Nghiên cứu công nghệ sản xuất rượu Whisky từ malt đại mạch và nguyên liệu thay thế của Việt Nam (LV thạc sĩ)

Nghiên cứu công nghệ sản xuất rượu Whisky từ malt đại mạch và nguyên liệu thay thế của Việt Nam (LV thạc sĩ)Nghiên cứu công nghệ sản xuất rượu Whisky từ malt đại mạch và nguyên liệu thay thế của Việt Nam (LV thạc sĩ)Nghiên cứu công nghệ sản xuất rượu Whisky từ malt đại mạch và nguyên liệu thay thế của Việt Nam (LV thạc sĩ)Nghiên cứu công nghệ sản xuất rượu Whisky từ malt đại mạch và nguyên liệu thay thế của Việt Nam (LV thạc sĩ)Nghiên cứu công nghệ sản xuất rượu Whisky từ malt đại mạch và nguyên liệu thay thế của Việt Nam (LV thạc sĩ)Nghiên cứu công nghệ sản xuất rượu Whisky từ malt đại mạch và nguyên liệu thay thế của Việt Nam (LV thạc sĩ)Nghiên cứu công nghệ sản xuất rượu Whisky từ malt đại mạch và nguyên liệu thay thế của Việt Nam (LV thạc sĩ)Nghiên cứu công nghệ sản xuất rượu Whisky từ malt đại mạch và nguyên liệu thay thế của Việt Nam (LV thạc sĩ)Nghiên cứu công nghệ sản xuất rượu Whisky từ malt đại mạch và nguyên liệu thay thế của Việt Nam (LV thạc sĩ)Nghiên cứu công nghệ sản xuất rượu Whisky từ malt đại mạch và nguyên liệu thay thế của Việt Nam (LV thạc sĩ)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

- NGUYỄN XUÂN BÁCH

NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT

RƯỢU WHISKY TỪ MALT ĐẠI MẠCH VÀ

NGUYÊN LIỆU THAY THẾ Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

Giáo viên hướng dẫn 1: TS.Đặng Hồng Ánh

Giáo viên hướng dẫn 2: GVCC.TS Nguyễn Minh Hệ

Hà Nội - Năm 2016

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

ATVSTP : An toàn vệ sinh thực phẩm

CNTP : Công nghiệp thực phẩm

CFU : Số lượng tế bào (colony-forming unit)

FAN : Axit amin tự do (free amino nitrogen)

FAO : Tổ chức nông nghiệp và lương thực (Food and Agriculture Organization)

GC : Sắc ký khí (Gas Chromatography)

GC-MS : Sắc ký khí khối phổ (Gas Chromatography Mass Spectrometry)

HP : Mức độ nướng nhiều (heavy toased)

LP : Mức độ nướng nhẹ (light toasted)

MP : Mức độ nướng vừa (medium toasted)

OD : Mật độ quang (optical density)

UP : Không nướng (untoasted)

KPH : Không phát hiện

TCCL : Tiêu chuẩn chất lượng

TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Diện tích, năng suất và sản lượng lúa Việt Nam qua các năm 10

Bảng 1.3 Diện tích, năng suất, sản lượng ngô Việt Nam qua các năm 11

Bảng 2.1 Điểm tiêu chuẩn cho từng chỉ tiêu cảm quan c a sản phẩm 38

ản 3 Ảnh hưởng c a tỉ lệ giống nấm men tới chất lượng dịch lên men từ malt 45

ản 3 2 Ảnh hưởng c a tỉ lệ giống nấm men tới chất lượng dịch lên men từ gạo 45

ản 3 3 Ảnh hưởng c a tỉ lệ giống nấm men tới chất lượng dịch lên men từ ngô 46

ản 3 5 Hàm lượng các chất bay hơi trong quá trình chưng cất rượu Malt l n thứ hai 49

ản 3 6 Hàm lượng các chất bay hơi trong quá trình chưng cất rượu Gạo l n thứ hai 51

ản 3 7 Hàm lượng các chất bay hơi trong quá trình chưng cất rượu Ngô l n thứ hai 53

ản 3 8 Biến đổi màu rượu (OD 420nm) theo thời gian khi ngâm với các loại gỗ sồi có

ản 3 10 Biến đổi c a màu rượu (OD420nnm) theo thời gian khi ngâm gỗ sồi nướng

nhiều với các tỉ lệ khác nhau

61

ản 3.11 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hóa lý c a rượu Whisky sau 1 năm tàng tr 65

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1.Thị ph n c a rượu mạnh trên toàn thế giới năm 2009 7

Hình 1.2 Một số chất thơm được tạo thành trong quá trình rượu bằng thùng gỗ sồi 21

Hình 2.1 Đồ thị đường chuẩn glucose theo phương pháp Nelson - Somogi 30

Hình 2.2 Đồ thị đường chuẩn Albumin theo phương pháp Lowry 31

Hình 2.3 Đường chuẩn axit gallic theo phương pháp Singleton 36

Hình 3.1 Ảnh hưởng c a thời gian th y phân tới chất lượng dịch th y phân

nguyên liệu malt đại mạch

41

Hình 3.2 Ảnh hưởng c a nồng độ Termamyl và thời gian th y phân đến độ nhớt (cPs)

c a dịch đường hóa từ nguyên liệu gạo và ngô

42

Hình 3.3 Ảnh hưởng nồng độ Neutrase và thời gian đạm hóa đến lượng FAN thu

được trong dịch th y phân

43

Hình 3.4 Ảnh hưởng c a nồng độ Dextrozyme và thời gian th y phân

đến hàm lượng đường thu được

44

Hình 3.5 Động học c a quá trình lên men ở nhiệt độ 25°C khi sử dụng ch ng EC1118 46

Hình 3.6 Biến đổi hàm lượng polyphenol trong các mẫu Whisky theo thời gian khi

ngâm gỗ sồi với các mức độ nướng khác nhau

57

Hình 3.7 Kết quả cảm quan các mẫu rượu được ngâm chiết với phoi gỗ sồi có mức độ

nướng khác nhau

58

Hình 3.8 Biến đổi hàm lượng polyphenol trong các mẫu Whisky theo thời gian khi

ngâm gỗ sồi mức độ nướng ít với các tỉ lệ khác nhau

62

Hình 3.9 Biến đổi hàm lượng polyphenol trong các mẫu Whisky theo thời gian khi

ngâm gỗ sồi mức độ nướng nhiều với các tỉ lệ khác nhau

63

Hình 3.10 Kết quả cảm quan rượu Whisky khi ngâm gỗ sồi với các tỷ lệ khác nhau 64

Hình 3.11 Đánh giá thị hiếu các chỉ tiêu chất lượng với các mẫu Whisky 66

Hình 3.12 Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất Whisky từ malt đại mạch và nguyên

liệu thay thế c a Việt Nam

68

MỞ ĐẦU

Việt Nam là một nước có truyền thống sản xuất đồ uống từ cồn lâu đời đặc biệt

là các loại rượu cao độ đã được sử dung rộng rãi Hiện nay các loại rượu cao độ

được nhập khẩu vào nước ta với số lượng lớn đặc biệt là các loại rượu màu mà tiêu

biểu là rượu Whisky Rượu Whisky được sản xuất từ nguồn nguyên liệu là malt đại

mạch và các loại ngũ cốc khác Việt Nam hiện nay là nước sản xuất nông nghiệp

với các sản phẩm ngũ cốc dồi dào phong phú với tổng sản lượng gạo cả nước sản

xuất được đạt 43,7 triệu tấn, tiếp đến là ngô với tổng sản lượng đạt 4,97 triệu tấn (

theo tổng cục thống kê-2013) là nguồn nguyên liệu thích hợp, rẻ tiền cho sản xuất

rượu Whisky Vì vậy để sản xuất được loại rượu Whisky nội địa có chất lượng tốt,

giá thành phù hợp thì đề tài “Nghiên cứu công nghệ sản xuất rượu Whisky từ malt

đại mạch và nguyên liệu thay thế của Việt Nam” được thực hiện

Whisky là một dòng rượu nổi tiếng trên thế giới có lịch sử phát triển từ thế kỷ

15 và đã được sản xuất với số lượng lớn ở nhiều nước trên thế giới Mặc dù đã du

nhập và được ưa chuộng ở thị trường Việt Nam từ 20 năm nay tuy nhiên vẫn chưa

có một nghiên cứu bài bản nào về sản xuất rượu Whisky tại Việt Nam

Các thí nghiệm trong luận văn này tập trung vào xử lý, đánh giá các nguyên

liệu để sản xuất rượu Whisky bao gồm malt đại mạch, gạo, ngô, gỗ sồi trong các

khâu đoạn đường hóa, lên men, chưng cất, tàng tr và sản phẩm cuối Từ đó đưa ra

được quy trình sản xuất rượu Whisky cho từng loại nguyên liệu đ u vào và các mẫu

sản phẩm đạt chất lượng ở đ u ra

Nghiên cứu này sẽ là tiền đề cho các nghiên cứu chuyên sâu hơn về sản xuất

rượu Whisky tại Việt Nam và các kết quả nghiên cứu này là khời đ u cho việc sản

xuất rượu Whisky mang thương hiệu Việt

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

I.1 Giới thiệu về rượu Whisky [1,5, 7, 22]

Rượu Whisky là một loại rượu cao độ rất phổ biến trên thế giới với sức tiêu

thụ hàng năm lên đến hơn 3 tỷ lít/năm và được tiêu thụ ở hàng trăm nước trên thế

giới trong đó có Việt Nam Trong các loại rượu mạnh trên thế giới thì Whisky là

loại rượu phổ biến thứ hai (chiếm 12%) chỉ sau rượu trắng (chiếm 23%)

Hình 1.1.Thị ph n c a rượu mạnh trên toàn thế giới năm 2009

Nguồn gốc c a rượu Whisky bắt nguồn tại Scotland từ cuối thế kỷ 15 nhưng tồn

tại ở dạng thô không qua tàng tr và có mùi vị rất đậm và nặng Đến thế kỷ 17

Whisky được hoàn thiện d n về hương vị tương tự như hiện nay Sau cuộc di dân

vào Mỹ do khan hiếm nguồn nguyên liệu nên sản suất rượu Whisky từ 100% malt

đại mạch đã được thay thế bằng các loại ngũ cốc khác Hiện nay rượu Whisky được

sản xuất thành rất nhiều dòng sản phẩm khác nhau từ các nguồn nguyên liệu biệt

được phân loại như sau:

White spirits 23%

whisky 12%

Rhum 7%

brandy and cognac 6%

liqueurs 5%

tequila 1%

other spirits 46%

 Phân loại theo loại ngũ cốc:

- Malt: là loại Whisky được làm từ mạch nha

- Grain: là loại Whisky được sản xuất từ lúa mạch

- Rye: là loại Whisky ch yếu được sản xuất từ lúa mạch đen, ít nhất là 51%

- Bourbon: là loại Whisky ch yếu được sản xuất từ ngô, ít nhất 51% và được chưng

cất tối đa là 81%V và được tàng tr tối đa là 61%V

 Phân loại theo quy trình sản xuất:

Tên gọi một ph n cũng thể hiện rõ quy trình sản xuất c a từng loại Whisky:

- Single: là loại Whisky có nguồn gốc chỉ từ một lò nấu rượu riêng lẻ thường dùng

cho Whisky c a Scotland: Single-Malt-Whisky

- Straight: là loại Whisky có nguồn gốc chỉ từ một lò nấu rượu riêng lẻ thường dùng

cho Whiskey c a Mỹ

- Blend: là loại Whisky đã được pha trộn Trong lúc sản xuất nhiều loại Whisky khác

nhau từ nhiều lò nấu rượu khác nhau được pha vào với nhau Trong một số sản

phẩm có đến 70 loại Whisky khác nhau

- Pot Still: là loại Whisky được sản xuất chỉ dùng loại bình nấu cổ điển, thường dùng

cho một số loại Whisky c a Ireland

- Pure Pot Still: là loại Whisky được sản xuất chỉ dùng mạch nha trong các bình nấu

rượu cổ điển, thường dùng cho một số loại Whisky riêng lẻ c a Ireland

 Các cách phân loại khác:

- Cask strength (độ mạnh thùng):Sau khi được tr trong thùng người ta không cho

thêm nước vào whisky n a để đạt đến một nồng độ rượu nhất định Nồng độ rượu

c a nh ng loại whisky này khác nhau vì thay đổi tùy theo thời gian tr , điều kiện

môi trường, chất lượng c a thùng chứa và nồng độ rượu c a ph n cất nguyên th y

- Vintage (năm sản xuất): Loại whisky được sử dụng có nguồn gốc từ năm được ghi

chú

- Single cask (thùng riêng lẻ): Loại whisky này có nguồn gốc từ một thùng rượu riêng

lẻ (thường dùng cho Whisky c a Scotland) Single barel (thùng riêng lẻ): Loại

whisky này có nguồn gốc từ một thùng rượu riêng lẻ (thường dùng cho Whisky c a

Mỹ)

Các nước sản xuất rượu Whisky hàng đ u trên thế giới đều đưa ra các định nghĩa

riêng về Whisky tùy thuộc với dòng sản phẩm c a riêng họ với tên gọi như: Scotch,

Irish hay American Whisky, Canadian Whisky, Indian Whisky Tóm chung lại

rượu Whisky là sản phẩm rượu cao độ có nồng độ cồn từ 40% (thường từ 40-60%);

được lên men từ nguyên liệu là malt đại mạch và (hoặc) ngũ cốc; được đem trưng

cất từ 40-95% cồn; hương, vị được tách triết từ gỗ sồi; thời gian tàng tr từ 3 năm

trở lên

I.2 Giới thiệu về sản xuất rƣợu tại Việt Nam[3, 24]

Việt Nam là nước có truyền thống nông nghiệp và văn hóa uống rượu lâu

đời Rượu truyền thống ở Việt Nam là rượu trắng (thường là rượu cao độ) với rất

nhiều các tên tuổi nổi tiếng gắn liền với từng vùng miền như: rượu Làng Vân (Bắc

Giang), rượu ngô Thanh Vân (Hà Giang), rượu Mai Hạ (Hòa Bình), rượu Mẫu Sơn

(Lạng Sơn), rượu Sán Lùng (Lào Cai), rượu Bàu Đá (Bình Định), rượu Đế Bến Lức,

Gò Đen (Long An)…Tuy nhiên do quy mô sản suất mới dừng ở mức độ làng nghề,

thiết bị máy móc thô sơ, thiếu đ u tư khoa học kỹ thuật nên đến nay Việt Nam vẫn

chưa có sản phẩm rượu truyền thống nào thành thương hiệu quốc gia Rượu cao độ

ở Việt Nam ph n lớn là do dân sản xuất th công Theo số liệu báo cáo c a sở công

thương các tỉnh, tổng sản lượng rượu dân tự nấu đạt 242,412 triệu lít/năm Trong đó

loại rượu nấu ở các địa phương có truyền thống khoảng 82,412 triệu lít/năm Sản

lượng rượu dân tự nấu rải rác ở các địa phương còn lại không thống kê được, ước

còn khoảng 160 triệu lít Các nhà sản xuất rượu cao độ quy mô công nghiệp tại Việt

Nam ch yếu sản xuất rượu Vodka như: Công ty Cổ ph n Cồn Rượu Hà Nội, Công

ty Cổ ph n Cồn Rượu Bình Tây (Tp Hồ Chí Minh), Công ty Cổ ph n Bia Rượu

Đồng Xuân (Phú Thọ)… và một số thương hiệu rượu Vodka đang bắt đ u đi vào

được thị trường như rượu Vodka Men, Vodka Avinaa, Vodka Cá sấu… với tổng sản

lượng khoảng 70 triệu lít/ năm

Các loại rượu màu cao độ tại Việt Nam đều được nhập khẩu như Jonnie

Walker, Chivas, Jack Daniels Crown Royal, XO… với mức thuế cao (thuế nhập

khẩu 60%, thuế tiêu thụ đặc biệt 75% và thuế VAT 10%) đẩy giá thành lên rất cao

Ngoài ra việc sản xuất rượu giả tại Việt Nam vẫn chưa kiểm soát được (theo phòng

thị trường Hà Nội thống kê năm 2013, có tới 95% rượu ngoại trên thị trường là hàng

giả hoặc có xuất xứ không rõ ràng) Điều đó làm cho khả năng tiếp cận c a người

tiêu dùng với các sản phẩm rượu màu chất lượng trở nên thấp đi Hiện nay Việt

Nam cũng chưa có một công trình nghiên cứu nào về rượu Whisky được công bố

cũng như chưa có một tiêu chuẩn cụ thể cho rượu Whisky và cũng chưa có sản

phẩm rượu Whisky mang thương hiệu Việt Nam

I.3 Giới thiệu một số nguyên liệu thay thế để sản xuất Whisky ở Việt Nam

I.3.1 Gạo

Gạo là sản phẩm từ cây lúa.Cây lúa đã gắn bó và đi sâu vào còn người làng

quê Việt Nam Ở nước ta hai vùng trồng lúa nhiều nhất là đồng bằng sông Cửu

Long và đồng bằng sông Hồng Mặc dù diện tích ngày càng bị thu hẹp nhưng sản

lượng lúa nước ta vẫn liên tục tăng nhờ vào việc áp dụng các cải tiến khoa học kỹ

thuật, sử dụng các giống cây trồng mới cho năng suất cao Không chỉ đáp ứng nhu

c u trong nước mà còn xuất khẩu ra thị trường bên ngoài.Theo thống kế c a FAO

năm 2008, Việt Nam có sản lượng lúa đứng thứ 5 trên thế giới Trong nhiều năm

g n đây, Việt Nam đã trở thành nước xuất khẩu gạo đứng thứ 2 thế giới

Bảng 1.1 Diện tích, năng suất và sản lượng lúa Việt Nam qua các năm

(Nguồn: Niêm giám thống kê 2013, Tổng cục thống kê, Nhà xuất bản thống kê)

(nghìn ha)

Năng suất (tạ/ha)

Sản lƣợng (nghìn tấn)

Gạo không chỉ là lương thực chiếm 80% năng lương b a ăn cho người Việt

mà còn là nguyên liệu sản xuất nhiều đồ uống có cồn như rượu nếp nó có nhiều

giá trị dinh dưỡng

Bảng 1.2 Hàm lượng chất dinh dưỡng có trong hạt gạo

I.3.2 Ngô

Ở Việt Nam, ngô là loại cây lương thực quan trọng thứ hai sau lúa Có nhiều

loại ngô, thường được xếp vào các loại khác nhau về cả tính chất và công dụng như

ngô nếp (hạt màu trắng, dẻo hạt), ch yếu để ăn; ngô tẻ (hạt màu trắng hoặc vàng),

cứng nhưng sản lượng cao nên dùng làm thức ăn cho gia súc; ngô đường (hạt màu

vàng không đều), vị ngọt và ngô rau (bắp nhỏ, ít tinh bột) dùng để ăn

Bảng 1.3 Diện tích, năng suất, sản lượng ngô Việt Nam qua các năm

(Nguồn: Niên giám thống kê 2013, Tổng cục thống kê)

(1000 ha)

Năng suất (tạ/ha)

Sản lƣợng (1000 tấn)

Từ năm 2006, năng suất và sản lượng ngô c a Việt Nam đã có nh ng bước

tiến nhảy vọt cao nhất từ trước đến nay Tốc độ tăng trưởng diện tích, năng suất và

sản lượng ngô c a Việt Nam cao hơn nhiều l n c a thế giới, lợi nhuận trồng ngô lai

cao hơn hẳn các loại cây trồng khác Năm 2008, diện tích trồng ngô c a cả nước

(trong đó 90% diện tích là ngô lai) đạt 1140,2 nghìn ha, tổng sản lượng trên 4573

nghìn tấn Đến năm 2013, diện tích đạt 1172,5 nghìn ha, tổng sản lượng lên tới trên

5193 nghìn tấn, cao nhất từ trước tới nay Các giống ngô lai c a Việt Nam bước đ u

cũng đã xuất bán sang các nước Bangladesh, Cam-pu-chia, Lào, Quảng Tây - Trung

Quốc, Pakistan, Indonesia, Ấn Độ…(Theo Viện nghiên cứu ngô)

ản 4 Thành ph n dinh dưỡng c a hạt ngô

Đơn vị: % so với trọng lượng hạt

Có thể thấy, hạt ngô có giá trị dinh dưỡng tương đối cao, chứa đ y đ các chất

dinh dưỡng c n thiết cho người, trong đó hàm lượng lipid và protid trong ngô nhiều

hơn trong gạo Với giá trị dinh dưỡng cao, ngô rất thích hợp để nấu rượu

I.4 Ứng dụng enzym trong sản xuất rƣợu Whisky

I.4.1 Amylase [8]

Amylase là enzym thuộc nhóm enzyme th y phân, xúc tác phân giải liên kết

nội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia c a nước

R-R’ + H-OH  RH + R’OH Amylase th y phân tinh bột, glucogen và dextrin thành glucose, maltose và

dextrin hạn chế Các enzyme amylase có trong nước bọt (còn được gọi là ptyalin),

nấm men, vi khuẩn

 α-amylase: Thuộc nhóm enzyme nội bào tử th y phân các liên kết bên trong

chuỗi polysaccharide, chuyển hóa tinh bột thành maltose, maltotrose, glucose và

dextrin phân tử thấp Tuy nhiên thông thường α-amylase phân tinh bột thành dextrin

và một ít maltose Một số đặc điểm là α-amylase chiết suất từ nâm mốc thì chỉ tấn

công nh ng hạt tinh bột bị hư tổn cho sản phẩm cuối cùng là glucose và maltose

α-amylase nấm sợi tấn công liên kết 1,6-glucoside c a amylopectin nên khi th y phân

sẽ cho các dextrin, pH thích hợp từ 4,0- 4,8, nhiệt đô tối thích 50°C, và bị vô hoạt ở

70°C Chế phẩm thương mại như Termamyl, Spezyme…

 β-amylase, γ-amylase: Thuộc nhóm enzyme ngoại bào Th y phân các liên kết

bên trong chuỗi polysaccharide

- β-amylase: không th y phân hạt tinh bột nguyên vẹn mà th y phân mạnh mẽ hồ

tinh bột Nó phân giải 100% amylose thành maltose và 54-58% amylopectin thành

maltose pH tối thích là 4,6, nhiệt độ 40- 50°C, bị vô hoạt ở 70°C, phổ biến trong

giới thực vật đặc biệt trong hạt nảy n m Trong vi khuẩn không có β-amylase

- γ-amylase: có khả năng xúc tác th y phân liên kết 1,4 và 1,6-glucan Nó th y

phân polysaccharide từ đ u không khử để tạo glucose Có khả năng th y phân hoàn

toàn tinh bột, glucogen, amylopectin, maltose tới glucose Được tìm thấy trên

Rhizopus delemer, Asp niger, Asp oryzae, ở các nhóm vi sinh vật khác và ở mô

động vật pH tối thích 3,5- 5,5 Một số enzyme thương mại như: Dextrozyme,

AMG, Stargen…

I.4.2 Protease [7,9,10]

Là enzym th y phân protein được ứng dụng trong công nghệ thực phẩm Giúp

tăng nhanh quá trình sản xuất, tăng hiệu suất trích ly, th y phân hoàn toàn các chất

protein làm giảm độ nhớt… nhờ khả năng xúc tác th y phân liên kết peptit

(CO-NH) trong phân tử protein và các cơ chất tương tự Nhiều protease có khả năng liên

kết este và vận chuyển axitamin Được thu nhận từ nhiều nguồn như động vật, thực

vật và vi sinh vật, nhưng phong phú nhất là là vi khuẩn, nấm mốc Asp oryzae, xạ

khuẩn Phân loại theo quốc tế chia làm 4 nhóm:

- Aminopeptidase: xúc tác th y phân liên kết peptit ở đ u N c a mạch

polypeptit

- Cacboxypeptidase: xúc tác th y phân liên kết peptit ở đ u C c a mạch

polypeptit

- Pipeptidhydrolase: xúc tác th y phân các liên kết peptit

- Proteinase: xúc tác th y phân các liên kết peptit nội mạch

Một số chế phẩm enzym thương mại như : Neutrase 0.8L, Fermgen…

I.5 Nấm men trong sản xuất rƣợu Whisky [3]

Nấm men được sử dụng trong sản xuất rượu Whisky ch yếu là các ch ng

thu n khiết thuộc loài Saccharomyces cerevisiae được phân lập và tuyển chọn tại

các viện nghiên cứu, phát triển tố ở nhiệt độ 25- 30°C loài này có nh ng đặc điểm

cơ bản về hình thái và sinh lý như sau:

- Tế bào có dạng hình c u hoặc hình b u dục, kích thước từ 3-5 ×10µm Cấu

tạo đơn bào bao gồm các thành ph n: thành tế bào, màng tế bào, tế bào chất, nhân,

ty thể, ribosome, không bào… và các hạt dự tr

- Là loài dị dưỡng cacbon, hiếu khí thùy tiện, trong môi trường hiếu khí thì

tổng hợp tạo sinh khối, trong điều kiện yếm khí thì thực hiện quá trình lên men

Sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi

Ch ng nấm men tốt cho sản xuất rượu c n phải đáp ứng được nh ng yêu c u

sau:

- Hoạt lực lên men cao, chịu được độ rượu cao, có khả năng phát triển và hoạt

động trong môi trường axit, ổn định và chịu được nh ng biến đổi c a môi trường

- Khả năng lên men nhanh và nhiều loại đường khác nhau, càng triệt để càng

tốt, tạo ra ít sản phẩm trung gian và sản phẩm phụ

- Tạo cho rượu nh ng hương vị thơm ngon đặc trưng, không bị nhiễm mùi lạ

và tạo váng trên bề mặt rượu

I.6 Gỗ sồi trong sản xuất rƣợu Whisky

I.6.1 Cấu trúc của ỗ sồi [7,22,9,10]

Các đặc điểm cấu trúc c a cây sồi khiến nó trở thành lý tưởng nhất cho bảo

quản rượu Gỗ sồi bao gồm cellulose (38-52%), hemicellulose (25-30%), lignin

(22-25%) và tannin (5-10%)

Mô gỗ bao gồm các thành tế bào và gian bào.Thành tế bào gồm có các phân tử

cellulose, hemicellulose và lignin, trong khi khu vực gian bào bao gồm ch yếu là

lignin.Trong gỗ, ngoài các ph n chính là polyme thì các thành ph n có khối lượng

phân tử thấp chiếm một khối lượng nhỏ

Cellulose là thành ph n phổ biến nhất c a gỗ, chiếm khoảng ½ khối lượng

Cellulose được mô tả như là một polyme tuyến tính với một cấu trúc chuỗi thống

nhất bao gồm các anhydroglucopyranose đơn vị Các đơn vị liên kết này bị ràng

buộc bởi gốc β-(1-4)-glycosidic được hình thành bởi việc loại bỏ một phân tử nước

c a các nhóm hydroxyl ở vị trí C1 và C4 c a glucose Hydro liên kết gi a các nhóm

hydroxyl trên cellulose liền kề các phân tử là kết quả c a việc hình thành sợi, do đó

tạo ra một cấu trúc thượng t ng cho ph n còn lại c a thành ph n gỗ

Ngoài cellulose, thành tế bào còn chứa các polysaccharide khác như

hemicellulose Các hợp chất này được phân nhánh heteropolyme ngắn hơn nhiều so

với các phân tử cellulose.Nó bao gồm ch yếu các thành ph n là đường, có thể được

chia thành các nhóm như pentose, hexose, axit hexuronic và deoxyhexose.Chuỗi

chính c a một phân tử hemicellulose bao gồm một hoặc nhiều đơn vị đường, và gắn

liền với chuỗi này là các thành ph n khác như acid 4-0-methylglucuronic và

galactose Thành ph n chính thứ ba c a gỗ là lignin, là một cao phân tử có phân

nhánh.Lignin nằm ở cả thành tế bào và các khu vực gian bào, có vai trò liên kết các

tế bào gỗ

Các tannin trong gỗ sồi là các ester axit gallic c a glucose và axit ellagic

Tannin là chất kết t a với protein.Tannin gỗ sồi cũng được gọi là ellagitannin hay

gallotannin.Ellagitannin là nh ng hợp chất phenol chính c a gỗ sồi

I.6.2 Một số loại gỗ sồi trên thế giới

 sồi ỹ: [9, 11, 12]

Cây sồi ở Mỹ được trồng ch yếu ở vùng phía bắc như Missouri, Minnesota và

Wisconsin Màu c a loại này có màu nâu xám, loại cây này có đường kính nhỏ

nhưng chiều cao rất dài nên chống chịu được các điều kiện thiên nhiên rất tốt, dễ

trồng diện rộng và cứng, chắc rất phù hợp để sản xuất thùng gỗ sồi

Sồi Mỹ có thớ gỗ lỏng và vị tannin nhạt.Khi xử lý sồi Mỹ, người ta thường

cưa thành từng thanh nhỏ, cách này làm cho rượu được tiếp xúc nhiều hơn với acid

lactic trong gỗ và nhờ đó mà có nhiều mùi s a dừa

Gỗ sồi Mỹ có vị ngọt hơn, hương cũng đượm hơn so với gỗ sồi Pháp Vì vậy,

gỗ sồi Mỹ thường được sử dụng để nh ng loại rượu có mùi mạnh mẽ Thùng gỗ

sồi Mỹ rất thích hợp để làm ra nh ng loại rượu có hương vị với thời gian ngắn

 sồi háp:[9, 12, 13, 25]

Cây sồi c a Pháp ch yếu trồng ở rừng miền Trung và Tây nam như Allier,

Limousin, Nevers, Troncais và Vosges Gỗ từ mỗi vùng này lại có nh ng đặc tính

riêng khác nhau, vì thế tùy theo loại rượu định làm mà người ta sẽ quyết định dùng

thùng đóng từ gỗ ở vùng nào, độ hun gỗ ra sao…

Gỗ sồi ở Pháp có rất nhiều điểm khác so với gỗ sồi ở Mỹ về màu, hương và

hàm lượng các chất hoà tan như tannin và một số chất khác Gỗ sồi Pháp có vị ngọt

và mạnh hương vanilla rõ rệt, trong khi đó gỗ sồi Mỹ có vị gắt hơn do lượng axit

lactic trong thân cây cao gấp 3- 4 l n Sồi Pháp có thớ gỗ chắc và rất dễ chẻ dọc

theo thớ mà không c n phải cưa Cách này làm cho rượu tiếp xúc dọc theo thớ gỗ và

nhờ đó mà có mùi vanilla mạnh hơn

Bảng 1.5 Độ ẩm một số loại gỗ sồi thương mại

3 Gỗ sồi trắng c a Mỹ (tuổi c a cây 30 năm) 20,4

4 Gỗ sồi trắng c a Mỹ (tuổi c a cây 56-60 năm) 18,6

Hiện có khoảng 300 loại gỗ sồi phân bố khắp nơi trên thế giới Một số nước

như: Tây Ban Nha, Ý, Rumani, Nam Phi, Úc, Indonesia cũng có nhiều loại gỗ sồi

nhưng chất lượng không tốt bằng Gỗ sồi đến từ Canada được coi là trung hoà các

đặc tính c a hai kiểu gỗ Mỹ và Pháp Bản thân người Pháp bây giờ cũng dùng gỗ

sồi c a vùng rừng Adygey g n biển Đen c a Nga vì giá rẻ hơn Còn người Ý lại

chuộng nh ng thùng đựng gỗ sồi đến từ Slovenia bởi chúng có thớ gỗ chắc, vị nồng

thấp và độ tannin vừa phải

Hiện nay rất nhiều công ty bán các sản phẩm gỗ sồi có các kích thước (dạng

phoi, dạng bột, dạng mảnh vụn nhỏ ) và mức độ nướng khác nhau.Các loại gỗ này

có kích thước nhỏ dùng để đưa trực tiếp vào trong rượu nhằm rút ngắn thời gian

tàng tr và giá thành thấp hơn

I.6.3 Một số hợp chất bay hơi có tron ỗ sồi

Gỗ sồi chứa nhiều thành ph n dễ bay hơi, đã phát hiện được khoảng 100 cấu

tử hương trong gỗ sồi bằng phương pháp sắc ký khí.Các cấu tử có lợi trong quá

trình tạo thành Whisky là các axit h u cơ, lactone, norisoprenoid và các hợp chất

phenol dễ bay hơi.Đa số các chất thơm có mùi đặc trưng riêng Mùi c a chúng do

nh ng nhómnguyên tử đặc biệt là nhóm mang mùi quyết định Tuy nhiên nếu tăng

số nhómmang mùi trong phân tử lên thì không làm tăng mùi mà lại làm yếu mùi và

đôi khi làm mất mùi hoàn toàn Nhóm mang mùi cơ bản thường là nguyên tử O, S,

N, P, Se Trong đó các nhóm mang mùi h u cơ thường là este, rượu, v.v

Nh ng hợp chất chính trong gỗ sồi ảnh hưởng lên hương vị rượu:

 Lactone:[9,16,18]

Các hợp chất lactone đặc trưng cho mùi gỗ sồi, được cấu tạo từ lipid trong gỗ

sồi Ở nồng độ cao hơn (thường thấy ở gỗ sồi Mỹ), các hợp chất này sẽ có mùi

giống như s a dừa Mùi hương này sẽ tăng lên khi gỗ sồi bị gia nhiệt (trong quá

trình làm thùng rượu) Tuy nhiên, nếu phơi các tấm ván gỗ ngoài trời trước khi làm

thùng thì các hợp chất lactone sẽ giảm đi đáng kể Loại đặc trưng nhất trong các

hợp chất lactone chính là 2 đồng phân cis và trans c a hợp chất βmethyl

-octalactone Đồng phân dạng cis tạo mùi hương nồng hơn, góp ph n tạo nên mùi

đất, thảo mộc; trong khi đồng phân dạng trans tạo vị cay cay cho rượu

Whisky lacton (đồng phân cis và trans β-methyl- -coctalactone) có nguồn gốc

từ gỗ sồi và ảnh hưởng trực tiếp các đặc tính c a rượu Đó là lý do tại sao nồng độ

c a hợp chất này trong rượu quyết định đáng kể chất lượng cũng như sự chấp nhận

c a người tiêu dùng Các đồng phân dạng cis có ngưỡng mùi thấp hơn 4-5 l n so

với đồng phân trans Whisky lacton có mặt trong tất cả các loại gỗ sồi được sử dụng

để làm thùng tàng tr nhưng so với các loài khác thì trong gỗ sồi trắng c a Mỹ đồng

phân cis hiện diện ở mức độ cao hơn Cả hai đồng phân sẽ tăng lên trong quá trình

nướng gỗ sồi

 Phenolic aldehyde:[16]

Còn gọi là vanillin, là sản phẩm c a sự phân h y chất gỗ (lignin) trong gỗ sồi

Các hợp chất này đóng vai trò chính tạo thêm hương vanilla cho rượu Nồng độ c a

trình phơi khô (ván gỗ) ngoài trời trước khi làm thùng Tuy nhiên, nếu lên men rượu

trong gỗ sồi sẽ khiến lượng vanillin giảm xuống do nấm men tác dụng với gỗ sồi,

khi quá trình trao đổi chất c a nấm men giảm, lượng vanillin cũng giảm theo

Vanillin được coi là chất chuẩn (marker) để đánh giá tuổi c a gỗ sồi

 Volatile phenol:[21]

Cũng là một trong nh ng sản phẩm c a sự phân h y chất gỗ trong gỗ sồi và

chúng sẽ không tồn tại khi gỗ không được gia nhiệt Chúng góp ph n tạo mùi đinh

hương (clove) cho đến mùi khói Loại hợp chất volatile phenol chiếm ch yếu trong

gỗ là eugenol (tạo mùi đinh hương), sau đó là 4-methylgluaiacol (tạo mùi khói) và

4-vinylguaiacol (tạo mùi hoa cẩm chướng)

 ác hợp chất g y ph n h y carbohydrate:[7,20]

Đây là một nhóm các hợp chất lớn và phức tạp bao gồm furfural, được hình

thành trong quá trình gia nhiệt đóng thùng và có vị hạnh đắng (bitter

almond).Fufural là chất lỏng không màu, có mùi hạnh nhân.2-furancarboxaldehyde

là sản phẩm c a sự suy thoái monosacarit được tạo ra bằng cách th y phân một

ph n c a hemicellulose

Maltol và cyclotene cũng được hình thành trong quá trình gia nhiệt đóng thùng

và chúng không chỉ có vị caramel mà còn đóng vai trò là nh ng chất tiềm năng

Giống như bột ngọt trong thực phẩm vậy, nh ng chất tiềm năng này giúp cho

hương vị rượu trở nên đậm đà hơn

 Tannin và một số hợp chất polyphenol khác:[21,22,17,25]

Tannin và một số hợp chất polyphenol khác giúp mang lại màu sắc và độ chát

cho rượu nhưng quan trọng hơn chính là chúng có khả năng làm cân bằng các phản

ứng oxy hóa/khử trong rượu, bảo vệ rượu khỏi các phản ứng oxy hóa/khử có hại

gây hỏng rượu

Ngoài ra một số phenol dễ bay hơi khác hình thành trong quá trình tàng tr

rượu như là: Ethylphenol, 4-ethylphenol và 4-ethylguaiacol tạo ra do sự ô nhiễm và

nấm men Brettanomyces,làm cho rượu có mùi khó chịu Các hợp chất này hình

thành nhiều hơn khi rượu được tàng tr trong các thùng đã qua sử dụng và nồng độ

c a chúng có xu hướng gia tăng trong quá trình tàng tr Ethylphenol hình thành

trong các loại rượu có nồng độ cồn thấp nhiều hơn là trong các loại rượu có nồng độ

cồn cao

Như vậy, polyphenol là nhóm hợp chất quyết định nhiều đến màu sắc cũng

như hương vị c a gỗ sồi

Hình 1.2 Một số chất thơm được tạo thành trong quá trình rượu bằng

thùng gỗ sồi

I.6.4 Mức độ nướng của gỗ sồi

Gỗ sồi tự nhiên được sấy và nướng qua 2 giai đoạn :

- Gia nhiệt (sấy): có tác động tới cấu trúc c a ligin, các polimer glucid như

cellulose và hemicellulose Gỗ sồi được sấy trong 20- 30 phút Kết thúc quá trình

này thì nhiệt độ bên trong c a gỗ sồi là 200°C, trong khi đó nhiệt độ bên ngoài đạt

50°C

- Nướng: tạo cho gỗ sồi có hình dạng cuối cùng và làm biến đổi cấu trúc và

thành ph n c a gỗ sồi Một số cấu tử có trong gỗ sồi nướng như: furfural,

methyl-furfural, vanillin, syringaldehyde

Chất lượng gỗ sồi nướng phụ thuộc vào quá trình nướng Thông thường có 03

mức độ nướng như sau :

- Mức độ nướng nhẹ (LP): thời gian nướng khoảng 5 phút, nhiệt độ bề mặt

II.1.1 Nguyên liệu chính

- Gạo: các loại gạo tẻ phổ biến trên thị trường: Khang Dân, Tạp Giao, IR504, Q5

- Ngô: Ngô hạt có nguồn gốc Hà Giang, Sơn La và giống ngô LVN-154 do Viện

Nghiên cứu ngô (Viện Khoa học Nông nghiệp VN) lai tạo

Hoạt động và bảo quản: là một protease trung tính với một hoạt động tối ưu

khoảng pH 5,5- 7,5 và 45- 55°C Neutrase có thể được bất hoạt bằng cách xử lý

nhiệt (ví dụ, 2 phút ở 85°C).Enzyme này c n được bảo quản ở nhiệt độ 3- 5°C và có

Nguồn: Termamyl là một loại α-amylase được sản xuất bằng cách lên men thu

chìm một dòng được lựa chọn c a Bacillus licheniformis Sau khi lên men, enzyme

được tách ra từ sinh vật sản xuất và tinh chế

Hoạt động và bảo quản: Termamyl làm giảm hàm lượng tinh bột, keo hóa

dextrin và oligosaccharides Enzyme chịu nhiệt và hoạt động tốt ở nhiệt độ từ 30-

100°C và pH 7- 11 và c n được bảo quản ở 3- 5°C

Enzyme Dextrozyme ® GA:

Nhà cung cấp: Novozymes

Tính chất vật lý: có màu nâu sáng hay nâu đen, ở dạng lỏng, độ nhớt (cPs) 10-

40

Nguồn: Thu được từ lựa một ch ng nấm Aspergillus niger nhờ quá trình lên men

sau đó chúng được tách và tinh chế

Hoạt động và bảo quản: có chức năng đường hóa cắt các liên kết 1,4 và

1,6-glucoside trong tinh bột để từng bước tạo ra các phân tử đường glucose Enzyme

hoạt động tốt ở nhiệt độ 55- 70°C, pH 4,0- 5,0 và bảo quản ở bao bì khô thoáng,

nhiệt độ bảo quản thích hợp là 0- 25°C

II.1.3 Nấm men

Ch ng nấm men nghiên cứu là ch ng Saccharomyces cerevisiae EC1118 được

lấy từ bộ sưu tập giống vi sinh vật công nghiệp c a Viện Công nghiệp Thực phẩm

II.1.4 Gỗ sồi

Gỗ sồi xuất xứ Pháp mang nhãn hiệu Arobois với mức độ nướng khác nhau:

không nướng (UP), nướng ít (LP), nướng vừa (MP), nướng nhiều (HP) [100]

II.2 Phương ph p nghiên cứu

II.2 Phươn pháp vi sinh

II.2.1.1 hương pháp hoạt hóa giống nấm men

Các ch ng nấm men sử dụng bảo quản lạnh sâu được làm tan băng tự nhiên

(trong điều kiện phòng thí nghiệm) Dùng que cấy vô trùng quấy đều dịch huyền

phù tế bào trong ống bảo quản Lấy 1 vòng que cấy ria đều lên bề mặt đĩa petri chứa

môi trường malt 11°Bx Nuôi ở nhiệt độ 28°C trong 3 ngày

Sau khi nấm men phát triển tốt, nh ng khuẩn lạc riêng rẽ được cấy sang các

ống thạch nghiêng chứa môi trường malt 11°Bx để làm giống nhân cấy

II.2.1.2 hương pháp xác định mật độ tế bào nấm men

Lượng tế bào nấm men có trong dịch nuôi cấy được xác định bằng cách đếm

tế bào trong buồng đếm hồng c u Lượng tế bào nấm men được tính theo công thức:

N (CFU/ml) = 0,25 a × f × 106Trong đó: a là số tế bào nấm men trung bình đếm được trong 1 ô (1 ô có 16 ô

nhỏ)

f là hệ số pha loãng

II.2.1.3 hương pháp lên men

Các thí nghiệm lên men được tiến hành trong các bình schott 500 ml Dịch lên

men là môi trường đã th y phân (malt, gạo, ngô) được bổ sung dinh dưỡng theo

mục đích thí nghiệm Ch ng nấm men sau khi được hoạt hóa (trong môi trường

nước chiết malt 11°Bx, KH2PO4 0,5%, MgSO4 0,03%), được bổ sung vào môi

trường lên men Theo dõi các thông số c a quá trình lên men theo thời gian

II.2.2 Phươn pháp hóa lý

II.2.2.1 hương pháp xác định hàm lượng tinh bột

 Nguyên tắc:

Th y phân tinh bột thành đường trong dung dịch HCl 2% ở điều kiện đun sôi

trong bình cách th y trong thời gian 2 giờ Dịch đã th y phân được làm nguội và

trung hòa bằng NaOH với chị thị methyl da cam Hàm lượng đường trong dịch được

xác định theo phương pháp Graxianop

 Hóa chất: HCl 2%, NaOH 10%, Methyl da cam 1%

 Tiến hành:

Cân khoảng 2g bột rồi chuyển toàn bộ vào bình tam giác hoặc bình c u có

dung tích 250 ml Tiếp theo cho thêm 100 ml HCl 2% (100 ml nước cất 6 ml HCl

35%), đậy nút cao su và nối với ống sinh hàn khí Lắc nhẹ rồi đặt nồi vào đun cách

th y, đun tới sôi khoảng 2 giờ Mức nước ở nồi cách th y luon cao hơn mức nước

trong bình th y phân, phải chuẩn bị nước sôi để bổ sung vào Sau 2 giờ th y phân,

toàn bộ lượng tinh bột đã chuyển hoá thành glucose, làm nguội đến nhiệt độ phòng

rồi thêm 4- 5 giọt methyl da cam, dung NaOH 10% để trung hòa axit tới đổi màu

Chú ý chỉ trung hòa khi đã làm nguội đến 30°C, vì ở nhiệt độ cao và kiềm cục bộ thì

glucose sẽ bị phân h y làm kết quả kém chính xác Trung hòa xong ta chuyển toàn

bộ dung dịch vào bình định mức 250 ml, tráng bình rồi thêm nước cất tới ngấn bình

và đem lọc Dịch đường thu được có thể xác định theo phương pháp xác định

a : số gam glucose tương ứng với 20ml ferixyanua (0,025)

b : số ml dịch đường loãng tiêu hao khi định phân

m : số gam bột ở mẫu thí nghiệm (2,0 g)

0,9 : hệ số chuyển glucose thành tinh bột

II.2.2.2 hương pháp xác định năng lực đường hóa

 Mục đích: Xác định hoạt độ kết hợp α,β-amylase c a malt trong các điều

kiện tiêu chuẩn Áp dụng cho tất cả các loại malt

 Nguyên tắc: Các enzyme trong malt được chiết với nước 40°C và dùng để

th y phân dung dịch tinh bột chuẩn Lượng đường khử tạo thành nhờ hoạt động c a

enzyme amylase được tính theo phương pháp Iốt Kết quả được tính bằng số gam

maltoza tạo thành từ 100g malt ở điều kiện tiêu chuẩn

 Tiến hành:

- Chuẩn bị mẫu: Nghiền mịn malt vàng nhạt và cân chính xác 20g cho vào cốc

nấu

- Thu dịch chiết malt: Đun bếp cách th y tới nhiệt độ 40°C Rót 480ml nước

lạnh vào mẫu malt Khuấy đều tránh vón cục Đặt cốc vào bếp cách th y 40°C

khuấy liên tục trong vòng 1giờ Làm nguội dịch chiết tới nhiệt độ phòng Rửa đũa

khuấy bằng một ít nước Lau khô phía ngoài cốc, điều chỉnh khối lượng cốc tới 520;

540; hoặc 510 0,2g tương ứng với lượng malt nêu trên

- Lọc: Khuấy thật đều dịch chiết, đổ ngay toàn bộ hỗn hợp vào phễu lọc, loại

bỏ 200ml dịch lọc đ u, lấy 50ml dịch lọc sau để phân tích

- Th y phân dịch lọc tinh bột:

+ Mẫu thí nghiệm: Dùng pitpet lấy 10ml dung dịch tinh bột vào bình định mức

250ml, thêm vào 6,5ml dung dịch đệm acetate, đặt vào bình cách th y 20°C, để yên

20 phút Cho tiếp 6,5ml dịch chiết malt đã lọc vào hỗn hợp trên, lắc đều rồi để 20°C

đúng 30 phút tính từ lúc bắt đ u thêm dịch chiết malt Sau đó cho thêm 5ml NaOH

để ngừng hoạt động c a enzyme.Thêm nước tới ngấn định mức và lắc đều Kiểm tra

độ kiềm bằng cách nhỏ một giọt thymolphtalein, màu c a dung dịch phải là màu

xanh

+ Mẫu kiểm chứng: Lấy 100ml dung dịch tinh bột vào bình 250ml, thêm 3ml

dung dịch NaOH, lắc kĩ Thêm 6,5ml dịch chiết malt rồi thêm nước tới ngấn bình và

lắc đều

- Xác định đường khử theo phương pháp Iốt: hút 50ml dung dịch trên vào bình

tam giác 250ml, thêm 25ml dung dịch Iốt và 3ml dung dịch NaOH và lắc đều Đậy

nút bình để tránh tổn thất Iốt và để yên trong 15 phút Thêm 4,5ml H2SO4 và chuẩn

ph n Iốt dư không phản ứng bằng dung dịch Na2S2O3 tới khi mất màu xanh

Kết quả:Tính lượng mantoza tạo thành theo công thức

DP1 = F(VB-VT)

DP2 =

Trong đó:

DP1 : hoạt lực enzyme distaza c a mẫu, tính theo đơn vị WK(Windish-Kolbach)

DP2 : hoạt lực enzyme distaza c a malt khô, WK

VB : thể tích Na2S2O3 dùng chuẩn độ lượng Iốt dư trong mẫu trắng, ml

VT : thể tích Na2S2O3 dùng chuẩn độ lượng Iốt dư trong mẫu thực, ml

F : hệ số chuyển đổi để tính kết quả theo 100g malt dùng trong chiết enzyme

(F20g=34,2)

W : độ ẩm c a malt (%)

k = 0,1075 (tùy thuộc vào tùng dụng cụ otvan mà có hệ số k khác nhau)

II.2.2.3 hương pháp xác định độ nhớt c a dịch hồ hóa

Độ nhớt c a dung dịch được xác định bằng nhớt kế (Đức)

Phương pháp đo: Dung dịch c n đo độ nhớt được làm nguội về

30°C Hút 2 ml dịch cho vào nhánh phải (nhánh không có mao quản)

c a nhớt kế Dùng quả bóp đẩy dịch lên trên vạch đo thứ nhất (vạch A) Đợi dịch

chảy đến vạch đo, ta bắt đ u tính thời gian (bằng đồng hồ bấm giây) cho đến khi

dịch chảy đến vạch đo thứ hai (vạch B) Ghi lại thời gian này, lặp lại 3 l n rồi lấy

kết quả trung bình

Tính toán kết quả:

- Đo tỷ trọng c a dịch: lấy 5 ml dịch đem cân khối lượng bằng cân phân tích,

sau đó tính ra tỷ trọng c a dịch th y phân theo công thức: d=

- Đo tỷ trọng c a nước: tương tự như đo với dịch th y phân

- Độ nhớt c a dịch th y phân được tính theo công thức: µ = µo ×

(cp) Trong đó:

µo : độ c a nhớt c a nước

d1 : tỷ trọng c a dịch th y phân

do : tỷ trọng c a nước (do = 0,997)

t1 : thời gian chảy c a 2 ml dịch (giây)

to : thời gian chảy c a 2 ml nước (giây)

II.2.2.4 hương pháp xác định hàm ẩm

Hàm ẩm c a nguyên liệu được xác định bằng máy đo hàm ẩm Sartorius (Đức)

II.2.2.5 hương pháp xác định hàm lượng chất khô tổng số

Hàm lượng chất khô tổng số được xác định bằng bằng chiết quang kế (Đức)

II.2.2.6 hương pháp xác định hàm lượng đường khử

(a) Với nguyên liệu chứa hàm lượng đường khử ≥ 50 g/l, sử dụng phương pháp

Granxianop

 Nguyên tắc: Đường khử khi đun nóng với dung dịch kiềm ferixyanua sẽ khử

ferixyanua thành feroxyanua và đường khử chuyển thành axit đường Dùng metyl

xanh làm chất chỉ thị sẽ mất màu xanh khi phản ứng kết thúc Phản ứng chính như

- Dung dịch KOH 2,5N: cân 140 KOH hòa tan trong 1 lít nước cất

- Dung dịch xanh metylen 0,5%

 Tiến hành: Hút 20ml dung dịch ferixyanua kali cho vào bình tam giác 250ml,

thêm vào đó 5ml dung dịch KOH 2,5N và 3- 4 giọt xanh metylen (nếu nồng độ

dung dịch đường thấp hơn 0,25% thì lấy 10ml ferixyanua kali và 2,5 ml dung dịch

KOH) Lắc nhẹ và đặt trên bếp điện hoặc bếp ga đun sôi Chuẩn độ từ từ bằng mẫu

c n xác định đường (dịch th y phân), vừa chuẩn vừ lắc, đến khi dịch không đổi màu

thì ngừng lại, xác định số ml mẫu đã dùng để chuẩn độ

Cách tính lượng đường khử trong mẫu phân tích:

Đường khử = ́

Trong đó:

0,025 : số g K3Fe(CN)6 ứng với 20ml K3Fe(CN)6

Vmẫu : thể tích mẫu dùng để chuản độ (ml)

(b) Với nguyên liệu chứa hàm lượng đường khử < 50 g/l, sử dụng phương pháp

Nelson - Somogi

 Nguyên tắc: Nguyên l ý cơ bản c a phương pháp này là đường khử bị oxy

hóa bởi Cu2+ trong môi trường kiềm, sau đó Cu2O tạo ra sẽ khử phức chất

arsenomolybdate để tạo thành sản phẩm có màu xanh Lượng đường khử có trong

dung dịch sẽ được xác định gián tiếp qua lượng phức tạo thành

Phương trình phản ứng như sau:

Dung dịch thuốc thử đồng (Somogy I):

(a) Hòa tan 24g Na2CO3 và12g Potassium tartrate vào trong 250 ml nước cất Thêm

40 ml CuSO4.5H2O 10% và 16g NaHCO3

(b) Hòa tan 180g Na2SO4 vào trong 500 ml nước cất

Trộn lẫn dung dịch (a) & (b) và nâng đến thể tích 1 lít bằng bình định mức Để ổn

định m u dung dịch này trong 1 tu n rồi lọc qua giấy lọc

Dung dịch thuốc thử muối asenic molybden (Somogy II):

(a) Hòa tan 25g (NH4)6Mo7O24.4H2O vào trong 450 ml nước cất Thêm 21 ml

H2SO4

(b) Hòa tan 3g Na2HAsO4.7H2O vào trong 25ml nước cất

Trộn lẫn dung dịch (a) & (b) và nâng đến thể tích 1 lít bằng bình định mức Để ổn

định màu dung dịch này trong bình tối màu trong 2 ngày rồi lọc qua giấy lọc

 Tiến hành:

- Lấy 1ml dịch pha loãng ở nồng độ thích hợp cho vào ống nghiệm Bổ sung thêm

1ml Somogy I vào Đậy kín sau đó đem đun sôi cách thuỷ trong vòng 10 phút Lấy

ra, làm nguội về nhiệt độ phòng Bổ sung thêm 2ml Somogy II và để trong vòng 10

phút cho phản ứng tạo phức màu xảy ra hoàn toàn sau đó lắc đều

- Cho hỗn hợp dung dịch màu vào cuvet rồi đo mật độ quang c a dung dịch tại

bước sóng 500 nm

Có thể sử dụng dung dịch đệm acetat 0,1M , pH 5,0 hoặc nước cất làm mẫu

trắng

Xây dựng đường chuẩn Glucose:

- Chuẩn bị dung dịch chuẩn glucose 1 g/l

- Chuẩn bị dãy pha loãng: 0; 0,05; 0,10; 0,15; 0,20; 0,25; 0,30; 0,35; 0,40; 0,45 g/l

Nồng độ

glucose (g/l) 0 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45

OD(500nm) 0 0,197 0,364 0,484 0,594 0,695 0,872 0,949 1,147 1,218

Hình 2.1 Đồ thị đường chuẩn glucose theo phương pháp Nelson - Somogi

Đường chuẩn thu được có phương trình:

y = OD = 2,6427x + 0,0574 (R2 = 0,993)

Từ giá trị OD thu được, dựa vào đường chuẩn và nồng độ pha loãng có thể xác

định được hàm lượng đường có trong mẫu phân tích:

x = [Glucose] (g/l) =

× D

y = 2.6427x + 0.0574 R² = 0.993

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

Trong đó: D là hệ số pha loãng

II.2.2.7 hương pháp xác định hàm lượng protein hòa tan

Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Lowry

 Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng màu c a protein và thuốc thử Folin, cường độ

màu c a dung dịch tỷ lệ thuận với nồng độ protein, và dựa vào đường chuẩn

c a protein, có thể tính được hàm lượng protein c a mẫu nghiên cứu

 Hóa chất:

Thuốc thử A: 20g Na2CO3 được hòa tan trong 1 lít 0,1M NaOH

Thuốc thử B : 0,5g CuSO4 và 1g potassium tartrate (2C4H4K2O6.H2O) được hòa tan

trong 100ml nước cất

Thuốc thử C: 50ml thuốc thử A và 1ml thuốc thử B trộn đều và dùng ngay

Thuốc thử D: 1 thể tích thuốc thử phenol gốc và 1 thể tích nước cất 2 l n được hòa

đều và cũng dung ngay

 Cách tiến hành:

Cho vào ống phân tích 0,5ml dung dịch protein (0,005- 0,1%) và 5ml thuốc

thử C được trộn đều và gi yên ở 30°C trong 10 phút Sau đó 0,5ml thuốc thử D

được thêm vào hỗn hợp trên, trộn đều và gi yên ở 30°C trong 20 phút Đo OD c a

mẫu kiểm tra ở bước sóng 750nm Nước cất sử dụng như mẫu trắng

Xây dựng đường cong protein chuẩn:

Thuốc thử Albumin chuẩn được sử dụng như dung dịch protein Ống albumin chuẩn

1g/l, được pha loãng ở các nồng độ từ 0,1- 0,9 g/l

Giá trị OD c a dung dịch albumin với các nồng độ khác nhau ở 750 nm:

Albumin (mg/ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9

OD (750 nm) 0 0,167 0,295 0,378 0,500 0,573 0,686 0,785 0,875 0,987

y = 1.0476x + 0.0532 R² = 0.9943

0.4 0.6 0.8 1.0 1.2

Hình 2.2 Đồ thị đường chuẩn Albumin theo phương pháp Lowry

Phương trình đường chuẩn thu được:

y = OD = 1,047x + 0,053 (R2 = 0,994) Hàm lượng protein (mg/ml) = x =

× Hệ số pha loãng

II.2.2.8 hương pháp xác định hàm lượng axit amin tự do (FAN)

Hàm lượng axit amin tự do được xác định bằng phương pháp Ninhydrin:

 Nguyên tắc: Phản ứng ninhydrin là phản ứng màu, dùng để định tính và định

lượng axit amin, imino axit và amin Khi đun nóng ninhydrin trong môi trường

kiềm với chất có nhóm chức amin bậc 1 sẽ thu được sản phẩm có màu tím

xanh có maximum hấp thụ ở 570nm Mật độ quang c a sản phẩm thu được

tuyến tính phụ thuộc vào số lượng nhóm amin tự do Dựa vào tính chất này

người ta có thể định tính được axit amin

Dung dịch pha loãng (2): Hòa tan 2g KIO3 vào 600 ml nước cất và thêm cồn 96%V

cho vừa đ 1000ml

 Cách tiến hành:

- Pha loãng mẫu tới nồng 1- 8mg α-amino nitrogen/lít (đối với dịch hèm thì

pha loãng 100 l n, đối với dịch bia thì pha loãng 50 l n)

- Lấy 2ml mẫu đã pha loãng cho vào ống nghiệm và được đậy kín để tránh

sự mất mát do bay hơi

- Thêm vào 1 ml dung dịch màu (1), đun cách th y trong nồi nước sôi 15

phút, sau đó làm nguội trong nước lạnh về 25°C

- Cho vào ống nghiệm 5ml dung dịch pha loãng (2)

- Lắc đều và đo ở bước sóng hấp thụ tại 570nm (đo trong vòng 30 phút sau

khi đã thêm dung dịch (2) vào)

- Mẫu trắng được chuẩn bị cùng với mẫu thí nghiệm ở trên, chỉ khác là thay

2ml dung dịch mẫu bằng 2ml nước cất

Mẫu chuẩn: Hòa tan 107,2 mg glyxin trong 100ml nước cất Dung dịch này

được bảo quản ở 0°C, mỗi l n thí nghiệm thì pha loãng 100 l n Dung dịch glyxin

đã pha loãng chứa 2 mg α-amino nitrogen/lít Tiến hành các bước tương tự như đối

II.2.2.9 hương pháp xác định hàm lượng cồn

Cồn được xác định bằng bộ cất cồn phòng thí nghiệm Salleron Dujardin

(Pháp).Thiết bị này cho phép ta biết được độ cồn thu được trong dịch sau quá trình

lên men qua nhiệt độ sôi c a dịch được quy đổi tương ứng trên bảng tra

ác bước tiến hành:

Làm sạch bộ cất cồn bằng nước cất

- Đo nhiệt độ sôi c a nước cất để hiệu chỉnh trên bảng: nhiệt độ sôi c a nước

tương ứng với 0 độ cồn

- Rửa lại bình cất bằng dung dịch mẫu sau đó cho 30ml mẫu vào bình chứa

mẫu Đun bằng đèn cồn và quan sát nhiệt độ sôi c a dịch mẫu trên nhiệt kế

- Tra trên bảng quy đổi từ nhiệt độ sôi c a dịch mẫu ra độ cồn tương ứng

II.2.2.10 hương pháp xác định hàm lượng axit

(a) hương pháp xác định hàm lượng axit tổng số:

Axit tổng số c a một dung dịch là một tiêu chuẩn để đánh giá tất cả nh ng ion

hydro (H+) c a cả nh ng axit dễ bay hơi và nh ng axit không bay hơi có mặt trong

dung dịch

 Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng trung hòa các axit có trong mẫu bằng dung

dịch kiềm NaOH 0,1N với chỉ thị là phenolphthalein 0,1% Từ lượng dịch kiềm tiêu

hao, ta tính được lượng axit tổng số có trong mẫu

 Cách tiến hành:

- Hút 20 ml dịch sau lên men vào bình tam giác 100 ml

- Nhỏ 1- 2 giọt phenolphthalein 0,1 % vào, lắc đều

- Chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N Vừa chuẩn vừa lắc, đến khi dung

dịch chuẩn sang màu hồng nhạt thì dừng lại

 Cách tính hàm lượng axit tổng trong dung dịch:

Nh ng loại axit trong dung dịch được quy về một axit chung là axit lactic

(C3H6O3)

C3H6O3 + NaOH → C3H5O3Na + H2O Lượng axit trong dịch sau lên men được tính theo công thức:

m (g/l) =

Trong đó:

m : khối lượng c a axit lactic (g/l)

K : hệ số quy đổi ra axit (với axit lactic K = 0,009;

axit acetic K = 0,006 ; axit xitric K = 0,0064)

VNaOH : thể tích NaOH 0,1N đã dùng (ml)

Vmẫu : thể tích mẫu đã sử dụng (ml)

(b) hương pháp xác định hàm lượng axit bay hơi:

Trong dịch sau lên men, ngoài nh ng axit cố định, còn có nh ng axit dễ bay

hơi Nh ng axit này cũng góp ph n, quyết định đến chất lượng c a rượu thành

phẩm

 Nguyên tắc: Axit bay hơi được tách ra bằng phương pháp chưng cất cuốn

theo hơi nước Ph n axit không bay hơi được xác định dựa trên phản ứng trung hòa

bằng dung dịch kiềm NaOH 0,1N với chỉ thị là phenolphthalein 0,1% Lượng axít

bay hơi được xác định bằng hiệu số gi a axit tổng và axit không bay hơi

 Cách tiến hành:

- Hút 20 ml dịch sau lên men vào bình tam giác 100ml

- Đun cách th y trong 10 phút để đuổi hết axit bay hơi.Làm nguội nhanh về

nhiệt độ phòng.Định mức lại lượng axit thoát ra

- Nhỏ 1- 2 giọt phenolphthalein 0,1%, lắc đều

- Chuẩn bằng dung dịch NaOH 0,1N

 Cách tính hàm lượng axit bay hơi trong dung dịch:

Lượng axit bay hơi (g) = Lượng axit tổng (g) - Lượng axit còn lại sau khi

đuổi hết axit bay hơi (g)

II.2.2.11 hương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng số

Hàm lượng polyphenol tổng số được xác định theo phương pháp

Folin-Ciolcateau c a Singleton:

 Nguyên tắc: Oxy hóa toàn bộ lượng polyphenol trong rượu vang bằng dung

dịch Folin-Ciolcateau (hỗn hợp axit phosphotungstic và axit phosphomolybdic)

Các axit này sẽ bị khử thành các oxit vonfram (W8O23) và oxit molipden (M8O23) có

màu xanh Màu xanh này bị hấp thụ nhiều nhất ở bước sóng 770 nm và cường độ

màu tỷ lệ với hàm lượng polyphenol có trong mẫu

 Hóa chất:

- Dung dịch chuẩn axit gallic 0,5 g/l: Cân 0,1 g axit gallic, thêm 2 ml ethanol

Để nguội và định mức đến 20 ml để có dung dịch axit gallic 5 g/l Hút 10 ml dung

dịch axit gallic 5 g/l pha loãng trong 90 ml nước để có dung dịch chuẩn axit gallic

0,5 g/l (Bảo quản dung dịch này ở 4°C trong vòng 2 tu n) Từ dung dịch chuẩn này,

pha loãng với nước cất thành các dung dịch axit gallic có dải nồng độ từ 0- 120

mg/l

- Dung dịch Folin Ciocalteu

- Dung dịch Na2CO3 20%

 Tiến hành:

- Hút 0,5ml mẫu và 3,95 ml nước cất vào ống nghiệm, thêm 0,25 ml dung

dịch Folin Ciocalteu, lắc đều Sau 5 phút (không được để quá 8 phút), thêm 0,75 ml

dung dịch Na2CO3 20%, lắc đều Để yên trong bóng tối, sau 30 phút tiến hành so

màu ở bước sóng 770 nm

- Dựng đường chuẩn polyphenol tổng số theo axit gallic:

Chuẩn bị dãy nồng độ axit gallic (mg/l): 0, 20, 40, 60, 80, 100, 120

Hình 2.3.Đường chuẩn axit gallic theo phương pháp Singleton

 Cách tính kết quả: OD = y = 0,009x + 0,043 (R2

= 0,994)

 x = Hàm lượng polyphenol (mg/ml) = × Hệ số pha loãng

II.2.2.12 hương pháp xác định màu rượu

Độ hấp thụ màu c a rượu Whisky được đo ở bước sóng 420 nm (ứng với độ

hấp thụ màu nâu hoặc vàng, theo phương pháp c a Mazza) Trước khi đo OD, mẫu

rượu được lọc qua màng lọc 0,45 µm Nếu màu đậm có thể pha loãng trước khi so

màu Mẫu trắng là dung dịch ethanol 10%

II.2.3 Phươn pháp tính hiệu suất

 Hiệu suất chuyển hóa tinh bột thành đường (hiệu suất th y phân) được tính

dựa trên lượng đường tạo thành sau quá trình th y phân so với lượng đường có

trong nguyên liệu

 Hiệu suất lên men được tính dựa trên lượng cồn thực tế thu được so với

lượng cồn tạo thành theo lý thuyết

 Hiệu suất chưng cất được tính theo công thức:

H (%) =

× 100 Trong đó:

V1 : Thể tích rượu đưa vào chưng cất

N1 : Nồng độ rượu đưa vào chưng cất

y = 0.0099x + 0.0431 R² = 0.9942

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

V2 : Thể tích rượu thu được sau chưng cất

N2 : nồng độ rượu thu được sau chưng cất

II.2.4 Phươn pháp cảm quan [2,4]

II.2.4.1 hương pháp cho điểm theo TCVN

Đánh giá chất lượng cảm quan rượu bằng phương pháp cho điểm theo TCVN

3217-79 Phương pháp này được sử dụng để đánh giá tổng quát mức chất lượng c a

sản phẩm so với tiêu chuẩn hoặc so với một sản phẩm cùng loại trên tất cả các chỉ

tiêu cảm quan Các chỉ tiêu đánh giá chất lượng rượu theo phương pháp cảm quan

và hệ số quan trọng cho từng chỉ tiêu như sau:

Bảng 2.1 Điểm tiêu chuẩn cho từng chỉ tiêu cảm quan c a sản phẩm

1 Chất lỏng đục nhiều lắng cặn, có nhiều vật thể lạ nhỏ thô

tr m trọng, màu không đặc trưng cho sản phẩm