn/vi nấm Do phiến phết nhuộm Gram thấy có diện tế bào bạch cầu, tế bào mủ vi khuẩn/vi nấm Dùng loại môi trường dinh dưỡng điều kiện ủ thích hợp để phân lập tăng sinh vi khuẩn gây bệnh từ bệnh phẩm Quy trình Kỹ thuật cấy: - Ghi mã số bệnh nhân, ngày thực lên hộp thạch BA, MC Dùng khuyên cấy (hoặc que gòn) trải bệnh phẩm lên bề mặt ở góc hộp thạch Cấy chiều Trên BA Ủ BA bình nến tủ ủ 5% C; MC ủ 35-C /24-48h Theo dõi trình phân lập o o o Khảo sát hộp thạch BA Tìm khuẩn lạc nghi ngờ cầu khuẩn gram (+) tiến hành định danh vi khuẩn Tìm khuẩn lạc nghi ngờ cầu trực khuẩn gram (-) tiến hành định danh vi khuẩn Tìm khuẩn lạc nghi ngờ song cầu gram (-) tiến hành định danh vi khuẩn - Khảo sát hộp thạch MC 33 o Tìm khuẩn lạc nghi ngờ cầu trực khuẩn gram (-) tiến hành định danh vi khuẩn o Khảo sát hộp thạch SDA Tìm khuẩn lạc nghi ngờ nấm men tiến hành định danh vi khuẩn Làm kháng sinh đồ với vi khuẩn/vi nấm gây bệnh phân lập cần thiết Diễn giải báo cáo kết - Cấy âm tính: đưa kết cuối sau 24-48h, trả lời kết “Không mọc” - Cấy dương tính: o Đối với dịch thể: Phát vi khuẩn gây bệnh (như Streptococci tiêu huyết beta, Staphylococci, S.pneumoniae, H.influenzae, N.menigitidis, tất trực khuẩn Gram âm, nấm men); trả lời kết định danh vi khuẩn kháng sinh đồ Cấy dương tính với nhiều loại vi khuẩn, nghi ngờ bội nhiễm từ phòng xét nghiệm: trả lời “Tạp nhiễm” đề nghị lấy lại bệnh phẩm khác o Đối với loại mủ dịch tiết khác: Phát vi khuẩn gây bệnh (như Streptococci tiêu huyết beta, S.aureus, S.pneumoniae, H.influenzae, N.menigitidis, tất trực khuẩn Gram âm); trả lời kết định danh vi khuẩn kháng sinh đồ Cấy dương tính với vi khuẩn Coagulase negative Staphylococci: trả lời “Coagulase negative Staphylococci” không trả lời kết kháng sinh đồ -Nhập kết soi, cấy kháng sinh đồ vào hệ thống QUY TRÌNH SƠ ĐỒ CẤY MỦ, DỊCH RỬA XOANG 34  Cấy phân Mục đích Khảo sát phân vi khuẩn học để chuẩn đoán bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa với triệu chứng kiết lỵ, tiêu chảy Trong trường hợp để chuẩn đốn bệnh thương hàn phó thương hàn cần lấy phân, máu, nước tiểu Môi trường nuôi cấy: - SS: thạch Salmonella-Shigella - MC: thạch MacConkey Agar Mẩu bệnh phẩm: - Mẫu phết trực tràng - Phân tươi bảo quản lọ cấy vô trùng Nguyên tắc Khảo sát kính hiển vi số lượng bạch cầu, hồng cầu tiêu chuẩn quan trọng quy trình cấy phân lập vi khuẩn gây tiêu đàm máu Thạch MC môi trường chọn lọc vừa cho hầu hết vi 35 khuẩn Gram âm, đặc biệt vi khuẩn đường ruột Ngồi ra, mơi trường thạch SS môi trường chọn lọc cao dùng để phân lập vi khuẩn Shigella spp Salmonella spp Quy trình Tiến hành -Điền đầy đủ thơng tin bệnh (kiểm tra,đối chiếu) -Mô tả đại thể bệnh phẩm: Màu sắc, Tính chất (lỏng, đặc, sệt,nhão, nước vo gạo ), Có máu nhày nhớt hay không? -Kỹ thuât cấy: Ghi mã số bệnh phẩm, ngày thực lên hộp thạch MC, SS Dùng khun cấy vơ trùng chọn vùng có mủ, nhầy máu cho lên mặc hộp thạch MC SS (Nếu phết trực tràng thì trải lên mặt hộp thạch) Bằng thao tác vô trùng, cấy ria chiều o Dùng khuyên cấy vô trùng trải bệnh phẩm lên lam kính diện tích 1,5x2,5cm o Ủ tất hộp thạch MC SS ở 35-370C 24h o o -Khảo sát trực tiếp (vật kính 100X) o o o Nhuộm Methylene Blue Tìm bạch cầu, hồng cầu Ghi nhận kết khảo sát trực tiếp lên phiếu tiến trình -Theo dõi trình cấy : kiểm tra hộp thạch sau ủ 24h Nếu có khuẩn lạc lên men Lactose (màu hồng) nghi ngờ vi khuẩn Escherichia coli,tiến hành định danh vi khuẩn thực kháng sinh đồ theo “ Quy trình Thực kháng sinh đồ kết khảo sát trực tiếp có hồng cầu và/hoặc bạch cầu ở trẻ < tuổi o Nếu có khuẩn lạc khơng lên men Lactose (không màu, hồng nhạt), tiến hành định danh vi khuẩn Nếu kết định danh nghi ngờ vi khuẩn Shigella spp Salmonella spp, Thực xác định typ huyết vi khuẩn Shigella vi khuẩn Salmonella phương pháp huyết học o -Thực kháng sinh đồ cho mẫu cấy dương tính  Cấy máu Mục đích: Ni cấy, phân lập vi khuẩn vi nấm từ chai cấy máu Ped Plus để tìm tác nhân gây nhiễm trùng huyết 36 Môi trường nuôi cấy: - BA: thạch máu (Blood Agar) MC: thạch MC (Mac Conkey Agar) CA: Thạch nâu (Chocolate Agar) Mẫu bệnh phẩm: - Máu tĩnh mạch, máu tủy xương nuôi cấy chai cấy máu Ped Plus Trang thiết bị: - Máy cấy máu máy Bactec 9120/ FM Top Nguyên lý hoạt động: * Vi sinh vật  thải khí CO2 phản ứng với chất nhuộm gắn phận cảm biến ở đáy chai (sensor) Phản ứng điều chỉnh lượng ánh sáng hấp thu bởi phát quang sensor * Phần Photo Detector đo mức phát quang tương ứng với hàm lượng CO vi sinh vật thải môi trường * Cứ 10 phút máy kiểm tra lần Mẫu dương tính báo hiệu nguồn ánh sáng thị nằm phía trước máy ƯU ĐIỂM: * Hệ thống kín, hồn tồn tự động, theo dõi liên tục, có đèn chuông báo động * Các phận ủ mẫu, lắc mẫu, giám sát theo dõi kiểm tra 10 phút, 24 / ngày, kết dương tính phát nhanh, cải thiện độ chuẩn xác * Thời gian phát nhanh * Thao tác đơn giản, không gây ảnh hưởng đến người thực Quy trình - Nhận bệnh phẩm, kiểm tra thơng tin ghi chai cấy máu với phiếu yêu cầu xét nghiệm Từ chối nhận bệnh phẩm không đạt Đặt chai cấy máu Ped Plus vào hệ thống Bactec Lưu ý: Các chai cấy máu hệ thống Bactec tự kiểm tra 10 phút Khi phát chai cấy máu nghi ngờ (+) hệ thống Bactec báo động âm thanh/đèn để thông báo Bactec thông báo chai cấy nghi ngờ (+) Lấy chai cấy máu (+) Sử dụng kim tiêm nguyên tắc vô khuẩn lấy khoảng 1ml máu khỏi chai để nhuộm Gram cấy chuyển 37 - Đánh giá kết nhuộm Gram: o Khơng có vi khuẩn: Cấy chuyển từ chai cấy máu lên hộp thạch BA (có vạch “Satellite”) ủ ở 35-C/ 5% C MC ủ ở 35-C /24-48h Cất chai cấy máu vào hệ thống Bactec vào vị trí ban đầu o Có vi khuẩn: Xác định vi khuẩn Gram (-) hay (+), cầu khuẩn, trực khuẩn, nấm men Thông báo kết sơ khởi qua điện thoại cho Bác sĩ lâm sang ghi vào sổ - Cấy phân lập vi khuẩn/ vi nấm: Cấy chuyển từ chai cấy máu (+) vào hộp thạch BA, MC SDA (nhuộm Gram có kết nấm men) Ủ BA (có vạch “Satellite”) ủ ở 35-C/ 5% C MC ủ ở 35-C Sau 24-48h quan sat khuẩn lạc → Mọc: Định danh Kháng sinh đồ → Không mọc: tiếp tục theo dõi chai cấy Bactec 5.4 Chai cấy máu (-) sau ngày ủ: Cấy phân lập vào mơi trường BA có vạch “Satellite” với khuẩn lạc S.aureus ủ ở 35-C/ 5% C/24h Kiểm tra mọc vi khuẩn ( có) Sau 24h, khơng có vi khuẩn mọc ghi kết “vi khuẩn khơng mọc sau ngày” Sau 24h, có vi khuẩn mọc cấy phân lâp BA, MC ( trên) Nếu nghi ngờ tạp nhiễm thì cấy lại từ chai cấy máu kiểm tra kết sau 24-48h, đồng thời lien hệ với lâm sàng kiểm tra tình trạng bệnh nhân có phù hợp với kết phân lập vi khuẩn 5.5 Diễn giải báo cáo kết o o o o o Mẫu (+) tính Mẫu (-) tính Mẫu tạp nhiễm (mọc từ vi khuẩn trở lên) Nhập kết Trả kết 38 b K h n g sinh đồ Có hai kỹ thuật kháng sinh đồ: phương pháp KIRBY-BAUER: pp khuếch tán kháng sinh thạch phương pháp MIC: pp vi pha loãng tìm nồng độ ức chế tối thiểu Phòng vi sinh bệnh viện Nguyễn Trãi sử dụng phương pháp khuyeetch tán thạch Thạch Mueller - Hinton Mơi trường phải chuẩn hố cao, giúp vi khuẩn gây bệnh thơng thường mọc tốt Có nhiều loại mơi trường thạch Mueller - Hinton thạch tốt để làm thử nghiệm kháng sinh đồ vì: - Có đầy đủ yếu tố giúp cho hầu hết vi khuẩn gây bệnh phát triển - Ức chế thấp với sulfonamide, trimethoprim, tetracyclin - Chất lượng môi trường ổn định từ mẻ đến mẻ khác - Đã tiến hành nghiên cứu với số lượng lớn Nếu môi trường không thích hợp, nghèo dinh dưỡng, vi khuẩn phát triển thì vòng vơ khuẩn lớn dẫn đến kết sai Các môi trường đặc biệt - S aureus để thử Oxacillin - Thạch BA cho S pneumoniae - Thạch BAcó yếu tố X V cho Haemophylus Các yếu tố cần thiết để vi khuẩn phát triển - Một số vi khuẩn cần thêm 5% máu cừu thỏ thì phát triển loại liên cầu, phế cầu ) 39 - Tuy nhiên ở môi trường có máu thì vòng vơ khuấn nhỏ lại khoanh giấy oxacillin, methicillin (nhỏ 2-3 mm), vòng vô khuẩn to ở xung quanh khoanh giấy sulfonamide trimethoprim - Một số vi khuẩn cần thêm yếu tố bổ trợ để phát triển vitamin, yếu tố X, V để phát triển (H influenzae) Độ ẩm thạch - Trước ria cấy vi khuẩn vào môi trường phải làm khô mặt thạch vì mặt thạch ướt vi khuẩn mọc dày làm thu hẹp vòng ức chế - Làm khơ mặt thạch cách để tủ ấm khoảng 15 - 30 phút, không để lâu vì làm khô mặt thạch, vi khuẩn khó mọc ảnh hưởng đến khuếch tán kháng sinh, làm vòng vơ khuẩn nhỏ lại Độ dày thạch Độ dày trung bình thạch + 0.5 mm, không nên dày mỏng làm kháng sinh khuếch tán nhiều theo chiều sâu chiều ngang làm sai kêt Huyền dịch vi khuẩn dùng thử nghiệm - Huyền dịch vị khuẩn dùng thử nghiệm 108 vi khuẩn/ ml So sánh với độ đục chuẩn Mc Farland 0.5 (pha BaS04) có nồng độ tương đương với nồng độ 108 vi khuẩn/ml Có hai phương pháp chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn: - Chọn trực tiếp khuẩn lạc: chủng vi khuẩn dùng phương pháp phải thuần, vừa nuôi cấy qua đêm Nhặt 3-5 khuẩn lạc loại môi trường nuôi cấy thuần, qua đêm Hoà - ml nước muối sinh lý Lắc tay máy lắc So sánh tương đương với độ đục chuẩn Mc Farland 0,5, điều chỉnh độ đục cách thêm nước muối sinh lý vi khuẩn - Nuôi cấy canh thang: Nhặt 3-5 khuẩn lạc loại môi trường nuôi cấy Hoà - ml canh thang thích hợp (tryptic soy broth, BHI) ủ ấm canh thang ở 35°C so sánh tương đương với độ đục chuẩn Mc Farland 0.5 (khoảng sau 2-6 giờ) Điều chỉnh độ đục cách thêm canh thang vi khuẩn Ria vi khuẩn Trong vòng 15 phút sau điều chỉnh độ đục, dùng que tăm vơ trùng nhúng vào canh khuẩn, xoay tròn tăm bơng vài lần vắt bớt nước cách ép tăm vào thành ống Dùng tăm vạch ngang lần vng góc mặt đĩa thạch Sau ria tăm lên mặt thạch cách lần ria xoay đĩa 60° Khoanh giấy kháng sinh - Bảo quản kháng sinh: khoanh giấy kháng sinh thấm hàm lượng định tính µg/ml Mỗi kháng sinh có độ bền khác Nhiệt độ độ ẩm cao dễ làm bất hoạt kháng sinh kháng sinh họ β-lactam Vì vậy, kháng sinh sử dụng hàng ngày phải bảo quản ở 2-8°C (ngăn tủ lạnh) Các kháng sinh bảo quản lâu phải bảo quản ở - 20°C (ngăn đá) - Chọn kháng sinh: loại kháng sinh có phổ tác dụng định với loại vi khuẩn Vì loại vi khuẩn thử với số loại kháng sinh định Các kháng sinh chọn theo tài liệu hướng dẫn CLSI (Bảng hướng dẫn lựa chọn kháng sinh) - Đặt kháng sinh: dùng kim đầu nhọn đặt nhẹ khoanh giấy cho tiếp xúc mặt thạch 40 Khoảng cách khoanh giấy 24 mm, cách rìa đĩa thạch 15 mm Như đĩa thạch đường kính 10 cm đặt 5-6 khoanh giấy kháng sinh Điều kiện ủ ấm Nhiệt độ q cao làm đường kính vòng vô khuẩn nhỏ lại Điều kiện ủ ấm cho vi khuẩn thơng thường 35-37°C/ khí trường thường/18-20 Đặc biệt: - Campylobacter ủ ở 42°C - S aureus thử độ nhạy cảm với oxacillin ủ ở 30°C, 24 - Enterococci thử độ nhạy cảm với vancomycin cần ủ 24 - Yersinia pestis cần ủ 25°c - Haemophylus cần ủ điều kiện có 5-7% CO2 Đọc diễn giải kết - Đo đường kính vòng vơ khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh, đường kính tính milimet Đường kính đựơc chia thành mức độ nhạy cảm, trung gian, đề kháng dựa vào bảng chuấn theo hướng dẫn tài liệu CLSI - Kết kháng sinh đồ chia thành loại A, B, C, U, O để ưu tiên chọn lọc điều trị Khu vực sinh học phân tử - Tiến hành chạy PCR HBV- DNA HCV- RNA vào sáng thứ tư thứ sáu - Mẫu : 8ml máu toàn phần ống Serum - Công việc thực : ly tâm mẫu máu ống Serum, tách chiết huyết vào eppendorf - khoảng 300µl Chờ đến ngày chạy PCR Khi chạy PCR : cần xếp viêm gan C chung với viêm gan B với nhau, không để lẫn hai mẫu vào Khởi động máy tách chiết DNA, kiểm tra thuốt thử, bồn nước thải… Khởi động máy định lượng PCR Cho mẫu vào máy tách chiết, sau 3h lấy mẫu tách chiết chuyển sang máy PCR để chạy PCR Kết có sau khoảng 1,5h Khu vực môi trường Thạch máu (Blood Agar) Thành phần : Bột môi trường Columbia agar; bột môi trường Agar; máu cừu;nước cất vừa đủ Cách pha chai 400ml: 41 - Dùng cân tiểu ly cân đúng: 16,8g Columbia agar, 2g agar Cho vào chai 400ml nước cất vừa đủ, - - khuấy tan máy gia từ Cho vào lò vi sóng quay phút Sau mang hấp ướt nồi hấp Autolave Sau hấp xong, mang làm nguội cách để ca nước máy gia từ cho chai môi trường vào cảm thấy nhiệt độ ấm vừa thì lấy ra, tiếp tục cho thêm 25ml máu cừu vào( đảm bảo vô trùng ) Khuấy cho máu tan máy gia từ tiến hành đổ thạch Đổ khoảng 60-70% mặt thạch, sau nghiêng nhẹ cho môi trường tràng mặt thạch, tiếp tục đổ hết môi trường Dùng phân lập ni cấy vi khuẩn khó tính Lưu giữ ở – 15 ngày 1.1 Môi trường Chocolate agar Thành phần : Bột môi trường Columbia agar; bột môi Agar; máu cừu;nước cất vừa đủ, yếu tố X-V trường Cách pha chai 400ml: - Dùng cân tiểu ly cân đúng: 16,8g Columbia agar, 2g agar Cho vào chai 400ml nước cất vừa đủ, khuấy tan máy gia từ - Cho vào lò vi sóng quay phút Sau mang hấp ướt nồi hấp Autolave - Sau hấp xong, mang làm nguội cách để ca nước máy gia từ cho chai môi trường vào cảm thấy nhiệt độ ấm vừa thì lấy ra, tiếp tục cho thêm 25ml máu cừu 5ml yếu tố X-V vào( đảm bảo vô trùng ) - Khuấy cho máu tan máy gia từ ở 37oC, đến chuyển màu socola tiến hành đổ thạch - Đổ khoảng 60-70% mặt thạch, sau nghiêng nhẹ cho môi trường tràng mặt thạch, tiếp tục đổ hết môi trường Cho phát triển cầu khuẩn Gram dương cầu khuẩn Gram âm khó mọc Neisseria spp, Haemophilus spp Lưu giữ ở – 15 ngày Môi trường MC (Mac Conkey Agar) Công thức Peptone Proteose peptone Lactose Bile salt NaCl Agar Neutral red Crystal violet pH = 7,2 Gram 17 10 1,5 13,5 0,03 0,001 42 Dùng phân lập vi khuẩn đường ruột, ngăn chặn vi khuẩn Gram dương Môi trường MHA (Muller Hinton Agar) Thành phần: bột MHA agar, nước cất Cách pha chai 400ml: - Dùng cân tiểu ly cân đúng: 13,6g MHA Cho vào chai 400ml nước cất vừa đủ, khuấy tan máy gia từ - Cho vào lò vi sóng quay phút Sau mang hấp ướt nồi hấp Autolave - Sau hấp xong, mang làm nguội cách để ca nước máy gia từ cho chai môi trường vào cảm thấy nhiệt độ ấm vừa thì lấy ra, tiến hành đổ thạch - Đổ khoảng 80-90% mặt thạch, sau nghiêng nhẹ cho mơi trường tràng mặt thạch, tiếp tục đổ hết môi trường - Khảo sát nhạy cảm vi khuẩn với kháng sinh( kháng sinh đồ) - Lưu giữ ở – 15 ngày Môi trường Thioglycollate Thành phần: bột thioglycollate, nước cất Cách pha chai 400ml: - Dùng cân tiểu ly cân đúng: 12g bột Thioglycolate Cho vào chai 400ml nước cất vừa đủ, khuấy tan máy gia từ - Cho vào lò vi sóng quay phút Sau mang để nguội, đổ vào ống nghiệm có nắp - vặn Sau đem hấp ướt nồi hấp Autolave Sau hấp xong cho vào tủ lạnh lưu trữ, Dùng để tăng sinh vi khuẩn cấy phân lập Lưu giữ ở – 15 ngày C Sau xét nghiệm 43 - Hoàn tất kết → Nhập kết → In kết → Trả kết → Sao chép kết → Thẩm quyền ký trả kết → Bảo vệ tính xác liệu kết xét nghiệm - Lưu trữ bảo quản mẫu bỏ mẫu: • Đối với mẫu là: đĩa,ống môi trường cấy, hay chai cấy máu: thì đem hấp bỏ • Đối với mẫu là: typ máu( EDTA, Serum ) thì lưu trữ lại tuần, sau đem bỏ • Đối với mẫu là: phân, đàm, nước tiểu… thì đem hấp bỏ ngayd PHẦN AN TOÀN SINH HỌC TRONG PHÒNG XÉT NGHIỆM VI SINH I HƯỚNG DẪN XỬ LÝ TRÀN ĐỖ TÁC NHÂN GÂY BỆNH BÊN NGOÀI TỦ AN TOÀN SINH HỌC Khi đánh đổ du ng dịch chứa tác nhân gây bệnh lên sàng nhà mặt bàn phòng xét nghiệm, cán xét nghiệm cần tiến hành bước xử lý sau: Báo với đồng nghiệp làm việc gần (nếu có) Để cho tủ hoạt động 10 phút trước tiến hành biện pháp xử lý đảm bảo cho tất khí dung lọc qua màng lọc HEPA tủ Thay găng tay lấy xử lý cố đổ mẫu Dùng giấy thấm phủ lên dung dịch bị đổ Đổ hóa chất khử trùng (dung dịch Bleach pha loãng 10 lần NaClO 0,5%), để khoảng 30 phút cho chất khử trùng phát huy tác dụng Thay gang Dùng kẹp thu nhặt vật sắc nhọn (nếu có) kẹp bỏ vào hộp đựng vật sắc nhọn Dùng kẹp thu nhặt giấy thấm cho vào túi đựng chất thải lây nhiễm để tiệt trùng Xịt sát khuẩn lau bề mặt làm việc tủ ATSH 10 Tháo gang rửa tay 11 Kết thúc trình xử lý 12 Sau kết thúc xét nghiệm khỏi PXN, phải ghi chép, báo cáo việc với người phụ trách ATSH người quản lý PXN II HƯỚNG DẪN XỬ LÝ TRÀN ĐỖ TÁC NHÂN GÂY BỆNH BÊN TRONG TỦ AN TOÀN SINH HỌC Khi đánh đổ dung dịch chứa tác nhân gây bệnh tủ ATSH, người làm xét nghiệm không tắt tủ tiến hành bước sau: 44 13 Báo với đồng nghiệp làm việc gần (nếu có) 14 Để cho tủ hoạt động 10 phút trước tiến hành biện pháp xử lý đảm bảo cho tất khí 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 III dung lọc qua màng lọc HEPA tủ Thay găng tay lấy xử lý cố đổ mẫu Dùng giấy thấm phủ lên dung dịch bị đổ Đổ hóa chất khử trùng (dung dịch Bleach pha loãng 10 lần NaClO 0,5%), để khoảng 30 phút cho chất khử trùng phát huy tác dụng Thay gang Dùng kẹp thu nhặt vật sắc nhọn (nếu có) kẹp bỏ vào hộp đựng vật sắc nhọn Dùng kẹp thu nhặt giấy thấm cho vào túi đựng chất thải lây nhiễm để tiệt trùng Xịt sát khuẩn lau bề mặt làm việc tủ ATSH Tháo gang rửa tay Kết thúc trình xử lý Sau kết thúc xét nghiệm khỏi PXN, phải ghi chép, báo cáo việc với người phụ trách ATSH người quản lý PXN QUY TRÌNH ỨNG PHĨ KHẨN CẤP Đổ vỡ tác nhân sinh học- hóa chất -Cảnh báo đồng nghiệp -Sử dụng giấy thấm để chống tràn -Xịt cồn 70° Javel 5% -Báo cho nhân viên phụ trách an tồn sinh học phòng xét nghiệm Cháy *Đám cháy nhỏ: -Cảnh báo đông nghiệp -Sử dụng bình chửa cháy tai chổ -Tránh hút thuốc *Đám cháy lớn: -Cảnh báo đồng nghiệp để sơ tán -Gọi số chữa cháy khẩn cấp -Đóng để ngăn chặn đám cháy 45 TỰ ĐÁNH GIÁ: Đã mô tả sơ đồ, cấu tổ chức, qui trình hoạt động phòng xét nghiệm vi- ký sinh bệnh viện thực tập Đã học tập, trình bày nguyên lý số test nhsnh thường dùng phòng xét nghiệm vi- ký sinh Nắm quy trình lấy, vận chuyển, xử lý bệnh phẩm, bảo quản lưu trữ bệnh phẩm Hiểu, biết thực hành thao tác phòng xét nghiệm Các vấn đề liên quan đế an tồn phòng xét nghiệm Tham gia, hòa nhập vào hệ thống, quy trình làm việc phòng xét nghiệm vi- ký sinh Phần quản lý chất lượng phòng vi- ký sinh trình bày học phần quản lý chất lượng riêng biệt nên không đề cập đến nội dung báo cáo TÀI LIÊU THAM KHẢO: - Phạm Hùng Vân (2006) Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng NXB Y học Lê Thị Xuân (2008) Ký sinh trùng thực hành Bộ Y tế Hà Nội NXB Y học Các tài liệu lưu trữ thư viện Bệnh viện phòng xét nghiệm Bệnh viện 46 ... gan, vi m gan tự miễn siêu vi Bệnh mô liên kết Vi m khớp dạng thấp, lupus hệ thống, xơ cứng bì, hội chứng Sjogren Nhiễm Vi khuẩn: vi m xương – tủy xương, vi m nội tâm mạc siêu vi: HIV/AIDS, vi m... vi n trưởng nhân hành chánh: CN Thái Bình An Kĩ thuật vi n trưởng chuyên môn( vi sinh) :CN Nguyễn Thị Ngọc Hạnh Tổng cộng nhân phòng gồm: CNXN, kĩ sư sinh học, KTV Y Cơng Sơ đồ phòng vi sinh: ... nươc tiểu khơng có vi khuẩn /vi nấm, ngoại trừ vi khuẩn sống hoại sinh ở niệu đạo phận sinh dục Đây xét ngiệm sử dụng mơi trường điều kiện thích hợp để phân lập tác nhân vi khuẩn /vi nấm gây bệnh