Nghiên cứu nấm đối kháng Trichoderma phòng trừ bệnh mốc vàng do nấm Aspergillus flavus Link. hại lạc tại Nghệ An

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM  HỒ THỊ NHUNG NGHIÊN CỨU NẤM ĐỐI KHÁNG Trichoderma PHÒ NG TRỪ BỆNH MỐC VÀNG DO NẤ M Aspergillus flavus Link HẠI LẠC TẠI NGHÊ ̣ AN CHUYÊN NGÀNH: BẢO VỆ THỰC VẬT MÃ SỐ: 62.62.01.12 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÀ NỘI - 2017 Cơng trình hồn thành tại: VIỆN KHOA HỌC NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM Người hướng dẫn: GS.TS VŨ TRIỆU MÂN PGS TS NGUYỄN VĂN VIẾT Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ hội đồng đánh giá luận án cấp Viện họp Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi phút, ngày tháng năm 201 Có thể tìm hiểu luận án thư viện: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Cây lạc (Arachis hypogaea L.) công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao dùng làm thực phẩm xuất Ở nước ta vùng Bắc Trung Bộ có diện tích trồng lạc lớn so với 24 tỉnh thành trồng lạc nước, chiếm 22,5% tổng diện tích trồng 21,6% tổng sản lượng lạc nước Diện tích trồng lạc Nghệ An, Hà Tĩnh Thanh Hóa tương ứng 16200 chiếm 8,1%; 16000 chiếm 8,0%; 12800 chiếm 6,4% tương ứng so với nước Sản lượng lạc Nghệ An, Hà Tĩnh Thanh Hóa 37300 chiếm 8,3%; 36900 chiếm 8,2%; 23600 tương ứng, chiếm 5,2% nước (Tổng cục thống kê, 2015) Bệnh mốc vàng hại lạc nấm Aspergillus flavus Link gây đối tượng hại có ý nghĩa kinh tế quan trọng với lạc Nấm A flavus có khả sinh độc tố aflatoxin, gây ung thư số bệnh nguy hiểm người động vật Các nghiên cứu nấm A.flavus hình thành aflatoxin lạc sản phẩm từ lạc giới tiến hành toàn diện hệ thống, với gần 2000 cơng trình xuất (Mehan et al 1991) Lê Văn Giang cs (2011), khảo sát 60 mẫu lạc Nghệ An, có 59 mẫu (98,30%) bị nhiễm nấm A flavus, 30 mẫu (50,0%) sinh độc tố aflatoxin từ – 100 ppb 10 mẫu (16,67%) vượt tiêu chuẩn cho phép Bộ Y tế Đây mối nguy hại cho sức khỏe người sử dụng sản phẩm lạc Nghiên cứu Torres et al (2014) tóm tắt tiến gần quốc gia trồng lạc giới phương pháp ngăn ngừa ô nhiễm aflatoxin lạc Trong đó, tập trung chủ yếu vào chiến lược trước thu hoạch, nhấn mạnh đến hướng nghiên cứu cần tập trung tương lai bao gồm: chọn tạo giống lạc kháng nấm, kiểm soát sinh học sử dụng ozon để giảm ô nhiễm aflatoxin lạc Tại Việt Nam nghiên cứu phòng trừ nấm mốc A flavus có số thành cơng Bên cạnh biện pháp canh tác bảo quản áp dụng để phòng chống bệnh, tác giả Nguyễn Thị Xuân Sâm, Lê Thiên Minh, Nguyễn Thùy Châu năm 2010-2011 phân lập, tuyển chọn dòng nấm A flavus TH97, DA2 khơng sinh độc tố dùng phòng trừ dòng nấm A flavus sinh độc tố aflatoxin Trung tâm nghiên cứu phát triển đậu đỗ tuyển chọn thành cơng giống lạc L17 có khả kháng nấm A.flavus (Nguyễn Văn Thắng, 2010) Chúng ta nghiên cứu ứng dụng thành công chế phẩm sản xuất từ nấm Trichoderma chống bệnh thối rễ, chết ẻo… nấm Rhizoctonia solani, Fusarium solani, Phytophtora, Sclerotium rolfsii gây Mặc dù vậy, hướng nghiên cứu ứng dụng nấm đối kháng Trichoderma để phòng trừ nấm mốc A flavus nhằm giảm thiểu độc tố aflatoxin lạc trồng khác chưa quan tâm Xuất phát từ lý trên, đề tài: “Nghiên cứu nấm đối kháng Trichoderma phòng trừ bệnh mốc vàng nấm Aspergillus flavus Link hại lạc Nghệ An” tiến hành nhằm tuyển chọn ứng dụng nấm đối kháng Trichoderma phòng trừ bệnh mốc vàng hại lạc Mục đích yêu cầu 2.1 Mục đích Tuyển chọn nguồn nấm Trichoderma có khả đối kháng với nấm mốc Aspergillus flavus hại lạc trồng Nghệ An xây dựng quy trình kỹ thuật sản xuất biện pháp sử dụng chế phẩm Trichoderma phòng trừ Aspergillus flavus hiệu đồng ruộng 2.2 Yêu cầu Tuyển chọn nguồn nấm Trichoderma có khả đối kháng cao với nấm mốc Aspergillus flavus hại lạc Nghệ An Xây dựng quy trình kỹ thuật sản xuất biện pháp sử dụng chế phẩm Trichoderma phòng trừ Aspergillus flavus hiệu đồng ruộng Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học Luận án bổ sung thông tin tuyển chọn sử dụng nấm đối kháng Trichoderma asperellum phân lập từ vùng đất trồng lạc để phòng trừ nấm A flavus hại lạc Nghệ An Kết luận án tài liệu phục vụ nghiên cứu, giảng dạy phục vụ sản xuất 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Sử dụng chế phẩm Trichoderma asperellum để phòng trừ nấm A flavus hại lạc Nghệ An, làm giảm nhiễm nấm mốc A flavus gây bệnh mốc vàng hại lạc giai đoạn đồng ruộng trình bảo quản, tăng hiệu kinh tế trồng lạc mà góp phần bảo vệ mơi trường đảm bảo vệ sinh an tồn thực phẩm Đối tượng phạm vi nghiên cứu đề tài 4.1 Đối tượng nghiên cứu Các loài nấm Trichoderma phân lập từ mẫu đất trồng lạc, sử dụng phòng trừ nấm A flavus gây bệnh mốc vàng hại lạc Nghệ An 4.2 Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu tuyển chọn nguồn nấm Trichoderma có khả đối kháng cao sản xuất chế phẩm sinh học Trichoderma có khả phòng trừ hiệu nấm mốc Aspergillus flavus lạc ứng dụng rộng rãi cho vùng chuyên canh lạc tỉnh Nghệ An Những đóng góp luận án - Là cơng trình nghiên cứu có hệ thống sử dụng nấm đối kháng Trichoderma asperellum phân lập từ vùng đất trồng lạc để chuyên phòng trừ nấm A flavus hại lạc Nghệ An - Ứng dụng thành công kỹ thuật sinh học phân tử dựa vào trình tự vùng gen ITS để định danh nguồn nấm Trichoderma có khả đối kháng cao với nấm mốc hại lạc A flavus - Đề xuất quy trình sản xuất chế phẩm nấm Trichoderma asperellum đạt nồng độ 5,3 × 109 bào tử/gam Chế phẩm T asperellum có tác dụng giảm nhiễm nấm mốc A flavus gây bệnh mốc vàng hại lạc giai đoạn đồng ruộng giảm độc tố aflatoxin trình bảo quản đạt 92,08%, tăng hiệu kinh tế trồng lạc Cấu trúc luận án Luận án dày 155 trang đánh máy vi tính khổ A4 với 37 bảng số liệu, hình Luận án gồm phần: Mở đầu trang; Tổng quan tài liệu 32 trang; Vật liệu, nội dung phương pháp nghiên cứu 18 trang; Kết nghiên cứu thảo luận 56 trang; Kết luận kiến nghị 02 trang Đã tham khảo 138 tài liệu bao gồm 40 tài liệu tiếng Việt 97 tài liệu tiếng Anh, Phụ lục 21 trang CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu giới Các xu hướng kiểm soát sinh học A flavus sinh độc tố aflatoxin giới với hướng là: (i) Hướng nghiên cứu sử dụng Bacillus (B pumilus, B subtilis) (Munimbazi et al., 1998;…); (ii) Hướng nghiên cứu sử dụng chủng A flavus, A parasiticus không sinh độc tố, có thành cơng, đặc biệt Hoa Kỳ, chủng A flavus AF36 (Cotty, 1994); (iii) Hướng nghiên cứu sử dụng nấm đối kháng Trichoderma có thành cơng định, đặc biệt Ấn Độ, sử dụng loài T harzianum, T viride, T auroviride, T longibrachiatum, T hamatum kiểm soát sinh học A flavus sinh độc tố aflatoxin (Reddy et al., 2010) 1.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam Cho đến Việt Nam có nhiều cơng trình nghiên cứu ứng dụng nấm đối kháng Trichoderma để phòng trừ số loại bệnh nấm gây hại rễ trồng ứng dụng nấm đối kháng Trichoderma sản xuất phân hữu sinh học hướng nghiên cứu ứng dụng nấm đối kháng Trichoderma để làm giảm thiểu độc tố aflatoxin lạc trồng khác chưa quan tâm Đã có chế phẩm từ nấm Trichoderma chống loại nấm bệnh trồng gây bệnh thối rễ, chết yểu, xì mủ,… nấm bệnh gây nên (Rhizoctonia solani, Fusarium solani, Phytophtora, Sclerotium rolfsii, …) chưa có chế phẩm chuyên phòng trừ nấm A flavus Các nghiên cứu nước phòng trừ nấm mốc A flavus sinh độc tố aflatoxin có thành cơng số hướng như: dùng nấm A flavus không sinh độc tố (chủng A flavus TH97 Nguyễn Thị Xuân Sâm, A flavus DA2 Lê Thiên Minh, Nguyễn Thùy Châu; chọn tạo giống kháng nấm A flavus giống lạc D8 (hay L17) Nguyễn Văn Thắng (Trung tâm nghiên cứu phát triển đậu đỗ) ; kết hợp với biện pháp canh tác biện pháp bảo quản sau thu hoạch 1.3 Những tồn vấn đề đề tài tập trung nghiên cứu Nghiên cứu Trichoderma phòng trừ A flavus quan tâm nghiên cứu giới, đặc biệt Ấn Độ Ở Việt Nam, có cơng trình nghiên cứu ứng dụng nấm đối kháng Trichoderma để phòng trừ số loại bệnh nấm gây hại rễ trồng Rhizoctonia solani, Fusarium solani, Phytophtora, Sclerotium rolfsii…và ứng dụng nấm đối kháng Trichoderma vào sản xuất phân hữu sinh học Việc nghiên cứu ứng dụng nấm đối kháng Trichoderma để làm giảm thiểu độc tố aflatoxin lạc trồng khác chưa quan tâm Vì vậy, nghiên cứu sản xuất chế phẩm nấm Trichoderma có khả kiểm sốt nấm A flavus gây bệnh mốc vàng lạc, giảm thiểu hàm lượng aflatoxin giúp nâng cao chất lượng nơng sản, có ý nghĩa ứng dụng vào sản xuất lạc CHƯƠNG II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu - Mẫu đất trồng lạc để phân lập Trichoderma; mẫu đất trồng lạc để đánh giá tỷ lệ nhiễm A flavus; mẫu hạt lạc giống thu từ nhà dân; mẫu hạt lạc giống thu từ chợ - Chế phẩm nấm đối kháng Trichoderma sản xuất từ nguồn nấm Trichoderma asperellum (Tri.020(2).NC), lượng bào tử 5,3 × 109 bt/g - Các loại mơi trường ni cấy: PDA, WA 0,01%, CAM; hóa chất phân tích DNA nguồn nấm Trichoderma 2.2 Thiết bị dụng cụ Tủ hấp khử trùng, buồng nuôi cấy vi sinh, tủ sấy, đĩa petri, ống nghiệm… 2.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu - Các nghiên cứu tiến hành Nghệ An, phân tích DNA thực Trung tâm BIOTEC (Thái Lan) Thời gian nghiên cứu từ năm 2011 - 2015 2.4 Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu thực trạng nhiễm nấm A flavus hạt giống đất trồng lạc Nghệ An - Thu thập, phân lập tuyển chọn nguồn nấm Trichoderma có khả đối kháng với nấm mốc A flavus hại lạc Nghệ An - Nghiên cứu biện pháp kỹ thuật sản xuất chế phẩm Trichoderma phòng trừ A flavus hại lạc Nghệ An - Nghiên cứu biện pháp kỹ thuật sử dụng chế phẩm Trichoderma phòng trừ A flavus hại lạc Nghệ An 2.5 Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu thực trạng nhiễm nấm A flavus hạt giống đất trồng lạc Nghệ An theo phương pháp Lester W Burgess (2009); Mathur S.B (2000), Lin Dianese (1976); Hamed et al (2004) Thu thập, phân lập, tuyển chọn nguồn nấm Trichoderma có khả đối kháng với nấm mốc A flavus hại lạc Nghệ An theo phương pháp Rahman et al (2009), Skidmore and Dickinson (1976) Dennis et al (1971) Định loại nguồn nấm Trichoderma đối kháng cao với A flavus công nghệ sinh học phân tử: Chiết xuất DNA: theo phương pháp Cirad Protocol, dùng cặp mồi vùng ITS rDNA, phản ứng PCR, tinh chiết sản phẩm PCR: bẳng kít Aquick PCR Purification Kit, gửi sản phẩm PCR sang Macrogen (Seoul, Hàn Quốc) để giải trình tự gen, hồn thiện lại trình tự gen phần mền Bioedit Căn chuỗi trình tự phần mềm ClustalX 2.1 Dùng phần mềm trực tuyến chuyên cho nấm Trichoderma TrichOKEY v 2.0 để định danh loài Dùng phần mềm MEGA v.6 để xây dựng phát sinh loài Nghiên cứu biện pháp kỹ thuật sản xuất chế phẩm T asperellum phòng trừ nấm A flavus hại lạc: nghiên cứu môi trường nhân giống cấp 1, môi trường nhân giống cấp 2, môi trường nhân sinh khối tỷ lệ nước/cơ chất, chế độ đảo trộn cấp khí chiếu sáng theo phương pháp thường quy bảo vệ thực vật kế thừa nghiên cứu trước Trần Thị Thuần cs (1995), Nguyễn Hồng Tuyên cs (2013) Trần Thị Thúy (2013) Nghiên cứu sử dụng chế phẩm nấm T asperellum phòng trừ nấm A flavus hại lạc điều kiện nhà lưới, đồng ruộng mơ hình theo phương pháp Srilakshmi (2001), Thakur (2003) Lester W Burgess (2009), (Askew & Laing 1993) Mathur S.B Olga K., 2000 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thực trạng nhiễm nấm A flavus hạt lạc đất trồng lạc Nghệ An 3.1.1 Thành phần nấm hại hạt lạc Nghệ An năm 2012 Các mẫu hạt lạc thu thập huyện Nghi Lộc, Nam Đàn, Yên Thành, Diễn Châu, Hưng Nguyên, Anh Sơn thành phố Vinh Đã xác định loài nấm gây hại mẫu lạc thu thập: có lồi nấm thuộc gây hại hạt lạc Xuất phổ biến loài nấm A niger, A flavus, Penicillium sp 3.1.2 Tỷ lệ nhiễm nấm A flavus hạt lạc thu từ chợ Nghệ An năm 2012 Đã tiến hành đợt thu thập, phân lập nấm gây bệnh 245 mẫu hạt lạc từ chợ khu vực Nghi Lộc thành phố Vinh, để đánh giá mức độ nhiễm nấm A flavus hạt lạc chợ khu vực Tỷ lệ mẫu hạt lạc nhiễm nấm A flavus chợ cao từ 28,6 – 51,4%, cao chợ Nghi Ân với số mẫu bị nhiễm chiếm đến 51,4% Tỷ lệ mẫu hạt lạc nhiễm A flavus thấp chợ Quán Lau – Thành phố Vinh Các chợ khu vực Nghi Lộc có tỷ lệ số mẫu nhiễm A flavus cao chợ, từ 45,7 – 51,4 % Các chợ khu vực thành phố Vinh: Chợ Ga, chợ Quang Trung, chợ Quán Lau, chợ Vinh có tỷ lệ nhiễm mẫu nhiễm nấm A flavus thấp Nghi Lộc từ 28,6 – 51,4% 3.1.3 Tỷ lệ nhiễm nấm A flavus hạt lạc thu từ nông hộ Nghệ An năm 2012 Mẫu hạt lạc giống thu từ nơng hộ có tỷ lệ nhiễm A flavus từ 15,6 – 64,4% Tại huyện Nghi Lộc, tỷ lệ mẫu lạc nhiễm A flavus cao xã Nghi Phong 64,4%, sau Nghi Trung 60,0% Các xã lại Nghi Lộc Nghi Ân, Nghi Trường Nghi Long tỷ lệ hạt lạc nhiễm A flavus thấp chiếm từ 35,6 – 37,8% Các xã Hưng Thông – Hưng Nguyên, Kim Liên – Nam Đàn Diễn An – Diễn Châu có số mẫu lạc giống nhiễm nấm A flavus từ 44,4 – 51,1 % Thấp Đỉnh Sơn – Anh Sơn với 15,6 % số mẫu bị nhiễm nấm A flavus 3.1.4 Thành phần nấm hại đất trồng lạc Nghệ An năm 2012 Thành phần nấm bệnh đất trồng lạc xã Nghi Trường, Nghi Ân, Nghi Phong huyện Nghi Lộc vùng phụ cận vụ xuân năm 2012 gồm 11 loài thuộc họ khác Các loài nấm phổ biến loài A flavus gây bệnh mốc vàng, loài A niger gây bệnh héo rũ gốc mốc đen, Penicillium sp gây mốc xanh lạc 3.1.5 Tỷ lệ nhiễm nấm A flavus đất trồng lạc điểm điều tra Nghệ An năm 2012 Đánh giá tỷ lệ nhiễm A flavus 420 mẫu đất thu từ vùng trồng lạc Nghi Lộc, Hưng Nguyên, Nam Đàn, Diễn Châu, Quỳnh Lưu: Tỷ lê ̣ nhiễm A flavus đấ t trồ ng la ̣c, từ 3,3-20,0%, các vùng luân canh lúa la ̣c tỷ lê ̣ mẫu đất nhiễm A flavus thấ p Điề u kiê ̣n gieo trồ ng và giai đoa ̣n phát triể n của la ̣c cũng ảnh hưởng đế n tỷ lê ̣ nhiễm A flavus đấ t Mẫu đấ t thu đươ ̣c vùng đấ t cát pha Nghi Lô ̣c, Hưng Nguyên và Quỳnh Lưu vào giai đoa ̣n hoa hình thành củ không có tưới có tỷ lê ̣ nhiễm A flavus từ 10,020,0% cao so với các mẫu đấ t thu ở Nam Đàn, Diễn Châu vào giai đoa ̣n đẻ nhánh vùng đấ t cát pha có tưới nước (3,3-5,0%) 3.1.6 Khả sinh độc tố aflatoxin mẫu nấm A flavus phân lập hạt lạc giống thu từ chợ huyện Nghi Lộc thành phố Vinh Với 107 mẫu nấm A flavus phân lập hạt lạc giống thu từ chợ, 51 mẫu chợ Nghi Lộc 56 mẫu chợ thành phố Vinh cho thấy: Tỷ lệ mẫu nấm A flavus phân lập từ hạt lạc thu từ chợ sinh độc tố aflatoxin từ 71,43-83,33% Các chợ Nghi Lộc trung bình có 80,39% số mẫu A flavus sinh độc tố aflatoxin Các chợ thành phố Vinh trung bình có 76,79% mẫu A flavus sinh aflatoxin Trên tổng số 107 mẫu A flavus thu từ chợ có 84 mẫu sinh độc tố aflatoxin chiếm 78,50% (bảng 3.1) Bảng 3.1 Số lượng mẫu nấm A flavus phân lập hạt lạc giống thu từ chợ huyện Nghi Lộc thành phố Vinh sinh độc tố aflatoxin Màu sắc Màu sắc Tỷ lệ Tổng số môi trường CAM đèn UV Tổng mẫu mẫu sinh mẫu sinh Vàng Vàng Trắng Tím Xanh aflatoxin aflatoxin nhạt sẫm Nghi Lộc 51 15 31 10 41 41 80,39 Chợ Nghi Ân 18 12 15 15 83,33 Chợ Sơn 17 13 13 76,47 Chợ Mới 16 10 13 13 81,25 ThànhphốVinh 56 16 35 13 43 43 76,79 Chợ Ga 16 13 13 81,25 Chợ Vinh 16 11 12 12 75,00 Chợ Quán Lau 10 2 8 80,00 Chợ Quang Trung 14 10 10 71,43 Tổng 107 10 31 66 23 84 84 78,50 3.1.7 Khả sinh độc tố aflatoxin mẫu nấm A flavus phân lập hạt lạc giống thu từ nông hộ Nghệ An Khả sinh độc tố aflatoxin 191 mẫu nấm A flavus phân lập hạt lạc giống thu từ nông hộ Nghệ An trình bày bảng 3.2 Tỷ lệ mẫu nấm A flavus sinh độc tố aflatoxin cao hầu hết nơng hộ từ 73,91-100%, trung bình chiếm 81,68% (bảng 3.2) Bảng 3.2 Số lượng mẫu nấm A flavus phân lập hạt lạc giống thu từ nông hộ Nghệ An sinh độc tố aflatoxin Màu sắc Màu sắc Tỷ lệ Tổng số môi trường CAM đèn UV Tổng mẫu Địa điểm mẫu sinh mẫu sinh Vàng Vàng Trắng Tím Xanh aflatoxin aflatoxin nhạt sẫm Nghi Lộc 105 16 33 56 18 87 87 82,86 Hưng Nguyên 20 15 17 17 85,00 Nam Đàn 23 11 17 17 73,91 Diễn Châu 20 10 16 16 80,00 Yên Thành 16 4 12 12 75,00 Anh Sơn 7 100,00 Tổng 191 31 57 103 35 156 156 81,68 3.1.8 Khả sinh độc tố aflatoxin mẫu nấm A.flavus phân lập từ đất trồng lạc Nghệ An Bảng 3.3 cho thấy nuôi cấy môi trường CAM 49 mẫu nấm A flavus phân lập từ đất trồng lạc Nghệ An: có 28 mẫu A flavus có màu vàng sẫm, 12 mẫu có màu vàng nhạt mẫu có màu trắng; đèn UV có 38 mẫu A flavus quan sát thấy huỳnh quang màu xanh, 11 mẫu có huỳnh quang màu tím Như vậy, với 49 mẫu isolate A flavus phân lập từ đất trồng lạc Nghệ An có 38 mẫu sinh độc tố aflatoxin chiếm 77,55% Bảng 3.3 Số lượng mẫu nấm A flavus phân lập từ đất trồng lạc Nghệ An sinh độc tố aflatoxin Màu sắc Màu sắc Tỷ lệ Tổng số môi trường CAM đèn UV Tổng mẫu Địa điểm mẫu sinh mẫu sinh Vàng Vàng Trắng Tím Xanh aflatoxin aflatoxin nhạt sẫm Nghi Lộc 23 13 19 19 82,61 HưngNguyên 2 7 77,78 Nam Đàn 1 1 50,00 Diễn Châu 2 1 33,33 QuỳnhLưu 12 10 10 83,33 Tổng 49 12 28 11 38 38 77,55 3.2 Thu thập, phân lập tuyển chọn nguồn nấm Trichoderma có khả đối kháng với nấm mốc A flavus hại lạc Nghệ An 3.2.1 Thu thập phân lập nấm đối kháng Trichoderma đất trồng lạc Tần suất xuất nấm Trichoderma 1000 mẫu đất trồng lạc thu Nghệ An, Thanh Hóa Hà Tĩnh Số mẫu đất trồng lạc có nấm Trichoderma Nghệ An chiếm 44,30%, Thanh Hoá 52,00% Hà Tĩnh 39,50% Trong tỉnh Nghệ An, tần suất xuất Trichoderma huyện Diễn Châu cao 55,00%, huyện Quỳnh Lưu trung bình 49,50% thấp huyện Nghi Lộc 28,50% (bảng 3.4) Bảng 3.4 Tần suất xuất nấm Trichoderma đất trồng lạc điểm thu mẫu từ 2011-2013 Số mẫu có Tần suất STT Điạ điể m thu mẫu Số mẫu Trichoderma xuất (%) Nghê ̣ An 600 266 44,30 Quỳnh Lưu 200 99 49,50 Diễn Châu 200 110 55,00 Nghi Lô ̣c 200 57 28,50 Hà Tinh 200 79 39,50 ̃ Thanh Hoá 200 104 52,00 Tổ ng số 1000 449 44,9 3.2.2 Nghiên cứu tuyển chọn nguồn nấm Trichoderma đối kháng cao với nấm mốc A flavus hại lạc Khả đối kháng với nấm mốc A flavus (Asp1.011NA) hại lạc 99 nguồn nấm Trichoderma phân lập vùng đất trồng lạc Nghệ An, Thanh Hóa Hà Tĩnh đánh giá phương pháp nuôi kép đĩa petri Trong số 37 nguồn nấm Trichoderma phân lập vùng đất trồng lạc tỉnh Nghệ An, có nguồn (chiếm 18,92%) đối kháng cao (PIRG>75%) với nấm mốc A flavus (Asp1.011NA) bao gồ m: Tri.011(1).NL; Tri.007(1).NĐ; Tri.014(1).NL; Tri.020(2).NC; Tri.005(2).NĐ; Tri.041(1).NĐ; Tri.027(2).NĐ (bảng 3.5) Bảng 3.5 Khả đối kháng nguồn nấm Trichoderma phân lập từ đất trồng lạc Nghệ An nấm A flavus (Asp1.011NA) sau ngày nuôi cấ y Cấp độ đối kháng Nguồn nấm Đối kháng cao Tri.011(1).NL; Tri.007(1).NĐ; Tri.014(1).NL; Tri.020(2).NC; PIRG >75% Tri.005(2).NĐ; Tri.041(1).NĐ; Tri.027(2).NĐ Đối kháng cao Tri.038(1).NL; Tri 022(1).NL; Tri.025(1).NĐ; Tri.011(1).NĐ; 60% < PIRG ≤ 75% Tri.016(2).NĐ; Tri 042(1).NĐ; Tri.016(1).NĐ; Tri.063(2).NĐ; Tri.062(1).QL; Tri.020(2).NĐ; Tri 046(2).NĐ; Tri.039(2).DC Đối kháng trung bình Tri.023(1).QL; Tri.022(1).NL; Tri 035(1).NL; Tri.059(1).NL 50% < PIRG ≤ 60% Đối kháng thấp Tri.046(1).NL; Tri.062(2).NĐ; Tri.008(1).NĐ; Tri.006(1).NĐ; PIRG ≤ 50% Tri.040(2).NL; Tri.127(2).NC;Tri.008(2).NĐ; Tri.010(1).NĐ; Tri.030(1).NĐ; Tri.032(1).NL; Tri.013(2).NĐ; Tri.022(2).NP; Tri.009(1).NĐ; Tri.023(3).NP Ghi chú: PIRG: số đối kháng Khả đối kháng 32 nguồn nấm Trichoderma phân lập từ đất trồng lạc Thanh Hóa với nấm mốc A flavus (Asp1.011NA) thể bảng 3.6: có 11 nguồn (chiếm 34,38%) đối kháng cao, bao gồm (Tri.019(4).NC; Tri.053(1).TG; Tri.011(1).NC; Tri.039(1).TG; Tri 014(4).NC; Tri.013(1).NC; Tri.002(2).NC; Tri.149(1).TG; Tri.009(1).NC; Tri.069(2).QX; Tri.008(1).NC) Bảng 3.6 Khả đối kháng nguồn nấm Trichoderma phân lập từ đất trồng lạc Thanh Hóa nấm mốc A flavus (Asp1.011NA) sau ngày nuôi cấ y Cấp độ đối kháng Nguồn nấm Đối kháng cao Tri.019(4).NC; Tri.053(1).TG; Tri.011(1).NC; Tri.039(1).TG; Tri PIRG >75% 014(4).NC; Tri.013(1).NC; Tri.002(2).NC; Tri.149(1).TG; Tri.009(1).NC; Tri.069(2).QX; Tri.008(1).NC Đối kháng cao Tri.016(1).NC; Tri 100(2).NC; Tri.012(2).NC; Tri.077(1).QX; Tri 60% < PIRG ≤ 75% 062(2).QX; Tri.034(1).TG; Tri 142(1).TG; Tri.013(4).NC; Tri.014(1).NC; Tri.065(1).QX; Tri.004(1).NC; Tri.012(1).NC Đối kháng trung bình Tri.049(2).TG; Tri.104(1).TH; Tri.081(1).QX; Tri.003(2).NC 50% < PIRG ≤ 60% Đối kháng thấp Tri.062(1).QX; Tri.127(1).NC; Tri.123(2).TH; Tri.033(1).TG; Tri PIRG ≤ 50% 156(2).TG Ghi chú: PIRG: số đối kháng Khả đối kháng 30 nguồn nấm Trichoderma phân lập từ đất trồng lạc Hà Tĩnh nấm mốc A flavus (Asp1.011NA): có 10 nguồn nấm Trichoderma đối kháng cao với nấm mốc A flavus (Asp1.011NA) (chiếm 33,33%) gồ m: Tri.002(2).NX; Tri.006(2).NX; Tri.004(2).NX; Tri.057(1).NX; Tri.005(1)NX; Tri.095(1).TH; Tri.008(1).NT; Tri.092(1).TH; Tri.038(2).NX; Tri.014(2).NX (bảng 3.7) Như vậy, qua thí nghiệm ni kép đĩa petri đánh giá khả đối kháng với nấm mốc A flavus (Asp1.011NA) hại lạc 99 nguồn nấm Trichoderma phân lập vùng đất trồng lạc Nghệ An, Thanh Hóa Hà Tĩnh xác định 28 nguồn nấm Trichoderma (chiếm 28,3%) có khả đối kháng cao nấm mốc A flavus (Asp1.011NA) với số đối kháng PIRG > 75% 11 3.2.3 Định danh 15 nguồn nấm Trichoderma có khả đố i kháng cao với nấm mốc A flavus hại lạc dựa vùng gen ITS-rDNA 3.2.3.1 Định danh phần mềm tìm kiếm trực tuyến TrichOKEY Nhóm 15 nguồn nấm Trichoderma có số đối kháng cao với nấm mốc A flavus đánh giá khả sinh tổng hợp enzyme chitinase, tiếp tục định danh đến lồi dựa vào trình tự vùng gen ITS 15 nguồn nấm Trichoderma định danh dùng phần mềm trực tuyến chuyên cho nấm Trichoderma TrichOKEY v 2.0 Phần mềm TrichOKEY cho phép định danh nấm dựa tổ hợp trình tự nucleotide nhận dạng (hallmarks) nằm vùng ITS (Druzhinina et al., 2005) Bảng 3.9 Kết định danh nguồn nấm Trichoderma dùng phần mềm TrichOKEY v 2.0 STT Nguồn nấm Loài xác định với mức tin cậy cao VN013NC T asperellum, T koningiopsis VN053TG T asperellum, T koningiopsis VN095TH T asperellum, T koningiopsis VN002NC T asperellum, T koningiopsis VN002NX T asperellum, T koningiopsis VN004NX T asperellum VN005ND T harzianum VN011NC T asperellum, T koningiopsis VN014NL T asperellum, T koningiopsis 10 VN019NC T asperellum, T koningiopsis 11 VN027ND T asperellum, T koningiopsis 12 VN069QX T asperellum, T koningiopsis 13 VN011NL T asperellum, T koningiopsis 14 VN020NC T asperellum, T koningiopsis 15 VN007ND T asperellum, T koningiopsis Kết định danh phần mềm TrichOKEY (bảng 3.9) cho thấy 15 nguồn nấm Trichoderma kiểm tra có 13 nguồn: VN013NC, VN053TG, VN095TH, VN002NC, VN002NX, VN011NC, VN014NL, VN019NC, VN027ND, VN069QX, VN011NL,VN020NC VN007ND, trùng với loài T asperellum T koningiopsis với mức độ tin cậy cao Nguồn nấm VN004NX trùng với loài T asperellum Đáng ý, nguồn nấm VN005ND trùng với loài T harzianum 3.2.3.2 Phân tích phả hệ Dựa kết định danh dùng phần mềm TrichOKEY v 2.0 trên, nguồn nấm tiếp tục phân tích phả hệ hình 3.2 Các nguồn nấm Trichoderma điển hình cho lồi xác định (T asperellum, T koningiopsis T harzianum) số loài Trichoderma tham khảo phổ biến khác (T austrokoningii, T ovalisporum, T viride T atroviride) sử dụng cho phân tích phả hệ Mã Genbank mẫu phân tích tham khảo từ cơng bố Bissett et al (2015), Samuels (2006) Samuels et al (2006) Kết phân tích trình tự gen cho phép kết luận nguồn VN005ND loài T harzianum, nguồn VN004NX lồi gần gũi với T asperellum, 13 nguồn lại lồi T asperellum 12 Hình 3.2 Phân tích phả hệ dựa trình tự tồn vùng ITS nguồn nấm Trichoderma dùng phần mềm MEGA v.6 Cây xây dựng dựa mơ hình thay nucleotide Jukes-Cantor (JC) lựa chọn từ phân tích xác định mơ hình thay phù hợp (lệnh models phầm mềm MEGA) Giá trị nốt giá trị thống kê boostrap dạng % (1000 lần lặp) (Ngưỡng tin cậy nhìn chung 75% có nghĩa 1000 lần lặp 750 lần đơn vị phân loại phân nhóm với nhau) Ký tự T ngoặc đơn nguồn nấm điển hình lồi (Type strain) Các nguồn nấm Trichoderma Việt Nam đánh dấu hình tròn Những kết đánh giá khả phòng trừ nguồn nấm Trichoderma nấm mốc A flavus phương pháp nuôi kép đĩa petri hợp chất kháng sinh dễ bay làm sở tuyển chọn 15 nguồn nấm Trichoderma có triển vọng cho phòng trừ nấm mốc A flavus, bao gồm: Tri.013(1).NC; Tri.053(1).TG; Tri.095(1).TH; Tri.002(2).NC; Tri.002(2).NX; Tri.004(2).NX; Tri.005(2).NĐ; Tri.011(1).NC; Tri.014(1).NL; Tri.019(4).NC; Tri.027(2).NĐ; Tri.069(2).QX; Tri.011(1).NL; Tri.020(2).NC; Tri.007(1).NĐ Theo kết định danh dựa vào trình tự vùng gen ITS-rDNA cho thấy nhóm 15 nguồn nấm chủ yếu lồi T asperellum (chiếm 86,67%) 13 Trong nhóm 15 nguồn nấm Trichoderma triển vọng nguồn nấm T asperellum (Tri.020(2).NC) có số đối kháng với A flavus thí nghiệm nuôi kép PIRG > 75% hiệu phòng trừ đạt cao 87,59% chất kháng sinh dễ bay Do vậy, chọn nguồn nấm T asperellum (Tri.020(2).NC) cho thí nghiệm phòng trừ A flavus điều kiện nhà lưới đồng ruộng 3.2.4 Mô tả đặc điểm hình thái T asperellum (Tri.020(2).NC) Đặc điểm hình thái nấm T asperellum (Tri.020(2).NC) mơ tả theo bảng 3.10 đây: Bảng 3.10 Đặc điểm hình thái nấm T asperellum (Tri.020(2).NC) Hình thái Đặc điểm Bào tử Hình gần cầu hình trứng Màu xanh đậm Kích thước 2,9(Conidia) 3,8 x 3,2-4,5 µm, tỷ lệ dài/rộng 1,0-1,3 Cuống đính bào tử Cuống bào tử đính có cành bên phân nhánh (Conidiophores) Thể bình Dài 6,8-9,9 µm, điểm thể bình từ 2,1-3,3 µm, chiều (Phialides) rộng đáy 1,1 – 1,8; tỷ lệ dài/rộng 1,5-1,9 Bào tử hậu Được hình thành nhiều sau ngày ni cấy, hình gần cầu đến (Chlamydospores) cầu, đường kính 8,3 - 12,2 µm Tản nấm PDA Sau 72 300C đường kính đạt 41,3 - 63,7 mm, bào tử màu (Colony) xanh hình thành tạo vòng tròn đồng tâm Khơng có mùi dừa Đặc điểm hình thái nấm T asperellum (Tri.020(2).NC) trùng khớp gần giống với mô tả loài chuẩn T asperellum nghiên cứu Samuels (2004) nghiên cứu gần Sriam et al (2013) 3.3 Nghiên cứu biện pháp kỹ thuật sản xuất chế phẩm nấm T asperellum phòng trừ A flavus hại lạc Nghệ An Nguồn nấm Trichoderma asperellum (Tri.020(2).NC) tuyển chọn dùng nghiên cứu biện pháp sản xuất chế phẩm phòng trừ nấm mốc A flavus hại lạc Nghệ An 3.3.1 Ảnh hưởng loại môi trường nuôi cấy giống cấp đến phát triển nấm T asperellum (Tri.020(2).NC) Đường kính tản nấm nồng độ bào tử T asperellum (Tri.020(2).NC) môi trường PDA sau ngày ni cấy đạt kích thước nồng độ cao (8,68 cm 51,4 x 108 bt/ml) so với môi trường Czapek CMA Như vậy, mơi trường PDA mơi trường thích hợp cho việc nhân giống cấp nguồn nấm T asperellum (Tri.020(2).NC) 3.3.2 Lựa chọn môi trường nhân giống cấp thích hợp cho nấm T asperellum (Tri.020(2).NC) 3.3.2.1 Xác đinh ̣ khớ i lượng đường glucose thích hợp cho nấm T asperellum (Tri.020(2).NC) Khối lượng đường glucose 1000 ml thành phần môi trường 30 g (CT4_30) thích hợp cho sinh trưởng, phát triển nấm T asperellum (Tri.020(2).NC), tương ứng với khối lượng sinh khối nấm thu lớn 2,47 g/100ml sau 72 nuôi cấy nhiệt độ 300C 14 3.3.2.2 Xác đinh ̣ khố i lượng giá đỗ thích hợp cho nấm T asperellum (Tri.020(2).NC) Lượng giá đỗ 1000 ml môi trường lỏng 250 g (CT6_250) khối lượng nấm T asperellum (Tri.020(2).NC) đạt lớn 1,97 g Tuy nhiên, phân tích thống kê cho thấy, khối lượng nấm T asperellum (Tri.020(2).NC) thu ứng với lượng giá đỗ khơng sai có ý nghĩa so với lượng giá đỗ 200 g (CT5_200) 150 g (CT4_150) Với lượng giá đỗ 150 g mơi trường lỏng khối lượng nấm T asperellum (Tri.020(2).NC) thu 1,94 g 3.3.2.3 Xác đinh ̣ thời gian thu hồi sinh khối nấm T asperellum (Tri.020(2).NC) thích hợp mơi trường nhân giống cấp Sinh khối nấm T asperellum môi trường lỏng tăng dần theo ngày nuôi cấy Đến ngày thứ 3, sinh khối nấm T asperellum đạt lớn 2,51 g không sai khác xử lý thống kê ngày thứ Đến ngày thứ thứ 6, sinh khối sợi nấm T asperellum giảm dần Như vậy, thu hồi sinh khối nấm T asperellum mơi trường lỏng thích hợp từ sau 3-4 ngày nuôi cấy 3.3.3 Lựa chọn môi trường rắn ni nhân sinh khối thích hợp cho nấm T asperellum (Tri.020(2).NC) 3.3.3.1 Nghiên cứu loại chất rắn thích hợp Nấm T asperellum (Tri.020(2).NC) phát triển nhanh mơi trường rắn thóc ngun hạt: lượng bào tử đạt cao 5,36 × 109 bt/g sau 2-3 ngày ni cấy xuất bào tử thóc so với mơi trường bột thóc bột ngơ (bảng 3.11) Bảng 3.11 Sự phát triển nấm T asperellum (Tri.020(2).NC) loại chất rắn sau 10 ngày ni cấy Cơng thức Lượng bào tử × 109 (bt/g) Ngày xuất bào tử (ngày) a CT1 5,36 2-3 b CT2 3,88 3-4 CT3 1,96c 3-4 CV (%) 6,7 LSD 0,05 0,36 3.3.3.2 Nghiên cứu tỷ lệ chất rắn/lượng nước thích hợp Kết bảng 3.12 thấy tỷ lệ thóc/nước: 1/1 thích hợp cho phát triển nấm T asperellum (Tri.020(2).NC), lượng bào tử sinh đạt cao Kết phù hợp với nghiên cứu Trần Thị Thuần cs (1995), tỷ lệ nước 1/1 mơi trường thóc cho lượng bào tử nấm T harzianum đạt cao Bảng 3.12 Sự phát triển nấm T asperellum (Tri.020(2).NC) tỷ lệ thóc/lượng nước sau 10 ngày nuôi cấy Công thức Lượng bào tử (bt/g) Ngày xuất bào tử (ngày) CT1_1/0,5 5,2 × 10 e 4-5 CT2_1/0,75 1,77 × 10 c 3-4 CT3_1/1 5,37 × 109 a 2-3 CT4_1/1,25 4,83 × 10 b 2-3 CT5_1/1,5 7,83 × 10 d 2-3 CV (%) 3,7 LSD 0,05 0,25 15 3.3.3.4 Nghiên cứu chế độ đảo trộn cấp khí q trình ni nhân sinh khối Chế độ buộc kín túi, khơng có trao đổi khơng khí đảo trộn q nhiều lần không phù hợp cho việc phát triển sinh bào tử nấm T asperellum (Tri.020(2).NC) môi trường thóc Chế độ buộc túi hở đảo trộn lần sau cấy ngày ngày môi trường thóc điều kiện thuận lợi cho nấm T asperellum (Tri.020(2).NC) phát triển đạt nồng độ bào tử cao 3.3.3.5 Nghiên cứu thời gian chiếu sáng thích hợp Chế độ chiếu sáng 12 sáng 12 tối thích hợp cho phát triển phát sinh bào tử nấm T asperellum (Tri.020(2).NC) lượng bào tử nấm T asperellum đạt cao 5,33 ×109 bt/g Như vậy, thí nghiệm từ phần 3.3.1 đến 3.3.3.5 xác định loại môi trường điều kiện nuôi cấy phù hợp cho việc sản xuất chế phẩm nấm T asperellum (Tri.020(2).NC): Nguồn nấm T asperellum (Tri.020(2).NC) nhân giống điều kiện thích hợp xác định Cụ thể: Nhân giống cấp nguồn nấm T asperellum (Tri.020(2).NC) môi trường PDA - ngày nhiệt độ 300C Sau đó, nguồn T asperellum (Tri.020(2).NC) môi trường PDA tiếp tục nhân giống cấp môi trường lỏng 150 (g) giá + 30 (g) đường + (g) urê + (g) KH2P04 + 0,5 MgS04 + 1000 (ml) H2O ni lắc 150 vòng/phút từ 3-4 ngày nhiệt độ 300C Thu dịch sinh khối nấm T asperellum (Tri.020(2).NC) môi trường nhân giống cấp để làm nguồn nhân lên mơi trường rắn thóc ngun hạt với tỷ lệ thóc/nước 1/1; túi mơi trường buộc hở; lần đảo trộn suốt thời kỳ nhân sinh khối sau ngày sau ngày nuôi cấy Ni nhân mơi trường thóc sau 10 ngày điều kiện nhiệt độ 300C, sản phẩm nấm T asperellum (Tri.020(2).NC) thu đưa sấy khô 400C hong khô tự nhiên nia, lượng bào tử 5,3 × 109 bt/g chế phẩm Đây sở để xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm nấm T asperellum (Tri.020(2).NC) đây: 3.3.3.6 Quy trình sản xuất chế phẩm nấm T asperellum (Tri.020(2).NC) phòng trừ nấm A flavus hại lạc Nghệ An Nội dung quy trình (hình 3.3): Nguồn giống nấm T asperellum: nguồn nấm T asperellum dùng làm chế phẩm T asperellum (Tri.020(2).NC) phân lập từ đất trồng lạc tỉnh Nghệ An có khả đối kháng cao với nấm mốc A flavus hại lạc Nhân giống cấp 1: Nấm đối kháng T asperellum (Tri.020(2).NC) nhân giống cấp môi trường PDA (Potato Dextro Agar) - ngày nhiệt độ 300C Nhân giống cấp 2: Nguồn giống T asperellum (Tri.020(2).NC) cấp nhân giống cấp môi trường lỏng ni lắc 150 vòng/phút để tăng nhanh sinh khối Thành phần môi trường lỏng bao gồm: 150 (g) giá + 30 (g) đường + (g) urê + (g) KH2P04 + 0,5 MgS04 + 1000 (ml) H2O Thời gian nhân giống cấp thời gian ngày nhiệt độ 300C Dùng dịch sinh khối nấm T asperellum (Tri.020(2).NC) môi trường nhân giống cấp để làm nguồn nhân lên mơi trường thóc ngun hạt Nhân sinh khối mơi trường thóc: Mơi trường thóc hấp khử trùng điều kiện 1210C 30 phút với tỷ lệ thóc/lượng nước 1/1 Các túi ni cấy nấm 16 đặt điều kiện 12h sáng : 12h tối, nhiệt độ 300C, túi đựng môi trường buộc hở lần đảo trộn: sau ngày ngày nuôi cấy Nuôi nhân 10 ngày điều kiện nhiệt độ 30 0C thu sinh khối nấm đưa làm khô Thu sản phẩm nhân sinh khối, làm khơ đóng gói: làm khơ nấm hong khô tự nhiên nia tủ sấy nhiệt độ 400C khô Cho vào túi hút chân không để đảm bảo lượng bào tử thời gian bảo quản Nguồn giống nấm Trichoderma T asperellum (Tri.020(2).NC) Nhân giống cấp Môi trường PDA (3-4 ngày): 200 (g) khoai tây + 20 (g) dextro + 15 (g) agar Nhân giống cấp Môi trường lỏng (nuôi lắc ngày):150 (g) giá + 30 (g) đường glucose + (g) urê + (g) KH2P04 + 0,5 (g) MgS04 + 1000 (ml) H2O Nhân sinh khối môi trường rắn Môi trường rắn (10 ngày): Thóc Lượng nước: Tỉ lệ thóc/nước =1/1 Buộc hở túi môi trưởng đảo trộn lần: sau ngày cấy o Ánh sáng: 12h sáng 12h tối; Nhiệt độ: 30 C Thu sản phẩm nhân sinh khối, làm khơ đóng gói CHẾ PHẨM TRICHODERMA Hình 3.3 Sơ đồ quy trình sản xuất chế phẩm nấm T asperellum (Tri.020(2).NC) phòng trừ nấm mốc A flavus hại lạc 3.3.3.7 Kết thử nghiệm tính an tồn sinh học chế phẩm sinh học T asperellum Tiến hành thí nghiệm kiểm tra tính an toàn sinh học chế phẩm nấm T asperellum Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương đối tượng động vật thí nghiệm chuột Swiss Chuột nhóm dùng chế phẩm nấm Trichodema (5g/kg 10g/kg) tăng tốt tương đương nhóm chứng Kết thực nghiệm cho thấy mức liều uống từ 10g/kg chuột trở xuống chế phẩm nấm T asperellum an toàn 17 3.4 Nghiên cứu biện pháp kỹ thuật sử dụng chế phẩm T asperellum phòng trừ A flavus hại lạc Nghệ An 3.4.1 Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm nấm T asperellum phòng trừ nấm A flavus hại lạc điều kiện nhà lưới 3.4.1.1 Nghiên cứu khả ức chế nấm T asperellum với nấm A flavus mức mật độ khác Bảng 3.13 cho thấy khả ức chế nấm A flavus nấm T asperellum tỷ lệ thuận với mật độ nấm có đất Ở cơng thức mật độ bào từ nấm đối kháng T asperellum cao gấp đôi mật độ bào tử nấm A flavus, số lượng mầm bệnh nấm A flavus đất giảm thấp so với cơng thức lại 3,11× 104 CFU/g tương ứng giảm 77,05% so với đối chứng Bảng 3.13 Khả ức chế nấm T asperellum với nấm A flavus mức mật độ khác điều kiện nhà lưới sau tuần gieo hạt Công thức Số lượng mầm bệnh A flavus (CFU/g) Giảm so với đối chứng (%) CT1_0/1 13,56 × 10 CT2_1/1 7,44× 104 45,08b CT3_2/1 3,11× 104 77,05a CT4_1/2 8,67× 104 36,07c CV (%) 1,8 LSD 0,05 1,42 Ghi chú: Các chữ số mũ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê (P