MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG SỐ LƯỢNG NOÃN VÀ NUÔI NOÃN CHÍN TRÊN CHÓ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRUỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM KHOA CHĂN NUÔI THÚ Y  LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG SỐ LƯỢNG NOÃN VÀ NUÔI NOÃN CHÍN TRÊN CHÓ Ngành : Thú Y Khóa : 2002 – 2007 Sinh viên thực hiện : NGUYỄN BẢO KHÁNH – 2007 – BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRUỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM KHOA CHĂN NUÔI THÚ Y  LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG SỐ LƯỢNG NOÃN VÀ NUÔI NOÃN CHÍN TRÊN CHÓ Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS. TRẦN THỊ DÂN NGUYỄN BẢO KHÁNH KS. NGUYỄN VĂN ÚT – 2007 – iii LỜI CÁM ƠN  Tôi xin chân thành cảm tạ và biết ơn : Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Ban chủ nhiệm khoa Chăn nuôi Thú y – trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Các quý thầy cô trong khoa Chăn nuôi Thú Y. Các quý thầy cô bộ môn Sinh lý Sinh hóa, đặc biệt tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Trần Thị Dân đã giúp đỡ, hướng dẫn tôi rất tận tình trong suốt quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp. KS. Nguyễn Văn Út – bộ môn Công nghệ Sinh học trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã đóng góp ý kiến, cung cấp tài liệu cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. BSTY Quách Tuyết Anh đã cung cấp tài liệu và kinh nghiệm trong phòng thí nghiệm. Những người bạn thân nhất đã chia sẻ những khó khăn, vui buồn trong suốt 5 năm học và những người bạn đã giúp tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện luận văn. Và tôi vô cùng biết ơn gia đình luôn tạo điều kiện tốt nhất cho tôi được học tập và đạt được kết quả như ngày hôm nay. Thành phố Hồ Chí Minh – 2007 Nguyễn Bảo Khánh iv MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn ......................................................................................................................... iii Mục lục .............................................................................................................................. iv Danh sách các bảng ........................................................................................................... vii Danh sách các biểu đồ ....................................................................................................... viii Danh sách các hình ảnh ..................................................................................................... ix Danh sách các chữ viết tắt ................................................................................................. x PHẦN 1 : MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 01 1.1 Đặt vấn đề ................................................................................................................... 01 1.2 Mục tiêu ...................................................................................................................... 01 1.3 Yêu cầu ....................................................................................................................... 01 1.4 Cải tiến so với các đề tài cũ ........................................................................................ 02 PHẦN 2 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................ 03 2.1 Cấu tạo và chức năng của hệ sinh dục chó cái ........................................................... 03 2.1.1 Buồng trứng ......................................................................................................... 03 2.1.2 Ống dẫn trứng ...................................................................................................... 04 2.1.3 Tử cung ................................................................................................................ 04 2.1.4 Âm đạo................................................................................................................. 05 2.2 Chu kỳ động dục của chó cái ...................................................................................... 05 2.2.1 Trước động dục .................................................................................................... 05 2.2.2 Động dục .............................................................................................................. 05 2.2.3 Sau động dục........................................................................................................ 06 2.2.4 Nghỉ ngơi ............................................................................................................. 06 2.3 Quá trình trưởng thành và phát triển của tế bào noãn ................................................ 07 2.3.1 Quá trình trưởng thành của nang noãn ................................................................. 07 2.3.2 Nội tiết của nang noãn tăng trưởng ...................................................................... 08 2.3.3 Sự trưởng thành của noãn ..................................................................................... 09 2.3.4 Phân loại noãn theo các giai đoạn ........................................................................ 11 v 2.4 Nuôi noãn in vitro (IVM) ........................................................................................... 13 2.4.1 Lịch sử IVM ........................................................................................................ 13 2.4.2 Hệ thống môi trường sử dụng trong nuôi noãn chó in vitro ................................ 13 2.4.3 Môi trường sinh hóa cho sự trưởng thành in vitro của noãn chó ........................ 16 2.4.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến IVM .......................................................................... 17 PHẦN 3 : NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................................................. 19 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện ................................................................................. 19 3.2 Nội dung khảo sát ....................................................................................................... 19 3.3 Vật liệu ....................................................................................................................... 19 3.3.1 Nguồn mẫu........................................................................................................... 19 3.3.2 Hóa chất ............................................................................................................... 19 3.3.3 Thiết bị ................................................................................................................. 21 3.3.4 Dụng cụ ................................................................................................................ 21 3.4 Phương pháp tiến hành ............................................................................................... 21 3.4.1 Bố trí khảo sát ...................................................................................................... 21 3.4.2 Cách tiến hành ..................................................................................................... 23 3.5 Xử lý thống kê ............................................................................................................ 28 PHẦN 4 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................... 29 4.1 Khảo sát 1: Ảnh hưởng của thời điểm thu hoạch buồng trứng lên số lượng noãn thu được và tỉ lệ noãn chín sau IVM .......................................................................... 29 4.2 Khảo sát 2: Ảnh hưởng của tuổi chó đến số lượng noãn thu được và tỉ lệ noãn chín sau IVM ...................................................................................................................... 30 4.3 Khảo sát 3: Ảnh hưởng của kích thước buồng trứng lên số lượng noãn thu được và tỉ lệ chín của noãn ....................................................................................................... 32 4.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của βmercaptoethanol đến tỉ lệ chín của noãn sau khi nuôi ............................................................................................................................. 33 PHẦN 5 : KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 36 5.1 Kết luận ....................................................................................................................... 36 5.2 Đề nghị ....................................................................................................................... 36 vi TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt .......................................................................................................................... 37 Tiếng Nước ngoài .............................................................................................................. 37 Trang web .......................................................................................................................... 39 Phụ lục ............................................................................................................................. 40 vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Phân loại noãn theo các giai đoạn ..................................................................... 12 Bảng 3.1 Thời gian mọc răng của chó .............................................................................. 24 Bảng 3.2 Phân loại noãn ................................................................................................... 26 Bảng 4.1 Số lượng noãn thu và tỉ lệ noãn phát triển tốt ở các thời điểm ......................... 29 Bảng 4.2 Tỉ lệ noãn ở các giai đoạn phát triển theo thời điểm trong năm ....................... 29 Bảng 4.3 Số lượng noãn thu và tỉ lệ noãn phát triển tốt ở các độ tuổi ............................. 30 Bảng 4.4 Tỉ lệ noãn ở các giai đoạn phát triển theo độ tuổi ............................................. 31 Bảng 4.5 Số lượng noãn thu và tỉ lệ noãn phát triển tốt ở các kích thước buồng trứng ....................................................................................................... 32 Bảng 4.6 Tỉ lệ noãn ở các giai đoạn phát triển theo kích thước buồng trứng .................. 32 Bảng 4.7 Tỉ lệ noãn ở các giai đoạn phát triển theo nồng độ βmercaptoethanol ............ 33 viii DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ Trang Biểu đồ 4.1 Số lượng noãn thu và tỉ lệ noãn phát triển ở các thời điểm thu hoạch ......... 30 Biểu đồ 4.2 Số lượng noãn thu và tỉ lệ noãn phát triển ở các độ tuổi .............................. 31 Biểu đồ 4.3 Số lượng noãn thu và tỉ lệ noãn phát triển tốt ở các kích thước buồng trứng ................................................................................................... 33 Biểu đồ 4.4 Tỉ lệ trung bình ở các giai đoạn phát triển ở từng nồng độ βME ................ 34 ix DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Quá trình phát triển của nang noãn .................................................................... 07 Hình 2.2 Sơ đồ nang Graaf ngay trước đỉnh LH ............................................................... 09 Hình 2.3 Noãn thứ cấp và thể cực thứ nhất ....................................................................... 10 Hình 2.4 Noãn di chuyển vào dịch nang ........................................................................... 10 Hình 2.5 Noãn và thể cực ở kỳ giữa II .............................................................................. 11 Hình 3.1 Công thức răng ở chó trưởng thành .................................................................... 23 Hình 3.2 Phân loại noãn .................................................................................................... 27 Hình 3.3 Sự giãn nở của tế bào cumulus ........................................................................... 27 Hình 4.1 Các giai đoạn phát triển của noãn....................................................................... 35 x DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BSA : Bovine serum albumin Albumin huyết thanh bò cAMP : Cyclic adenosine monophotphate COC : Cumulusoocyte complex Phức hợp noãn – tế bào hạt FSH : Follicle stimulating hormone Hormone kích thích nang noãn GV : Germinal vesical Giai đoạn túi mầm GVBD : Germinal vesical breakdown Giai đoạn vỡ túi mầm hCG : Human chorionic gonadotropin Kích dục tố nhau thai người HEPES : Hydroxyethylpiperazine ethanesulfonic acid IVM : in vitro maturation Trưởng thành trong ống nghiệm LH : Luteinizing hormone Hormone thể vàng MI : Metaphase I Trung kỳ I MII : Metaphase II Trung kỳ II NCSU 37 : North Carolina State University 37 PBS : Phosphatbuffered saline PVA : Polyvinyl alcohol xi TÓM TẮT LUẬN VĂN Đề tài “Một số yếu tố ảnh hưởng số lượng noãn và nuôi noãn chín trên chó” được tiến hành tại phòng thí nghiệm Sinh Lý Sinh Hóa, phòng Nuôi Cấy Tế Bào, khoa Chăn Nuôi Thú Y, trường đại học Nông Lâm TP. HCM. Việc lấy mẫu được thực hiện ở lò mổ anh Phước, quận Thủ Đức, TP. HCM. Thời gian thực hiện từ tháng 032007 đến tháng 072007. Đề tài có 4 nội dung khảo sát, bao gồm: So sánh số lượng noãn thu được và tỉ lệ noãn chín sau khi nuôi dựa trên thời điểm thu hoạch buồng trứng. Thời điểm thu hoạch được chia làm 4 thời điểm, đó là tháng 3 (20 chó), tháng 4 (26 chó), tháng 5 (17 chó) và tháng 6 (13 chó). Số noãn trung bình thu được trên mỗi chó ở từng thời điểm lần lượt là 22,8; 27,19; 40,06 và 37,38. Tỉ lệ noãn chín theo từng thời gian lần lượt là 1,2%; 2,64%; 3,06% và 3,8%. So sánh số lượng noãn thu được và tỉ lệ noãn chín sau IVM dựa theo tuổi chó. Tuổi chó được chia làm 4 khoảng, từ 5 – 12 tháng tuổi, > 12 – 18 tháng tuổi, > 18 – 24 tháng tuổi và > 24 tháng tuổi. Số noãn trung bình thu được trên mỗi chó ở mỗi độ tuổi lần lượt là 28,33; 40,36; 31,64 và 38,25. Tỉ lệ noãn chín ở từng độ tuổi lần lượt là 1,67%; 5,15%; 2,42% và 4,09%. So sánh số lượng noãn thu được và tỉ lệ noãn chín sau IVM dựa theo kích thước buồng trứng. Kích thước buồng trứng được chia làm 4 mức là ≤ 500 mm3, > 500 mm3 – 1000 mm3, > 1000 – 1500 mm3 và > 1500 mm3. Số noãn trung bình thu được trên mỗi chó ở mỗi khoảng kích thước buồng trứng lần lượt là 22,09; 43,71; 32,13 và 24,33. Tỉ lệ noãn chín ở từng mức kích thước buồng trứng lần lượt là 0,83%; 5,97%; 4,36% và 0%. xii Đánh giá ảnh hưởng của việc bổ sung βmercaptoethanol đến tỉ lệ noãn chín. Nồng độ βmercaptoethanol được bổ sung vào môi trường nuôi noãn lần lượt là 0 μM, 50 μM và 100 μM. Ở nồng độ 0 μM, tỉ lệ noãn phát triển đến giai đoạn GV, GVBD, MI, MII lần lượt là 33,81%; 8,95%; 5,17%; 2,26%. Ở nồng độ 50 μM, tỉ lệ noãn phát triển đến giai đoạn GV, GVBD, MI, MII lần lượt là 49,64%; 14,58%; 14,7%; 11,99%. Ở nồng độ 100 μM, tỉ lệ noãn phát triển đến giai đoạn GV, GVBD, MI, MII lần lượt là 42,16%; 14,28%; 9,61%; 4,89%. 1 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Xã hội ngày càng phát triển, mức sống nhân dân tăng dần thì đời sống tinh thần được chú trọng hơn. Mỗi người đều có nhu cầu giải trí, bầu bạn, tâm sự và hơn hết là cần được bảo vệ tính mạng cũng như tài sản. Ở đây chó là loài vật được ưa chuộng hàng đầu do bởi tính trung thành, sự thông minh và lòng can đảm. Mặt khác, đời sống người dân ngày nay khá cao nên mức độ thẩm mỹ cũng sâu sắc hơn. Chó được yêu thích trong nhà phải là chó đẹp, giống quý, lạ mắt, mà phần lớn những chú chó này là chó nhập từ nước ngoài với giá thành cao, thủ tục phức tạp. Đáp ứng nhu cầu trên, việc tạo ra chó con từ phôi sản xuất in vitro được khuyến khích với các ưu điểm : Tham gia vào quá trình chọn lọc, nhân giống, lai tạo để đạt được những tính trạng mong muốn Tối ưu hóa khả năng sinh sản của chó bố mẹ Sản xuất được số lượng lớn phôi trong thời gian ngắn, giá thành hạ Tiền đề cho công nghệ sinh sản vô tính trong tương lai Vì vậy đề tài “Một số yếu tố ảnh hưởng số lượng noãn và nuôi noãn chín trên chó” được thực hiện, nhằm chuẩn bị bước đầu cho việc sản xuất phôi chó in vitro. 1.2. Mục tiêu Cải thiện quy trình nuôi noãn trong phòng thí nghiệm và khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến số lượng noãn thu nhận và sự phát triển in vitro của noãn. 1.3. Yêu cầu Xác định quy trình nuôi noãn chín. Ghi nhận một số yếu tố ảnh hưởng số lượng noãn thu nhận từ chó ở lò mổ và tỉ lệ chín của noãn chó: thời điểm lấy mẫu trong năm, tuổi chó, kích thước buồng trứng. Khảo sát ảnh hưởng của βmercaptoethanol đến tỉ lệ noãn chín. 2 1.4. Cải tiến so với các đề tài cũ của nhóm nghiên cứu tại ĐH Nông Lâm TP. HCM Sau khi nghiên cứu các tài liệu khoa học nước ngoài và vì điều kiện khách quan, môi trường NCSU 37 được sử dụng thay cho môi trường TCM 199. So với kết quả tỉ lệ noãn chín (MII) của Lâm Thị Ngọc Thanh, 2006 là 0,75%, tỉ lệ noãn chín ở đây đạt được 11,99%. Khi thu buồng trứng tại lò mổ, mẫu được trữ trong dung dịch PBS có bổ sung kháng sinh thay vì trữ trong nước muối sinh lý (Nguyễn Bạch Thảo Vy, 2005), vì môi trường này cung cấp dinh dưỡng và bảo vệ buồng trứng tốt hơn trong thời gian vận chuyển về phòng thí nghiệm. 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Cấu tạo và chức năng của hệ sinh dục chó cái 2.1.1. Buồng trứng Đây là cơ quan sản xuất ra noãn và một số hormone sinh dục. Noãn ở buồng trứng phát triển trong một bao chứa đầy dịch gọi là nang noãn. Buồng trứng của chó cái có dạng hình oval, nằm trong hai túi buồng trứng, ở phía sau thận, khoảng đốt sống lưng thứ 3 4, buồng trứng phải nằm cao hơn buồng trứng trái. Chó cái có trọng lượng 12,5 kg thì buồng trứng có chiều dài 1,5 cm, chiều rộng 0,7 cm và chiều dày 0,5 cm. Kích thước của buồng trứng phụ thuộc vào trọng lượng cơ thể nhưng sự chênh lệch không quá 0,2 cm và kích thước của buồng trứng chó thay đổi qua từng giai đoạn của chu kỳ động dục (Luvoni và cs, 2003). Buồng trứng cấu tạo gồm phần lõi và phần vỏ. Nó được bao quanh bởi biểu mô sinh dục và thường tăng gấp 4 – 7 lần kích thước lúc sinh ra khi đạt tuổi thành thục. Phần lõi gồm mô liên kết sợi sắp xếp không đều và hệ thống mạch máu thần kinh bao quanh, động mạch được sắp xếp ở dạng xoắn ốc. Phần vỏ gồm các nang noãn, phần trung gian (tiền chất) và sản phẩm cuối của chúng. Ngoài ra, nó còn là vùng hình thành noãn và sản xuất hormone. Vì vậy buồng trứng có thể có những cấu trúc và thành phần khác nhau (nang noãn hoặc thể vàng) ở các giai đoạn khác nhau của sự phát triển hoặc thoái biến. Mô liên kết của phần vỏ bao gồm nguyên bào sợi, chất keo, sợi gian bào, mạch máu, mạch bạch huyết, dây thần kinh và sợi cơ trơn. Những tế bào mô liên kết gần bề mặt được sắp xếp gồ ghề song song với bề mặt buồng trứng và hơi dày hơn so với những tế bào hướng về phần lõi. Lớp này được gọi là màng bao buồng trứng. Trên bề mặt buồng trứng là một lớp tế bào dẹt, đó là biểu mô sinh dục (Hafez, 1968). Xét về chức năng, buồng trứng vừa là tuyến ngoại tiết sản xuất tế bào sinh dục cái (noãn bào), vừa là tuyến nội tiết tổng hợp và phân tiết estrogen, progesterone, androgen và oxytocin (Charlotte, 2000). 4 2.1.2. Ống dẫn trứng Là phần nối giữa buồng trứng với tử cung. Phần nối với buồng trứng loe rộng có dạng hình phễu được gọi là vòi Fallope. Phần nối với tử cung gọi là vòi tử cung. Ống dẫn trứng chia làm ba phần: phần phễu, phần rộng và phần eo. Phần phễu hay vòi Fallope tiếp xúc và bao bọc buồng trứng bằng những tua vòi. Vào giai đoạn xuất noãn, phần phễu sẽ bao chặt buồng trứng và di chuyển đến vị trí nang Graaf để hứng các noãn bào rụng. Phần rộng ở vị trí 13 ống dẫn trứng, nơi đây xảy ra hiện tượng thụ tinh. Phần eo nối tiếp với sừng tử cung có cấu tạo bởi lớp cơ trơn dày giúp di chuyển trứng đã thụ tinh đi về phía sừng tử cung. Về chức năng, đây là nơi để noãn di chuyển từ buồng trứng đến tử cung. Thời gian di chuyển này khoảng 2 ngày. Ống dẫn trứng còn là nơi để noãn trưởng thành, cũng là nơi hiện tượng thụ tinh xảy ra. 2.1.3. Tử cung Tử cung chó có dạng hình chữ Y cấu tạo gồm: hai sừng, thân và cổ tử cung. Thân tử cung định vị ở mặt dưới của bàng quang, một phần nằm trong xoang bụng, một phần nằm trong xoang chậu. Kích thước của tử cung rất thay đổi, tuỳ thuộc nhiều vào trọng lượng của chó cái, số lần mang thai, tình trạng viêm nhiễm của tử cung và các giai đoạn của sự mang thai. Một con chó cái nặng 12,5 kg có chiều dài phần sừng tử cung từ 10 – 15 cm, chiều dài phần thân tử cung từ 1,4 – 3 cm, có đường kính cổ tử cung là 0,8 cm (Luvoni, 2003). Sừng tử cung là phần nối giữa ống dẫn trứng và thân tử cung, nó nằm hoàn toàn trong xoang bụng, sừng bên phải thường dài hơn sừng bên trái. Thân tử cung là phần nối giữa sừng tử cung và âm đạo thông qua cổ tử cung. Cổ tử cung có cấu trúc như một cái vòi hẹp nối tử cung với âm đạo, dài 0,5 – 1 cm. Suốt thời kỳ mang thai, cổ tử cung rất gần với lỗ ra của đường sinh dục. Nó có chức năng như một rào cản chống lại sự xâm nhập của vi sinh vật vào tử cung. Tử cung có những chức năng như tiếp nhận tinh trùng của chó đực, vận chuyển tinh trùng đến ống dẫn trứng, cung cấp môi trường thuận lợi cho sự định vị và phát triển của phôi thai trong suốt giai đoạn mang thai, bảo vệ và tống bào thai ra ngoài. 5 2.1.4. Âm đạo Cơ quan rỗng này kéo dài từ cổ tử cung tới âm hộ, nằm hoàn toàn trong xoang chậu. Lớp lót bên trong của âm đạo được cấu thành từ những tế bào thay đổi đặc biệt suốt chu kỳ động dục. Chức năng: tiếp nhận dương vật chó đực trong quá trình giao phối và là đường tiếp dẫn thú con sinh ra. 2.2. Chu kỳ động dục ở chó cái Tuổi bắt đầu sinh sản ở chó từ 6 đến 24 tháng, trung bình là 9 – 10 tháng. Khoảng nghỉ giữa 2 chu kỳ động dục thay đổi từ 4 đến 12 tháng, trung bình là 7 tháng và khác nhau ở từng cá thể. Chu kỳ động dục ở chó cái được chia làm 4 giai đoạn: trước động dục, động dục, sau động dục và nghỉ ngơi (Nelson, 1989). 2.2.1. Trước động dục Giai đoạn này bắt đầu khi xuất hiện hiện tượng âm hộ sưng lên và chảy máu, và chấm dứt khi chó chịu phối. Đặc điểm của giai đoạn này là tăng sự tập trung estradiol, do đó làm âm hộ sưng phù và hóa sừng biểu bì âm đạo. Thời gian trung bình của giai đoạn là 9 ngày, với khoảng thay đổi là 3 đến 17 ngày. Sự hấp dẫn chó đực tăng dần suốt thời gian này. Trong giai đoạn này, nang noãn trải qua sự phát triển và trưởng thành và tiết ra 17βestradiol. Nồng độ estradiol tăng dần, từ thấp hơn 15 pgml đến cao hơn 50 pgml, rồi giảm nhanh trong 1 – 2 ngày trước khi LH tăng lên và giai đoạn động dục bắt đầu. 2.2.2. Động dục Giai đoạn này thường vào khoảng tháng 8 đến tháng 11, được xác định bằng sự chấp nhận giao phối. Độ dài trung bình là 9 ngày, với khoảng thay đổi từ 3 đến 21 ngày. Âm hộ bớt sưng và chảy máu so với giai đoạn trước động dục. Cùng với giảm nồng độ estradiol, nang noãn bắt đầu lutein hóa và tiết ra progesterone. Việc giảm estrogen và tăng progesterone ở cuối giai đoạn trước động dục được cho là nguyên nhân của sự thay đổi trong hành vi, đưa đến giai đoạn động dục và gây ra sự tăng tiết FSH và LH. Ở phần lớn chó cái, sự rụng trứng xảy ra trong vòng 48 giờ của việc tăng LH, thay đổi trong khoảng 0 đến 96 giờ. Noãn trưởng thành có khả năng tồn tại 2 – 3 6 ngày để được thụ tinh và tinh trùng chó có khả năng thụ tinh trong ống sinh dục cái trung bình 3 – 4 ngày, đôi khi kéo dài đến 6 ngày. 2.2.3. Sau động dục Giai đoạn này bắt đầu khi con cái từ chối giao phối. Không có dấu hiệu bên ngoài nào đánh dấu sự bắt đầu giai đoạn này ngoài sự chấm dứt các biểu hiện của giai đoạn động dục. Thể vàng tiết ra progesterone phụ thuộc vào LH tuyến yên và prolactin. Nồng độ progesterone tăng nhanh trong suốt 2 tuần đầu sau khi LH tăng và thời điểm rụng trứng. Nó đạt đến đỉnh cao nhất từ 15 đến hơn 80 ngml trong 15 – 30 ngày sau khi rụng trứng. Progesterone tiếp tục tăng, nhưng tiệm giảm trong 2 tháng tiếp theo, dù có xảy ra mang thai hay không. Ở chó có mang, có sự giảm nhanh progesterone xuống dưới 2 ngml, xảy ra khoảng 64 ngày sau khi LH tăng và 24 giờ trước khi sinh con. Ở chó không mang thai, sự giảm progesterone diễn ra chậm hơn và có thể không đạt đến mức cơ bản 0,2 – 0,5 ngml trong 90 ngày. 2.2.4. Nghỉ ngơi Giai đoạn này tiếp nối giai đoạn sau động dục và chấm dứt khi giai đoạn trước động dục của chu kỳ kế tiếp bắt đầu. Khoảng nghỉ từ khi chấm dứt giai đoạn sau động dục đến lúc bắt đầu giai đoạn trước động dục thay đổi khá lớn, nhưng trung bình là 4,5 tháng. Bởi vì không có dấu hiệu lâm sàng nào liên quan đến giai đoạn này, nên pha này của chu kỳ được mô tả là thời gian không có hoạt động tính dục. Thật ra tuyến yên, buồng trứng và tử cung vẫn hoạt động trong thời gian này. Sự lên xuống của LH và FSH của tuyến yên, sự tiết estrogen của buồng trứng đã được ghi nhận. Trong giai đoạn này, màng trong tử cung bong ra, hoạt động và kích thước các tuyến ở màng trong tử cung, độ dày cơ trơn thành tử cung, độ dày màng trong tử cung đều giảm. Quá trình phục hồi của màng trong tử cung kéo dài khoảng 120 ngày sau chu kỳ không mang thai và lâu hơn (150 ngày) ở chu kỳ mang thai. 7 2.3. Quá trình trưởng thành và phát triển của tế bào noãn 2.3.1. Quá trình trưởng thành của nang noãn Hình 2.1. Quá trình phát triển của nang noãn (Nguồn: http:sprojects.mmi.mcgill.ca...folliculardevelopmentpage.html) Trong suốt quá trình hình thành phôi, tế bào mầm nguyên thủy phát triển từ trung bì ở túi niệu, định vị tại buồng trứng, sau đó tăng lên về số lượng và biệt hóa Tế bào mầm nguyên thuỷ Nang noãn nguyên thuỷ Nang Graaf Xuất noãn Thể vàng Thể trắng Nang noãn bậc 1 Nang noãn bậc 2 8 thành nang noãn nguyên thủy. Nang noãn nguyên thủy ngừng phát triển đến giai đoạn cơ thể thành thục về mặt sinh dục. Vào đầu chu kỳ động dục, nang noãn nguyên thủy phát triển thành nang noãn sơ cấp. Dưới ảnh hưởng của gonadotropin và các hormone buồng trứng, nang noãn phát triển thành nang Graaf, một số nang không phát triển trở thành nang noãn tịt. Khi nang Graaf xuất noãn, noãn và một số tế bào hạt rơi vào màng bụng, trong khi các tế bào hạt còn lại vẫn ở trong buồng trứng. Các tế bào này và lớp tế bào vỏ sau đó phát triển thành thể vàng. 2.3.2. Nội tiết của nang noãn tăng trưởng Sự tăng trưởng, thành thục, rụng trứng và lutein hóa của nang Graaf phụ thuộc vào các yếu tố: kiểu chế tiết thích hợp, hàm lượng đủ và tỉ lệ phù hợp của FSH và LH trong huyết thanh. Những hormone này gồm các steroid, các prostaglandin, các glycoprotein (những phức hợp của axit sialic và polypeptid chuỗi kép) và tất cả chúng đều được chế tiết từ những tế bào B của tuyến yên. FSH giữ vai trò chủ đạo cho việc khởi đầu sự hình thành xoang nang. Gonadotropin này kích thích quá trình phân bào nguyên nhiễm của tế bào hạt và quá trình hình thành dịch nang. Estradiol thúc đẩy tác dụng phân bào nguyên nhiễm của FSH. FSH kích thích những tế bào hạt thông qua các thụ thể màng, mà số lượng thụ thể của mỗi tế bào được duy trì ổn định trong giai đoạn tăng trưởng của nang. Ngoài ra FSH làm tăng khả năng cảm ứng của tế bào hạt đối với LH bằng cách tăng số lượng các thụ thể LH. Ở heo, các thụ thể LH tăng từ 300 (trong các nang bé) lên 10000 (trong các nang lớn trước lúc xuất noãn). Việc tăng thụ thể LH như vậy chuẩn bị cho quá trình lutein hoá của các tế bào hạt trong việc đáp ứng sóng gây xuất noãn của LH. Vai trò của LH trong sự phát triển nang noãn có phần phức tạp hơn. Tế bào vỏ mang thụ thể với LH. LH có khả năng kích thích sự sản xuất androgen trong tế bào vỏ, sau đó androgen sẽ được chuyển thành estrogen dưới kích thích của FSH tại tế bào hạt. Ở giữa chu kỳ, thụ thể LH được phát triển trên tế bào hạt. Ở giai đoạn này, LH có vai trò hiệp đồng với FSH làm nang noãn tiếp tục phát triển và chuẩn bị nang noãn cho đỉnh LH giữa chu kỳ. Cuối cùng, tương tác giữa LH và nang noãn trước thời điểm phóng noãn cắt đứt sự liên kết giữa tế bào bao quanh với noãn làm cho noãn hoàn 9 thành giảm phân để trưởng thành, gây vỡ nang và khởi phát hoàng thể hóa. Ở heo cái, số lượng các thụ thể trên mỗi tế bào vỏ chỉ tăng lên gấp đôi vào cuối kỳ tăng trưởng của nang (Isobe, 2001). 2.3.3. Sự trưởng thành của noãn Trong tuần đầu của chu kỳ trưởng thành, noãn liên kết với nang và phụ thuộc vào sự phát triển của những tế bào nang xung quanh. Nang liên kết chặt chẽ nhất với noãn sẽ trở thành nang chính và sau đó trở thành nang Graaf. Hình 2.2. Sơ đồ nang Graaf ngay trước đỉnh LH (Nguồn: http:www.embryology.changlaisdbefruchtungeisprung02.html) Chú thích:  Mặt ngoài và mặt trong màng bao nang  Màng đáy giữa màng bao và lớp tế bào hạt  Tế bào hạt  Mô buồng trứng  Dịch nang  Màng bao buồng trứng  Noãn sơ cấp  Xoang bụng  Lớp tế bào cumulus Sự trưởng thành của noãn là sự hấp thu các vật chất được cung cấp bởi các tế bào hạt bám xung quanh màng trong suốt của bề mặt noãn. Nhân của noãn cũng trưởng thành vào những ngày cuối trước đỉnh LH. Cho tới thời điểm này, nhiễm sắc thể đang ở kỳ trước I của lần phân chia thứ nhất (prophase I). Nhiễm sắc thể từ từ xoắn lại, hạch nhân và màng nhân biến mất, thoi phân bào được thành lập, chuẩn bị cho sự hoàn tất lần phân chia thứ nhất ngay vào lúc đỉnh LH. Thể cực xuất hiện đánh dấu lần phân chia thứ nhất hoàn tất (telophase I). 10 Hình 2.3. Noãn thứ cấp và thể cực thứ nhất (Nguồn: http:www.embryology.changlaisdbefruchtungeisprung02.html) Dưới tác dụng của LH, các tế bào hạt bắt đầu dãn ra và nhân lên, đồng thời chúng cũng sản xuất progesterone và phóng thích vào dịch nang. Noãn thứ cấp và thể cực bây giờ có bộ nhiễm sắc đơn bội. Ngoài các hormone, tế bào hạt cũng tiết ra hợp chất khác, chủ yếu là acid hyaluronic, vào dịch nang. Trước thời điểm rụng trứng lượng dịch nang tăng rõ rệt. Sự liên kết giữa các tế bào cumulus ngày càng lỏng lẻo, theo hướng đó, những tế bào cumulus này và noãn tách khỏi nơi chúng bám trên thành nang và rơi vào dịch nang. (Nguồn: http:www.embryology.changlaisdbefruchtungeisprung02.html) Chú thích:  Ổ bụng Chú thích:  Thể cực Hình 2.4. Noãn di chuyển vào dịch nang 11  Dịch nang (chứa nhiều acid hyaluonic và progesterone)  Noãn và đám mây tế bào cumulus  Lớp tế bào cumulus giãn ra  Noãn thứ cấp  Màng phóng xạ  Mô buồng trứng Noãn bây giờ đã hoàn tất các giai đoạn của sự trưởng thành. Các nhiễm sắc thể kép tập trung về mặt phẳng xích đạo của thoi phân bào sát màng tế bào (metaphase II), gần vị trí của thể cực. Các nhiễm sắc thể đơn tách về 2 cực tế bào. Quá trình tương tự diễn ra trong thể cực. Hình 2.5. Noãn và thể cực ở kỳ giữa II (metaphase II) (Nguồn: http:www.embryology.changlaisdbefruchtungeisprung02.html) Chú thích:  Thoi phân bào và các chromosome  Thoi phân bào trong thể cực  Không bào Nang noãn bây giờ đã sẵn sàng cho quá trình rụng trứng. 2.3.4. Phân loại noãn theo các giai đoạn + FC, SC: Noãn đang tăng trưởng trong buồng trứng + GV I: Noãn đã tăng trưởng đầy đủ + GV II, GV III, GV IV: Noãn bắt đầu chín dưới ảnh hưởng của hormone gonadotropin 12 Bảng 2.1. Bảng phân loại noãn theo các giai đoạn (Hong Thuy Bui, 2004) FC Filamentous chromatin stage Các sợi NST nằm rải rác khắp túi nhân, nhân bắt màu orcein và có nhiều không bào SC Stringy chromatin stage NST bắt đầu xoắn lại, nhân không bắt màu GV I Germinal vesicle I stage Túi nhân còn nguyên có đặc điểm là màng nhân rõ ràng và NST xung quanh nhân bắt màu GV II Germinal vesicle II stage NST xếp quanh nhân, một vài vùng bắt màu orcein gần màng nhân GV III Germinal vesicle III stage Dịch nhân mất hạt, nhưng màng nhân vẫn còn nguyên, NST kép xuất hiện quanh nhân 13 GV IV Germinal vesicle IV stage Màng nhân mờ dần và nhân biến mất hoàn toàn, NST kép tách rời nhau 2.4. Nuôi noãn chín in vitro (IVM, in vitro maturation) 2.4.1. Lịch sử IVM Năm 1935, Pincus và Enzmann tách noãn thỏ chưa trưởng thành khỏi sự ức chế của nang noãn, cho phép noãn đạt tới trưởng thành khi nuôi cấy in vitro. Năm 1983, Minato và Toyoda (Nhật) và Schroeder và Eppig (Mỹ) cho rằng noãn chuột được trưởng thành in vitro có khả năng tạo phôi nếu được thụ tinh. Năm 1983, Lenz và cộng sự cho rằng 39oC là nhiệt độ tối ưu để noãn bò trưởng thành in vitro. Năm 1988, Lu và cộng sự cho ra đời con bê từ kỹ thuật chín noãn và thụ tinh in vitro. Năm 1996, Eppig và O’Brien cho ra đời chuột con sau khi dùng kỹ thuật IVM, thụ tinh in vitro và chuyển phôi vào tử cung chuột mẹ. 2.4.2. Hệ thống môi trường sử dụng trong nuôi noãn chó in vitro 2.4.2.1. Môi trường nang noãn Sự duy trì cấu trúc 3 chiều của nang noãn cho phép bảo toàn chức năng và sự nguyên vẹn về mặt hình thái của những thành phần duy trì sự phát triển của noãn và sự trưởng thành in vivo. Bolamba và cs (1998) đánh giá sự trưởng thành nhân của noãn chó được lấy từ những nang nuôi cấy in vitro trong các đĩa nuôi cấy bằng nhựa phủ 0,6% agar tinh sạch để ngăn chặn sự mất mát của tế bào hạt. Kết quả đạt được cao nhất ở quá trình từ MI đến MII khi noãn được nuôi cấy trong 48 giờ trong những nang noãn ở giai đoạn tiền nang (11,5%) hay đầu giai đoạn xoang nang (8,7%). Nguyên nhân gây nên tỉ lệ thành công thấp này là do sự phân tách làm gián đoạn sự trao đổi sinh lý của những yếu tố bên trong nang noãn, điều này làm giảm khả năng hỗ trợ của nang noãn lên quá trình giảm phân của noãn. 14 2.4.2.2. Môi trường giọt Hệ thống nuôi cấy phổ biến này thích hợp cho sự trưởng thành của noãn ở rất nhiều loài khác nhau, bao gồm các loài chó thuần hóa. Đây là một hệ thống các giọt môi trường được phủ bằng dầu khoáng. Trong hệ thống này, các yếu tố sinh hoá chính được đặc trưng bằng tỉ lệ thể tích của môi trường và số noãn nuôi cấy trong một giọt. Quá nhiều noãn nuôi cấy trong một giọt nhỏ sẽ ức chế sự giảm phân. Ngoài ra, các chất do tế bào hạt tụ tiết ra cũng là tác nhân ức chế sự giảm phân. Các yếu tố này có lẽ ức chế sự tách riêng ra của các vùng kết nối trên màng tế bào, do đó ngăn chặn noãn trải qua giai đoạn vỡ túi nhân (germinal vesicle breakdown – GVBD). Tóm lại, chính sự gián đoạn liên hệ giữa noãn và tế bào hạt đã ảnh hưởng đến sự giảm phân (Isobe và cs, 2001). Noãn chó được nuôi cấy trong những thể tích môi trường khác nhau với mật độ khác nhau (số noãn : thể tích môi trường). Số liệu duy nhất liên quan đến sự tác động của mật độ noãn lên sự giảm phân được báo cáo bởi Otoi và cộng sự (2002). Kết quả của nghiên cứu này chỉ ra rằng ảnh hưởng của mật độ noãn khác nhau tuỳ thuộc vào chu kỳ động dục của chó cái. Khi 10 phức hợp noãn – tế bào hạt (cumulusoocyte complex – COC) lấy từ buồng trứng của chó ở giai đoạn nghỉ ngơi được nuôi cấy trong giọt 100 μl, tỉ lệ noãn đạt MII cao hơn có ý nghĩa về mặt thống kê so với các nhóm 5 COC (10,2% so với 4,6%). Nhưng không có sự khác biệt giữa các noãn lấy từ buồng trứng của chó ở giai đoạn sau động dục. Mật độ noãn phù hợp liên quan đến chu kỳ động dục của chó cái (tỉ lệ này ở giai đoạn nghỉ ngơi là 1:10, ở giai đoạn sau động dục là 1:7). Điều này có thể chứng minh rằng số lượng và ảnh hưởng của tế bào cumulus khác biệt giữa hai pha của chu kỳ động dục. 2.4.2.3. Môi trường tế bào một lớp Tác động có lợi của môi trường đồng nuôi cấy lên sự phát triển của phôi đã được biết rõ từ sự sản xuất tạo phôi bò in vitro (Gordon, 1994). Trên chó, Otoi sử dụng hệ thống tế bào hạt của bò với môi trường nuôi cấy phôi trong IVM. Tỉ lệ noãn đạt MII tăng nhưng không tác động lên sự phát triển kế tiếp sau quá trình thụ tinh in vitro. 15 Hệ thống đồng nuôi cấy với tế bào ống dẫn trứng chó đơn lớp lần đầu tiên đã được thử nghiệm trong IVM trên chó bởi Hewitt và England, 1999. Kết quả chỉ ra rằng tế bào ống dẫn trứng đã không có tác động tích cực nào lên sự trưởng thành nhân sau 48 giờ đồng nuôi cấy. Chỉ sau 96 giờ, có một sự cải thiện nhỏ lên quá trình giảm phân. Gần đây Bogliolo và cs (2002) chứng minh rằng môi trường đồng nuôi cấy với tế bào ống dẫn trứng lấy từ vùng nang của chó cái ở giai đoạn động dục có tác động tích cực lên tỉ lệ noãn chín (MII). Tỉ lệ này đạt 16,7% (sau 48 giờ) và 23,2% (sau 72 giờ). Trong trường hợp này, có lẽ tình trạng của chu kỳ động dục và những vùng trên ống dẫn trứng (nơi lấy các tế bào để nuôi cấy) có tác dụng quyết định. Môi trường đồng nuôi cấy noãn chó trên tế bào ống dẫn trứng đơn lớp là một nỗ lực để tạo các điều kiện sinh lý cho quá trình giảm phân. Tuy nhiên, mô hình này vẫn còn khác biệt so với môi trường ống dẫn trứng in vivo bởi vì trên chó có vài đặc tính riêng biệt có ích trong việc hỗ trợ sự trưởng thành và kéo dài khả năng phát triển của noãn. 2.4.2.4. Môi trường ống dẫn trứng tách biệt Ống dẫn trứng tách biệt có lẽ cung cấp môi trường in vitro với những đặc điểm khác với tế bào ống dẫn trứng đơn lớp. Thực vậy, các tế bào được nuôi cấy đặc trưng bởi một số loại tế bào giới hạn (Hewitt và England, 1999), trong khi đó, trong ống dẫn trứng tách biệt, tất cả các loại tế bào đều hiện diện và có lẽ chúng được duy trì trong cùng tình trạng biệt hóa như trong cơ thể sống. Một lợi thế khác của hệ thống nuôi cấy này là sự bảo toàn cấu trúc không gian và sự tương tác giữa lớp niêm mạc và noãn. Điều này tạo ra một vi môi trường khác với nuôi cấy trên tế bào đơn lớp hay trên môi trường giọt. Luvoni và cs (2003) chứng minh rằng nuôi cấy noãn trong vùng eo của ống dẫn trứng có ảnh hưởng tích cực lên sự sống sót của noãn và quá trình trưởng thành nhân có được trong vòng 30 giờ nuôi cấy, kết quả quá trình giảm phân (MI  MII) đạt từ 12,5 – 31,9%. Hệ thống này khó thực hiện trong thực tế. Tuy nhiên ống dẫn trứng tách biệt, bên cạnh sự hiện diện của tế bào ống dẫn trứng, có thể còn cung cấp chất tiết và các yếu tố khác (như nguyên liệu dinh dưỡng năng lượng hay các yếu tố khác) liên quan đến sự trưởng thành và khả năng sống sót của noãn chó. 16 2.4.3. Môi trường sinh hóa cho sự trưởng thành in vitro của noãn chó 2.4.3.1. Môi trường nuôi cấy Môi trường đơn giản: gồm dung dịch nước muối sinh lý và nguồn năng lượng như pyruvate, lactate và glucose. Môi trường phức tạp: là môi trường chứa thêm hỗn hợp acid amin, vitamin và các phân tử khác. So sánh giữa môi trường đơn giản và môi trường phức tạp đối với sự trưởng thành của noãn chó đã không được báo cáo. TCM 199 và NCSU 37 là những môi trường phức tạp hỗ trợ tốt nhất đến sự trưởng thành nhân của noãn chó. 2.4.3.2. Các chất bổ sung vào môi trường Hormone Sự cung cấp các chất ngoại bào rất cần thiết cho noãn chó để tiếp nhận các yếu tố của ống dẫn trứng, giúp cho quá trình giảm phân và trưởng thành của noãn. Thực vậy, ảnh hưởng của hormone trong nang noãn có lẽ là nhân tố chính giúp noãn đạt giảm phân ở giai đoạn MII rất cao (31,9%) khi lấy noãn ở chó cái đa xuất noãn (Yamada và cs, 1993). Ở nhiều loài, người ta chứng minh rằng FSH giúp cho quá trình giảm phân in vitro bằng cách điều hoà mức độ cAMP trong phức hợp COC. Ngoài ra, FSH còn giúp quá trình giãn nở của tế bào cumulus, một trong những yếu tố liên quan đến khả năng giảm phân của noãn. Nhưng trái lại, khả năng trưởng thành của noãn chó không liên quan đến mức độ giãn nở của tế bào cumulus. Sự hiện diện của gonadotropin (FSHLH 1μgml kết hợp hoặc riêng lẽ) đã không làm tăng tỉ lệ giảm phân (Hewitt và England, 1999). Nguồn protein Huyết thanh thai bò (FBS) chỉ hỗ trợ khả năng phát triển của noãn chó in vitro khi thêm với nồng độ trên 10%, nhưng lại không giúp cho quá trình giảm phân (Hewitt và cs,1998). 17 Chất cung cấp năng lượng và chất chống oxi hoá Sự sống sót của tế bào trong môi trường nuôi cấy đòi hỏi phải cung cấp một nguồn năng lượng thích hợp, nhưng tỉ lệ kết hợp tối ưu giữa các chất cung cấp năng lượng hỗ trợ cho quá trình giảm phân của noãn chó vẫn chưa được hiểu rõ. Để ngăn chặn sự oxi hoá xảy ra trong quá trình nuôi cấy, các hợp chất chống oxi hoá cần được thêm vào môi trường. Betamercaptoethanol (βME), một tiền chất của glutathione – hợp chất chống oxi hoá trong tự nhiên – tổng hợp bởi tế bào sống được thêm vào môi trường nuôi noãn. Sự hiện diện của βME làm gia tăng tổng hợp glutathione và làm tăng tỉ lệ chín của noãn bò. Tuy nhiên, báo cáo duy nhất trên noãn chó cho thấy hợp chất chống oxi hoá này đã không làm tăng tỉ lệ giảm phân (Hewitt và cs, 1998). Các hợp chất khác Khi noãn bị phóng thích khỏi nang noãn, sự dịch mã dừng lại. Do đó, duy trì noãn bò trong tình trạng ngừng giảm phân bằng cách nuôi chúng trong chất ức chế giảm phân cho phép noãn hoàn thành quá trình dịch mã và trải qua quá trình biến đổi siêu cấu trúc. Điều này sẽ làm tăng tỉ lệ noãn chín sau khi noãn được đưa ra khỏi tình trạng ngừng giảm phân và nuôi cấy trong môi trường bình thường. Dựa trên sự khám phá này, cơ chế tương tự đã được áp dụng cho noãn chó. Một chất tương tự như cAMP, dibutyryl cyclic adenosine monophotphate (dbcAMP) được sử dụng để duy trì noãn trong tình trạng ngừng giảm phân. Quá trình giảm phân của noãn bị chặn lại. Tuy nhiên, nuôi cấy 2 bước (24 giờ với dbcAMP) và 48 giờ không có dbcAMP) đã không tăng tỉ lệ noãn đạt MII. 2.4.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến IVM 2.4.4.1. Thời gian Thời gian cần thiết cho sự trưởng thành noãn in vitro ở loài chó vẫn còn là một câu hỏi chưa lời giải đáp. Vài tác giả báo cáo rằng quá trình trưởng thành đầy đủ của noãn xảy ra sau 24 – 48 giờ nuôi cấy trong khi một số nhà khoa học khác lại chỉ định rằng thời gian để đạt tỉ lệ noãn trưởng thành cao nhất là 72 – 96 giờ. 18 2.4.4.2. Chất lượng noãn và kích thước nang noãn Theo Sorrensen và Wassaman (1976) nang noãn nguyên thủy chứa noãn không có khả năng hỗ trợ quá trình giảm phân và phát triển của phôi. Tỉ lệ noãn có khả năng giảm phân và hỗ trợ quá trình phát triển của phôi tăng dần theo đường kính của noãn. 2.4.4.3. Tuổi và tình trạng sinh dục chó cái Hewitt và England (1998) so sánh noãn chó từ 2 nhóm tuổi: từ 1 – 6 tuổi và trên 7 tuổi. Kết quả chứng minh rằng noãn từ các chó từ 1 6 tuổi đạt tỉ lệ trưởng thành nhiều hơn nhóm thứ hai. Nghiên cứu của Rodrigues và Rodrigues (2003) cho thấy rằng kết quả IVM trên noãn chó không ảnh hưởng bởi tình trạng sinh dục của chó cái. Chất lượng của noãn là yếu tố cần thiết trong IVM hơn là môi trường hormone của chó cái tại thời điểm thu nhận noãn. 2.4.4.4. Nồng độ oxi và nhiệt độ Nồng độ oxi ảnh hưởng đến sự trưởng thành nhân của noãn chuột và bò. Vài tài liệu chứng minh rằng mức oxi 5% thích hợp hơn mức oxi bình thường trong không khí (20%) (Gordon, 2004). Dữ liệu liên quan đến nồng độ oxi trong nuôi cấy noãn chó chỉ ra rằng mức oxi 5% hoặc 20% trong môi trường TCM 199 hay CMRL 1066 đã không ảnh hưởng đến sự trưởng thành của nhân (Sorensen và Wassaman, 1976). Về nhiệt độ, noãn chó đã được nuôi cấy trong khoảng nhiệt độ từ 37 – 390C, nhưng không có bất cứ số liệu nào so sánh sự khác biệt giữa nhiệt độ trong tủ nuôi cấy. 19 PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện Thời gian: từ 05032007 đến 20072007. Địa điểm: phòng thí nghiệm Sinh Lý Sinh Hoá, phòng Nuôi Cấy Tế Bào, khoa Chăn Nuôi Thú Y, Trường Đại Học Nông Lâm TP. HCM. 3.2. Nội dung khảo sát Xác định môi truờng nuôi noãn chín. So sánh số lượng noãn thu được và tỉ lệ noãn chín sau IVM dựa theo thời điểm thu hoạch buồng trứng, tuổi chó và kích thước buồng trứng. Đánh giá ảnh hưởng của việc bổ sung βmercaptoethanol vào môi truờng nuôi in vitro đến tỉ lệ noãn chín. 3.3. Vật liệu 3.3.1. Nguồn mẫu Buồng trứng chó từ chó ở lò mổ anh Phước, quận Thủ Đức, Tp. Hồ Chí Minh. 3.3.2. Hóa chất Hóa chất thu hoạch buồng trứng Phosphatbuffered saline (PBS), pH=7,4 , trữ ở nhiệt độ phòng. NaCl 137 mM KCl 2,7 mM Na2HPO4 8 mM KH2PO4 2 mM Nước cất khử ion Hóa chất thu hoạch noãn HEPESTLPVA, pH=7,4 , trữ ở 4oC Hepes KOH 10 mM NaCl 129 mM KH2PO4 0,8 mM MgCl2 0,8 mM 20 D – glucose 5,6 mM NaHCO3 8,9 mM CaCl2 1 mM PVA 0,1% Nước cất khử ion Hóa chất nuôi noãn Môi trường North Carolina State University 37 (NCSU 37) có bổ sung BSA 0,4% , trữ ở 4oC. NaCl 108,73 mM NaHCO3 25,07 mM KCl 4,78 mM KH2PO4 1,19 mM MgSO4.7H2O 1,19 mM CaCl2.2H2O 1,70 mM Glucose 5,55 mM Penicillin G 0,18 mM Streptomycine sulphate 39,00 mM D – Sorbitol 5,55 mM BSA 0,4% Nước cất khử ion Follicle stimulating hormone (FSH) 1 μgml Human chorionic gonadotropin (hCG) 10 UIml Estradiol 1 μgml Phenol red 2 μgml Hóa chất nhuộm noãn Hyaluronidase 0,1% Acid acetic : ethanol 1 : 3 vv Acetoorcein 1% Acetoglycerol 21 3.3.3. Thiết bị Kính hiển vi đảo ngược (Olympus CX41) Kính hiển vi soi nổi (Nikon SMZ800) Tủ ấm CO2 Tủ thao tác vô trùng 3.3.4. Dụng cụ Bình giữ nhiệt Bộ ổn nhiệt Kéo các loại Khay Becher Găng tay Kẹp Đầu tip các loại Pipette Pasteur vô trùng Micropipette Màng lọc (0,2μm) Đĩa petri nhựa (35 x 10 mm) Đĩa petri thủy tinh Lame và lamel Chai lọ đựng hóa chất và vật mẫu Đèn cồn pH kế 3.4. Phương pháp tiến hành 3.4.1. Bố trí khảo sát + Khảo sát 1: Ảnh hưởng của thời điểm thu hoạch buồng trứng lên số lượng noãn thu được và tỉ lệ noãn chín sau IVM Mục tiêu: So sánh số lượng noãn thu được và tỉ lệ noãn chín sau IVM ở các thời điểm lấy mẫu khác nhau. 22 Cách thực hiện: Chia thời điểm thu hoạch buồng trứng theo 4 giai đoạn khảo sát từ 05032007 đến 28032007 (lô 1, có 20 chó), từ 01042007 đến 27042007 (lô 2, có 26 chó), từ 02052007 đến 31052007 (lô 3, có 17 chó) và từ 01062007 đến 16062007 (lô 4, 13 chó). Chỉ tiêu quan sát: Số lượng noãn thu được và tỉ lệ noãn chín sau khi IVM với môi trường cơ bản NCSU 37. Phương pháp thống kê: Kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố. + Khảo sát 2: Ảnh hưởng của tuổi chó đến số lượng noãn thu được và tỉ lệ noãn chín sau IVM Mục tiêu: So sánh số lượng noãn thu được và tỉ lệ noãn chín sau IVM ở các độ tuổi. Cách thực hiện: Khảo sát dựa vào 4 giai đoạn tuổi của chó, từ 5 đến 12 tháng tuổi (lô 1, có 12 chó), lớn hơn 12 đến 18 tháng tuổi (lô 2, có 14 chó), lớn hơn 18 đến 24 tháng tuổi (lô 3, có 11 chó) và lớn hơn 24 tháng tuổi (lô 4, có 8 chó). Chỉ tiêu quan sát: Số lượng noãn thu được và tỉ lệ noãn chín sau khi IVM với môi trường cơ bản NCSU 37. Phương pháp thống kê: Kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố. + Khảo sát 3: Ảnh hưởng của kích thước buồng trứng lên số lượng noãn thu được và tỉ lệ chín của noãn Mục tiêu: So sánh số lượng noãn thu được và tỉ lệ noãn chín sau IVM ở các kích thước buồng trứng. Cách thực hiện: Kích thước buồng trứng được tính theo công thức: Kích thước (mm3) = Dài (mm) x Rộng (mm) x Dày (mm) Phân chia 4 nhóm kích thước buồng trứng chó, ≤ 500 mm3 (lô 1, có 11 chó), > 500 mm3 và ≤ 1000 mm3 (lô 2, có 23 chó), > 1000 mm3 và ≤ 1500 mm3 (lô 3, có 8 chó) và > 1500 mm3 (lô 4, có 3 chó). Chỉ tiêu quan sát: Số lượng noãn thu được và tỉ lệ noãn chín sau khi IVM với môi trường cơ bản NCSU 37. Phương pháp thống kê: Kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố. 23 + Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của βmercaptoethanol đến tỉ lệ chín của noãn sau khi nuôi Mục tiêu thí nghiệm: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ βmercaptoethanol đến sự phát triển của noãn. Cách thực hiện: Bố trí thí nghiệm theo nồng độ βmercaptoethanol được bổ sung vào môi truờng cơ bản NCSU 37, với 3 nghiệm thức là 0 μM (lô đối chứng, 10 chó), 50 μM (lô 2, 10 chó), 100 μM (lô 3, 10 chó). Chỉ tiêu quan sát: Chất lượng noãn sau IVM và mức độ phát triển của noãn. Phương pháp thống kê: Kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố. 3.4.2 Cách tiến hành 3.4.2.1. Xác định tuổi chó Vì mẫu được lấy ở lò mổ, nên việc đoán tuổi chó được dựa vào hình dạng của răng . Công thức răng: Răng sữa: 2(33 cửa + 11 nanh + 33 tiền hàm) = 28 Răng vĩnh viễn: 2(33 cửa + 11 nanh + 44 tiền hàm + 23 hàm) = 42 Hình 3.1. Công thức răng ở chó trưởng thành (Nguồn: http:www.wirefoxterrierassociation.co.ukconformationSkull.jpg) 2 răng hàm răng nhai thịt 4 răng tiền hàm 1 răng nanh 3 răng cửa 3 răng cửa 1 răng nanh 4 răng tiền hàm răng nhai thịt 3 răng hàm 24 Bảng 3.1. Thời gian mọc răng của chó (Nguồn: Merck Veterinary Manual, 2006) Răng Thời gian Răng cửa sữa 1 Răng cửa sữa 2 Răng cửa sữa 3 Răng cửa 1 Răng cửa 2 Răng cửa 3 Răng nanh sữa Răng nanh Răng tiền hàm sữa 2 Răng tiền hàm sữa 3 Răng tiền hàm sữa 4 Răng tiền hàm 1 Răng tiền hàm 2 Răng tiền hàm 3 Răng tiền hàm 4 Răng hàm 1 Răng hàm 2 Răng hàm 3 4 – 5 tuần 4 – 5 tuần 3 – 4 tuần 4 tháng 4 ½ tháng 5 tháng 3 – 4 tuần 5 – 6 tháng 4 – 6 tuần 4 – 6 tuần 4 – 6 tuần 4 – 5 tháng 5 – 6 tháng 5 – 6 tháng 5 – 6 tháng 4 – 5 tháng 5 – 6 tháng 6 – 7 tháng Hình dáng răng : 1 ½ năm: đỉnh răng cửa dưới 1 mòn. 1 ½ 2 ½ năm: đỉnh răng cửa dưới 2 mòn. 3 ½ năm: đỉnh răng cửa trên 1 mòn. 4 ½ năm: đỉnh răng cửa trên 2 mòn. 5 năm: đỉnh răng cửa dưới 3 hơi mòn. Bề mặt nhai của răng cửa dưới 1 và 2 hình chữ nhật. Các răng nanh hơi mòn. 25 6 năm: đỉnh răng cửa dưới 3 mòn. Các răng nanh mòn tù. Răng nanh dưới có dấu vết răng cửa trên 3. 7 năm: bề mặt nhai của răng cửa dưới 1 hình elip với mặt cắt dài. 8 năm: bề mặt nhai của răng cửa dưới 1 nghiêng về phía trước. 10 năm: răng cửa dưới 2 và răng cửa trên 1 có bề mặt nhai hình elip. 12 năm: răng cửa bắt đầu rụng. 3.4.2.2. Thu buồng trứng từ chó Đặt chó nằm ngửa, xác định vị trí cần mổ (từ rốn kéo dài về phía đuôi khoảng 5cm), dùng cồn sát trùng vị trí mổ Mổ bụng chó 1 đường 5 – 7cm, cách rốn 2cm Dùng 2 ngón tay tìm 2 buồng trứng trái và phải (nằm phía dưới thận, kết nối bởi mô liên kết) Dùng kéo cắt, thu nhận phức hợp gồm buồng trứng và 1 phần ống dẫn trứng Trữ trong PBS có bổ sung 75 μgml Penicillin, 50 μgml Streptomycine ở 30 370C Vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm. 3.4.2.3. Xử lý buồng trứng Buồng trứng sau khi mang về phòng thí nghiệm, được xịt khử trùng bằng cồn 70% Tách buồng trứng ra khỏi mô mỡ Đo kích thước các chiều của buồng trứng Trữ trong PBS có bổ sung 75 μgml Penicillin, 50 μgml Streptomycine ở 30 370C Chuyển vào tủ thao tác vô trùng. 3.4.2.4. Tìm và rửa noãn (Rodrigues, 2002) Chuyển buồng trứng vào dung dịch HEPES – TL – PVA, cắt trứng Xem dưới kính hiển vi, độ phóng đại 40 lần Tìm những noãn tốt (đen, đồng nhất, có 2 hoặc 3 lớp tế bào hạt), đường kính > 100 μm 26 Rửa 2 lần trong môi trường NCSU 37 có bổ sung 1 μgml FSH, 10 UIml hCG, 1 μgml estradiol. 3.4.2.5. Nuôi noãn Chuyển các noãn sau khi rửa vào môi trường nuôi noãn chín dạng giọt, có phủ dầu khoáng trên bề mặt, đặt trong tủ ấm CO2, nuôi ở điều kiện 370C, 5% CO2 trong 72 giờ. Môi trường nuôi chín noãn là NCSU 37 có bổ sung FSH (1 μgml), hCG (10 UIml), estradiol (1 μgml). Thể tích giọt nuôi là 100 μl, mỗi giọt nuôi 10 noãn, 4 giọt nuôi trong 1 đĩa petri nhỏ, được phủ 4 ml dầu khoáng. 3.4.2.6. Thu nhận noãn sau khi nuôi (dẫn liệu Nguyễn Bạch Thảo Vy, 2005) Chuyển noãn sau khi nuôi vào đĩa chứa PBS – PVA Thêm 200 μl hyaluronidase 0,1% vào, để trong 15 phút Dùng pipette Pasteur làm bong lớp tế bào hạt tụ xung quanh noãn bằng cách hút nhẹ nhàng noãn ra vào pipette Đánh giá phân loại noãn. Chuyển qua phiến kính, nhuộm NST. 3.4.2.7. Đánh giá phân loại noãn Noãn được phân loại, đánh giá sau khi nuôi 72 giờ. Noãn được phân thành 3 loại: noãn xấu, noãn tốt và noãn chín. Bảng 3.2. Phân loại noãn (Theiss, 1997) Noãn xấu Noãn tốt Noãn chín Gồm những noãn thoái hoá Tế bào chất không đồng nhất, bị co cụm hay phân tán Không xuất hiện thể cực thứ nhất Là các noãn chưa chín Tế bào chất đồng nhất, chiếm hết xoang tế bào Không xuất hiện thể cực thứ nhất Là các noãn trưởng thành Tế bào chất đồng nhất Có sự xuất hiện thể cực thứ nhất 27 (a) Noãn xấu (b) Noãn tốt (c) Noãn chín Hình 3.2. Phân loại noãn Các noãn có tế bào cumulus giãn nở và tế bào chất đồng nhất là những noãn tốt và noãn chín. Hình 3.3. Sự giãn nở của tế bào cumulus 3.4.2.8. Nhuộm noãn Chuyển noãn qua giọt PBS – PVA mới, rửa trong 15 phút Chuyển giọt PBS lên phiến kính Cố định bằng hỗn hợp acetic acid: ethanol (1: 3 vv) Trét silicon lên 4 góc của lamelle. Đậy lá kính, cạnh nào tiếp xúc dung dịch nhuộm trước thì đè mạnh cạnh đó Ngâm trong hỗn hợp acetic acid: ethanol (1: 3 vv) trong 48 giờ Rửa hỗn hợp acetic acid: ethanol (1: 3 vv) bằng ethanol 100% mới Nhuộm bằng dung dịch 1% acetoorcein trong 15 phút Rửa bằng dung dịch acetoglycerol đến khi sạch màu Phủ sơn móng tay 4 cạnh lamen. Xem dưới kính hiển vi (x100). 28 3.5. Xử lý thống kê Xử lý thống kê kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố (ANOVA) bằng phần mềm Minitab 15.1.1.0, với tỉ lệ được chuyển đổi arcsin khi xử lý. Kết quả được trình bày dưới dạng ± SE. 29 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Khảo sát 1: Ảnh hưởng của thời điểm thu hoạch buồng trứng lên số lượng noãn thu được và tỉ lệ noãn chín sau IVM Bảng 4.1. Số lượng noãn thu và tỉ lệ noãn phát triển tốt ở các thời điểm Chỉ tiêu Thời điểm thu hoạch P Tháng 3 (1) Tháng 4 (2) Tháng 5 (3) Tháng 6 (4) Số chó cái 20 26 17 13 Số noãn thu được chó 22,8 ± 4,04a 27,19 ± 2,65b 40,06 ± 6,18b 37,38 ± 5,83b 0,025 Tỉ lệ noãn phát triển tốt (%) 20,8 ± 3,7 26,12 ± 3,32 22,27 ± 3,63 31,34 ± 7,68 0,324 Tháng 3: Từ 05032007 đến 28032007 Tháng 5: Từ 02052007 đến 31052007 Tháng 4: Từ 01042007 đến 27042007 Tháng 6: Từ 01062007 đến 16062007 Do điều kiện hạn chế nên khi nhuộm các noãn phát triển tốt để xác định giai đoạn phát triển chỉ có 285 noãn bắt màu nhuộm chính xác. Bảng 4.2. Tỉ lệ noãn ở các giai đoạn phát triển theo thời điểm trong năm Giai đoạn phát triển của noãn nuôi Thời điểm thu hoạch Tháng 3 P (1) Tháng 4 (2) Tháng 5 (3) Tháng 6 (4) GV (%) 37,07 ± 7,37 39,42 ± 4,33 42,89 ± 7,58 52 ± 8,79 0,433 GVBD (%) 6,41 ± 2,31 8,46 ± 2,45 7,32 ± 2,47 5,24 ± 1,95 0,817 MI (%) 4,49 ± 1,48 3,54 ± 1,4 5,95 ± 2,25 5,61 ± 2,31 0,746 MII (%) 1,2 ± 0,66 2,64 ± 1,17 3,06 ± 1,2 3,8 ± 2,23 0,58 (): Không trình bày tỉ lệ noãn không xác định rõ Theo số liệu thông kê từ bảng 4.1 và bảng 4.2 cho thấy, số lượng noãn trung bình thu được trên mỗi chó ở tháng 5 là cao nhất (40,06 noãnchó), tuy nhiên tỉ lệ noãn 30 phát triển tốt và tỉ lệ noãn chín lại cao nhất ở tháng 6 (31,34% và 3,8%). Khoảng thời gian thực hiện khảo sát (0503 – 1606) có lẽ rơi vào thời điểm nghỉ ngơi trên chó, nên tỉ lệ noãn phát triển tốt và tỉ lệ noãn chín khác biệt không có ý nghĩa (P > 0,05). Tuy nhiên vào tháng 6 có tỉ lệ noãn phát triển tốt và tỉ lệ noãn chín cao nhất có thể lúc này gần với thời điểm động dục c

VÀ

NUÔI

MỘT

SỐ

YẾU

TỐ

ẢNH

HƯỞNG

SỐ

LƯỢNG

VÀ

CHÍN

TRÊN

VÀ

NUÔI

MỘT

SỐ

YẾU

TỐ

ẢNH

HƯỞNG

SỐ

LƯỢNG

VÀ

CHÍN

TRÊN

hướng

nuôi

tỏ

hướng

cho

Anh

Và

cho

ảnh

Yêu

so

chó

noãn

chó

cho

chó

yếu

tố

ảnh

hưởng

VÀ

Ảnh

hưởng

số

lượng

noãn

chín

Ảnh

hưởng

chó

số

lượng

chín

Ảnh

hưởng

số

lượng

chín

Ảnh

hưởng

chín

noãn

chó

noãn

Số

lượng

noãn

Số

lượng

noãn

Số

lượng

noãn

Số

lượng

noãn

Số

lượng

noãn

Số

lượng

noãn

Sơ

chó

noãn

tố

Ảnh

hưởng

chó

số

lượng

chín

So

noan

ảnh

hưởng

số

lượng

chín

So

noan

Ảnh

hưởng

chín

Định dạng
Số trang	72
Dung lượng	0,92 MB