Nghiên cứu nấm đối kháng Trichoderma phòng trừ bệnh mốc vàng do nấm Aspergillus flavus Link. hại lạc tại Nghệ An

Khả năng đối kháng của các nguồn nấm Trichoderma phân lập được từ đất trồng lạc Hà Tĩnh đối với nấm mốc A... Trong đó, tập trung chủ yếu vào các chiến lược trước thu hoạch, nhấn mạnh đế

HỒ THỊ NHUNG

NGHIÊN CỨU NẤM ĐỐI KHÁNG Trichoderma

PH NG TRỪ BỆNH MỐC VÀNG DO NẤM

Aspergillus flavus in HẠI ẠC TẠI NGHỆ AN

UẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI - 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

UẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Người hướng dẫn hoa học: GS.TS Vũ Triệu Mân

PGS.TS Nguyễn Văn Viết

Hà Nội, 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày trong luận án là trung thực và khách quan

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã đƣợc cảm

ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều đƣợc chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Tác giả luận án

Hồ Thị Nhung

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình

Cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới GS.TS Vũ Triệu Mân, PGS.TS Nguyễn Văn Viết và PGS.TS Trần Ngọc Lân đã định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Quá trình thực hiện đề tài, hoàn thiện bài báo và luận án, tôi đã được nhận sự giúp

đỡ, góp ý quý báu của cô TS Đặng Vũ Thị Thanh và thầy PGS.TS Hà Viết Cường Nhân dịp này, tôi xin được bày tỏ sự cảm ơn sâu sắc đến sự giúp đỡ nhiệt tình mà Thầy

Cô đã dành cho

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Đào tạo Sau đại học - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam và đơn vị sinh hoạt chuyên môn Viện Bảo vệ thực vật, đặc biệt là TS Phạm Bích Hiên và TS Lê Mai Nhất đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và bảo vệ luận án

Tôi xin cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Trường Đại học Vinh, TS Nguyễn Thị Thanh - chủ nhiệm đề tài KH&CN Độc lập cấp Nhà nước (Mã Số: ĐTĐL.2011G/28/HĐ) các thành viên đề tài đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình công tác và thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi trong suốt thời gian học tập

Xin chân thành cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp và các em sinh viên đã giúp đỡ tôi hoàn thành luận án./

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Nghiên cứu sinh

Hồ Thị Nhung

1.1.4 Biện pháp chẩn đoán nấm A flavus sinh độc tố aflatoxin bằng sử

1.1.5 Nghiên cứu các phương pháp phòng trừ nấm A flavus sinh độc tố aflatoxin 10

1.1.6 Nghiên cứu sử dụng nấm Trichoderma phòng trừ nấm A flavus sinh

1.2.4 Nghiên cứu các phương pháp phòng trừ nấm A flavus sinh độc tố aflatoxin 28

1.2.5 Nghiên cứu sử dụng nấm Trichoderma phòng trừ nấm A flavus sinh

1.2.6 Ứng dụng nấm đối kháng Trichoderma trong phòng trừ nấm

CHƯƠNG II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37

2.5.1 Nghiên cứu thực trạng nhiễm nấm A flavus trên hạt lạc và đất trồng

2.5.2 Phương pháp thu thập, phân lập, tuyển chọn các nguồn nấm

Trichoderma có khả năng đối kháng với nấm mốc A flavus hại lạc

tại Nghệ An

2.5.3 Nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật sản xuất chế phẩm T asperellum

2.5.4 Nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật sử dụng chế phẩm T asperellum

phòng trừ nấm A flavus hại lạc tại Nghệ An

3.1 Thực trạng nhiễm nấm A flavus trên hạt lạc và đất trồng lạc tại Nghệ An 56

3.1.2 Tỷ lệ nhiễm nấm A flavus trên hạt lạc thu từ các chợ Nghệ An năm 2012 56

3.1.3 Tỷ lệ nhiễm nấm A flavus trên hạt lạc thu từ nông hộ Nghệ An năm 2012 57

3.1.5 Tỷ lệ nhiễm nấm A flavus trên đất trồng lạc của các điểm điều tra tại

Nghệ An năm 2012

3.1.6 Khả năng sinh độc tố aflatoxin của các mẫu nấm A flavus phân lập

được trên hạt lạc giống thu từ các chợ của huyện Nghi Lộc và thành

phố Vinh

3.1.7 Khả năng sinh độc tố aflatoxin của các mẫu nấm A flavus phân lập

3.1.8 Khả năng sinh độc tố aflatoxin của các mẫu nấm A.flavus phân lập

3.2 Thu thập, phân lập và tuyển chọn các nguồn nấm Trichoderma có khả

3.2.2 Nghiên cứu tuyển chọn các nguồn nấm Trichoderma đối kháng cao

3.2.3 Định danh 15 nguồn nấm Trichoderma có khả năng đối kháng rất

cao với nấm mốc A flavus hại lạc dựa trên vùng gen ITS-rDNA

3.3 Nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật sản xuất chế phẩm T asperellum

3.3.1 Ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy giống cấp 1 đến sự phát

3.3.2 Lựa chọn môi trường nhân giống cấp 2 thích hợp nhất cho nấm

3.3.3 Lựa chọn môi trường rắn nuôi nhân sinh khối thích hợp nhất cho

3.4 Nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật sử dụng chế phẩm T asperellum

phòng trừ A flavus hại lạc tại Nghệ An

3.4.1 Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm nấm T asperellum phòng trừ nấm

A flavus hại lạc trong điều kiện nhà lưới

3.4.2 Nghiên cứu chế phẩm nấm T asperellum phòng trừ nấm A flavus

3.4.3 Kết quả xây dựng và đánh giá hiệu quả mô hình sử dụng chế phẩm

nấm T asperellum phòng trừ nấm A flavus hại lạc ngoài đồng

PHỤ LỤC 124

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

TT Chữ viết tắt Từ viết tắt

1 A flavus Aspergillus flavus

2 A nomius Aspergillus nomius

3 A parasiticus Aspergillus parasiticus

19 T atroviride Trichoderma atroviride

20 T asperellum Trichoderma asperellum

21 T aureoviride Trichoderma aureoviride

22 T hamatum Trichoderma hamatum

23 T harzianum Trichoderma harzianum

24 T koningii Trichoderma koningii

25 T pseudokonigii Trichoderma pseudokonigii

26 T reesci Trichoderma reesci

27 T virens Trichoderma virens

DANH MỤC BẢNG

1.5 Mối tương quan tỷ lệ hạt lạc bị nhiễm nấm A flavus với mức độ

3.2 Tỷ lệ nhiễm nấm A flavus trên hạt lạc thu từ các chợ của huyện Nghi

3.5 Tỷ lệ nhiễm nấm A.flavus trên đất trồng lạc của các điểm điều tra tại

3.6 Số lượng các mẫu nấm A flavus phân lập được trên hạt lạc giống thu từ

3.7 Số lượng các mẫu nấm A flavus phân lập được trên hạt lạc giống thu

3.8 Số lượng các mẫu nấm A flavus phân lập được từ đất trồng lạc ở

3.9 Tần suất xuất hiện nấm Trichoderma trên đất trồng lạc tại các điểm

3.10 Khả năng đối kháng của các nguồn nấm Trichoderma phân lập được từ đất

3.11 Khả năng đối kháng của các nguồn nấm Trichoderma phân lập từ đất

trồng lạc Thanh Hóa đối với nấm mốc A flavus (Asp1.011NA) sau 7

3.12 Khả năng đối kháng của các nguồn nấm Trichoderma phân lập được

từ đất trồng lạc Hà Tĩnh đối với nấm mốc A flavus (Asp1.011NA)

3.13 Hiệu lực phòng trừ của các nguồn nấm Trichoderma đối với nấm

3.14 Kết quả định danh của các nguồn nấm Trichoderma dùng phần mềm

3.16 Ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy tới sự phát triển của nấm

3.17 Khối lượng đường glucose thích hợp nhất cho sự phát triển của nấm

T asperellum (Tri.020(2).NC) trong môi trường lỏng sau 72 giờ ở 300C 78 3.18 Khối lượng giá đỗ thích hợp nhất cho sự phát triển của nấm

T asperellum (Tri.020(2).NC) trong môi trường lỏng sau 72 giờ ở 300C 79

3.19 Thời gian thu hồi sinh khối nấm T asperellum (Tri.020(2).NC) thích

3.20 Sự phát triển của nấm T asperellum (Tri.020(2).NC) trên các loại cơ

3.21 Sự phát triển của nấm T asperellum (Tri.020(2).NC) trên các tỷ lệ

3.22 Sự phát triển của nấm T asperellum (Tri.020(2).NC) trên các túi môi

3.23 Sự phát triển của nấm T asperellum (Tri.020(2).NC) trên các túi môi

3.24 Sự phát triển của nấm T asperellum (Tri.020(2).NC) với các mức

3.25 Ảnh hưởng của chế phẩm T asperellum đến khối lượng của chuột thí

3.26 Khả năng ức chế của nấm T asperellum với nấm A flavus ở các mức

3.27 Ảnh hưởng của thời điểm sử dụng chế phẩm nấm T asperellum khác

nhau đến số lượng mầm bệnh nấm A flavus trong điều kiện nhà lưới

3.28 Ảnh hưởng của các phương pháp sử dụng chế phẩm nấm

T asperellum đến số lượng mầm bệnh nấm A flavus trong điều kiện

3.29 Ảnh hưởng của liều lượng và phương pháp sử dụng của chế phẩm

đến khả năng hình thành quần thể của nấm T asperellum trong đất

vùng rễ cây lạc vào giai đoạn thu hoạch tại Nghi Lộc, Nghệ An vụ

3.30 Ảnh hưởng của các mức liều lượng và phương pháp sử dụng khác

nhau của chế phẩm nấm T asperellum đến tần suất xuất hiện của

nấm T asperellum tại vùng rễ cây lạc vào giai đoạn thu hoạch tại

3.31 Ảnh hưởng của liều lượng và phương pháp sử dụng chế phẩm nấm

T asperellum đến số lượng mầm bệnh nấm A flavus tại vùng đất rễ cây

3.32 Ảnh hưởng của liều lượng và phương pháp sử dụng chế phẩm nấm

T asperellum đến năng suất lạc tại Nghi Lộc, Nghệ An vụ xuân 2014 và

3.33 Ảnh hưởng của các mức liều lượng và phương pháp sử dụng khác nhau

của chế phẩm nấm T asperellum đến tỷ lệ nhiễm nấm A flavus của quả

3.34 Ảnh hưởng của các mức liều lượng và phương pháp sử dụng khác nhau

của chế phẩm nấm T asperellum đến tỷ lệ hạt lạc nhiễm nấm A flavus

3.35 Ảnh hưởng của các mức liều lượng và phương pháp sử dụng khác

nhau của chế phẩm nấm T asperellum đến tỷ lệ hạt lạc nhiễm A

flavus sau thời gian bảo quản 12 tháng tại Nghi Lộc, Nghệ An vụ

3.36 Hiệu quả phòng trừ nấm A flavus hại lạc của chế phẩm T asperellum

3.37 Hiệu quả kinh tế của mô hình sử dụng chế phẩm nấm T asperellum

DANH MỤC HÌNH

1.1 Kết hợp các phương pháp để đánh giá nguồn nấm sinh độc tố

2.1 Phương pháp cấy nấm Trichoderma (T) và nấm A flavus (C) trên

2.2 Phương pháp cấy nấm Trichoderma và A flavus trên đĩa petri trong

thí nghiệm đánh giá khả năng phòng trừ của nấm Trichoderma đối

3.1 Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma spp đối với nấm

3.5 Khối lượng giá đỗ thích hợp nhất cho sự phát triển của nấm

T asperellum (Tri.020(2).NC) trong môi trường lỏng 80

3.6 Thời gian thu hồi sinh khối nấm T asperellum (Tri.020(2).NC)

3.7 Sơ đồ quy trình sản xuất chế phẩm nấm T asperellum phòng trừ

3.8 Ảnh hưởng của các phương pháp sử dụng chế phẩm nấm

T asperellum đến số lượng mầm bệnh nấm A flavus trong điều

3.9 Ảnh hưởng của liều lượng và phương pháp sử dụng chế phẩm nấm

T asperellum đến tần suất xuất hiện của nấm T asperellum trên

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Cây lạc (Arachis hypogaea L.) là cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh

tế cao được dùng làm thực phẩm và xuất khẩu Ở nước ta vùng Bắc Trung Bộ có diện tích trồng lạc lớn nhất so với 24 tỉnh thành trồng lạc trong cả nước, chiếm 22,5% tổng diện tích trồng và 21,6% tổng sản lượng lạc trên cả nước Diện tích trồng lạc ở Nghệ An, Hà Tĩnh và Thanh Hóa tương ứng là 16200 ha chiếm 8,1%; 16000 ha chiếm 8,0%; 12800 ha chiếm 6,4% tương ứng so với cả nước Sản lượng lạc ở Nghệ An, Hà Tĩnh và Thanh Hóa là 37300 tấn chiếm 8,3%;

36900 tấn chiếm 8,2%; 23600 tấn tương ứng, chiếm 5,2% cả nước (Tổng cục thống kê, 2015)

Bệnh mốc vàng hại lạc do nấm Aspergillus flavus Link gây ra là đối tượng hại có ý nghĩa kinh tế quan trọng với cây lạc Nấm A flavus có khả năng sinh độc

tố aflatoxin, có thể gây ung thư và một số bệnh nguy hiểm trên người và động vật

Các nghiên cứu về nấm A.flavus và sự hình thành aflatoxin trên lạc và các sản

phẩm từ lạc trên thế giới được tiến hành toàn diện và hệ thống, với gần 2000 công

trình được xuất bản (Mehan et al 1991)

Lê Văn Giang cs (2011), khảo sát trên 60 mẫu lạc ở Nghệ An, có 59 mẫu (98,30%) bị nhiễm nấm A flavus, trong đó 30 mẫu (50,0%) sinh độc tố aflatoxin

từ 2 – 100 ppb và 10 mẫu (16,67%) vượt quá tiêu chuẩn cho phép của Bộ Y tế Đây chính là mối nguy hại cho sức khỏe đối với người sử dụng những sản phẩm lạc này

Nghiên cứu của Torres et al (2014) đã tóm tắt những tiến bộ gần đây ở các

quốc gia trồng lạc trên thế giới về các phương pháp ngăn ngừa ô nhiễm aflatoxin trên lạc Trong đó, tập trung chủ yếu vào các chiến lược trước thu hoạch, nhấn mạnh đến các hướng nghiên cứu cần tập trung trong tương lai bao gồm: chọn tạo giống lạc kháng nấm, kiểm soát sinh học và sử dụng ozon để giảm ô nhiễm aflatoxin trên lạc

Tại Việt Nam nghiên cứu phòng trừ nấm mốc A flavus đã có một số thành

công Bên cạnh các biện pháp canh tác và bảo quản được áp dụng để phòng chống bệnh, các tác giả Nguyễn Thị Xuân Sâm, Lê Thiên Minh, Nguyễn Thùy

Châu năm 2010-2011 đã phân lập, tuyển chọn được các dòng nấm A flavus TH97, DA2 không sinh độc tố dùng trong phòng trừ các dòng nấm A flavus sinh

độc tố aflatoxin Trung tâm nghiên cứu và phát triển đậu đỗ đã tuyển chọn thành

công giống lạc L17 có khả năng kháng nấm A.flavus (Nguyễn Văn Thắng, 2010)

Chúng ta đã nghiên cứu và ứng dụng thành công các chế phẩm sản xuất từ nấm

Trichoderma chống các bệnh thối rễ, chết ẻo… do các nấm Rhizoctonia solani, Fusarium solani, Phytophtora, Sclerotium rolfsii gây ra Mặc dù vậy, hướng

nghiên cứu ứng dụng nấm đối kháng Trichoderma để phòng trừ nấm mốc

A flavus nhằm giảm thiểu độc tố aflatoxin trên lạc cũng như các cây trồng khác

chưa được quan tâm

Xuất phát từ những lý do trên, đề tài: ―Nghiên cứu nấm đối háng

Trichoderma phòng trừ bệnh mốc vàng do nấm Aspergillus flavus in hại

lạc tại Nghệ An” đã được tiến hành nhằm tuyển chọn và ứng dụng nấm đối

kháng Trichoderma trong phòng trừ bệnh mốc vàng hại lạc

2 Mục đích và yêu cầu

2.1 Mục đích

Tuyển chọn được các nguồn nấm Trichoderma có khả năng đối kháng với nấm mốc Aspergillus flavus hại cây lạc trồng tại Nghệ An và xây dựng được quy trình kỹ thuật sản xuất và biện pháp sử dụng chế phẩm Trichoderma phòng trừ

Aspergillus flavus hiệu quả trên đồng ruộng

Yêu cầu

Tuyển chọn được các nguồn nấm Trichoderma có khả năng đối kháng cao với nấm mốc Aspergillus flavus hại lạc tại Nghệ An

Xây dựng được quy trình kỹ thuật sản xuất và biện pháp sử dụng chế phẩm

Trichoderma phòng trừ Aspergillus flavus hiệu quả trên đồng ruộng

3 Ý nghĩa hoa học và thực tiễn của đề tài

3 Ý nghĩa hoa học

Luận án bổ sung những thông tin mới về tuyển chọn sử dụng nấm đối

kháng Trichoderma asperellum được phân lập từ vùng đất trồng lạc để phòng trừ nấm A flavus hại trên lạc tại Nghệ An

Kết quả luận án là tài liệu phục vụ nghiên cứu, giảng dạy và phục vụ sản xuất

3 Ý nghĩa thực tiễn

Sử dụng chế phẩm Trichoderma asperellum để phòng trừ nấm A flavus hại trên lạc tại Nghệ An, không những làm giảm sự nhiễm nấm mốc A flavus gây

bệnh mốc vàng hại lạc giai đoạn trên đồng ruộng và trong quá trình bảo quản,

tăng hiệu quả kinh tế trong trồng lạc mà còn góp phần bảo vệ môi trường và đảm

bảo vệ sinh an toàn thực phẩm

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài

4.1 Đối tượng nghiên cứu

Các loài nấm Trichoderma được phân lập từ các mẫu đất trồng lạc, sử dụng

trong phòng trừ nấm A flavus gây bệnh mốc vàng hại lạc tại Nghệ An

4.2 Phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu tuyển chọn các nguồn nấm Trichoderma có khả năng đối kháng

cao và sản xuất chế phẩm sinh học Trichoderma có khả năng phòng trừ hiệu quả

nấm mốc Aspergillus flavus trên cây lạc và ứng dụng rộng rãi cho vùng chuyên

canh lạc tỉnh Nghệ An

5 Những đóng góp mới của luận án

- Là công trình nghiên cứu có hệ thống về sử dụng nấm đối kháng

T asperellum được phân lập từ vùng đất trồng lạc để chuyên phòng trừ nấm

A flavus hại trên lạc tại Nghệ An

- Ứng dụng thành công các kỹ thuật sinh học phân tử dựa vào trình tự vùng

gen ITS để định danh các nguồn nấm Trichoderma có khả năng đối kháng cao với

nấm mốc hại lạc A flavus

- Đề xuất được quy trình sản xuất chế phẩm nấm T asperellum đạt 5,3 ×

A flavus gây bệnh mốc vàng hại lạc giai đoạn trên đồng ruộng và giảm độc tố

aflatoxin trong quá trình bảo quản đạt 92,08%, tăng hiệu quả kinh tế trong trồng

lạc

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

1.1.1 Tình hình sản xuất lạc trên thế giới

Cây lạc đứng hàng thứ hai sau cây đậu tương trong số các cây trồng ngắn ngày lấy dầu thực vật (cả về diện tích và sản lượng) và được trồng rộng rãi ở hơn

100 quốc gia trên thế giới (bảng 1.1)

Bảng 1 Diện tích, năng suất và sản lượng lạc của thế giới (năm - 2014)

Nguồn: FAO (2016)

Theo thống kê của FAO, từ năm 2000 đến năm 2014 diện tích lạc trên thế giới có xu hướng tăng lên, năm 2000, diện tích trồng lạc là 23,260 nghìn ha, đến năm 2014 diện tích trồng lạc đạt 26,542 nghìn ha Năng suất lạc ngày càng tăng nhờ được áp dụng những tiến bộ kỹ thuật mới vào sản xuất Năm 2000 năng suất lạc đạt 1,49 tấn/ha, tăng 35,5% so với năng suất năm 1980 (1,10 tấn/ha) và tăng 29,6% so với năng suất năm 1990 (1,15 tấn/ha) Đến năm 2014, năng suất lạc đạt 1,82 tấn/ha Cùng với sự gia tăng về năng suất, sản lượng lạc của thế giới cũng tăng lên, từ 34,720 nghìn tấn trong năm 2000 tăng lên 43,915 nghìn tấn vào năm 2014

1.1.2 Nghiên cứu bệnh mốc vàng do nấm Aspergillus flavus Link hại lạc

1.1.2.1 Đặc điểm của nấm A flavus

Nấm A flavus thuộc chi Aspergillus, chi Aspergillus được mô tả lần đầu tiên bởi Florentine et al vào năm 1729 và tên của nấm được đặt dựa vào cấu trúc của cuống sinh bào tử Aspergillus là chi phổ biến hiện tại đã phát hiện được trên

200 loài (Samson et al., 1992) Loài A flavus được mô tả bởi Link vào năm

1890 và được biết đến như một loài sinh sản vô tính Gần đây, giai đoạn sinh sản

hữu tính của A flavus đã được công bố là nấm Petromyces flavus Nấm A flavus

phân bố ở nhiều dạng địa hình khác nhau nhưng xuất hiện phổ biến hơn từ vĩ độ

160 đến 350 có khí hậu ấm, không phổ biến ở những vùng có vĩ độ trên 450 (Klich, 2007)

Nấm A flavus có màu vàng xanh lá cây trên môi trường Czapeck hay

Sabouraud sau 24h tản nấm có màu vàng nhạt ở trung tâm, rìa mép bờ có màu trắng mịn, sau 48h từ trung tẩm tản nấm, xuất hiện các khối bào tử chín màu vàng nhạt hay vàng Đường kính tản nấm đạt 4-5 cm sau 6-7 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, các bào tử hình thành vòng tròn đồng tâm đều đặn, thường có 5-

6 vòng tròn màu xanh lục trên bề mặt khuẩn lạc (Rapper, 1965)

1.1.2.2 Đặc điểm phát sinh, phát triển của bệnh mốc vàng hại lạc do nấm A flavus

Nấm A flavus là một trong những loài nấm gây bệnh tồn tại phổ biến

trong đất trồng lạc có khả năng sinh trưởng cộng sinh trong quá trình phát triển của cây lạc và từ đó có thể xâm nhập vào các hạt lạc Trên cây lạc đang

phát triển có nhiều con đường nhiễm nấm A flavus khác nhau: như qua rễ, hoa,

hoặc qua lá bị côn trùng ăn hoặc từ bụi và không khí, nhưng con đường lây

nhiễm chính diễn ra trực tiếp từ sự tiếp xúc của mầm bệnh A flavus từ đất xung quanh vỏ của quả lạc (Pitt et al., 2013)

Sự xâm nhiễm của nấm A flavus và hình thành aflatoxin trên lạc khác nhau

tùy vào giai đoạn trước thu hoạch, sau thu hoạch và thời gian bảo quản

Giai đoạn trước thu hoạch: Các nhân tố có ảnh hưởng bất lợi đến cây và quả trong quá trình chín như thu hoạch muộn, khô hạn, vết thương cơ giới, sự gây hại

của côn trùng, nhện và tuyến trùng , đều làm gia tăng mức độ nhiễm A.flavus và aflatoxin trên lạc Sự xâm nhiễm của các nấm đất như Fusarium ssp.,

Rhizocctonia solani, Pythium myriotylum có thể không gây hại nghiêm trọng

nhưng là nhân tố làm tăng tỷ lệ nhiễm A.flavus và aflatoxin Các bệnh hại quả và

hạt khác có ảnh hưởng đáng kể đến mức độ nhiễm nấm A flavus của hạt lạc trên đồng ruộng (Mehan et al., 1986)

Giai đoạn sau thu hoạch: Độ ẩm quả lạc từ 8 - 40% thuận lợi cho sự xâm

nhiễm của A.flavus Thời gian làm khô quả dài hay ngắn ảnh hưởng lớn đến sự

xâm nhiễm nấm và sản sinh aflatoxin Các hình thức làm khô như phơi, sấy, phương pháp đảo lạc, vật liệu phơi lạc cũng có ảnh hưởng khác nhau đến quá

trình nhiễm aflatoxin (McDonal et al., 1963)

Giai đoạn bảo quản: Độ ẩm cao là yếu tố thuận lợi cho sự xâm nhiễm vào

hạt của A.flavus cũng như các nấm khác Độ ẩm hạt từ 10,5 -11% sẽ làm hạn chế

sự nhiễm nấm (Mehan, 1998)

Nguồn bệnh A flavus trong đất tiếp xúc với vỏ lạc là sự tiếp xúc đầu tiên của cây lạc với mầm bệnh A flavus Chu kỳ bệnh và dịch tễ học của nấm

A flavus đã được Amaike et al (2011) nghiên cứu Nấm A flavus tồn tại trong

đất dưới dạng bào tử hoặc hạch nấm hoặc dạng sợi nấm trên tàn dư cây

trồng Hạch nấm A flavus có thể tồn tại trong đất ở điều kiện môi trường khắc

nghiệt, sau 3 năm vẫn giữ được sức nảy mầm Gặp điều kiện thời tiết nóng và hạn hán, hạch nấm nảy mầm sản sinh ra bào tử, dẫn đến sự gia tăng quần thể nấm bệnh trong điều kiện này

Hạch nấm nảy mầm thành sợi nấm, sau đó hình hành cuống sinh bào tử (conidiophores) Sự phân tán trong không khí của bào tử có liên quan đến sự nhiễm bệnh trên cây Quá trình lưu chuyển của đất trồng hay dòng nước mưa đóng

vai trò quan trọng trong sự nhiễm bệnh trên hạt lạc (Horn et al 1997)

Điều kiện thời tiết hạn hán, nắng nóng là yếu tố lớn ảnh hưởng đến năng suất

và phẩm chất lạc do sự ô nhiễm aflatoxin Trong điều kiện có mưa hoặc tưới tiêu

thích hợp, lạc thường không bị nhiễm độc aflatoxin (Pitt et al., 2013)

1.1.3 Tình trạng ô nhiễm aflatoxin do nấm A flavus tiết ra trên lạc

Aflatoxin là độc tố chính được tiết ra chủ yếu bởi một số loài nấm

Aspergillus spp Các aflatoxin được cấu tạo gồm bốn hợp chất của nhóm

bis-furanocouramin, là sản phẩm trao đổi chất của nấm A flavus và A parasiticus

Hiện có khoảng 18 loại độc tố aflatoxin đã được tìm thấy, có kí hiệu B1, B2, G1,

G2, M1, M2, P1, Q1, được phân biệt trên đặc tính lý hóa và độc tính của chúng

(Reddy et al., 2000)

Theo Yu (2012) hầu hết A flavus sản sinh aflatoxin B1 và B2 trong

khi Aspergillus parasiticus , tạo ra aflatoxins B1 , B2 , G1 , và G2 Bốn aflatoxin chủ yếu này được đặt tên dựa trên ánh sáng huỳnh quang màu xanh nước biển (Blue) hoặc xanh lá cây (Green) dưới ánh sáng cực tím và tính di động tương đối

dẫn chất hydroxyl hóa chuyển hóa từ aflatoxin B 1 bởi bò và tiết ra trong sữa

Martinez et al (1994) đã chỉ ra rằng các aflatoxin ít hoặc không bị phân hủy

trong điều kiện làm nóng khi thanh trùng, khi đun nấu ở nhiệt độ thông thường Độc tố này rất bền với các men tiêu hóa nhưng dễ bị phá hủy bằng amoniac hay hypochlorit Các aflatoxin có thể tồn tại trong thực phẩm mà không cần sự có mặt của nấm mốc tương ứng

Độc tố aflatoxin được tạo ra từ một số chủng nấm mốc thuộc chi Aspergillus như: A flavus, A parasiticus, A nomius, A pseudotamarii, A bombycis… trong

đó loài A flavus có khả năng sinh aflatoxin mạnh nhất và phổ biến trong môi

trường tự nhiên và nhân tạo Độc tố aflatoxin gây ung thư, gây đột biến, gây quái

thai và các tác dụng phụ ức chế miễn dịch (Bhatnagar-Mathur et al., 2015)

Tại Thái Lan, kết quả điều tra trên hơn 100 địa điểm cho thấy 49% các mẫu lạc nhiễm aflatoxin, trung bình là 1530g/kg, cao nhất là 12.300g/kg

(Mehan et al., 1991)

Tại châu Phi, một số nước có diện tích trồng lạc lớn cũng bị nhiễm

aflatoxin cao Mehan et al (1991) đã ghi nhận, 44% mẫu lạc nhiễm aflatoxin tại

Ai Cập và 94/98 mẫu nhiễm aflatoxin tại Nigeria, trong đó 54% mẫu có hàm lượng aflatoxin cao hơn 30g/kg

Kết quả nghiên cứu của Mutegi et al (2012), sự xuất hiện của nấm A

flavus và hàm lượng aflatoxin tổng số đã được xác định trên 436 mẫu lạc từ các

quận Busia và Homa Bay của Kenya Tổng cộng có 1458 chủng Aspergillus

flavus được phân lập Mẫu lạc có hàm lượng aflatoxin tổng số ≥10 μg kg -1 được

sinh ra bởi các loài A flavus (tỷ lệ 78%)

Mức aflatoxin trong các loại sản phẩm từ lạc ở Đài Loan được khảo sát trên 1827 mẫu được thu thập từ các vùng khác nhau của Đài Loan từ năm 1997 đến năm 2011 Bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với huỳnh quang

đã phát hiện có 32,7% mẫu với các mức nhiễm từ 0,2 μg/kg đến 513,4 μg/kg Bơ làm từ lạc bị nhiễm hàm lượng aflatoxin cao nhất, tiếp theo là bột lạc, kẹo lạc và hạt lạc Trong số các mẫu dương tính aflatoxin, aflatoxin B1 có hàm lượng phát hiện cao nhất, tiếp theo là aflatoxin B2 , aflatoxin G2 và

aflatoxin G1 (Chen et al., 2013)

Theo Kana et al (2013) khi phân tích hàm lượng aflatoxin trên tổng số 201

mẫu ngô, bột lạc và thức ăn gia súc hỗn hợp được thu thập tại các trang trại gia cầm của Cameroon và phân tích hàm lượng độ ẩm và aflatoxin Kết quả cho thấy khoảng 9% mẫu ngô dương tính với aflatoxin, với nồng độ từ ≤ 2 - 42 μg/kg Hầu hết các mẫu bột lạc (100%) và thức ăn gia súc hỗn hợp (83,0%) đều

có kết quả dương tính với nồng độ các mẫu dương tính từ 39-950 μg/kg đối với bột lạc và 2-23 μg/kg đối với thức ăn hỗn hợp Những kết quả này cho thấy bột lạc là loại thức ăn gia súc có nguy cơ cao về ô nhiễm aflatoxin

Kết quả khảo sát của Filbert et al (2012) thấy rằng tất cả các mẫu bơ từ lạc

thu được từ cửa hàng tạp hoá Haiti và Kenya trong năm 2009 và 2010 đều bị ô nhiễm aflatoxin Mức aflatoxin dao động từ 7,9 đến 799,8 ppb

1.1.4 Biện pháp chẩn đoán nấm A flavus sinh độc tố aflatoxin bằng sử dụng

môi trường CAM (Coconut Agar Medium)

Các phương pháp phân tích để xác định các độc tố nấm mốc đã được phát triển và hoàn thiện từ những năm 1960 Độc tố nấm mốc là những hợp chất có cấu trúc hóa học và tính chất lý hóa khác nhau nên cần những phương pháp kiểm tra đặc trưng riêng Chính vì vậy đã xuất hiện nhiều phương pháp xác định như: Phương pháp truyền thống, phương pháp vật lý hóa học, phương pháp hóa sinh học, các phương pháp dựa trên cơ sở sắc ký lỏng (LC) hoặc sắc ký khí (GS) với dectector thích hợp như dectector huỳnh quang (FLD), dectector bắt điện tử UV , dectector ion (FID), dectector bắt điện tử (ECD)

Hình 1.1 Kết hợp các phương pháp để đánh giá nguồn nấm sinh độc tố aflatoxin

của các loài Aspergillus spp (Nguồn Abbas et al., 2004 )

Theo Abbas et al (2004) màu trắng đến màu vàng cam trên môi trường nuôi cấy là dấu hiệu để nhận biết các chủng A flavus sinh độc tố aflatoxin bởi vì

chúng gây ra sự sai khác trong các lần định lượng aflatoxin bằng phương pháp

hấp phụ Lin et al (1976), môi trường thạch chứa nước cốt dừa được phát triển để xác định độc tố aflatxin sinh ra bởi Aspergillus spp Trên môi trường này, nếu

aflatoxin được tạo ra, môi trường sẽ có huỳnh quanh màu xanh da trời hoặc xanh

lá cây dưới ánh sáng của tia cực tím Huỳnh quang xuất hiện do aflatoxin được sinh ra nhiều sau 32 giờ chuyển sang môi trường thạch nước cốt dừa Màu vàng cam trên môi trường thạch nước cốt dừa là một cơ sở để kết hợp với màu của

huỳnh quang để đánh giá khả năng sinh độc tố aflatoxin của Aspergillus spp Sự

biến đổi màu sắc trên môi trường thạch nước cốt dừa không thể sử dụng để định tính aflatoxin sinh ra mà không cần kết hợp với việc sử dụng ánh sáng của đèn cực tím Môi trường thạch nước cốt dừa rất dễ dàng để chuẩn bị và định tính được độc

tố aflatoxin nhanh chóng với trang thiết bị rất đơn giản

1.1.5 Nghiên cứu các phương pháp phòng trừ nấm A flavus sinh độc tố

aflatoxin

Viện quốc tế nghiên cứu cây trồng vùng nhiệt đới bán khô hạn (ICRISAT),

đã nghiên cứu về aflatoxin trên hạt lạc trong nhiều năm và đã có những công nghệ để ngăn chặn sự lây nhiễm aflatoxin trên lạc Chiến lược quản lý sự lây nhiễm aflatoxin ở lạc đã được các nhà khoa học của ICRISAT nghiên cứu đưa ra

bao gồm: (i) nghiên cứu tạo giống kháng với nấm A flavus; (ii) quản lý cây trồng

tổng hợp bao gồm cày sâu, để ải đất, sử dụng thuốc trừ nấm sinh học và hoá học, bón vôi, xử lý phân chuồng và tàn dư cây trồng, tưới bảo vệ; (iii) cải thiện phương pháp làm khô quả sau thu hoạch (phơi theo hàng, phơi theo mẻ); làm khô nhanh đến độ ẩm hạt dưới 10%; (iv) loại bỏ hạt bị nhiễm trước khi bảo quản

Luân canh trồng lạc với cây trồng khác là một biện pháp canh tác nhằm

giảm tỷ lệ lạc bị nhiễm nấm A flavus Trồng lạc liên tục trên cùng một vùng đất làm tích lũy số lượng mầm bệnh nấm A flavus trong đất cao, từ đó làm tăng sự xâm nhiễm và hàm lượng aflatoxin trên cây lạc (Ortiz et al., 2011)

1.1.5.2 Biện pháp sử dụng giống kháng

Nghiên cứu đánh giá các giống lạc mới kháng nấm A flavus thích hợp với

các vùng khác nhau đã được Waliyar và cộng sự thực hiện trên đồng ruộng ở bang Andhra Pradesh, Ấn Độ (năm 2003-2005) cho thấy 14 dòng/giống mới

nhiễm bào tử nấm A flavus trên hạt dưới 10% so với trên 50-90% của giống

nhiễm TMV2 Các giống đó là: ICGV 91278, 91279, 91283, 91284, 91315,

91317, 91324, 91328, 91341, 92302, 93305, 93328, 93379 và 94434 Các giống này cho năng suất cao hơn 12-45% so với TMV2 và hàm lượng aflatoxin từ 0-7

đã chọn các giống ICGV 91341, 93305, 94379 và 94434, còn ở huyện Anantapur chọn ICGV 91278, 91328, 94379 và 94434 đưa vào mở rộng sản xuất Các giống này có khả năng chịu hạn tốt, năng suất cao, tỷ lệ nhân cao và nhiễm aflatoxin

thấp (Waliyar et al., 2003)

Nghiên cứu chọn tạo giống lạc kháng nấm A flavus sinh độc tố aflatoxin là

một chiến lược quan trọng Chiến lược này bao gồm: chọn tạo giống có sức chống chịu tốt trong điều kiện môi trường bị hạn hán; giống có khả năng kháng

sự xâm nhiễm của nấm sinh độc tố aflatoxin; giống có khả năng ức chế sản

xuất aflatoxin sau khi bị nhiễm nấm (Mahuku et al., 2013)

Các đoạn gen quy định khả năng kháng nấm A flavus giảm thiểu aflatoxin đã

được lập bản đồ Việc chuyển các đoạn gen này vào cây trồng đang được tiến hành Các kỹ thuật mới có thể cho phép cây chuyển gien chống lại sự xâm nhiễm

bởi A flavus, ngăn ngừa sự phát triển của nấm trong cây trồng (Brown et al., 2013) Theo Bhatnagar-Mathur et al (2015), chọn tạo giống kháng bệnh A flavus

có điểm hạn chế đó là tính kháng không bền vững đối với nấm A flavus theo thời gian Hướng nghiên cứu tập trung vào việc xác định các đoạn gen kháng nấm A

flavus, ứng dụng những tiến bộ trong công nghệ sinh học như chuyển gen kháng

sang các giống thương mại đang được các nhà khoa học quan tâm

1.1.5.3 Biện pháp sinh học

Các xu hướng kiểm soát sinh học A flavus sinh độc tố aflatoxin trên thế giới hiện nay với 3 hướng chính là: (i) Hướng nghiên cứu sử dụng Bacillus (B

pumilus, B subtilis) (Munimbazi et al., 1998;…); (ii) Hướng nghiên cứu sử dụng

các chủng A flavus, A parasiticus không sinh độc tố, đã có những thành công, đặc biệt là ở Hoa Kỳ, như chủng A flavus AF36 (Cotty, 1994); (iii) Hướng nghiên cứu sử dụng nấm đối kháng Trichoderma đã có những thành công nhất định, đặc biệt ở Ấn Độ, như sử dụng 5 loài T harzianum, T viride, T auroviride,

T longibrachiatum, T hamatum kiểm soát sinh học A flavus sinh độc tố

aflatoxin (Reddy et al., 2010)

Một số loại dầu chiết xuất từ kinh giới, húng quế, bạc hà, đinh lăng,

quế…có thể ức chế sự phát triển của A flavus, ngăn chặn sự hình thành

aflatoxin Dùng lá cây xoan hoặc lá hoa cúc vàng để xông vì cả hai loại lá cây này đều có tinh dầu chứa axit formic Đó là những chất sát khuẩn, kháng khuẩn Nhưng cách làm này không kinh tế và ít nhiều ảnh hưởng đến mùi vị của sản phẩm (Anthony, 2006)

Cơ quan bảo vệ môi trường của Mỹ đã cho phép đưa vào danh mục chủng

A flavus AF36 như là tác nhân sinh học an toàn để phòng chống aflatoxin trên

ngô, lạc và bông Chế phẩm AF36 sản xuất từ chủng A flavus AF36 được công

nhận là thuốc bảo vệ thực vật tích cực để giảm aflatoxin trên ngô, lạc và bông

bằng việc cạnh tranh và thay thế chủng A flavus sinh aflatoxin vốn nhiễm tự nhiên trên đất trồng ngô, lạc và bông Chủng A flavus AF36 chứa các gen mã

hóa cho sự tạo aflatoxin bị đột biến và không thể hiện sự trao đổi vật chất di truyền với các chủng aflatoxin (United States (2002)

Sử dụng chủng nấm A flavus không sinh độc tố cũng đã được áp dụng để ngăn ngừa sự nhiễm nấm A flavus sinh độc tố aflatoxin trên lạc tại Argentina (Alaniz et al., 2013) Việc áp dụng chế phẩm nấm A flavus không sinh độc tố trong nhiều năm trên đồng ruộng để kiểm soát nguồn nấm bệnh A flavus sinh

độc tố aflatoxin có thể dẫn đến một sự thay đổi trong thành phần di truyền của các chủng nấm gây bệnh do áp lực chọn lọc Do vậy, cần được kiểm soát chặt

chẽ sự xuất hiện loài gây bệnh A flavus mới khi áp dụng biện pháp kiểm soát

sinh học này (Olarte et al., 2012)

1.1.6 Nghiên cứu sử dụng nấm Trichoderma phòng trừ nấm A flavus sinh

độc tố aflatoxin

1.1.6.1 Lược sử về hệ thống phân loại nấm Trichoderma

Trước những năm 1990, định danh Trichoderma được dựa vào đặc điểm

hình thái và đặc điểm sinh lý Năm 1969, Rifai đã mô tả đặc điểm hình thái của

tất cả các loài Trichoderma Sau đó, Gams et al (1998) đã bổ sung đặc điểm hình thái của các loài nấm Hypocrea và Gliocladium, là giai đoạn sinh sản hữu tính (teleomorphs) của nấm Trichoderma Phương pháp định danh chỉ dựa vào hình thái không hoàn toàn chính xác do một số loài Trichoderma có đặc điểm

hình thái rất giống nhau, chỉ khác nhau ở một vài đặc điểm rất khó xác định

Thời gian sau định danh và phân loại Trichoderma được bổ sung bằng

phương pháp sử dụng công nghệ sinh học phân tử (Samuels, 2006) Năm 2005,

Druzhinina et al đã bổ sung hệ thống phân loại và phổ hệ di truyền của

Trichoderma/Hypocrea bằng cách kết hợp cả đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh

học phân tử Hiện nay, vùng ITS – rDNA được xem là cơ sở đáng tin cậy để

phân nhóm và định danh Trichoderma

Ribosomal DNA (rDNA) là nhóm gene mã hoá rRNA của ribosome, có nhiều bản sao và không mã hoá cho bất kỳ protein nào Đây là vùng gen bảo tồn nên được xem là cơ sở chính xác để tìm ra sự tương đồng và các khác biệt của các sinh vật cùng loài hay khác loài, đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu quá trình tiến hoá, phát sinh loài, phân loại nấm và xác định tính đa dạng di

truyền của sinh vật cũng như các dòng nấm do việc phân loại nấm dựa vào đặc điểm hình thái, cơ chế trao đổi chất, cấu trúc vách tế bào và thành phần protein

có kết quả phân loại thường không chính xác và cần khoảng thời gian dài

(Guarro et al., 1999)

rDNA chứa vùng 18S, ITS1, 5.8S, ITS2, 28S và IGS (Intergenic Spacer,

là vùng kém bảo tồn nhất của rDNA) Vùng 5.8S – rDNA có kích thước rất nhỏ

và ít có sự biến đổi (Szymanski et al., 2001) Vùng ITS – rDNA là vùng có rất

nhiều biến đổi, mặc dù chúng thường được sử dụng trong nghiên cứu tiến hoá của sinh vật tuy nhiên phần lớn các so sánh trên vùng này thường để xác định

các biệt hoá trong cùng loài để lập phổ hệ di truyền (Guarro et al., 1999)

Christian et al (2002) đã giải mã trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng phần vùng tef1 (5th large intron, khuếch đại bằng cặp primer tef1fw và

tef1rev) trên 96 dòng nấm được phân lập từ những địa điểm khác nhau ở Đài Loan, Indonesia, Campuchia, Thái Lan, Burma, Malaysia và Singapore Kết

quả định danh được 37 dòng là T harzianum, 16 dòng T virens, 8 dòng là T

spirale, T asperellum có 4 dòng, T koningii có 3 dòng, T atroviride có 3

dòng, 1 dòng là T hamatum, 1 dòng là T ghanense và 2 dòng là Hypocrea

jecorina (anamorph là T reesei) Xác định sự tương quan, mối quan hệ di

truyền của chúng, trong 4 loài T harzianum, T virens, T asperellum và T

atroviride thì T harzianum có quan hệ di truyền gần nhất với T viren; T asperellum và T atroviride có mối quan hệ di truyền gần nhau nhất Kết quả

về mối quan hệ di truyền này tiếp tục được khẳng định trong nghiên cứu của

Christopher et al (2002)

1.1.6.2 Ứng dụng nấm đối kháng Trichoderma trong phòng trừ sinh học

Trên thế giới cũng đã có nhiều công trình nghiên cứu về nấm đối kháng

Trichoderma và việc ứng dụng chúng trong phòng trừ bệnh hại cây trồng

Nấm đối kháng Trichoderma xuất hiện phổ biến trong các hệ sinh thái đất Nhiều loài Trichoderma đóng vai trò là các tác nhân kiểm soát sinh học chống lại một loạt các bệnh cây trồng (Abo-Elyousr et al., 2014; Kim et al., 2013)

Trichoderma là một loại nấm sinh sản vô tính và phân hủy xác bã thực

vật (Gajera et al., 2013) Các chủng Trichoderma được sử dụng như là các tác

nhân kiểm soát sinh học theo cơ chế: cạnh tranh về chất dinh dưỡng và không gian với các loại mầm bệnh; sản xuất enzyme phân huỷ vách tế bào của tác nhân

gây bệnh; sản xuất kháng sinh tiêu diệt mầm bệnh, thúc đẩy phát triển của cây

trồng và tăng cường cơ chế phòng thủ chủ động của cây trồng (Saba et al., 2012) Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma spp đối với các loài gây bệnh bằng

cách kí sinh trực tiếp lên loài gây bệnh thông qua việc sản xuất enzyme lytic như chitinases và β-1,3-glucanases Những enzyme này thủy phân thành tế bào của tác nhân gây bệnh do đó hạn chế được sự tăng trưởng của loài gây bệnh

(Qualhato et al., 2013, Lopes et al., 2012)

Khả năng tiết ra các loại kháng sinh bay hơi của một số loài nấm

Trichoderma góp phần vào vai trò phòng trừ sinh học của những loài này trong

tự nhiên Hàng trăm hợp chất kháng sinh dễ bay hơi được tiết ra bởi các loài

nấm Trichoderma spp Trong báo cáo của Siddiquee et al (2012) có 282 hợp chất kháng sinh dễ bay hơi được tiết ra bởi T harzianum Perveen et al (2012)

đã tiến hành nghiên cứu khả năng đối kháng của T harzianum và T

viride phân lập từ đất trồng cây cọ đối với F oxysporum Các chất kháng sinh

dễ bay hơi được tiết ra bởi T viride có khả năng ức chế sự phát triển của F

oxysporum cao nhất (40,91%) Khalili et al (2012) đã phân lập được tổng số

45 chủng Trichoderma từ ruộng lúa ở Golestan và Mazandaran thuộc 3 loài T

harzianum, T virens và T atroviride Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của

các chủng Trichoderma này cho thấy có thể ức chế đáng kể sự phát triển của nấm

Bipolaris oryzae gây bệnh đốm nâu trên lúa bằng cách tạo ra các hợp chất kháng

sinh dễ bay hơi và không bay hơi Các chất kháng sinh dễ bay hơi được tiết ra bởi

T harzianum đã ức chế sự phát triển của các loài nấm bệnh Pythium aphanidermatum, Pythium vexans và Pythium ultimum từ 74,44 - 87,78% Loài

T viride tiết ra các chất kháng sinh dễ bay hơi ức chế sự phát triển của các loài

nấm bệnh từ 38,46 - 81,11% Như vậy các loài Pythium đã được phân lập từ

vùng đất nhiễm bệnh vùng rễ cây cà chua đã được kiểm soát bởi các loài

Trichoderma, các hợp chất kháng sinh dễ bay hơi đã làm giảm sự phát triển của Pythium (Patil et al., 2012) Trong báo cáo của Dubey et al (2014) đã chỉ ra các

hợp chất kháng sinh dễ bay hơi được sản xuất bởi T harzianum làm giảm sự phát triển của Colletotrichum capsici gây ra bệnh rụng lá trên húng quế và hạt tiêu Theo Gveroska et al (2012), khả năng phòng trừ nấm Alternaria alternata gây bệnh đốm nâu trên thuốc lá của T harzianum bằng chất kháng sinh dễ bay hơi

được đánh giá là có hiệu quả tốt và có thể được áp dụng trong kiểm soát sinh học của nấm bệnh này Kết quả của các thử nghiệm hợp chất kháng sinh bay hơi gây

ra bởi chủng T harzianum SQR-T037 cho thấy rằng các hợp chất kháng sinh dễ bay hơi có hiệu quả cao để ngăn chặn sự phát triển của F oxysporum lên đến 9 ngày Hiệu quả phòng trừ nấm F oxysporum đạt từ 18 đến 40% Ngoài ra, với sự hiện diện của các hợp chất kháng sinh dễ bay hơi được sản xuất bởi chủng T

harzianum SQR-T037 nấm F oxysporum không thể tạo ra sắc tố (Raza et al.,

2013) Rekha et al (2012) đã khảo sát 44 chủng Trichoderma (1 đến 44) đối với nấm bệnh S rolfsii bằng phương pháp nuôi kép trên đĩa petri, kết quả

tuyển chọn được 10 chủng 8, 13, 15, 16, 19, 23,

Tri-27, Tri- 29, Tri- 41 và Tri- 44 Thử nghiệm khả năng sinh các hợp chất kháng sinh dễ bay hơi của 10 chủng nấm này, kết quả chủng nấm Tri-13 là tốt nhất ứng

với khả năng ức chế sự phát triển của nấm S rolfsii cao nhất 69,33%

Khai thác tính chất đa dạng của các chất chuyển hóa thứ sinh do các

loài Trichoderma khác nhau tạo ra đang được nghiên cứu và ứng dụng rất nhiều trong ngành nông nghiệp và các ngành liên quan Keswani et al (2014) đã tổng hợp được danh sách các chất chuyển hóa thứ sinh do các loài Trichoderma

khác nhau và các ứng dụng của chúng vào sản xuất nông nghiệp Các chất

chuyển hóa thứ cấp do nấm Trichoderma sinh ra như: Emodin, Gliotoxin,

Harzianolide, Koninginins, Trichokonins, Viridin… Việc tạo ra các chất chuyển hóa thứ cấp sẽ có thời hạn sử dụng lâu hơn, hiệu quả cao hơn đối với các loài gây bệnh trong đất

Nicolás et al (2014) đã đưa ra một hướng nghiên cứu mới về nấm đối kháng Trichoderma Nhiều loài thuộc chi Trichoderma có khả năng tiêu diệt các loài gây bệnh cây trồng Một số gen kháng bệnh từ các Trichoderma spp đã

được xác định và chuyển vào cho các loại cây trồng để cải thiện sức khả năng tự kháng bệnh của cây trồng Hướng nghiên cứu này dự kiến sẽ đưa ra một kỷ nguyên mới trong công nghệ sinh học thực vật, nơi có thể chuyển một số gen từ những loại nấm đối kháng này sang cây trồng để đạt được khả năng chống chịu bệnh cao, dung nạp thuốc diệt cỏ và giảm phytotoxins

Các loài Trichoderma ức chế sự phát triển của nấm gây bệnh trên cây có dầu như lạc, vừng, hướng dương…bao gồm nấm A flavus, Alternaria alternata,

Curvularia lunata, Fusarium moniliforme, Fusarium oxysporum, Rhizopus nigricans, Penicillium notatum và Penicillium chrysogenum (Jat et al 2013)

Theo Keswani et al (2013) hiện nay, nấm đối kháng Trichoderma chiếm gần 70% thị trường các sản phẩm phòng trừ sinh học Trichoderma được sử dụng

rộng rãi do nó có thể kiểm soát nhiều loài nấm bệnh trong đất và trên hạt giống

và nó như là một loại phân bón sinh học có hiệu quả Mặt khác, Trichoderma

cũng được khai thác để sản xuất thương mại của các enzyme như chitinase, cellulase, hemicellulase, protease

Trong vài năm qua, sản phẩm thương mại từ nấm đối

kháng Trichoderma như thuốc trừ bệnh sinh học, phân bón vi sinh và cải tạo

đất…đã được sử dụng phổ biến Những dạng chế phẩm này bảo vệ cây trồng chống lại các sinh vật gây bệnh, tăng năng suất và rất thân thiện với môi trường

(Mukherjee et al , 2012)

1.1.6.3 Ứng dụng nấm đối kháng Trichoderma asperellum trong phòng trừ sinh học

Loài nấm T asperellum được xác định là loài mới vào năm 1999 với đặc

điểm là trên bề mặt bào tử có những nốt sần khó thấy, phát triển ở nhiệt độ tối thích là 30oC và tồn tại bằng cách sinh ra bào tử hậu (chlamydospores) Tuy

nhiên, trước đó loài T asperellum thường được xác định là T viride hoặc là một loài Trichoderma khác rất phổ biến ở nhiều quốc gia, trong đó có Ấn Độ Theo Sriram et al (2013), khi xác định trình tự vùng gen ITS và tef1 của 30 chủng nấm đã được xác định là T viride dựa trên các đặc điểm hình thái, kết quả cho thấy các nguồn nấm này đều thuộc về loài T asperellum

Theo kết quả nghiên cứu của Lin et al (2014), dựa vào trình tự vùng gen ITS, chủng nấm Trichoderma sp T31 được xác định là T asperellum Loài nấm

T asperellum sinh trưởng và sinh bào tử thuận lợi nhất trên môi trường PDA

C và cho sự sản xuất bào

C Mức pH thích hợp nhất cho nấm là 6 Chủng

nấm T asperellum T31 có khả năng phòng trừ các loại nấm bệnh như:

Exserohilum turcicum, S sclerotiorum, Pythium và Fusarium với hiệu lực từ

44,49% đến 77,91%

Nhiệt độ đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển và khả năng đối

chủng T asperellum T46 và T109 có khả năng phát triển và đối kháng với nấm

Rhizoctonia ở phạm vi nhiệt độ rộng từ 4 - 30°C Trong đó, hiệu quả phòng trừ

nấm Rhizoctonia sp của nấm T asperelleum đạt cao nhất ở 20-30 °C (Vargas et

al., 2012)

Bốn chủng của loài nấm T asperellum đã được đánh giá khả năng đối kháng với nấm Pythium gây bệnh thối rễ Trong điều kiện nhà lưới, hiệu quả

phòng trừ đạt hơn 60%, điều kiện trên đồng ruộng cho thấy hiệu quả phòng trừ

trên 50% (Mbarga et al., 2012)

Chủng nấm T asperellum T34 đã được chứng minh có khả năng phòng trừ nấm Phytophthora capsici gây bệnh thối rễ tiêu đến 71% T asperellum T34

được xem là một tác nhân phòng trừ sinh học hữu ích thay thế cho các loại thuốc

bảo vệ thực vật trừ nấm P capsici hại cây tiêu (Segarra et al., 2013)

Nấm T asperellum T8a có thể kiểm soát nấm Colletotrichum

gloeosporioides ATCC MYA 456 gây bệnh thán thư xoài tại Mexico trong điều

kiện nhà lưới và đồng ruộng (Sergio et al., 2013)

Tác giả El_Komy (2015) đã chứng minh sự tương quan giữa khả năng đối

kháng của 30 nguồn nấm T asperellum và sản xuất enzyme chitinase trong phòng trừ nấm bệnh Fusarium gây bệnh héo trên cà chua

Những kết quả nghiên cứu về sự sản xuất enzyme chitinase của nấm T

asperellum UTP-16 để sử dụng nó như một tác nhân kiểm soát sinh học nấm bệnh Fusarium đã được nghiên cứu bởi Kumar et al., 2012 Các điều kiện để tăng năng

suất sản xuất chitinase của T asperellum UTP-16 trong quá trình lên men trạng

thái rắn gồm nhiệt độ, pH, NaCl, thời gian nuôi cấy, nguồn nitơ và carbon

1.1.6.4 Sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh từ nấm đối kháng Trichoderma

Phần lớn các loài Trichoderma đều cảm quang, dễ nảy mầm ở điều kiện tự

nhiên hay môi trường nhân tạo trong điều kiện tối sáng xen lẫn, hay bào tử có thể

xuất hiện trong điều kiện sáng Đặt đĩa nấm Trichoderma nuôi cấy trên môi

trường thạch trong khoảng 20-30 giây dưới ánh sáng 85 Lux làm tăng hiệu quả

nảy mầm của bào tử Trichoderma không hình thành bào tử ở bước sóng dưới

254 nm hoặc trên 1.100 nm và hình thành bào tử nhiều nhất ở bước sóng 380 nm đến 440 nm Các bào tử cảm quang hạn chế phát triển dưới ảnh hưởng của các

hóa chất Các hỗn hợp như azaguanine, 5-fluorouracil, actiomycin D, cycloheximide, phenethyl alcohol và ethidium bromide ngăn cản sự hình thành bào

tử (Betina et al 1998)

Shahrim et al (2008) nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của Trichoderma sp KUPM0001 với 5 mức nhiệt độ thí nghiệm (25,

hưởng của độ ẩm ban đầu (60, 65, 70, 75 và 80%) và nồng độ giống 10, 20 và

80%, nồng độ giống 10% là tốt nhất để thu được sinh khối cao nhất từ

Trichoderma sp KUPM0001

Begoude et al (2007), đánh giá sự phát triển của bốn chủng T asperellum

0.980, 0.960, 0.930, 0.910 và 0.880) được kết hợp với ba giá trị của pH (4.5, 6.5,

và 8.5) và nhiệt độ nuôi dưỡng (20, 25 và 30 oC) Sự phát triển, tốc độ tăng trưởng sợi nấm đã được tối ưu tại aw giữa 0,995 và 0,980 Ngoài ra, tất cả bốn chủng có thể phát triển ở tất cả các nhiệt độ và các giá trị pH (4,5-8,5) thử nghiệm, tốc độ tăng trưởng cao nhất được quan sát thấy ở 30oC và độ pH 4,5-6,5 Như vậy, ẩm độ là một yếu tố môi trường quan trọng Ẩm độ thấp có thể

ngăn ngừa sự phát triển các chủng T asperellum theo một số điều kiện

Singh (2007), sử dụng 10 loại phụ phẩm nông nghiệp: thân chuối, đất hữu

cơ đã hoai mục, lõi ngô, bột ngô, vỏ trấu, mùn cưa, hạt lúa miến, bã trà, bột mì,

lúa mì xay vỡ để đánh giá hiệu quả sản xuất sinh khối nấm T harzianum Mỗi túi

bóng được cho vào 250g mỗi loại và được ngâm qua đêm (trừ gốc của cây chuối

và lõi ngô) để có độ ẩm khoảng chừng 80% rồi đem hấp khử trùng 2 lần liên tiếp trong ngày ở 121o, 15psi, 30 phút/lần, sau khi làm nguội được cấy vào mỗi túi 5ml dịch nấm (108 – 1010 bt/ml) rồi đem nuôi ở nhiệt độ phòng (25 – 30oC) trong

15, 30 ngày Kết quả sau 30 ngày nhân nuôi cho thấy lượng bào tử nấm cao nhất lần lượt ở 3 loại phụ phẩm tương ứng là bã trà (8 x 108 bt/g), lõi ngô (6,4 x 107bt/g), vỏ trấu (5,4 x 106 bt/g) và thấp nhất là mùn cưa (4,4 x 106 bt/g)

1.1.6.5 Ứng dụng nấm đối kháng Trichoderma trong phòng trừ nấm A flavus sinh độc tố aflatoxin

Mặc dù đã có rất nhiều nghiên cứu và thực nghiệm cố gắng sử dụng

Trichoderma spp để kiểm soát sinh học nhưng các nhà nghiên cứu ít để ý đến tác

dụng của nấm Trichoderma spp đối với các loài Aspergillus

Calistru et al (1997) đã công bố kết quả nghiên cứu: hai chủng của loài

T harzianum và T viride có khả năng ức chế sự tăng trưởng của A flavus Quan

sát dưới kinh hiển vi điện tử quét về sự tương tác của A flavus và Trichoderma tuy không chứng minh được sự xâm nhập sợi nấm của Trichoderma vào

Aspergillus, nhưng đã có sự thay đổi về hình thái sợi nấm của Aspergillus Trong

nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng phần nước lọc thu từ môi trường nuôi

T viride và T harzianum đã ức chế được sự phát triển của nấm A flavus Cơ chế

đối kháng của Trichoderma đối với nấm A flavus trên lạc liên quan đến sản xuất

của các chất kháng sinh dễ bay hơi hoặc sản xuất enzyme ngoại bào cản trở sự

phát triển của nấm A flavus

Nghiên cứu của Srilakshmi et al (2001), phân tích 386 mẫu đất thu tại

Andhra Pradesh, Karnataka và Tumkur của Ấn độ, phân lập được 212 mẫu nấm

đối kháng Trichoderma Bằng phương pháp nuôi kép trên đĩa petri đã xác định được 145 nguồn nấm Trichoderma có khả năng đối kháng với nấm mốc A flavus AF11-4 Có 39 nguồn nấm Trichoderma trong nhóm này quan sát rõ ràng được

vùng đối kháng Đánh giá khả năng sinh các hợp chất kháng sinh dễ bay hơi của

39 nguồn nấm này, đã tuyển chọn được 21 nguồn nấm, ứng với tỷ lệ ức chế sự

phát triển của nấm mốc A flavus từ 25 – 83% so với đối chứng Chủng

T.longibrachiatum T 102 có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất kháng sinh bay

hơi cao nhất, ức chế nấm A flavus AF11-4 mạnh nhất Kiểm tra dưới kính hiển

vi cho thấy, chủng nấm T16 (T viride), T109 (T harzianum) và T188 (T viride) tạo hệ sợi nấm cuộn lại với sợi nấm A flavus AF11-4

Theo Thakur et al (2003) có 6 chủng Trichoderma và 3 chủng

Pseudomonas có tính đối kháng cao với A flavus AF11-4 đã được áp dụng trên

đồng ruộng để xác định khả năng phòng trừ sinh học nấm A flavus Các chủng

đối kháng được áp dụng ở giai đoạn xử lý hạt giống và bón vào đất tại các ô thí

nghiệm có lây nhiễm nấm A flavus Các chủng nấm đối kháng đã làm giảm sự lây nhiễm nấm A flavus lên hạt ở các thí nghiệm Hai chủng T viride (Tv17 và Tv23), 1 chủng T harzianum (Th23) và 1 chủng Pseudomonas (Pf2) có khả năng bảo vệ hạt khỏi sự lây nhiễm bởi A flavus tốt hơn các chủng đối kháng còn lại

Sự giảm tỷ lệ nhiễm nấm A flavus trên hạt lạc là do sự suy giảm quần thể nấm A

flavus ở vùng rễ lạc

Anjaiah et al (2006) đã sử dụng nấm đối kháng Trichoderma spp được

phân lập từ vùng rễ lạc và được sử dụng thành công để phòng trừ sự lây nhiễm

trên hạt lạc bởi nấm A flavus Thí nghiệm trong nhà kính và trên đồng ruộng đã cho thấy sử dụng các chủng nấm đối kháng Trichoderma trên lạc dã cho kết quả khả quan trong việc giảm hơn 50% số lượng quần thể nấm A flavus trong vùng

rễ lạc và giảm sự lây nhiễm nấm A flavus trên hạt lạc

Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm của Luisa et al (2008) cho thấy, điều kiện môi trường nhân nuôi có ảnh hưởng đến hiệu lực nấm Trichoderma

harzianum Nếu nhân nuôi 15 ngày trên môi trường Malt Extract Agar (MEA) có

khả năng kiểm soát làm giảm sinh khối và sản xuất afatoxin B1 tương ứng là

31,7% và 51,87%; trong khi đó, nấm T harzianum được nuôi trên môi trường là

mầm ngô - vỏ trấu thì hiệu lực giảm đi nhiều Tuy nhiên khi sử dụng trên quy mô

nhỏ thì sự phát triển của A favus bị ức chế (90%) Những kết quả này chứng minh tiềm năng sử dụng nấm T harzianum như một tác nhân sinh học quan trọng

để kiểm soát nấm Aspergillus sinh độc tố và giảm độc tố trong bảo quản

Emma et al (2008) đã sử dụng hai chủng nấm đối kháng Trichoderma (T

harzianum và T viride) có khả năng kiểm soát sinh học đối với các loài nấm sinh

độc tố aflatoxin trên hạt lạc Nhiên cứu tập trung vào cơ chế tác động của các

chủng Trichoderma gồm 2 chủng Th1 và Th2 của loài T harzianum và 2 chủng Tv1, Tv2 của loài T viride Nghiên cứu đã tìm thấy hiệu quả ngăn chặn sự phát triển của nấm A flavus trên lạc và làm giảm đáng kể hàm lượng aflatoxin B1 và

aflatoxin B2 trong hạt lạc bị nhiễm bệnh Mức độ ức chế sự phát triển của

Aspergillus tương quan thuận với hoạt động của các enzyme ngoại bào của Trichoderma Trichoderma có nhiều loại enzyme ngoại bào như amylolytic,

chitinolytic, pectinolytic, proteolytic, lipolytic và cellulolytic để kháng lại các loài nấm cạnh tranh khác trong môi trường nuôi cấy Các hoạt động của enzyme ngoại bào càng đa dạng thì hiệu quả của các chất đối kháng trong việc ngăn chặn

sự phát triển của nấm mốc A flavus và sự sản xuất aflatoxin trên lạc nhân càng

cao Kết quả nghiên cứu cho thấy Trichoderma-enzymolomic có thể khai thác như một yếu tố kháng hiệu quả phòng trừ nấm mốc hại lạc và quá trình sản sinh aflatoxin sau đó ở trên nhân lạc

Nghiên cứu của Nyasha et al (2015) đã cho thấy chủng nấm T harzianum

đã ức chế 73,3% sự tăng trưởng của sợi nấm A flavus bằng phương pháp nuôi

kép Quan sát sự tương tác dưới kính hiển vi điện tử quét (ESEM) cho thấy hình

ảnh sợi nấm Trichoderma cuộn lại xung quanh sợi nấm A flavus Trên đồng

ruộng hiệu quả của xử lý hạt giống lạc bằng chủng nấm T harzianum này đã

giảm 56,9% hàm lượng aflatoxin B1 so với hạt lạc đối chứng Kết quả nghiên

cứu cho thấy rằng chủng nấm T harzianum có tiềm năng rất lớn để sử dụng như

là một tác nhân kiểm soát sinh học đối với aflatoxin nhiễm trên lạc trước thu hoạch trong điều kiện hạn hán

1.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

1.2.1 Tình hình sản xuất lạc ở Việt Nam và tỉnh Nghệ An

1.2.1.1 Tình hình sản xuất lạc ở Việt Nam

Sản xuất lạc ở nước ta được phân bố ở hầu hết các vùng sinh thái nông nghiệp với diện tích trồng lạc chiếm khoảng 28% tổng diện tích cây công nghiệp hàng năm, tập trung ở các vùng chủ yếu như vùng Duyên hải Nam Trung Bộ, vùng Đồng bằng sông Hồng, vùng Trung du và Miền núi phía Bắc, vùng Bắc Trung Bộ Các vùng khác có diện tích trồng lạc thấp hơn (bảng 1.2)

Bảng 1.2 Diện tích, năng suất và sản lượng lạc của Việt Nam (năm 4 - 2014)

(1.000 ha)

Năng suất (tạ/ha)

có những bước chuyển biến tích cực về năng suất từ 17,8 tạ/ha (năm 2004) tăng

lên 21,7 tạ/ha (năm 2014), đỉnh điểm trong năm 2013, năng suất đạt cao nhất 22,7 tạ/ha Sản lượng lạc tăng trong giai đoạn từ 2004 – 2008 từ 469,0 nghìn tấn (năm 2002) lên 530,2 nghìn tấn (năm 2008) Năm 2009 – 2014, sản lượng lạc có

xu hướng giảm nhẹ, từ 510,9 nghìn tấn xuống còn 453 nghìn tấn

1.2.1.2 Tình hình sản xuất lạc ở Nghệ An

Nghệ An là một tỉnh thuộc vùng Bắc Trung Bộ Có tọa độ địa lý từ 18033'10’’ đến 19024’43’’ vĩ độ Bắc, kinh độ 1030 52'53’’ đến 1050 48' kinh độ Đông, với diện tích đất tự nhiên 1.673.068 ha (bằng 1/20 diện tích lãnh thổ Việt Nam) Nghệ An là vùng đất cổ truyền trồng lạc, cây lạc đã có từ lâu đời nhưng sản xuất lạc thì chỉ phát triển mạnh trong những năm gần đây, với diện tích trồng lạc lớn nhất cả nước.Theo số liệu của Tổng cục thống kê năm 2016 (bảng 1.3), sản xuất lạc tại Nghệ An trong 10 năm trở lại đây, từ năm 2004 – 2014 đang có

xu hướng giảm dần về diện tích và sản lượng Về diện tích giảm từ 24,1 nghìn ha (2004) xuống 18,0 nghìn ha (2014) Về sản lượng lạc hàng năm cũng bị giảm dần

do diện tích trồng lạc giảm: từ 48,7 nghìn tấn (2004) xuống còn 36,5 nghìn tấn (2014) Năng suất lạc hàng năm biến động không lớn, trung bình trong 10 năm qua đạt 20,7 tạ/ha

Bảng 1.3 Diện tích, năng suất và sản lượng lạc của Nghệ An (năm 4 - 2014)

1.2.2 Nghiên cứu bệnh mốc vàng do nấm Aspergillus flavus Link hại lạc

2.2.2.1 Triệu chứng bệnh mốc vàng và đặc điểm của nguyên nhân gây bệnh

Bệnh mốc vàng do nấm Aspergillus flavus Link gây ra, là bệnh gây hại

quan trọng Nấm bệnh gây hại chủ yếu trên hạt và tiết ra độc tố aflatoxin có khả năng gây ung thư và nhiều bệnh nguy hiểm khác cho người và động vật Các nước nhập khẩu lạc đang đưa ra những yêu cầu ngày càng nghiêm ngặt hơn để kiểm soát hàm lượng aflatoxin (Ngô Thế Dân, 2000)

Quan sát triệu chứng bệnh các tác giả thấy rằng bệnh mốc vàng xuất hiện đầu tiên là những đốm trên lá mầm ở cây lạc con sau khi nảy mầm Những đốm

này được bao phủ bởi đám nấm A flavus Nấm bệnh lan truyền đến thân mầm và

trụ dưới của lá mầm gây nên những đốm chết hoại Những cây bị bệnh trở nên cằn cỗi, gân lá của những lá chét bị chết hoại, thường phát triển hệ rễ thứ cấp (Ngô Bích Hảo, 2007)

Bệnh mốc vàng của quả và hạt lạc có thể xuất hiện đầu tiên ở trên hoặc trong quả lạc trước khi thu hoạch đặc biệt ở giai đoạn quả phát triển mà cây lạc lại gặp hạn Những đám bào tử nấm màu xanh vàng phát triển trên quả và hạt lạc Hạt bị bệnh thường có màu vàng hoặc màu nâu, trọng lượng hạt giảm hơn so với những hạt chín bình thường cấp (Ngô Bích Hảo, 2007)

Cơ quan sinh sản có hình hoa cúc Bọng tròn có kích thước từ 25 – 45 µm, giá conidi (conidiophores) (cuống sinh bào tử) mọc thẳng từ sợi xù xì có kích thước từ 400 – 1000 µm; rộng 5 – 15 µm Bào tử trần (conidi) hình tròn hoặc hình ovan, có đường kính từ 2 – 4 µm Thể bình có hai lớp, kích thước từ 10 – 15

µm và 3 – 5 µm, đôi khi chỉ có 1 lớp (Đậu Ngọc Hào, 2003)

Nấm A flavus phân bố khắp nơi, chúng tồn tại ở đất, trên các nông sản thực

phẩm, đặc biệt là trên lạc và các sản phẩm chế biến từ lạc Ngoài ra chúng còn được thấy nhiều trên sợi bông, nhất là trên hạt bông và khô hạt bông, thức ăn gia

súc, dăm bông, dồi thịt và nhiều thức ăn khác… Nấm A flavus xâm nhập vào

nông sản, thực phẩm qua các vết thương do côn trùng gây ra Trên cây lạc tươi,

nấm A flavus khó xâm nhập và gây hại Nấm bệnh A flavus xâm nhập vào giai

đoạn quả lạc đã già, nhất là sau khi thu hoạch (Đặng Hồng Miên, 1980)

Các kết quả nghiên cứu phạm vi ký chủ cho thấy nấm A flavus có phạm vi

ký chủ rộng; chúng có thể gây hại trên nhiều loại quả, hạt khác nhau, như: lạc, ngô, bông, dừa và một số cây lấy hạt khác Nấm bệnh tồn tại trong đất, trên tàn

dư cây trồng, đặc biệt là trên củ, quả, hạt (Ngô Bích Hảo, 2007)

1.2.2.2 Đặc điểm phát sinh, phát triển của bệnh mốc vàng hại lạc do nấm A flavus

Kết quả điều tra của các Viện nghiên cứu trong nước phối hợp với các

chuyên gia ICRISAT trong những năm gần đây cho thấy nấm A flavus tồn tại

trong đất trồng lạc ở nước ta rất phổ biến và mật độ khá cao Theo thông báo của Mehan (1994) trong 135 mẫu đất trồng lạc thu từ các tỉnh Hà Tĩnh, Nghệ An,

Thanh Hóa và Bắc Giang đều thấy sự hiện diện của nấm A flavus Theo Nguyễn

Thị Ly (1996) công bố kết quả phân tích 196 mẫu đất trồng lạc thu thập từ các

tỉnh nêu trên cho thấy nấm A flavus tồn tại ở 100% mẫu đất Số mầm bệnh trong

các mẫu đất của Bắc Giang là thấp nhất (10 – 1625 mầm bệnh/gam đất), sau đó đến Hà Tĩnh (312 – 6437 mầm bệnh/gam đất), Thanh Hóa (375-7812 mầm bệnh/gam đất) và cao hơn cả là Nghệ An (437-8250 mầm bệnh/gam đất) Trên đất luân canh lúa – lạc mật độ nguồn bệnh thấp (0-347 mầm bệnh/gam đất) Trên đất chuyên màu với các công thức luân canh lạc – ngô, lạc – ngô – khoai lang

hoặc lạc – vừng – ngô số lượng mầm bệnh A flavus cao hơn đáng kể: 1238 mầm

bệnh/gam đất ở Diễn Châu, Nghệ An, 1516 mầm bệnh/gam đất ở Nam Đàn, Nghệ An và 3361 mầm bệnh/gam đất ở Hương Sơn, Hà Tĩnh Trong công thức luân canh lạc – lúa – khoai lang số lượng mầm bệnh ở mức trung bình so với các công thức trên

Nấm A flavus xâm nhiễm vào hạt lạc từ khi cây lạc còn ở trên đồng ruộng

Kết quả nghiên cứu ở miền Bắc Việt Nam cho thấy, ngay sau khi thu hoạch đã có tới 66% số mẫu thu thập bị nhiễm bệnh với tỉ lệ hạt bị nhiễm bệnh từ 1–30% Đa

số mẫu mới thu hoạch bị nhiễm có tỉ lệ hạt bệnh trong khoảng 1-5% Lạc sau thu hoạch 2 tháng đến 1 năm có tới 82% số mẫu bị nhiễm với tỉ lệ hạt bị nhiễm biến động từ 1-61% (Nguyễn Thị Ly, 1996)

Điều kiện gieo trồng có ảnh hưởng đáng kể đến tỉ lệ hạt bị nhiễm bệnh trên đồng ruộng Lạc trồng trên đất đồi gò chuyên màu không có tưới vị nhiễm nặng nhất (10-12% số hạt bị bệnh), sau đó đến lạc trồng trên đất bãi ven sông không tưới (6,7-8,5%) và ít nhiễm nhất là lạc trồng đất luân canh có tưới (2,5-3,0%) Những chân ruộng cao không chủ động được nước tưới có nguy cơ nhiễm nấm mốc nhiều hơn các chân ruộng khác

Thời điểm thu hoạch cũng ảnh hưởng lớn đến tỷ lệ bệnh Lạc thu muộn có

tỷ lệ hạt bị nhiễm nấm A flavus trên đồng ruộng nhiều hơn khoảng 2 lần so với

lạc thu sớm Ở miền Bắc, hạt lạc thu hoạch vụ xuân bị nhiễm bệnh nặng hơn vụ

thu Vụ thu đông hạt lạc bị nhiễm A flavus với tỷ lệ thấp nhất ở thời điểm thu

hoạch (Nguyễn Xuân Hồng, 1999)

Theo Nguyễn Xuân Hồng (1999), sản xuất lạc ở nước ta đã có bước nhảy vọt nhờ các thành tựu nghiên cứu khoa học giai đoạn 1995-2000 và 2001- 2005

Nhưng các giống hiện đang trồng phổ biến ở sản xuất bị mẫn cảm với nấm A

flavus Năm 1998, tại Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, 82 giống lạc đang

được trồng ở các tỉnh miền Bắc nước ta cũng đã được đánh giá về khả năng

chống chịu đối với sự xâm nhiễm của nấm A flavus vào hạt trong điều kiện nhân

tạo Kết quả nghiên cứu cho thấy hầu hết các mẫu giống đều bị nhiễm bệnh nhưng

có 5 mẫu giống lạc địa phương kháng cao và hầu như không bị nhiễm Trong số các giống lạc mới được công nhận đang phát triển trong sản xuất thì giống LVT và 4329

có tỷ lệ nhiễm cao nhất Giống LO2 bị nhiễm ở mức trung bình

Các giống lạc có khả năng chống chịu khác nhau đối với sự xâm nhiễm

của nấm A flavus Tại Viện Bảo vệ thực vật đã tiến hành thử khả năng hạt lạc chống chịu sự xâm nhiễm của nấm A flavus trên 41 giống và dòng lai Tất cả

các dòng, giống trong thí nghiệm đều bị nhiễm bệnh nhưng tỷ lệ bệnh giao động từ 8-100% Trong số các giống đang trồng phổ biến trong sản xuất, đáng chó ý là giống Sen Nghệ An tỏ ra kháng bệnh khá (tỷ lệ nhiễm 12,7%), trong khi đó giống lạc Cúc Nghệ An bị nhiễm nặng với 100% hạt đều bị bệnh (Nguyễn Thị Ly, 1996)

Kết quả thực hiện Dự án ― Kiểm soát aflatoxin trên ngô và lạc có sử dụng các biện pháp thích ứng‖ cho thấy các mẫu lạc tại các tỉnh Hà Tây, Thanh Hóa, Nghệ An, Đồng Nai có tỷ lệ hạt nhiễm mốc bên trong hạt lạc từ 45% đến 50%

Kết quả cũng đã cho thấy rằng mức độ nhiễm A flavus trên lạc ở các tỉnh nghiên

cứu dao động từ 15% tới 35%, trong đó mẫu lạc ở Thanh Hóa và Nghệ An có tần suất nhiễm nấm cao hơn lạc ở Hà Tây với mức độ là 32% và 34%, theo thứ tự

còn ở Đồng Nai là 35% A parasiticus được phát hiện rất thấp trong các mẫu nghiên cứu, từ 0 đến 7% Như vậy có thể nói rằng A flavus sinh aflatoxin là loài

nấm chủ yếu nhiễm trong lạc ở Việt Nam Nhìn chung tỷ lệ nhiễm mốc trên lạc ở Đồng Nai không cao hơn so với các tỉnh miền Trung và miền Bắc nhưng tỷ lệ

nhiễm chủng A flavus là cao hơn hẳn so với các tỉnh Thanh Hoá, Nghệ An, Hà

Tây Điều này cho thấy khí hậu nhiệt đới với độ ẩm tương đối không khí thấp là

thích hợp cho sự phát triển của A flavus Dự án cũng đã nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc A.flavus trên đất trồng ngô tại một số tỉnh ở Việt Nam cho thấy mẫu có A flavus trên tổng số mẫu đất phân tích ở các tỉnh khảo sát có sự chênh

lệch nhau không đáng kể, dao động từ 25/50 mẫu đến 30/50 mẫu, nhưng mật độ

A flavus trong 1g đất trồng ngô của các tỉnh Thanh Hoá, Nghệ An, và Đồng Nai

lại có sự khác biệt rõ rệt với mật độ A flavus theo thứ tự là 2,0 x 104 CFU/g đến 2,5 x 104 CFU/g

Kết quả nghiên cứu của Ngô Bích Hảo (1996) về bệnh hại hạt cho biết

trong số các loại hạt giống như ngô, lạc, đậu đỗ thì tỷ lệ hạt giống lạc bị nhiễm A

flavus cao nhất (30,12%) Kết quả giám định bệnh hại giống nhập nội sau nhập

khẩu có tới 100% số mẫu giống hạt kiểm tra nhiễm Aspergillus spp Khi mức độ nhiễm nấm Aspergillus spp dưới 5% thì tỷ lệ nảy mầm của hạt đạt trên 91,2%

còn khi nhiễm trên 20% thì tỷ lệ nảy mầm của hạt giảm chỉ còn 69,8%, tỷ lệ mầm yếu và cây con yếu tăng lên

Theo Nguyễn Văn Thắng (2010), trong số 300 mẫu giống lạc đã thu thập có

tới 238 mẫu bị nhiễm nấm A flavus chiếm tỷ lệ 79,33%, nhưng chỉ có 28 mẫu

chứa aflatoxin chiếm tỷ lệ 9,3%

1.2.3 Tình trạng ô nhiễm aflatoxin do nấm A flavus tiết ra trên lạc

Ở Việt Nam, kể từ năm 1990, nhiều đợt bùng phát các loại bệnh do độc tố aflatoxin gây nên trên động vật, gia cầm và bò sữa từ cả hai miền Bắc và Nam Việt Nam, nguyên nhân được tìm thấy trong lạc dùng làm thức ăn gia súc Tại miền Bắc Việt Nam, 65% trong số 200 mẫu lạc là thức ăn chăn nuôi lấy từ Nghệ

An, Thanh Hoá, Hà Bắc đã được tìm thấy nhiễm aflatoxin Lạc mẫu bánh từ tỉnh Nghệ An có mức cao hơn nhiều so với những người aflatoxin từ các tỉnh khác (Đậu Ngọc Hào, 2003)

Khả năng sản sinh độc tố aflatoxin của nấm A flavus gây bệnh mốc vàng

trên lạc ở Việt Nam đã được khẳng định qua các nghiên cứu trong thời gian qua Bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng, Bộ môn vi sinh vật thuộc Viện Công nghệ

sau thu hoạch đã kiểm tra 50 mẫu nấm A flavus phân lập từ hạt lạc và đất Kết

quả cho thấy có 41 mẫu nấm (tương đương 82%) chứa độc tố aflatoxin B1 (Lê

Hữu Hiếu và cs., 1994) Điều này chứng tỏ rằng đa số các dòng nấm A flavus

xâm nhập và gây bệnh trên lạc đều có khả năng sinh độc tố aflatoxin

Kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp và được khẳng định bởi nghiên cứu của Mehan và cộng sự của Viện cây có dầu (1996) Hàm lượng aflatoxin B1

trong các mẫu hạt lạc bị nhiễm A flavus ở miền Bắc nằm trong khoảng 12,5 –

150 µg/kg và ở miền Nam là 5,0 – 125 µg/kg (bảng 1.4) Hàm lượng độc tố cao nhất trong các mẫu hạt lạc giống thu thập từ các chợ và từ kho chế biến

Bảng 1.4 Kết quả điều tra tình hình nhiễm aflatoxin trên lạc tại Việt Nam

Nguồn gốc mẫu thu

thập

Số lượng mẫu kiểm tra

Số lượng mẫu chứa aflatoxin

% số mẫu chứa aflatoxin

Hàm lượng aflatoxin B1 trong các mẫu nhiễm µg/kg Miền Bắc

Theo dõi mối tương quan tỷ lệ hạt bị nhiễm nấm A flavus với mức độ

nhiễm độc tố aflatoxin, Nguyễn Thị Ly (1996) nhận xét rằng hầu hết các mẫu hạt nhiễm bệnh với tỷ lệ thấp dưới 8% thì chưa bị nhiễm độc tố aflatoxin mặc dù có

sự hiện diện của nấm bệnh Các mẫu có tỉ lệ hạt nhiễm nấm càng cao thì lượng độc tố aflatoxin phân tích được càng lớn (bảng 1.5)

Bảng 1.5 Mối tương quan tỷ lệ hạt lạc bị nhiễm nấm A flavus với mức độ nhiễm

Tỷ lệ mẫu chứa aflatoxin

aflatoxin B1(µg/kg)

Lạc ngay sau khi thu

Các nhà nghiên cứu tại Viện Công nghệ sau thu hoạch, Hà Nội, đã phát hiện 70-100% mẫu lạc khác nhau thu thập từ miền Bắc Việt Nam bị nhiễm

nấm A flavus, mức độ nhiễm đáng kể của aflatoxin đã được phát hiện trong 50

mẫu lạc, dầu lạc tinh chế và khô dầu lạc từ các thị trường ở Hà Bắc và Hà Nội (Ngô Thế Dân, 2000)

Hơn 98% các chủng thu được từ đất và hạt giống lạc là loài A flavus Trong

số 50 mẫu phân lập tinh khiết được thử nghiệm, có 35 mẫu (chiếm 70%) sinh ra aflatoxin B1 (Ngô Thế Dân, 2000)

1.2.4 Nghiên cứu các phương pháp phòng trừ nấm A flavus sinh độc tố

aflatoxin

1.2.4.1 Biện pháp canh tác

Tại Việt Nam, theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Hiên (2008) bón vôi và các phương pháp bón vôi cho lạc thực hiện trong thí nghiệm đều làm giảm số mầm

bệnh nấm A.flavus có trong đất, làm giảm tỷ lệ nhiễm nấm A.flavus và hàm lượng

độc tố aflatoxin trên hạt giai đoạn sau thu hoạch so với không bón vôi ở mức có ý nghĩa Trong đó, bón vôi theo phương pháp chia 2 lần (50% bón lót, 50% bón thúc khi lạc bắt đầu đâm tia) và phương pháp bón thúc 1 lần khi lạc bắt đầu đâm

tia hạn chế nấm A.flavus và hàm lượng aflatoxin hiệu quả nhất

Trên cơ sở những kết quả điều tra về tình hình bệnh mốc vàng hại lạc ở Việt Nam, Mehan và cs., (1996) khuyến cáo áp dụng các biện pháp sau đây để phòng ngừa và hạn chế sản sinh độc tố aflatoxin vào hạt lạc và các sản phẩm chế biến từ lạc: Điều chỉnh thời vụ gieo trồng hợp lý để thu hoạch lạc vào cuối mùa mưa khi thời tiết nắng ráo để tách quả và phơi kịp thời Tránh gây chấn thương cho cây và quả lạc trong quá trình chăm sóc, làm cỏ và thu hoạch Tránh những tổn thương cho cây do các loại sâu bệnh trong đất gây ra Bón thạch cao hoặc vôi cho lạc ở giai đoạn đâm tia Trong thời gian phát triển quả hoặc quả chưa vào chắc nếu gặp hạn cần tưới nước Giữ đất đủ ấm ít nhất một tháng trước khi thu

hoạch Sử dụng các chế phẩm sinh học phòng trừ nấm A flavus trong đất như chế phẩm từ nấm A flavus không sinh độc tố hoặc từ nấm đối kháng Trichoderma.Sử dụng các loại giống lạc kháng bệnh hoạch đã được chuyển gen kháng nấm A

flavus Khi lạc chín cần thu hoạch ngay Những cây bị bệnh thu hoạch riêng

Tránh thu hoạch lẫn lộn cây bị bệnh hoặc bị hạn nặng với các cây khỏe và không

bị hạn gây tác hại Sau khi nhổ xong nếu cần phơi cả cây ngoài ruộng thì cần phơi gốc và quả lên phía trên Phơi quả càng nhanh càng tốt cho tới khi đạt ẩm