GIÁO TRÌNH THỰC tập DI TRUYỀN học đại CƯƠNG

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SHƢD BỘ MƠN DI TRUYỀN - GIỐNG NƠNG NGHIỆP GIÁO TRÌNH THỰC TẬP DI TRUYỀN HỌC ĐẠI CƢƠNG TS NGUYỄN LỘC HIỀN 2010 MỤC LỤC Bài 1 Bài 2 Bài 3 Bài 4 Mục lục Mở đầu Cơ sở tế bào học sinh sản vơ tính – Phân bào ngun nhiễm (Mitosis) Mục đích Vật liệu hóa chất Phƣơng pháp 3.1 Phƣơng pháp cố định mẫu rễ hành 3.2 Phƣơng pháp thực tiêu tạm thời chóp rễ hành Chu kỳ tế bào phân bào nguyên nhiễm 4.1 Chu kỳ tế bào 4.2 Phân bào nguyên nhiễm Yêu cầu sinh viên Phúc trình Cơ sở tế bào học sinh sản hữu tính – Phân bào giảm nhiễm (Meiosis) Mục đích Vật liệu hóa chất Phƣơng pháp 3.1 Phƣơng pháp cố định mẫu cờ bắp 3.2 Phƣơng pháp thực tiêu tạm thời hạt phấn bắp non Phân bào giảm nhiễm Yêu cầu sinh viên Phúc trình Sự hình thành giao tử (Gametogenesis), thụ tinh (Fertilization) tạo phôi (Embryogenesis) Mục đích Vật liệu Phƣơng pháp Sự hình thành giao tử Sự thụ tinh tạo phơi Sự hình thành trái hạt Yêu cầu sinh viên Phúc trình Ứng dụng lý thuyết xác suất di truyền – Phƣơng pháp kiểm định Chi bình phƣơng χ2 Mục đích Phƣơng tiện Phƣơng pháp Lý thuyết xác suất Kiểm định Chi bình phƣơng χ2 5.1 Kiểm định χ2 phù hợp 5.2 Kiểm định χ2 đồng 5.3 Kiểm định χ2 độc lập Tần số tái tổ hợp Trang 5 5 8 11 12 13 13 13 13 13 14 14 19 19 20 20 20 20 20 22 23 25 25 26 26 26 26 27 28 28 31 31 32 Yêu cầu sinh viên Phúc trình Phụ lục Phụ lục Phụ lục Phụ lục PHỤ LỤC Kính hiển vi quang học Cố định mẫu Phƣơng pháp điều chế thuốc nhuộm Aceto Carmine Bảng phân bố Chi bình phƣơng χ2 Tài liệu tham khảo 33 33 34 35 36 39 41 42 MỞ ĐẦU Giáo trình thực tập Di truyền học đại cương đƣợc biên soạn để làm tài liệu học tập cho sinh viên ngành Nông Học, Trồng Trọt, Bảo Vệ Thực Vật, Hoa Viên Cây Cảnh, Công Nghệ Giống Cây Trồng Khoa Nông Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng chuyên ngành khác Khoa thuộc Trƣờng Đại Học Cần Thơ nhƣ Công Nghệ Sinh Học, Sƣ Phạm Sinh SP Sinh – Kỹ Thuật Nông Nghiệp Mục đích thực tập nhằm cung cấp cho sinh viên phƣơng pháp thực mẫu để quan sát dƣới kính hiển vi số tƣợng di truyền giúp sinh viên cố kiến thức học phần lý thuyết Di truyền học đại cƣơng thông qua quan sát dƣới kính hiển vi mơ hình thí nghiệm Vì vậy, sinh viên cần phải xem kỹ phần lý thuyết phƣơng pháp thực hành trƣớc thực tập Ngoài ra, sinh viên cần nắm vững thao tác phịng thí nghiệm đƣợc học học phần đại cƣơng sở có liên quan nhƣ phƣơng pháp sử dụng kính hiển vi, thao tác sử dụng dụng cụ hóa chất, nguyên tắc an tồn vệ sinh phịng thí nghiệm BỘ MƠN DI TRUYỀN - GIỐNG NÔNG NGHIỆP PTN Di Truyền – Giống Nông Nghiệp Bài CƠ SỞ TẾ BÀO HỌC CỦA SỰ SINH SẢN VƠ TÍNH – PHÂN BÀO NGUYÊN NHIỄM (MITOSIS) MỤC ĐÍCH: - Thực hành phƣơng pháp chuẩn bị tiêu tạm thời để quan sát trình phân bào nguyên nhiễm thực vật - Quan sát tế bào mô phân sinh phân biệt giai đoạn phân chia tiến trình phân bào ngun nhiễm tế bào chóp rễ hành thơng qua biến đổi trạng thái nhiễm sắc thể giai đoạn phân bào - Tìm hiểu ý nghĩa di truyền học phân bào nguyên nhiễm VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT: - Rễ hành (Allium sp.) (2n=16) - Kính hiển vi quang học với vật kính độ phóng đại 10X 40X - Kính mang vật (lame) kính đậy vật (lamella) - Kim mủi giáo, kẹp nhọn, dĩa đồng hồ, chai thủy tinh, giấy thấm, dao lam - Hóa chất: dung dịch Carnua biến đổi (Carnua acetic), cồn 700, HCl 2N, dung dịch nhuộm Aceto carmine, nƣớc cất PHƢƠNG PHÁP: 3.1 Phƣơng pháp cố định mẫu rễ hành: Quá trình phân bào nguyên nhiễm đƣợc quan sát tế bào thuộc vùng mơ phân sinh nhƣ chóp rễ non, chóp rễ mầm, đỉnh sinh trƣởng Phƣơng pháp cố định mẫu rễ hành đƣợc thực nhƣ sau: - Rửa củ hành cắt hết rễ Sau đem giâm củ hành mơi trƣờng ẩm nhƣ cát ẩm, tro trấu nƣớc khoảng 36-48 rễ phát triển dài khoảng 1-2cm (Hình 1.1.) Hình 1.1 Kích thích rễ hành phát triển cách ngâm cát ẩm nước - Cắt rễ rửa nƣớc cất ngâm dung dịch Carnua biến đổi khoảng 24 (Hình 1.2.) Hình 1.2 Rễ cố định dung dịch Carnua biến đổi rửa cồn 700 - Sau cố định mẫu Carnua biến đổi, lấy rễ rửa rễ cồn 70 Sau giữ mẫu cồn 700 nhiệt độ tủ lạnh khoảng 10-150C Mẫu rễ đƣợc cố định phƣơng pháp tồn trữ điều kiện sử dụng thời gian dài khoảng 1-2 năm để quan sát giai đoạn trình phân bào nguyên nhiễm 3.2 Phƣơng pháp thực tiêu tạm thời chóp rễ hành: Lớp vỏ Mạch trụ Biểu bì Lơng hút Vùng chín Vùng kéo dài Mơ phân sinh Chóp rễ Vùng phân bào Hình 1.3 Cấu tạo rễ hành Để quan sát trình phân bào ngun nhiễm tế bào chóp rễ hành (Hình 1.3.), việc thực tiêu tạm thời đƣợc cố định đƣợc thực theo bƣớc nhƣ sau (Hình 1.4.): - Dùng kẹp nhọn gấp 2-3 rễ hành đặt lên kính mang vật dùng kim mủi giáo hay dao lam cắt phần chóp rễ dài khoảng 0,5 -1mm - Nhỏ 1-2 giọt HCl 2N lên chóp rễ, bảo đảm che phủ tồn chóp rễ, ngâm 1-2 phút - Thấm HCl rửa chóp rễ nhiều lần nƣớc cất - Dùng kim mủi giáo ấn nhẹ chóp rễ cho rễ bẹp tế bào rời - Nhỏ 1-2 giọt thuốc nhuộm Aceto carmine vào mẫu rễ nhuộm 1-2 phút - Đậy mẫu lại kính đậy vật Dùng cán kim mủi giáo hay cán kim nhọn tán mẫu cho tế bào phân tán Sau tán mẫu, mẫu đƣợc sử dụng để quan sát Rễ hành chứa cồn 700 Cắt phần chóp rễ Rửa chóp rễ nước cất Gấp rễ hành cho lên kính mang vật Ngâm chóp rễ HCl 1N Nhuộm mẫu Aceto Carmine Đậy mẫu kính đậy vật tán mẫu Hình 1.4 Phương pháp thực tiêu tạm thời chóp rễ hành để quan sát phân bào nguyên nhiễm CHU KỲ TẾ BÀO VÀ PHÂN BÀO NGUYÊN NHIỄM: 4.1 Chu kỳ tế bào: Sự sinh trƣởng quan đa bào phụ thuộc vào nhân lên tế bào đơn Các tế bào nhân thật trãi qua chu kỳ tế bào Một chu kỳ tế bào cuối lần phân bào trƣớc đến cuối lần phân bào Nó gồm giai đoạn chính: Gian kỳ (kỳ trung gian, Interphase) giai đoạn phân chia (Mitotic phase) Ở gian kỳ, tế bào tăng trƣởng chuẩn bị cho phân bào, đặc biệt có tổng hợp DNA Trong suốt giai đoạn này, nhiễm sắc thể khơng quan sát đƣợc dạng duổi xoắn Gian kỳ đƣợc phân thành giai đoạn nhỏ (Hình 1.5.): Giai đoạn tiền tổng hợp (G1): bắt đầu sau kết thúc lần phân bào trƣớc Trong giai đoạn này, tế bào tăng trƣởng kích thƣớc, tích tụ chất liệu nhƣ enzyme chất cần thiết cho tổng hợp ADN Các quan tử, protein, loại ARN đƣợc tạo thành Tốc độ chuyển hóa tế bào giai đoạn cao Giai đoạn tổng hợp (S): giai đoạn này, phân tử ADN tự nhân đôi, mức độ tổng hợp protein tăng cao Cuối giai đoạn này, nhiễm sắc thể dạng nhân đôi với hai nhiễm sắc tử dính tâm động Giai đoạn sau tổng hợp (G2): Toàn gen đƣợc nhân đơi Trong giai đoạn này, tế bào tích lũy lƣợng chuẩn bị phân bào Trạng thái chuyển hóa tế bào gia tăng Giai đoạn phân bào xảy tiếp sau gian kỳ Gian kỳ S G1 M G2 Nguyên phân Chung kỳ Tiền kỳ Đầu biến kỳ Tiến kỳ Biến kỳ Hình 1.5 Chu kỳ tế bào trình phân bào nguyên nhiễm 4.2 Phân bào nguyên nhiễm: Phân bào nguyên nhiễm đƣợc Walter Flemming quan sát vào năm 1789 sau Strasburger mô tả tỉ mỉ đặt tên cho giai đoạn phân bào vào năm 1884 Kết phân bào nguyên nhiễm tạo tế bào giống mặt di truyền Phân bào nguyên nhiễm trình phân chia tế bào xảy tế bào sinh dƣỡng tế bào vùng mô phân sinh Phân bào nguyên nhiễm đảm bảo cho hoạt động ổn định tế bào trình sinh trƣởng phát triển sinh vật Nó giúp gia tăng số lƣợng tế bào, giúp cho tăng trƣởng mô thay tế bào chết hay bị tổn thƣơng Đây sở cho sinh sản vơ tính Phân bào nguyên nhiễm trình phân chia tế bào đơn giản nhƣng xác qua phân chia xác vật liệu di truyền (nhiễm sắc thể) Vì đãm bảo số nhiễm sắc thể đặc trƣng tính ổn định mặt di truyền loài Phân bào nguyên nhiễm xảy qua bốn giai đoạn nhƣ sau Tiền kỳ ( Prophase): Vào đầu tiền kỳ, nhiễm sắc thể xuất tế bào dƣới dạng sợi mãnh nằm rãi rác nhân bắt đầu co xoắn lại cuối tiền kỳ Lúc màng nhân hạch nhân cịn quan sát đƣợc Thoi vơ sắc dần đƣợc hình thành nối liền với hai cực tế bào Các sợi tơ vô sắc proten sợi trạng thái gel co dãn đƣợc Ở tế bào động vật, có xuất trung thể Cuối tiền kỳ, nhiễm sắc thể đạt trạng thái xoắn cực đại thể hình dạng đặc trƣng nhiễm sắc thể loài Mỗi nhiễm sắc thể gồm hai nhiễm sắc tử dính tâm động Cuối tiền kỳ màng nhân hạch nhân tiêu biến Đầu tiền kỳ Tiền kỳ Tiến kỳ Chung kỳ Biến kỳ Hình 1.6 Các giai đoạn trình phân bào nguyên nhiễm tế bào chóp rễ hành Biến kỳ ( Metaphase): Nhiễm sắc thể tập trung lại tế bào Mỗi tâm động đính sợi tơ vơ sắc tạo thành mặt phẳng gọi mặt phẳng xích đạo hay mặt phẳng biến kỳ Mặt phẳng xích đạo vng góc với thoi vô sắc Các nhiễm sắc tử nằm hƣớng theo sợi tơ vơ sắc phía hai cực tế bào Ở biến kỳ, nhiễm sắc thể đƣợc đếm dễ dàng khảo sát hình thái nhƣ cấu trúc chúng Tiến kỳ ( Anaphase): Đầu tiến kỳ, tâm động nhiễm sắc thể kép bắt đầu tách nhiễm sắc thể phân ly nhờ vào co giãn sợi tơ vô sắc Mỗi nhiễm sắc tử (nhiễm sắc thể đơn) cực tế bào Vào cuối tiến kỳ, cực tế bào chứa số nhiễm sắc thể có gian kỳ dƣới dạng nhiễm sắc thể đơn Chung kỳ ( Telophase): Vào đầu chung kỳ phân chia nhân (nhiễm sắc thể) kết thúc bắt đầu phân chia tế bào chất hình thành tế bào Nhiễm sắc thể tháo xoắn trở lại dạng sợi mãnh Thoi vô sắc tiêu biến Màng nhân hạch nhân xuất trở lại Cuối giai đoạn nhiễm sắc thể khơng thể nhận thấy dƣới kính hiển vi quang học Eo thắt tế bào động vật Vách ngăn tế bào thực vật Các túi hình Vách Vách thành vách tế bào tế bào Vách tế bào mẹ Eo thắt Các vi sợi co rút Tế bào Tế bào Hình 1.7 Giai đoạn chung kỳ phân bào nguyên nhiễm Có khác trình phân chia thành tế bào tế bào thực vật động vật Ở thực vật, có xuất vách ngăn tế bào từ phía tế bào phía ngồi màng tế bào xung quanh Ở động vật, có xuất eo thắt tế bào từ phía bên ngồi tế bào thắt vào phía tâm tế bào Vách ngăn tế bào eo thắt tế bào vị trí mặt phẳng xích đạo giai đoạn biến kỳ Vì vậy, mặt lý thuyết 10 KIỂM ĐỊNH CHI BÌNH PHƢƠNG χ2: Kiểm định χ2 thƣờng đƣợc áp dụng để đánh giá mức độ phù hợp tỉ lệ quan sát tỉ lệ lý thuyết Đây phƣơng pháp lƣợng hóa độ lệch giá trị quan sát thực tế với giá trị lý thuyết mong muốn Có loại kiểm định 2 đƣợc áp dụng nghiên cứu di truyền học kiểm định phù hợp, kiểm định đồng kiểm định độc lập 5.1 KIỂM ĐỊNH χ2 PHÙ HỢP: Mục đích kiểm định χ2 phù hợp kiểm định phù hợp tỉ lệ dự đoán (lý thuyết) với tỉ lệ thực tế (quan sát) Thí dụ nhƣ tổ hợp lai hoa Cẩm chƣớng màu tím thu đƣợc 35 hoa đỏ, 62 hoa tím 23 hoa trắng Kết cho thấy tính trạng màu hoa trội khơng hoàn toàn Nhƣ vậy, tỉ lệ lý thuyết phải tƣơng đƣơng 25% hoa đỏ : 50% hoa tím : 25% hoa trắng (tức 30 hoa đỏ : 60 hoa tím : 30 hoa trắng) Trong trƣờng hợp kiểm định χ2 đƣợc áp dụng Kết quan sát đƣợc so sánh với kết giả thuyết đặt Đó giả thuyết H0 (null hypothesis) Giả thuyết H0 giả thuyết số liệu quan sát lệch cách không ý nghĩa với số liệu giả thuyết hay tỉ lệ quan sát phù hợp với tỉ lệ lý thuyết Vì vậy, vấn đề đƣợc đặt số liệu thu đƣợc có tƣơng đƣơng với tỉ lệ lý thuyết hay khơng sai số ngẫu nhiên Nếu số liệu thực tế tƣơng đƣơng với số liệu lý thuyết giả thuyết H0 đƣợc chấp nhận, ngƣợc lại giả thuyết H0 bị bác bỏ Kiểm định χ2 phù hợp kiểm tra mặt thống kê cho biết xác suất mà khác biệt kết quan sát đƣợc ngẫu nhiên giả thuyết H0 Tuy nhiên nên nhớ giả thuyết H0 đƣợc chấp nhận tỉ lệ thực tế khơng giống xác nhƣ tỉ lệ lý thuyết Nếu thí nghiệm tỉ lệ phân ly kiểu hình 1:1 có kết 52 hoa đỏ : 48 hoa trắng 60 hoa đỏ : 40 hoa trắng, so sánh số liệu rõ ràng kết thí nghiệm độ lệch so với lý thuyết nhỏ kết thí nghiệm sau Tuy nhiên, thí nghiệm dẫn đến giả thuyết H0 cho tỉ lệ 1:1 đƣợc chấp nhận, khác mức độ tin cậy thí nghiệm cao Nếu độ lệch thực tế lý thuyết lớn dẫn đến giả thuyết H0 bị bác bỏ Nhƣ vậy, trƣờng hợp giả thuyết đúng, tất độ lệch đƣa đến xác suất khác giả thuyết bị bác bỏ? Chính so sánh, có qui ƣớc khoa học chung có xác suất 5% số độ lệch quan sát đƣợc dẫn đến bác bỏ giả thuyết H0 Điều có nghĩa chấp nhận có khoảng 5% trƣờng hợp sai lầm số liệu (hay độ lệch) Do đó, để đánh giá H0 ngƣời ta sử dụng giá trị χ2 mức ý nghĩa 5% bảng giá trị χ2 làm điểm mốc (χ2bảng, 2 df, 5%) so sánh giá trị χ tính với giá trị χ bảng Trong số thí nghiệm đặc thù số mức 1% * Trình tự thực phép kiểm định Chi bình phương χ2 sau: - Đặt giả thuyết cần kiểm định (H0) - Tính giá trị χ2 thực tế (χ2tính) độ tự (df) - Tra bảng phân phối χ2 độ tự tƣơng ứng để xác định χ2 lý thuyết (χ2bảng, df, 5%) - So sánh χ2tính χ2bảng, df, 5% - Kết luận giả thuyết H0 28 Kiểm định χ2 khẳng định khả tin cậy (thông qua xác suất hay độ tin cậy) kết luận giả thuyết Đối với phép kiểm định χ2 phải đặt đƣợc giả thuyết H0 trƣớc kiểm định tức phải xác định đƣợc tỉ lệ lý thuyết dựa quy luật Trong nghiên cứu di truyền có loại tỉ lệ lý thuyết nhƣ tỉ lệ phân ly giao tử, tỉ lệ phân ly kiểu hình, tỉ lệ phân ly kiểu gen kiểu giao phối khác Kiểm định giả thuyết H0: “Tỉ lệ quan sát không khác biệt (khác biệt không đáng kể hay tƣơng đƣơng) so với tỉ lệ dự đoán (tỉ lệ lý thuyết)” Khi so sánh χ2tính χ2bảng, df, 5% : - Nếu χ2tính ≤ χ2bảng, df, 5% H0 đƣợc chấp nhận - Nếu χ2tính > χ2bảng, df, 5% H0 bị bác bỏ * Cơng thức tính χ2: (| Oi  Ei |)   Ei Với: O số quan sát, E số lý thuyết Chú ý giá trị χ2 tính dựa số liệu gốc không sử dụng số tỉ lệ hay tần số * Độ tự df: giá trị số lƣợng loại (kiểu) quan sát độc lập thí nghiệm Độ tự đƣợc tính nhƣ sau: Độ tự df = {Số kiểu giao tử (kiểu hình, kiểu gen) quan sát} - Độ tự cho biết có loại số liệu thay đổi tùy ý Thí dụ thí nghiệm lai đơn tính màu hoa đậu Hồ lan Mendel, có loại số liệu màu tím trắng Nếu đếm hết số hoa tím cịn lại hoa trắng số liệu cố định Nhƣ vậy, độ tự * Hệ số hiệu chỉnh Yates : Bởi χ2 hàm phân phối liên tục, để giảm thấp sai số xảy kiểm định χ2 với cở mẫu (số lƣợng cá thể) nhỏ, hệ số hiệu chỉnh Yates (½ hay 0,5) đƣợc sử dụng Cơng thức tính χ2 đƣợc hiệu chỉnh nhƣ sau: (| Oi  Ei |  0,5)   Ei Qui định “mẫu nhỏ” khác tùy thuộc đặc điểm thí nghiệm cụ thể Trong thí nghiệm mơ thực hành này, cở mẫu nhỏ đƣợc qui định là: số lƣợng cá thể (số lƣợng mẫu) N ≤ 100 độ tự df = * Ví dụ : Lai dịng có hoa vàng có hoa đỏ Ở hệ F1 tất có hoa màu cam Khi cho F1 tự thụ, hệ F2 thu đƣợc 182 có hoa màu cam, 61 có hoa màu vàng 77 có hoa màu đỏ 29 Hãy kiểm định tỉ lệ phân ly kiểu hình màu hoa hệ F2 P: Hoa vàng x Hoa đỏ F1 : Hoa cam F2 : 61 hoa vàng : 182 hoa cam : 77 hoa đỏ Với xuất màu hoa cam hệ F1 kết phân ly màu hoa hệ F2 thí nghiệm này, kiểm định giả thuyết tỉ lệ phân ly tƣơng quan di truyền nhƣ sau Giả thuyết 1: tính trạng màu hoa tƣơng quan trội khơng hồn tồn với tỉ lệ phân ly hệ F2 vàng : cam : đỏ H0: Tỉ lệ phân ly kiểu hình màu hoa thể hệ F2 tƣơng đƣơng hoa vàng : hoa cam : hoa đỏ Vàng 61 80 19 361 4,5 Cam 182 160 22 484 3,0 Đỏ 77 80 0,1 Tổng 320 320 Số quan sát (O) Số lý thuyết (E) (O - E) ((O - E))2 7,6 ((O - E))2/E Độ tự df = - = Kết quả: 2 tính, df=2 = 7,6 > 2 bảng, df=2, 5% = 5,99 Kết luận: Bác bỏ giả thuyết H0 Nhƣ vậy, tỉ lệ phân ly kiểu hình hệ F2 thí nghiệm khơng tn theo tỉ lệ vàng : cam : đỏ Giả thuyết 2: tính trạng màu hoa có tƣơng tác át chế lặn với tỉ lệ phân ly hệ F2 cam : vàng : đỏ H0: Tỉ lệ phân ly kiểu hình màu hoa thể hệ F2 tƣơng đƣơng hoa cam : hoa vàng : hoa đỏ Cam 182 180 0,02 Vàng 61 60 1 0,02 Đỏ 77 80 0,11 Tổng 320 320 Số quan sát (O) Số lý thuyết (E) (O - E) ((O - E))2 0,15 ((O - E))2/E Độ tự df = - = Kết quả: 2 tính, df=2 = 0,15 < 2 bảng, df=2, 5% = 5,99 Kết luận: Chấp nhận giả thuyết H0 với độ tin cậy 90%