Nghiên cứuphân lập các hợp chất hữu cơ chiết xuất từ dịch của lá cây Mâm xôi = RUBUS ALCEAEFOLIUS POIR

Trường ĐHSP Hà Nội Cao Thanh Tùng Khóa luận tốt nghiệp K32B - Hóa học trường đại học sư phạm hà nội khoa hoá học cao tùng nghiên cứu Phân lập hợp chất hữu chiết xuất từ dịch mâm xôi (rubus alceaefolius Poir) khoá luận tốt nghiệp đại học chuyên ngành : hoá hữu Hà Nội - 2010 trường đại học sư phạm hà nội khoa hoá học cao tùng nghiên cứu Phân lập hợp chất hữu chiết xuất từ dịch mâm xôi (rubus alceaefolius Poir) khoá luận tốt nghiệp đại học chuyên ngành : hoá hữu Người hướng dẫn khoa học TS Nguyễn văn Hà Nội - 2010 mục lục Trang Lời cảm ơn Lời cam đoan Danh muc chữ viết tắt danh mục hình vẽ danh mục bảng biểu sơ đồ mở đầu chương tổng quan I.1.Tổng quan Mâm xôi I.1.1 Thực vật học .4 I.1.2 Phân bố, sinh thái .5 I.1.3 Công dụng I.1.4 Thành phần hoá học 1.2 Vài nét lignan I.2.1 Đại cương phân loại I.2.2 Các dẫn xuất quan trọng Lignan 10 I.2.3 Tổng hợp Lignan 12 Chương II đối tượng phương pháp nghiên cứu 21 II.1 Mẫu thực vật 21 II.2 Phương pháp phân lập hợp chất 21 II.2.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC) 21 II.2.2 Sắc ký lớp mỏng điều chế .21 II.2.3 Sắc ký cột (CC) .21 II.3 Phương pháp xác định cấu trúc hố học hợp chất 22 II.3.1 Điểm nóng chảy (Mp) .22 II.3.2 Phổ khối lượng (ESI-MS) 22 II.3.3 Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR) .22 Chương III Thực nghiệm kết 23 III.1 Thu mẫu thực vật xử lý mẫu 23 III.2 Phân lập hợp chất 23 III.3 Hằng số vật lý kiện phổ hợp chất .25 Chương IV Thảo luận 26 IV.1 Hợp chất RA21.6 26 (Axít-3-O-methylellagic7- -D-Rhamnopyranoside) (7) IV.2 Hợp chất RA13.3 (Icariside E4) (2) .32 v kết luận Tài liệu tham khảo mở đầu Việt Nam nằm vùng lục điạ Đông Nam thuộc khu vực nhiệt đới hệ thực vật Việt Nam vô phong phú, đa dạng, đặc biệt tài nguyên rừng Rừng Việt Nam có thảm thực vật phong phú vào loại bậc giới với khoảng 12000 lồi, có 4000 lồi [1] nhân dân ta dùng làm thảo dược Đây thực tài sản vô quý báu mà thiên nhiên ban tặng cho đất nước ta Ngoài giá trị to lớn kinh tế mà thực vật đem lại, có ý nghĩa vô quan trọng việc cải tạo môi trường đất, nước khơng khí Những năm gần với phát triển số ngành khoa học công nghệ sinh học, công nghệ gen làm tăng thêm khơng số lượng mà làm tăng thêm giá trị mà thực vật đóng góp cho kinh tế đất nước với phát nhiều chất có hoạt tính sinh học cao nguồn gốc tự nhiên, nhà khoa học lại đầu việc tạo loại thuốc đặc trị giúp điều trị bệnh hiểm nghèo cho người, cải thiện chất lượng sống kéo dài tuổi thọ Cây mâm xôi (Rubus alceaefolius ) thuộc họ Hoa hồng hay có tên gọi khác đùm đũm loài sử dụng từ lâu dân gian làm thuốc chữa bệnh Quả mâm xơi chữa bệnh đường tiêu hố, đau thận, tinh ứ, liệt dương đái són hoạt tinh Cành rễ dùng chữa viêm gan cấp mãn tính, viêm loét miệng, dùng cho phụ nữ sinh đẻ uống làm thơng máu, tiêu cơm Cây sử dụng làm trà uống giúp nhiệt lợi tiểu Theo nghiên cứu nhà nghiên cứu thuộc trường đại học Kentucky (ohio- Hoa Kỳ) trái mâm xơi đen ngăn chặn khối u phát triển trường hợp ung thư miệng Chỉ cho thấy tầm quan trọng Mâm xôi việc chữa trị số bệnh thường gặp người Tuy nhiên chưa có tài liệu thức xác định thành phần hợp chất hữu có chứa dịch mâm xôi Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn mà tơi chọn đề tài khóa luận tốt nghiệp là: " Nghiên cứu phân lập hợp chất hữu chiết xuất từ dịch mâm xơi " Việc nghiên cứu tìm hiểu nhằm tìm chất giúp tăng thêm giá trị mâm xơi đời sống Nhiệm vụ khóa luận Phân lập số hợp chất từ dịch chiết nước mâm xôi Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập Chương Tổng Quan 1.1 Giới thiệu mâm xôi 1.1.1 Thực vật học Cây Mâm xôi hay gọi đùm đũm có tên khoa học Rubus alceaefolius Poir., thuộc họ Hoa hồng - Rosaceae Đây lồi bụi nhỏ, thân leo có gai to dẹt Cành mọc vươn dài, có nhiều lơng Lá đơn, mọc so le, hình bầu dục, hình trứng gần tròn, chia thùy nơng, khơng đều, gân chân vịt, mép khía răng, mặt màu lục sẫm phủ lơng lởm chởm, mặt có nhiều lơng mềm, mịn màu trắng xỉn; cuống dài có gai; kèm sớm rụng Cụm hoa mọc kẽ đầu cành thành chùm ngắn; bắc giống kèm, hoa màu trắng; cánh hoa 5, mỏng hình tròn, nhị nhiều thường dài cánh hoa, nhị dẹt, nỗn nhiều Quả hình cầu, gồm nhiều hạch tụ họp lại dáng mâm xơi, chín màu đỏ tươi, ăn Cây hoa tháng 2-3, tháng 5-7 [1, 2] Hình 1.1.1 Cây mâm xơi Rubus alceaefolius Poir 1.1.2 Phân bố, sinh thái Theo Đỗ Huy Bích cộng [1], giới chi Rubus có khoảng 400 lồi, hầu hết bụi, mọc thẳng hay bụi trườn, phân bố chủ yếu vùng ôn đới, cận nhiệt đới vùng nhiệt đới Bắc bán cầu Một vài loài trồng lấy Việt Nam, chi có 51 lồi, thứ, mâm xơi lồi phân bố tương đối rộng rãi khắp tỉnh vùng núi thấp, trung du đồng Cây ưa sáng ẩm, thường mọc trùm lên bụi leo khác ven rừng ẩm, rừng núi đá vôi, đồi, trảng bụi ưa sáng đất sau nương rẫy vùng đồng bằng, mâm xôi mọc lẫn lùm bụi quanh làng, hai bên đường Cây sinh trưởng, phát triển nhanh Những bị chặt phá hoa nhiều hàng năm Cây có khả tái sinh mạnh sau bị chặt phá 1.1.3 Công dụng Lá, cành rễ mâm xơi có vị nhạt, tính bình, có tác dụng nhiệt, tán ứ, tiêu viêm, huyết, kích thích tiêu hóa, giúp ăn ngon miệng Cành phơi khô, nấu nước uống thay chè, dùng cho phụ nữ sau đẻ sức người ăn khơng tiêu, đầy bụng Ngồi cành mâm xơi dùng phối hợp với Mộc thơng, Ơ rơ để chữa viêm tuyến vú, viêm gan cấp mạn tính Quả có vị ngọt, tính bình, dùng thay vị Phúc bồn tử y học cổ truyền, có tác dụng bổ gan thận, giữ tinh khí, làm tráng dương, mạnh sức Quả dùng chữa thận hư, liệt dương, di tinh, đái són, đái buốt [1, 2] ấn Độ người ta dùng mâm xôi làm thuốc chữa bệnh đái dầm trẻ em Nước sắc vỏ thân dùng làm thuốc điều kinh, chữa tiêu chảy Trung Quốc, mâm xôi sử dụng y học cổ truyền để chữa albumin niệu, viêm tuyến vú viêm gan mạn tính số vùng Trung Quốc, sử dụng để chữa số bệnh ung thư định Theo kết nghiên cứu Cui C -B cộng sự, rễ mâm xôi thể hoạt tính ức chế mạnh chu kỳ tế bào pha G0/G1 dòng tế bào tsFT210 (Chu kỳ tế bào, đường để tế bào sinh sôi, q trình sinh học kiểm sốt chặt chẽ thực tế ung thư tăng sinh vô hạn độ không mong muốn tế bào ung thư với thối hóa chu kỳ tế bào Do đó, chất ức chế chu kỳ tế bào có khả tiềm tàng điều trị ung thư) [5] 1.1.4 Thành phần hoá học Theo sách thuốc Việt Nam [1, 2], Mâm xôi chứa axit hữu (chủ yếu axit citric, malic, salycilic), đường, pectin Lá chứa tanin Tuy nhiên, cơng trình nghiên cứu cơng bố lồi Rubus alceaefolius Mới có nhà khoa học Trung Quốc nghiên cứu loài nghiên cứu thuốc mọc Trung Quốc Còn Việt Nam hồn tồn chưa có nghiên cứu thuốc quí Theo tra cứu chúng tôi, từ R alceaefolius mọc Trung Quốc, năm 1998 Gan L đồng nghiệp phân lập được: axit corosolic (1), axit tormentic (2), niga-inchigoside F1 (3), trachelosperoside E-1 (4) suavissimoside R1 (5) [4] Năm 2000, Gan L đồng nghiệp lại công bố phân lập alcesefoliside (6), hyperoside (7), vomifoliol (8), õ-sitosterol (9), daucosterol (10) dotriacontyl alcohol (11) [5] Năm 2002, nhóm nghiên cứu Cui C -B cơng bố phân lập rubuphenol (12) sanguiin H-2 ethyl ester (13), axit ellagic (14), ethyl gallate (15), 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-õ-Dglucopyranose (16) 1,2,3,6-tetra-O-galloyl-õ-D-glucopyranose (17) [3] Dưới dẫn cấu trúc số hợp chất phân lập từ loài R alceaefolius C a a,c C 111,45 (d) H (J, Hz) 7,49 (1H, s) 3a 3b 5a 5b 152,60 (s) 140,03 (s) 141,66 (s) 111,15 (s) 158,56 (s) 107,07 (s) 114,11 (s) 111,45 (d) 146,38 (s) 141,11 (s) - 8a 10 10a 1’ 136,00 (s) 158,52 (s) 112,84 (s) 100,10 (d) 5,50 (1H, d, 1,5 Hz) 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ OCH3 8-OH 2-OH 69,91 (d) 70,55 (d) 71,76 (d) 69,84 (d) 17,83 (q) 60,88 (q) 3,55 (1H, m) 3,87 (1H, br d, 8,5) 3,33 (1H*) 4,04 (1H, br d) 1,45 (3H, d, 6,5) 4,05 (3H, s) 11,01 (1H, br s) 10,87 (1H, br s) a,b b 7,72 (1H, s) - c Đo DMSO, 500MHz, 125MHz Trên phổ 13 C-NMR tín hiệu hai nhóm este nội vòng 158,52 158,56 điển hình cho hợp chất có khung axit ellagic [6,7] Thơng thường nhóm cacbonyl este nội vòng có độ dịch chuyển hoá học cao (từ 168-172 ppm), tức tín hiệu tương ứng cộng hưởng vùng trường thấp Để xác định xác cấu trúc phân tử (1), phổ hai chiều đo bao gồm phổ HSQC HMBC Dựa vào phổ HSQC, liên kết H-C trực tiếp xác định Trên phổ HMBC, tương tác H-C chủ yếu mơ tả Hình 3.4.1.e Phân tử đường xác định nối với C-4 nhờ tương tác HMBC H-2” (5,50) với C-4 (146,38) Tương tác HMBC proton methoxyl 4,05 với C-3’ (140,03) khẳng định nhóm methoxyl nối với C-3’ Ngồi ra, xuất hai tín hiệu hai proton hai nhóm hydroxyl 11,01 10,87 chứng tỏ phân tử hai nhóm hydroxyl Những phân tích nêu cho ta công thức cộng C21H18O12 ( 1) Kết lại kiểm tra phổ khối lượng Trên phổ khối lượng phun mù điện tử ESI-MS, xuất píc m/z 463 [M+H] + hồn tồn phù hợp với công thức phân tử C21H18O12 (1) Như vậy, hợp chất (1) xác định axit 3-O-methylellagic 7--D- Rhamnopyranoside, hợp chất lần đầu phân lập từ mâm xôi O 1'' O O '' 5'' 3'' O 3' 2' OH 1' OH 2'' H C OCH3 10 HO 7' O O 4'' HO OH Hình 3.4.1.f Một số tương tác phổ HMBC (1) Hình 3.4.1.g Phổ ESI-MS ( 1) Hình 3.4.1.h Phổ HMBC của( 1) 3.4.2 Hợp chất RA13-3 (Icariside E4) (2) Hợp chất (2) nhận dạng chất bột không màu Các phổ NMR (2) có dạng phổ hợp chất liglan-glycozit Trên phổ H-NMR xuất tín hiệu proton vòng thơm 7,04, 7,10, 6,94, 6,75, 6,74 Phân tử đường rhamnozơ xác định tín hiệu H-1” 5,35 (d, J = 1,5 Hz), 3,90, 4,08, 3,47 3,83 (4H) tín hiệu H-6” 1,23 (d, J = 6,5 Hz) Hai nhóm metoxi 3,82 3,88 Ngồi có hai nhóm oximetylen 3,58 (2H, t, J = 2,5 Hz) 3,91 (1H)/3,74 (1H), proton gắn với nhóm oximetin 5,58 (1H, d, J = 6,0 Hz) Hình 3.4.2.a Phổ 1H-NMR (2) OH O 1" O 6" H3 C 5" OH 2" H3CO 6' 5' O 4' 1' 3' 9' CH2OH 7' 8' 2' H3CO 3" OH 4" OH Hình 3.4.2.b Cấu trúc hố học (2) Hình 3.4.2.c Phổ 13C-NMR (2) Bảng 3.4.2 Kết phổ NMR ( 2) C 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 7’ 8’ 9’ 1” 2” 3” 4” 5” 6” 3-OCH3 3’-OCH3 C* [8] Pyridin-d5 138,0 (s) 111,3 (d) C (125 MHz) MeOD-d 138,82 (s)4 111,31 (d) 147,3 (s) 151,4 (s) 119,0 (d) 119,0 (d) 88,0 (d) 55,2 (d) 64,5 (t) 152,12 (s) 146,58 (s) 119,61 (d) 119,12 (d) 88,54 (d) 55,63 (d) 65,09 (t) 129,9 (s) 113,9 (d) 144,7 (s) 146,4 (s) 137,09 (s) 114,21 (d) 145,23 (s) 147,49 (s) 136,4 (s) 117,6 (d) 32,7 (t) 36,0 (t) 61,5 (t) 101,6 (d) 72,7 (d) 72,1 (d) 73,8 (d) 71,0 (d) 18,6 (q) 56,0 (q) 56,4 (q) 129,62 (s) 117,94 (d) 32,88 (t) 35,78 (t) 62,22 (t) 101,40 (d) 72,20 (d) 72,04 (d) 73,83 (d) 70,82 (d) 17,93 (q) 56,47 (q) 56,80 (q) H (500 MHz; J, Hz) MeOD-d4 7,04 (1H, d, 2,0) 7,10 (1H, d, 8,0) 6,94 (1H, dd, 8,0, 2,0) 5,58 (1H, d, 6,0) 3,44 (1H, m) 3,91 (dd*)/3,74 (dd*) 6,75 (1H, br s) 6,74 (1H, br s) 2,64 (2H, t, 8,0) 1,83 (2H, m) 3,58 (2H, t, 2,5) 5,35 (1H, d, 1,5) 3,90 (1H, m*) 4,08 (1H, m*) 3,47 (1H, m*) 3,83 (1H, m) 1,23 (3H, d, 6,5) 3,82 (3H, s) 3,88 (3H, s) *C Icariside E4 [8], Cao Thanh Tùng 50 K32B - Hóa học OH 9' CH2OH 5' 1' O 1" O OH O 4' 3' H3CO H3CO OH OH H3C Hình 3.4.2.d Các tương tác phổ HMBC (2) Trên phổ 13 C-NMR xuất tín hiệu 26 cacbon, có 12 cabon thuộc vào hai vòng thơm 152,12 (s), 147,49 (s), 146,58 (s), 145,23 (s), 138,82 (s), 137,09 (s), 129,62, 119,61 (d), 119,12 (d), 117,94, 114,21 (d), (s), (d) 111,31 (d), hai nhóm metoxi 56,47 56,80, hai nhóm oximetylen 62,22 65,09, cacbon CH nối với oxi 88,54 Ngồi có tín hiệu phân tử đường rhamnozơ 101,40, 72,20, 72,04, 73,83, 70,82 17,93 Những phân tích chi tiết phổ NMR cho thấy cơng thức phân tử dự đốn (2) C26H34O10 với khối lượng phân tử 506 Kết dự đoán kiểm chứng xuất pic ion m/z 529 [M+Na] + phổ ESI-MS (positive) Ngoài phổ hai chiều HSQC HMBC thực để xác định xác cấu trúc phân tử (2) Với kiện phổ nêu trên, hợp chất (2) dự đoán Icariside E4, liglan-glycozit [8] Hỡnh 3.4.2.e Phổ ESI-MS ( 2) Tuy nhiên so sánh giá trị phổ (2) với Icariside E4 (Bảng 3.4.2) kiểm tra tương tác phổ hai chiều HSQC HMBC thấy số vị trí cần phải gán lại giá trị độ dịch chuyển hoá học Các tương tác chi tiết phổ HMBC mô tả Hình 3.4.2.d, tương tác H-8’ với C-1’ (137,09) với tương tác H-7’ với C- 1’/C-6’ tương tác H-8 với C-4’ C-5’ (129,62) chứng tỏ hai giá trị 137,09 129,62 phải gán tương ứng cho C-1’ C-5’ Cũng tương tự vậy, tương tác H-1” phân tử đường tương tác HMBC với C-4 ( 146,58) tương tác proton metoxi 3,82 với cacbon C-3 (152,12) chứng tỏ hai vị trí phải gán lại độ dịch chuyển hoá học Từ kết phổ nêu trên, hợp chất (2) xác định Icariside E4 Tuy nhiên giá trị độ dịch chuyển hoá học hợp chất xác định lại cách xác Đây lần hợp chất Icariside E4 (2) phân lập từ mâm xơi Hình 3.4.2.f Phổ HSQC (2) Hình 3.4.2.g Phổ HMBC (2) Hình 3.4.2.h Phổ HMBC dãn rộng ( 2) Hình 3.4.2.i Phổ HMBC dãn rộng ( 2) Kết luận Đã thu thập mẫu lượng lớn mâm xơi lồi TS Trần Huy Thái (Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật) xác định Rubus alceaefolius Poir (Rosaceae) Bằng phương pháp sắc ký kết hợp, hợp chất phân lập từ dịch chiết nước mâm xôi (Rubus alceaefolius poir) Các hợp chất là: - 3-O-methylellagic 7--D-Rhamnopyranoside (1) - Icariside E4 (2) Cấu trúc hợp chất xác định nhờ vào phương 13 pháp phổ đại phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều ( H-NMR, CNMR, DEPT 135 DEPT 90), hai chiều (HSQC, HMBC), Phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI) Cấu trúc hóa học ( 1) (2) O O HO 8a O O OH H3 C 4' 3a 5a 2' ' OH 3b 5' 10a 5b 1' 10 3' OCH3 O O HO OH 3-O-methylellagic 7--D-Rhamnopyranoside (1) OH O 6" H3 C 2" 5" 3' OH O 4' H3CO H3CO 3" OH 4" OH Icariside E4 (2) 9' CH2OH 7' 1' O 1" 6' 5' 2' 8' Tài liệu tham khảo Tài liệu tiếng Việt Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập Trần Toàn (2004) Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam (tập I), Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, tr 827-828 Võ Văn Chi(1997), Từ điển Cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học Hà Nội, tr 728 Tài liệu tiếng Anh Cui C -B., Zhao Q., Cai B., Yao X and Ossadsa H, (2002) Two new and four known polyphenolics obtained as new cell-cycle inhibitors from Rubus aleaefolius Poir, Journal of Asian Natural Products Research, Vol 4(4), pp 243–252 Gan L., Zhao Y., Zhang J., and Jiang F(1998) Isolation and identification of triterpenoids from Rubus alceaefolius Poir, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, Vol 23(6), pp 361-362 Gan L., Wang B., Liang H., Zhao Y, and Jiang F(2000), Chemical constituents from Rubus alceaefolius Poir., Journal of Beijing Medical University, Vol 32(3), pp 226-228 Yoshikazu Y and Edwin W H.(1976)., Polyphenols of Eucalyptus globulus, E regnans and E deglupta, Phytochemistry, Vol 15(7), pp 1180-1182 Duc D K., Sung T V., Angela M C., Jean Y L and Marcel F.(1990), Ellagic acid compounds from Diplopanax stachyanthus, Phytochemistry, Vol 29(1), pp 251-256 Toshio M., Akira U., Nobuo T., Hiromi K and Hiroko O.(1989), Ionone and lignan glycosides from Epimedium diphyllum, Phytochemistry, Vol 28(12), pp 3483-3485 ... " Nghiên cứu phân lập hợp chất hữu chiết xuất từ dịch mâm xơi " Việc nghiên cứu tìm hiểu nhằm tìm chất giúp tăng thêm giá trị mâm xôi đời sống Nhiệm vụ khóa luận Phân lập số hợp chất từ dịch chiết. .. hà nội khoa hoá học cao tùng nghiên cứu Phân lập hợp chất hữu chiết xuất từ dịch mâm xơi (rubus alceaefolius Poir) khố luận tốt nghiệp đại học chuyên ngành : hoá hữu Người hướng dẫn khoa học... hà nội khoa hoá học cao tùng nghiên cứu Phân lập hợp chất hữu chiết xuất từ dịch mâm xơi (rubus alceaefolius Poir) khố luận tốt nghiệp đại học chuyên ngành : hoá hữu Hà Nội - 2010 trường đại