Chương 4. NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH IN VITRO

Chương NHÂN GIỐNG VƠ TÍNH IN VITRO Sinh sản vơ tính hữu tính 4.1.1 Nhân giống theo cấu trúc tự nhiên thực vật Dạng hành (bull) xắp xếp chồng lên nhau, bên ngồi có lớp bảo vệ, nhu mô dự trữ dày xốp Dạng hành thường thấy họ hoa tulip, họ hành… Dạng giò (corm) : nhu mơ dự trữ lớn, dày có cấu tạo giống hành, nằm gốc thân, dạng giò thường thấy hoa gladiolus Dạng củ (rhizome): dày có cấu tạo thân rễ nằm chìm mặt đất, phía vòm tăng trưởng chứa chồi thân dạng thường thấy họ hoa iris Thân bò (stolom): nhánh hay thân mỏng manh, thường dạng thân bò, chốp hoàn chỉnh thấy dâu tây Dạng hành nhỏ (bulbil): giống hành, tròn nằm nách thấy hoa lily 4.1.2 Nhân giống theo phương thức nông học Giâm cành Chiết cành Ghép hay tháp cành 4.2 Mục đích nhân giống invitro 4.2.1 Ưu điểm vi nhân giống 1- Đưa sản phẩm nhanh hơn: Từ ưu việt tạo quần thể có độ đồng cao với số lượng không hạn chế, phục vụ sản xuất thương mại, dù dị hợp mặt di truyền 2- Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: Trong hầu hết trường hợp, công nghệ vi nhân giống đáp ứng tốc độ nhân nhanh cao, từ vòng 1-2 năm tạo thành hàng triệu 3- Sản phẩm giống đồng nhất: Vi nhân giống cơng nghệ nhân dòng Nó tạo quần thể có độ cao dù xuất phát từ mẹ có kiểu gen dị hợp hay đồng hợp 4- Tiết kiệm khơng gian: Vì hệ thống sản xuất hồn tồn phòng thí nghiệm, khơng phụ thuộc vào thời tiết vật liệu khởi đầu có kích thước nhỏ Mật độ tạo đơn vị diện tích lớn nhiều so với sản xuất đồng ruộng nhà kính theo phương pháp truyền thống 5- Nâng cao chất lượng giống: Nuôi cấy mô phương pháp hữu hiệu để loại trừ virus, nấm khuẩn khỏi giống nhiễm bệnh Cây giống bệnh tạo cấy mô thường tăng suất 15 - 30% so với giống gốc 6- Khả tiếp thị sản phẩm tốt nhanh hơn: Các dạng sản phẩm khác tạo từ hệ thống vi nhân giống in vitro (trong ống nghiệm) bầu đất Các giống bán dạng cây, củ bi thân củ 7- Lợi vận chuyển: Các kích thước nhỏ vận chuyển xa dễ dàng thuận lợi, đồng thời tạo điều kiện vô trùng xác nhận bệnh Do vậy, bảo đảm an toàn, đáp ứng qui định vệ sinh thực vật quốc tế 8- Sản xuất quanh năm: Q trình sản xuất tiến hành vào thời gian nào, không phụ thuộc mùa vụ 4.2.2 Hạn chế vi nhân giống 1- Hạn chế chủng loại sản phẩm: Trong điều kiện kỹ thuật nay, tất trồng nhân giống thương phẩm vi nhân giống Nhiều trồng có giá trị kinh tế quý chưa thể nhân nhanh để đáp ứng nhu cầu thương mại bảo quản nguồn gen Nhiều vấn đề lý thuyết liên quan đến nuôi cấy tái sinh tế bào thực vật in vitro chưa giải đáp 1- Chi phí sản xuất cao: Vi nhân giống đòi hỏi nhiều lao động kỹ thuật thành thạo Do đó, giá thành sản phẩm cao so với phương pháp truyền thống chiết, ghép nhân giống hạt 2- Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình: Cây ni cấy mơ sai khác với mẹ ban đầu tượng biến dị tế bào soma Kết khơng giữ đặc tính q mẹ Tỷ lệ biến dị thường thấp giai đoạn đầu nhân giống, sau có chiều hướng tăng lên nuôi cấy kéo dài tăng hàm lượng chất kích thích sinh trưởng Hiện tượng biến dị cần lưu ý khắc phục nhằm đảm bảo sản xuất hàng triệu giống đồng mặt di truyền 4.3 Các phương pháp nhân giống invitro 4.3.1.Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh hay đỉnh phân sinh 4.3.1.1 Đỉnh sinh trưởng Hình 4.1 Đỉnh sinh trưởng Mơ phân sinh đỉnh chứa tế bào đỉnh sinh trưởng bao bọc lớp vỏ bề mặt có cấu tạo cutin hạn chế thấp q trình nước lớp cutin bao bọc chồi đỉnh Ở thực vật, hình thành quan bắt đầu mô phân sinh đỉnh, mô phân hóa từ giai đoạn phát triển đầu phôi giữ lại suốt đời sống Điều xảy mô phân sinh có phân hóa tế bào khởi sinh Tất tế bào lại xuất phát từ tế bào khởi sinh Mơ phân sinh tích tương đối ổn định, nên tế bào sinh từ tế bào khởi sinh sau vài lần phân chia rời khỏi mơ phân sinh Q trình sinh trưởng đỉnh sinh trưởng chia làm giai đoạn - Giai đoạn phôi sinh: điểm sinh trưởng xảy hình thành mầm quan phân chia thành mơ riêng biệt.Giai đoạn dài sinh trưởng nhanh chóng, mầm quan đạt kích thước tối đa có hình dạng định Kết thúc phân hóa tế bào, bắt đầu phân hóa gỗ Các thành tế bào khơng khả sinh trưởng Trước hết u lồi dần tạo thành gọi u Thể tích u lớn nhanh kéo theo phần lớn đỉnh sinh trưởng Dần dần u lồi chuyển thành mầm Mầm phát triển nhanh theo chiều dài Sự sinh trưởng tiên hành khơng đồng nên mầm cong dần lên phía đỉnh Sau tách xảy phân chia tế bào kết thể tích đỉnh sinh trưởng phục hồi nhanh chóng hình thành lại bắt đầu Ở nách có chồi nách Chồi nách thực chất khơng khác đỉnh sinh trưởng Do tượng ưu nên chồi nách không phát triển đánh thức bắt đầu sinh trưởng chúng có cấu tạo đầy đủ thân Mơ đỉnh sinh trưởng mơ virus Do vật liệu nuôi mô tế bào sử dụng tạo giống bệnh Do kích thước nhỏ nên kỹ thuật nuôi cấy mô đỉnh sinh trưởng thường tiến hành kính lúp hay bao gồm chồi đỉnh 4.3.1.2 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Limmasets Cornuet (1949) phát nhiễm bệnh virus, virus phân bố không đồng thường không thấy chúng vùng đỉnh sinh trưởng Phát sở để Morel Martin (1952) chứng minh giả thuyết cách tạo bệnh virus từ giống khoai tây qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Năm 1960, Morel thực bước ngoặt áp dụng thành công kỹ thuật nhân nhanh lồi địa lan Cymbidium thơng qua protocorm Sau đó, việc phát cytokinin môi trường nuôi cấy mô cải tiến (Murashige Skoog, 1962) tạo sức sống để ứng dụng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng nhân giống thương mại thực vật Ngày nay, kỹ thuật với số cải tiến trở thành phương pháp loại trừ bệnh virus sử dụng rộng rãi nhiều lồi trồng khác 4.3.1.3 Mẫu mơ thực vật dùng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Kết nuôi cấy đỉnh sinh trưởng phụ thuộc vào vật liệu khởi đầu, nguồn gốc kích thước mẫu Để đạt hiệu cao, cần lấy mẫu nuôi cấy từ chồi sinh trưởng mạnh (Gupta CS, 1981) chồi ghép (Jones cs, 1985) Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng non dễ dàng trưởng thành, tỷ lệ rễ trường hợp đạt 83%, với trưởng thành đạt 63% (Vieitez cs, 1985) Điều kiện nuôi cấy, thời điểm lấy mẫu ảnh hưởng lớn đến kết tái sinh từ đỉnh sinh trưởng Một số lồi có ưu chồi đỉnh mạnh, ni cấy đỉnh sinh trưởng từ chồi đỉnh dễ dàng từ chồi nách, số loài khác lại thu kết ngược lại Kích thước mẫu ni cấy lớn, tỷ lệ tái sinh sống sót mẫu cao, nhiên mẫu nhỏ khả bệnh virus lại cao Do vậy, kích thước mẫu nuôi cấy cần phải xác định thực nghiệm lồi Mẫu ni cấy nhỏ có chóp sinh trưởng - mầm lý tưởng để tạo giống bệnh mơ phân sinh đỉnh nằm chóp đỉnh chồi, trung tâm hoạt động sinh trưởng, phân hoá phát triển thực vật Ngay mô phân sinh mầm Đơi kích thước mẫu lớn đảm bảo bệnh virus (Vine Jones, 1969) song số trường hợp khác lại đòi hỏi mẫu nhỏ (Hunter cs, 1984) Phương thức sử dụng phận nhỏ đỉnh chồi hay đỉnh sinh trưởng làm mẫu vật nuôi cấy Nó bao gồm mơ phân sinh đỉnh mầm non Khái niệm mô phân sinh đỉnh (ngọn) mẫu vật tách từ đỉnh sinh trưởng có kích thước vòng 0,1-0,15 mm tính từ chóp sinh trưởng Trong thực tế mẫu vật tách với kích thước người ta tiến hành ni cấy với mục đích làm virus cho trồng Thường gặp khó khăn lớn việc nuôi thành công mô phân sinh đỉnh riêng rẽ có kích thước nhỏ Do đó, khn khổ nhân giống in vitro người ta thường nuôi cấy đỉnh chồi đỉnh sinh trưởng Phổ biến đối tượng phong lan, dứa, mía, chuối… đỉnh sinh trưởng tách với kích thước từ 510 mm, nghĩa tồn mơ phân sinh đỉnh phần mô xung quanh Tương quan độ lớn chồi nuôi cấy, tỷ lệ sống mức độ ổn định mặt di truyền chồi biểu sau: Nếu độ lớn tăng tỷ lệ sống tính ổn định tăng, độ lớn giảm tỷ lệ sống tính ổn định giảm Nhưng xét hiệu kinh tế ni cấy (thể tích bình ni, lượng dung dịch mơi trường dinh dưỡng): Nếu độ lớn tăng hiệu kinh tế giảm, độ lớn giảm hiệu kinh tế tăng Do đó, phải kết hợp hài hòa yếu tố để tìm phương thức lấy mẫu tối ưu Một đỉnh sinh trưởng ni cấy điều kiện thích hợp tạo hay nhiều chồi chồi phát triển thành hoàn chỉnh Xét nguồn gốc có ba khả năng: - Cây phát triển từ chồi đỉnh (chồi ngọn) - Cây phát triển từ chồi nách phá ngủ - Cây phát triển từ chồi phát sinh, ví dụ: ni cấy đoạn trụ mầm mãng cầu (Annona squamosa) cho xuất nhiều mầm mô ni cấy, số mầm sau phát triển thành chồi trở thành in vitro hoàn chỉnh Tuy nhiên, thơng thường khó phân biệt chồi phá ngủ chồi phát sinh Các phương thức phát triển hồn chỉnh từ đỉnh sinh trưởng ni cấy sau: - Phát triển trực tiếp Chủ yếu đối tượng hai mầm (dicotyledon) khoai tây, thuốc lá, cam chanh, hoa cúc… Ví dụ: Khoai tây (Solanum tuberosum): Đỉnh sinh trưởng → Chồi nách → Cây - Phát triển thông qua giai đoạn protocorm Chủ yếu gặp đối tượng mầm (monocotyledon) phong lan, dứa, huệ… Cùng lúc đỉnh sinh trưởng tạo hàng loạt protocorm (proembryo) protocorm tiếp tục phân chia thành protocorm phát triển thành hoàn chỉnh Bằng phương thức thời gian ngắn người ta thu hàng triệu cá thể Đỉnh sinh trưởng → Protocorm → Cây Các đối tượng hoa lan mang lại hiệu kinh tế đặc biệt cao Sau kết chi Cymbidium Morel (1966) người ta thu kết tốt 22 chi khác họ Sở dĩ nhân giống vơ tính hoa lan đạt thành cơng lớn ứng dụng rộng rãi hoa lan có phương thức sinh sản qua protocorm Lĩnh vực ứng dụng bắt đầu có kết ăn lâm nghiệp, có quý cà phê, táo, lê, thơng, bồ đề… Tổng số có 30 chi khác nuôi cấy thành cơng Vì rằng, trồng rừng ăn trồng lâu năm phí ban đầu nhân giống in vitro chấp nhận 4.3.1.4.Ghép chồi đỉnh (shoot apex grafting) hay vi ghép Phương pháp phổ biến để tạo Citrus bệnh chọn lọc có nguồn gốc từ tế bào nucellar Tuy nhiên, có giai đoạn chưa thành thục kéo dài trước bước vào giai đoạn sinh sản Việc xử lý nhiệt để loại trừ bệnh exocortis xyloporosis thường không hiệu Hiện nay, vi ghép chồi kỹ thuật tạo bệnh sử dụng thành công nhiều phòng thí nghiệm Murashige cs (1972) nguời tạo Citrus bệnh kỹ thuật vi ghép chồi đỉnh in vitro Sau đó, Navarro (1975) sử dụng kỹ thuật nhiều Citrus khác thu kết khả quan Kỹ thuật vi ghép chồi bao gồm bước sau: 11 Chuẩn bị gốc ghép mắt ghép ống nghiệm: gốc ghép thường dùng vi ghép Troyer citrange vài gốc ghép khác có khả tương hợp cao với mắt ghép Tách chồi đỉnh gồm đỉnh sinh trưởng mầm từ mẹ (hình), chồi đỉnh dạng ngủ dạng sinh trưởng sử dụng 22 Ghép cấy ghép vào ống nghiệm: Hạt dùng làm gốc ghép gieo môi trường lỏng, ghép chồi đỉnh lên đoạn thân non gốc ghép Sau - tuần, chuyển ghép đất Hiện phương pháp vi ghép chồi đỉnh sử dụng rộng rãi để tạo dòng Citrus bệnh phục vụ cho nhân giống thương mại *.Vi ghép kết hợp với xử lý nhiệt hoá chất Murashige cộng (1972) dùng vi ghép đỉnh sinh trưởng để tạo vật liệu bệnh Citrus, tái sinh tác nhân gây bệnh micoplasma exocortis Năm 1975, Navarro cộng hồn thiện quy trình vi ghép chồi đỉnh có múi in vitro Bằng kỹ thuật này, khoảng 90 loại có múi khác làm bệnh (Navarro cs, 1988) Kỹ thuật vi ghép loại trừ hàng loạt bệnh khỏi nguồn gen có múi, ví dụ: - Virus gây bệnh tristeza, psorosis - Stubborn spiroplasma - Exocortis viroid - Tác nhân gây bệnh chảy gơm, cristacortis, impietratura Quy trình vi ghép: 1- Gốc ghép chuẩn bị từ hạt nuôi cấy in vitro mơi trường MS có 1% agar Troyer citrance thường dùng làm gốc ghép, gốc ghép Etrog citron dùng để ghép tất loại chanh 2- Cây giống nhiễm bệnh dùng làm mắt ghép chuẩn bị sau: bỏ lá, giữ nhiệt độ 32oC từ 12-15 ngày Sau đó, tách đỉnh sinh trưởng kích thước 0,1- 0,2 mm từ chồi hình thành vi ghép theo kiểu chữ T lộn ngược gốc ghép 3- Nuôi sau vi ghép mơi trường MS có 100 mg/l myo-inositol, đường 4%, thiamin HCl 0,2 mg/l, pyridoxine HCl 1mg/l, nicotinic 1mg/l, đặc biệt sử dụng nồng độ đường sucrose, vitamin B cao với hàm lượng BA, IAA GA khác để kích thích bật chồi từ đỉnh sinh trưởng vi ghép Tỷ lệ vi ghép thành công 60-70% chuyển đất sống 90% Chương trình vi ghép tạo giống bệnh có múi triển khai hầu Về nguyên tắc, vi ghép nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, thông qua dinh dưỡng tự nhiên gốc ghép Đỉnh sinh trưởng dùng làm mắc ghép có kích thước khoảng từ 0,2-0,5 mm, tách từ búp non sinh trưởng mạnh mẹ trưởng thành, gốc ghép mầm giá nảy mầm từ hạt giống hoang dại, toàn ghép nuôi dưỡng điều kiện ống nghiệm vô trùng Phương thức thường dùng để tạo giống ăn bệnh virus nhằm cung cấp mắt ghép cành chiết đầu dòng làm nguyên liệu nhân giống cho sản xuất đại trà Phương thức cho phép thu hoàn toàn bệnh mang đặc điểm di truyền mẹ cho mắt ghép 4.3.2 Tái sinh hoàn chỉnh từ phận khác 4.3.2.1 Nuôi cấy chồi bất định Đỉnh chồi bất định phát triển trực tiếp mẫu vật gián tiếp từ mô callus, mà mơ callus hình thành bề mặt vết cắt mẫu vật Một số loại mẫu vật dùng sau: - Đoạn thân: thuốc lá, cam, chanh, cà chua, bắp cải… - Mảnh lá: thuốc lá, cà chua, bắp cải, cà phê, ca cao… - Cuống lá: thủy tiên… - Các phận hoa: súp lơ, lúa mỳ, thuốc lá… - Nhánh củ: họ hành, họ lay ơn, họ thủy tiên… - Đoạn mầm: măng tây Sự phát sinh chồi bất định trực tiếp bắt đầu tế bào nhu mô nằm biểu bì phía bề mặt thân; số tế bào trở thành mô phân sinh túi nhỏ gọi thể phân sinh phát triển Các thể phân sinh rõ ràng có nguồn gốc từ tế bào đơn Tuy nhiên, chiều hướng phản ứng thực vật tùy thuộc vào nồng độ phytohormone Nghiên cứu tạo chồi mô nuôi cấy linh sam Douglas cho thấy cytokinin (BAP µM) cần thiết cho phát sinh chồi bất định, có ba kiểu phản ứng khác có kết tùy thuộc vào nồng độ auxin cung cấp Nồng độ auxin thấp (NAA < µM) có chồi phát triển Khi nồng độ auxin cao (NAA > µM) mầm tạo callus nhiều chồi Khi cung cấp riêng auxin (NAA = µM) có callus tạo thành Sự phát triển chồi bất định gián tiếp qua giai đoạn hình thành callus sở từ chồi tách nuôi cấy Các chồi sau phát triển từ ngoại vi mơ callus khơng có quan hệ ban đầu với mơ có mạch dẫn mẫu vật 4.3.2.2 Nhân giống thông qua giai đoạn callus Trong nhân giống in vitro tái sinh hồn chỉnh trực tiếp từ mẫu vật ni cấy ban đầu khơng nhanh chóng thu mà đồng mặt di truyền Tuy nhiên, nhiều trường hợp mô nuôi cấy không tái sinh mà phát triển thành khối callus Tế bào callus cấy chuyển nhiều lần khơng ổn định mặt di truyền Để tránh tình trạng thiết phải sử dụng loại callus vừa phát sinh, tức callus sơ cấp để tái sinh hy vọng thu tái sinh đồng Thơng qua giai đoạn callus thu cá thể virus trường hợp Kehr Sehaffer (1976) thu tỏi Hình 4.2 Nhân giống thơng qua giai đoạn tạo mơ sẹo A Mô sẹo tỏi sau tuần nuôi cấy B Mô sẹo sau tuần nuôi cấy C Tạo chồi từ mô sẹo D Cây tái sinh từ mô sẹo E Củ tỏi thu từ nuôi cấy mô thông qua tạo mô sẹo 4.3.3 Nhân giống thơng qua phát sinh phơi vơ tính 4.3.3.1 Phơi vơ tính Năm 1958, Street Reinert hai tác giả mơ tả hình thành phơi vơ tính từ tế bào đơn cà rốt (Daucus carota) Đến năm 1977, Murashige cho phơi vơ tính trở thành biện pháp nhân giống in vitro Ở số lồi, phát sinh phơi vơ tính hình thành trực tiếp từ phơi bất định nằm phôi tâm Đến nay, công nghệ phôi vô tính coi cơng nghệ có triển vọng cho nơng nghiệp kỷ 21 Phơi vơ tính cá thể nhân giống có cực tính bắt nguồn từ tế bào soma Chúng giống phôi hữu tính hình thái, q trình phát triển sinh lý, sản phẩm thụ tinh giao tử đực giao tử cái, khơng có q trình tái tổ hợp di truyền phơi vơ tính có nội dung di truyền giống hệt với tế bào soma sinh chúng Ở trường hợp phơi hữu tính, kết hợp giao tử đực cho hợp tử (zygote) Hợp tử phân chia nhiều lần tạo nên phơi hữu tính có cấu trúc hai cực: rễ Khi hợp tử phát triển, miền sinh trưởng rễ miền sinh trưởng phát triển cuối tạo thành hoàn chỉnh, qua giai đoạn phôi học sau: - Trường hợp hai mầm: Dạng cầu → dạng thủy lơi → dạng có mầm - Trường hợp mầm: Dạng cầu → dạng scutellar → dạng diệp tiêu Ở nhiều cây, người ta nhận thấy tế bào phân chia vô tổ chức tạo nên callus ni cấy Có thể thay đổi hướng phát triển chúng để tạo phơi vơ tính với bước phát sinh hình thái giống với trường hợp phơi hữu tính Điểm khác phơi hữu tính phơi vơ tính phơi hữu tính luôn kèm với nội nhũ quan dự trữ lượng chất dinh dưỡng phục vụ cho q trình nảy mầm, phơi vơ tính hồn tồn khơng có nội nhũ Khả tạo phơi vơ tính ni cấy mơ thực vật, ngồi điều kiện vật lý, hóa học thuận lợi cho tạo phơi, phụ thuộc lớn vào lồi, vào giống, dòng lồi 4.3.4 Nhân giống nồi phản ứng sinh học Trước đây, nồi phản ứng sinh học hay gọi nồi lên men (fermentor) chủ yếu dùng cho công nghệ vi sinh Trên sở thiết bị đó, với số cải tiến, nhiều tác giả nhân giống thành cơng nhiều loại phơi vơ tính thể chồi, cụm chồi củ nhỏ Phơi vơ tính cà phê sản xuất thành công Brasil nồi phản ứng sinh học dung tích từ 2-4 lít Mỗi mẻ thu 4-5 triệu phơi vơ tính cà phê Ở Indonesia, cụm chồi dứa đưa vào sản xuất thành công với nồi lên men 10 lít Dịch lỏng ni cấy (mơi trường mới) bơm vào nồi hút (môi trường cũ) theo chu kỳ ngắn, nhờ mô tế bào thực vật có đủ oxy chất dinh dưỡng để phát triển mạnh Phương thức nuôi cấy gọi nuôi cấy thể ổn định hóa tính (chemostat culture) 4.3.5 Hệ thống hình thành chồi Sự hình thành chồi có tương quan với hàm lượng etylen CO Chồi phát sinh nhiều bình ni cấy tích lũy 5-8 m C 2H4 10% CO2 15 ngày ni cấy chất phóng thích khỏi bình ni cấy q trình biệt hóa bị ức chế.Sau 15 ngày chất ngồi khơng ảnh hưởng đến q trình biệt hóa Trong 10 ngày C 2H4 CO2 ảnh hưởng đến q trình biệt hóa phù hợp với giai đoạn tăng trưởng phân chia tế bào dẫn đến hình thành vòm đỉnh sinh trưởng Như tác động kích thích C 2H4 phát sinh hinh thái có tác động bổ sung trình phân bào Sự tác động tương hỗ C2H4 CO2 cho thấy qui luật tác động CO2: Trong 10 ngày đầu CO2 kích thích q trình sinh tổng hợp C2H4 Sau 10 ngày có tác động tương phản với C2H4 Sau CO2 tham gia vào trình trao đổi chất tỉ lệ tác động C 2H4/CO2 có hiệu có mặt O2 CO2 trì q trình trao đổi oxihóa mơ SF SNF ( SF: shoot forming: chồi mầm nuôi cấy mơi trường khơng có BA, phát sinh chồi sau ngày tiến hành phân chia tế bào khơng phân chia trong mơi trường có BA hình thành chồi khơng xảy ra: NSF: non shoot forming) Tóm lại, có phương thức tạo nhân giống in vitro: - Mẫu mô trực tiếp tạo chồi hoàn chỉnh (Sơ đồ 4.1) - Mẫu mô phát sinh callus callus tạo chồi (Sơ đồ 4.2) - Mẫu mô phát sinh callus, callus phát triển phôi (hoặc nuôi cấy dịch huyền phù tế bào phát sinh phôi) từ phôi thu hoàn chỉnh (Sơ đồ 4.3) Sơ đồ 4.1 Mẫu mơ trực tiếp tạo chồi hồn chỉnh (thơng qua phương thức tăng khả phát sinh chồi nách) 4.5.1 Ảnh hưởng mơi trường chất kích thích sinh trưởng đến nhân giống in vitro 4.5.1.1 Mẫu ni cấy Có thể chia làm hai nhóm: lựa chọn mẫu cấy xử lý mẫu cấy chọn mẫu: Các nhân tố chọn mẫu bao gồm kiểu gen, quan chọn, tuổi sinh lý, mùa vụ, giai đoạn sinh trưởng, độ khỏe mẫu nguồn mẫu + Kiểu gen: ảnh hưởng sâu sắc đến q trình ni cấy, số lượng chồi tạo được, khác tăng sinh chồi, khác khả phát sinh phôi Người ta ghi nhận kiểu di truyền ảnh hưởng đến số lượng đường kính mơ sẹo qua nuôi cấy hạt phấn cà chua, ghi nhận khác gennome qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng mô lõi + Chọn quan: Hầu hết loại quan mơ có khả sử dụng nuôi cấy in vitro Cho mẫu nuôi cấy khác lồi khác dùng chồi đỉnh để ni cấy, chồi mầm thích hợp làm mẫu nuôi cấy nảy mầm từ hạt Dùng mô tỏi để nuôi cấy tạo thể bulb Ni cấy thân mầm để tạo protoplast có khả phát sinh phôi Nuôi cấy lát cắt mỏng mơ thuốc tái sinh quan khác hoa chồi rễ phụ thuộc vào lớp mỏng tế bào phận ni cấy hocmon Có thể thu nhận cúc có kiểu hoa màu hoa khác với mẹ nuôi cấy phần mẫu hoa + Tuổi sinh lý: Tuổi thực mẫu nuôi cấy tuổi theo mùa năm mẫu ni cấy có ảnh hưởng quan trọng đến biệt hóa tế bào tuổi sinh lý Thành phần quan có cấu tạo thấp khơng thể nuôi cấy in vitro sử dụng thành phần khống mơi trường Rễ phát sinh non lunaria không phát sinh già Khả tái sinh cao trưởng thành so với non Ngược lại mẫu non cắt cành Hedora helix dễ mẫu so với mẫu trưởng thành nuôi cấy non phát sinh quan tốt so với nuôi cấy trưởng thành + Mẫu in vitro: Mẫu in vitro có khả tái sinh cao mẫu lấy từ mẹ đồng ruộng hay vườn ươm Nuôi cấy mẫu in vitro cho thấy nâng cao khả nhân giống cắt đốt Nuôi cấy túi phấn đạt tỉ lệ thành công cao nuôi cấy túi phấn đồng ruộng + Sức sống mẫu: Mẫu mẹ có ảnh hưởng quan trọng đến nuôi cấy in vitro Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để loại virus sản xuất bệnh Những bị nhiễm virus tạo bệnh nhờ ni cấy đỉnh sinh trưởng + Duy trì mẫu: Xử lý vận dụng quản lý mẫu nuôi cấy cho phép nhà vi nhân giống ln có nguồn ngun liệu để sử dụng nhân giống Nguyên liệu nuôi cấy cần phải bệnh Có nhiều nhân tố kiểm tra cải thiện điều kiện sinh lý vật lý mẫu mẹ dinh dưỡng, nhiệt độ, cường độ ánh sáng mà mẫu mẹ sinh trưởng xử lý vật lý hóa học trực tiếp mẫu mẹ + Dinh dưỡng: Sử dụng vật liệu nuôi cấy khỏe dinh dưỡng mẹ cho thấy quan trọng để có mẫu ni cấy khỏe Đoạn cắt cành cà chua mẹ chăm bón đạm cao khó rễ mẹ chăm sóc đạm thấp Khả tăng sinh chồi mẹ chăm bón đạm cao Mức bón đạm thấp cho thấy khả tăng sinh chồi đi, mức độ đạm có liên quan đến khả phát sinh chồi từ in vitro + Nhiệt độ: Có ảnh hưởng ni cấy mô thể bulb mẹ bảo quản nhiệt độ khác thời gian bảo quản khác + Ánh sáng: Khả nuôi cấy túi phấn cao mẹ sinh trưởng với cường độ ánh sáng cao Khả tạo protoplast cao lúa mạch mẹ sinh trưởng cường độ ánh sáng thấp Khi mẹ sinh trưởng cường độ ánh sáng thấp cho thấy cành cắt in vitro dễ dàng rễ mẹ sinh trưởng với cường độ ánh sáng cao Cường độ ánh sáng trung gian cho thấy số lượng chồi phát sinh nhiều khả tạo rễ tốt Khả tăng sinh chồi in vitro tốt nuôi cấy chồi mẹ bóng râm so với chồi ngồi trời Tạo rễ cành cắt in vitro thúc đẩy nuôi cấy mẫu mẹ tuần với ánh sáng cao ánh sáng đỏ sau ni cấy tuần với ánh sáng đỏ Sự tăng sinh chồi qua nuôi cấy mẫu sau mẹ xử lý ánh sáng đỏ Ánh sáng đỏ kích thích tăng khả tổng hợp Cytokinin làm giảm tổng hợp Auxin + Hóa học vật lý: Có tăng sinh chồi nuôi cấy mẫu cà chua in vitro cách phun chất ức chế sinh trưởng lên mẹ Khi phun Daminozide (B9)sẽ tăng khả phát sinh mô sẹo Tiền xử lý mẫu nuôi cấy in vitro có ảnh hưởng đến khả tăng sinh quan in vitro Khi ngâm mẫu hay phận khác dung dịch Cytokinin BA trước nuôi cấy, xử lý chồi tách rời với ABA hay NAA cho thấy có ý nghĩa tạo phôi nuôi cấy protoplast Sử dụng dung dịch xử lý phương pháp có hiệu nuôi cấy thân gỗ xử lý đoạn chồi tách rời thân gỗ cách ngâm vào dung dịch tương tự xử lý trì chất lượng thời gian bảo quản cắt cành Dung dịch thường sử dụng: 55-60 µm sucrose 600µm 8-hydroxyquiniline citrate có tác dụng chồi tách rời in vitro sử dụng thêm GA3 Cytokinin hay Auxin phát sinh quan 4.5.1.2 Ảnh hưởng môi trường Môi trường MS (Murashige Skoog, 1962) sử dụng phổ biến nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Nhưng lồi khác đòi hỏi mơi trường nuôi cấy khác Samartin (1989) sử dụng công thức muối đa lượng khác trà Camelia japonica thấy môi trường MS cho tốc độ sinh trưởng nhanh thu mẫu từ non Mơi trường MS chứng tỏ khơng thích hợp cho mẫu lấy từ già, môi trường muối loãng (Heller, 1953) lại cho kết Tính độc mơi trường MS quan sát số loài (Sommer, 1982; Vieitez, 1983) môi trường chứa hàm lượng muối đa lượng cao, gây độc cho tế bào in vitro, protoplast Phương pháp đơn giản giảm nồng độ muối khống xuống 1/3 1/2 (Grosser, 1994) Mơi trường MS có hàm lượng NH 4NO3, KNO3 giảm nửa, bổ sung thêm glutamine 1,550 mg/l, KCl 750 mg/l tốt cho nuôi cấy mô sẹo phôi hố giảm tích luỹ tinh bột số giống Citrus (Grosser Gmitter, 1990) Trong số muối đa lượng, muối nitơ có ý nghĩa định đến tái sinh chồi Welander (1985) cho biết nồng độ NH4NO3 KNO3 MS giảm 1/2, đỉnh sinh trưởng dâu tây phát triển hơn, rễ tái sinh mạnh Giảm muối khoáng số trường hợp có tác dụng tốt rễ số loài (Murashige, 1977; Hasegawa, 1980; Drew, 1987) trường hợp chồi hoa hồng rễ tốt nồng độ nitơ tổng số giảm (Hyndman cs., 1982) Nguồn carbon quan trọng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Nồng độ đường 1- % sử dụng phổ biến Nồng độ đường sucrose cao % tỏ độc số trường hợp (Rublue Kartha, 1985) Chong Pua (1985) sử dụng sucrose, glucose, fructose and sorbitol nồng độ từ 1-7 % nuôi cấy đỉnh sinh trưởng giống táo Ottawa thấy nồng độ sucrose 3% tối ưu cho sinh trưởng, 100% chồi tạo rễ chất lượng khoẻ mạnh Trạng thái vật lý mơi trường có ý nghĩa quan trọng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Đa số trường hợp người ta sử dụng môi trường agar nuôi cấy đỉnh sinh trưởng số lồi, mơi trường lỏng tỏ tốt (Mellor Stace Smith, 1969) Nồng độ chất kích thích sinh trưởng thấp mơi trường làm giảm biến dị tế bào soma (Grosser Gmitter, 1990) Tế bào mô sẹo phôi hố có múi ni cấy bảo quản lâu dài mơi trường khơng có chất kích thích sinh trưởng + Nhiệt độ: Nhiệt độ thích hợp nuôi cấy mô 20-27 0C Nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc đến sinh trưởng phát triển in vitro qua tiến trình sinh lý hơ hấp hay hình thành tế bào quan Trong ni cấy mơ Nhiệt độ thích hợp từ 32-35 0C Tuy nhiên 24 0C Cytokinin kích thích hình thành chồi bị ức chế Sự hình thành quan in vitro phụ thuộc vào nhiệt độ Xử lý mẹ trước đưa vào nuôi cấy in vitro phương pháp xử lý đển sản xuất bệnh Xử lý nhiệt trước nuôi cấy in vitro cho thấy đỉnh sinh trưởng khử virus + Ánh sáng Cường độ ánh sáng: cường độ ánh sáng nhân tố quan trọng quang hợp, ảnh hưởng đến khả nuôi cấy in vitro có xanh Tuy nhiên ảnh hưởng đến quang hợp ảnh hưởng đến sinh lý Ảnh hưởng quan trọng đến chồi, lại tối cần thiết cho tạo rễ cường độ ánh sáng cao hay thấp ảnh hưởng đến tăng sinh chồi +Quang kì chất lượng ánh sáng Thời gian chiếu sáng ảnh hưởng sâu sắc đến đáp ứng sinh lý trồng Ở ngày ngắn, hoa ngày ngắn, điều xảy tương tự dài ngày (đêm ngắn), thời gian chiếu sáng 12-15 thích hợp cho loại thân gỗ Chất lượng ánh sáng ảnh hưởng trực tiếp đến in vitro ánh sáng cao ánh sáng đỏ hay ánh sáng đỏ có ảnh hưởng đến biến đổi sinh lí hoa, chế độ dinh dưỡng tượng khác tăng sinh chồi in vitro cách xử lý mẹ với ánh sáng đỏ ánh sáng đỏ cao ánh sáng đỏ ảnh hưởng đến khả rễ cành cắt in vitro Có lồi xử lý tuần với ánh sáng đỏ cho thấy hiệu cao ánh sáng trắng.ánh sáng xanh có khả kích thích ức chế Ngồi có ảnh hưởng bước sóng đến phản ứng in vitro có mối tương tác bước sóng ánh sáng mơi trường dinh dưỡng + Các chất khí: Thành phần chất khí bình ni cấy có ảnh hưởng đến sinh trưởng in vitro O2, CO2 etylen chất khảo sát nhiều CO2 bị giới hạn bình ni cấy sử dụng nắp bình có lỗ thơng khí, sử dụng bình có bổ sung CO làm giàu CO2 phòng dưỡng cho vi nhân giống giá thành hạ Giàu CO2 cường độ ánh sáng cao giúp cho trình quang hợp xảy nhanh nâng cao tốc độ vi nhân giống Không sử dụng đường sucrose làm giảm hoại mẫu nuôi cấy vi sinh vật gây O2 có giới hạn nuôi cấy mô Etylen xem chất làm giảm sinh trưởng nuôi cấy mô Auxin hưởng đến phóng thích etylen Nâng cao hàm lượng etylen làm giảm sinh trưởng mô sẹo + Hormon Người ta nhấn mạnh tầm quan trọng việc sử dụng auxin Cytokinin hệ thống vi nhân giống phối hợp 2,4 D NAA có ảnh hưởng đến hình thành mơ sẹo tái sinh GA3 sử dụng mơi trường ni cấy để kích thích vươn thân, đặc biệt trường hợp có hàm lượng Cytokinin cao dẫn đến hình thành cụm chồi có cấu trúc đặc 4.5.2 Tính bất định mặt di truyền Mặc dù kỹ thuật nhân giống vơ tính sử dụng nhằm mục đích tạo quần thể trồng đồng với số lượng lớn phương pháp tạo quần thể biến dị tế bào soma qua nuôi cấy mô sẹo nuôi cấy tế bào đơn Những biến dị nghiên cứu vận dụng vào cải thiện giống trồng biến dị có lợi báo cáo Tần số biến bị hồn tồn khác khơng lặp lại ni cấy mơ sẹo tế bào đơn có biến dị nhiều nuôi cấy chồi đỉnh Cây trồng biến dị tế bào soma qua nuôi cấy thường biến dị chất lượng, số lượng suất, biến dị không di truyền Nguyên nhân gây biến dị chưa làm sáng tỏ chủ yếu biến đổi vật chất di truyền đứt gãy, chuyển đoạn ADN hoặt đảo đoạn Những nguyên nhân gây biến dị tế bào soma là: + kiểu di truyền + thể bội : đa bội thể tần số biến dị cao nhị bội + số lần cấy truyền: số lần cấy truyền cao tần số biến dị lớn + loại mô 4.5.3 Mẫu đưa vào nuôi cấy - Sự hoại mẫu: Có hai tác nhân làm hư mẫu ni cấy in vitro: + Bị virus hay thể giống virus xâm chiếm, khơng hoại mẫu có ảnh hưởng sau Có xâm nhiễm nhiều vi sinh vật như: Agrobacterium, bacillus, erwinia pseudomonas vào nhu mô dẫn truyền hoại mẫu tế bào bắt đầu phân chia Để làm giảm tác nhân gây nhiễm sử dụng mẫu nuôi cấy nhu mô phân sinh đỉnh + Bị vi sinh vật hủy hoại, khử trùng mẫu trước cấy vào môi trường Những loại đưa vào nuôi cấy thường bị vi sinh vật hoại mẫu nên đưa vào trồng môi trường mát khô vài tuần trước lấy mẫu nuôi cấy giảm hoại mẫu Sử dụng thuốc kháng sinh Nhằm hạn chế hoại mẫu vi sinh vật amphotoricin B, nystelin, kanamicin, vancomicin penicillin khử vi khuẩn Gram (-) Gram(+) nấm mốc… sử dụng đơn chất hay phối hợp Nồng độ khử trùng 5-100 g/l phụ thuộc vào vật liệu nuôi cấy loại kháng sinh sử dụng Mô thực vật nhạy cảm với tác động kháng sinh có phản ứng khác lên kiểu di truyền nên cẩn thận sử dụng 4.5.4 Việc sản xuất chất gây độc từ mẫu cấy Hiện tượng hóa mẫu hóa nâu hay bị đen chết mẫu hay làm giảm tăng trưởng Nguyên nhân tượng mẫu ni cấy có chứa nhiều tannin hay hydroxyphenol có nhiều mơ già mơ sẹo Một số phương pháp làm giảm hóa nâu mẫu: - tách phần tử phenol khỏi môi trường - bổ sung chất khử redox (oxidation-redution) phenol vào môi trường - ngăn chặn hoạt động enzim phenolase - giảm lượng phenol có sẵn mẫu môi trường lỏng giống môi trường rắn - mẫu chuẩn bị có vết cắt nhỏ, để ngồi vài trước cấy, hay nơi cấy mơi trường khơng có ánh sáng Than hoạt tính đưa vào mơi trường để hấp thụ chất kìm hãm phenol, ngăn chặn trình hóa nâu hay đen, đặc biệt có hiệu loại phong lan, nồng độ thường 0,1-0,3% Tuy nhiên than hoạt tính làm chậm q trình phát triển mơ hấp thụ chất kích thích sinh trưởng chất khác Polyvinylpyrolidone (pvp), chất thuộc loại polyamide, hấp thụ phenol qua vòng hydrogen, ngăn chặn hóa nâu, hiệu phụ thuộc vào lồi trồng khác Giảm hóa nâu cách cho chất khử q trình oxi hóa vào mơi trường ngăn chặn oxi hóa phenol Chất khử thường dùng: vitamin C, axit citric, L-cystein hydroclorit, gluta thione, mecaptoethanol Phương pháp quan trọng phối hợp vitaminC axit citric Phương pháp đề nghị: + sử dụng mẫu cấy nhỏ từ mô sẹo + gây vết thương mẫu nhỏ khử trùng + ngâm mẫu vào dung dịch vitamin C axit citric vài trước cấy + Nuôi cấy mẫu môi trường lỏng, O thấp khơng có đèn 1-2 tuần chuyển mẫu từ mơi trường có nồng độ chất kích thích sinh trưởng thấp sang mơi trường có nồng độ cao 4.5.5 Hiện tượng thủy tinh thể Nhân giống vơ tính in vitro có hiệu nhân giống chuyển đồng ruộng có tỉ lệ sống cao Có tượng ni cấy mơ xuất in vitro thủy tinh thể Khi chuyển khỏi bình ni cấy, đễ dàng bị nước tỉ lệ sống thấp Đây dạng bệnh sinh lý Dạng thường thấy nuôi cấy mơi trường lỏng hay mơi trường thạch có hàm lượng thạch thấp, đặc biệt trao đổi khí thấp, q trình nước tập trung - Đặc điểm thủy tinh thể Nhận thấy có khác hình thành lớp sáp ni cấy mơ ngồi tự nhiên Lượng sáp chứa vườn ươm cao hẳn in vitro Tế bào có chứa nhiều phân tử có cực dễ dàng nhận phân tử nước gắn nó, gia tăng độ nước tốc độ hơ hấp tế bào nhân vơ tính đưa đến chết mô nuôi cấy - Ngăn chặn trình thủy tinh thể + giảm hút nước cách tăng nồng độ đường + giảm tăng hấp thụ nước cách tăng nồng độ đường ni cấy dùng chất có áp suất thẩm thấu cao, phương pháp làm thay đổi tổng hợp cấu trúc không gian diệp lục ức chế hình thành chồi + giảm gây vết thương mẫu qua chất khử trùng tiếp xúc với mơi trường cấy ABA ngăn chặn hóa thủy tinh thể số lồi trồng + giảm nồng độ đạm môi trường nuôi cấy +chuyển in vitro hóa ngồi vườn ươm không ảnh hưởng đến bị thủy tinh thể + giảm etylen bình ni cấy cách thơng khí tốt + tăng nồng độ ánh sáng giảm nhiệt độ phòng cấy 4.5.6 Khống chế điều kiện mơi trường Chứng minh ni cấy có diệp lục hay in vitro có khả quang hợp tự dưỡng Để nâng cao tối đa khả quang hợp in vitro, cải thiện điều kiện vật lí mơi trường nuôi cấy nhiệt độ, cường độ thời gian chiếu sáng, trao đổi khí… Nhân giống in vitro điều kiện quang tự dưỡng có ưu phương pháp thông thường: + sinh trưởng phát triển cấy in vitro thúc đẩy cách tăng cường độ ánh sáng phòng ni cấy từ 30-35 µmol/m2/s đến 100 tăng nồng độ CO lên gấp 2-3 lần Quá trình rễ gia tăng Có thể dùng lượng nhỏ chất kích thích sinh trưởng hay chất dinh dưỡng mơi trường ni cấy Bình ni cấy đậy kín nối tiếp với hệ thống cung cấp khí, điều dẫn đến giảm độ ẩm tương đối khí etylen mơi trường , ảnh hưởng đến khả hình thành khí khổng bình thường sáp bảo vệ Dẫn đến hóa in vitro thuận lợi, tăng tỉ lệ sống tiết kiệm chi phí sản xuất + sử dụng môi trường nuôi cấy in vitro không đường làm giảm đáng kể chết nguyên nhân sinh học + ngăn chặn hay tránh trình phát sinh hình thái hay tượng sinh lý không thuận lợi sản xuất in vitro đồng + bình ni cấy in vitro sử dụng bình tích lớn, dễ dàng kiểm sốt mơi trường ni cấy, thực tự động hóa 4.5.7.Những trở ngại thương mại hóa Có nhiều lồi phải dùng phương pháp thơng thường, có loại dùng ni cấy mơ tốt có lồi khơng có hiệu kinh tế + Giảm chi phí sản xuất:chi phí lao động chiếm 60-80 % nên hạn chế kỹ thuật nuôi cấy mô nhân giống trồng Đặc biệt có hệ số nhân giống thấp + Ở phòng thí nghiệm thương mại thí nghiệm cấy truyền thời gian dài vấn đề Có 1-2 năm trưởng thành + Khi nhân giống in vitro có số thay đổi kiểu di truyền 4.5.8 Nhân giống in vitro việc sử dụng giống ưu lai Ở ngành trồng trọt, giống ưu lai ứng dụng số đối tượng như: ngô, cà chua, lúa, cải đầu, bắp cải, hành tây, măng tây, đặc biệt giống hoa… Sử dụng ưu lai làm tăng suất từ 20-40%, mà giống lai có đặc điểm đồng so với giống bố mẹ Tính đồng giống tiền đề quan trọng cho sản xuất theo phương thức công nghiệp Ở súp-lơ chẳng hạn, phương thức sản xuất cơng nghiệp đòi hỏi phải thu hoạch tồn diện tích giới vào thời điểm Điều thực sử dụng giống ưu lai F1 Nếu dùng giống chủng theo phương thức tự phối khơng đảm bảo, giống rau họ cải (Brassicaceae) thường xuất hiện tượng bất tự thụ Vì vậy, phương pháp nhân giống bảo quản giống ống nghiệm số giống rau giống hoa có ý nghĩa kinh tế cao Vấn đề đặt phải nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro tối ưu cho loài trồng cải tiến quy trình để giảm tới mức đối đa tốn nhân công lao động công đoạn nuôi cấy đưa ngồi đất 4.6.Qui trình nhân giống số trồng phổ biến 4.6.1.Cây khoai tây Solanum tuberosum L * Phục tráng giống khoai tây phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Phương pháp tiến hành: 4.6.1.1 Xử lý nhiệt: Trồng khoai tây chậu đất điều kiện nhiệt độ, ánh sáng bình thường Khi chồi nảy từ củ cao khoảng 15 cm cắt phần dài 6-8 cm, bỏ bớt cắm vào ly thủy tinh đựng đất mùn vô trùng Dùng ly thủy tinh khác đậy ly đất để tránh cho chồi đất bị nước vòng 10 ngày để chồi rễ (điều kiện nhiệt độ, ánh sáng không thay đổi) Sau 3-4 tuần chuyển sang điều kiện chiếu sáng 3000-4000 lux, thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày, nhiệt độ 36oC ban ngày 33oC ban đêm Sau tuần cắt bỏ chồi để chồi bên phát triển Sau tuần xử lý nhiệt, chồi bên thu để tách đỉnh sinh trưởng 4.6.1.2 Tách đỉnh sinh trưởng: Chồi cắt bỏ bớt đặt giấy thấm ẩm hộp petri kín để tránh bị nước Nếu giai đoạn tạo chồi, nuôi cẩn thận việc khử trùng chồi khơng cần thiết Nếu cần khử trùng mẫu dung dịch khử trùng có nồng độ thấp, khoảng thời gian ngắn Mẫu rửa dung dịch khử trùng nhiều lần nước cất vô trùng Thao tác tách đỉnh sinh trưởng thực tủ cấy vơ trùng, kính lúp có độ phóng đại x25 Dùng kim nhọn hay đầu dao mổnhọn gạt bỏ bao bên ngồi đến đỉnh sinh trưởng phác thể Cắt đỉnh sinh trưởng với độ dài khoảng 0,6 mm cấy lên mặt mơi trường MS đặc có bổ sung IAA 0,5 mg/l, GA 0,1 mg/l inositol 100 mg/l Đỉnh sinh trưởng nuôi 23 oC, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày Sau vài tuần, cao khoảng cm cấy sang mơi trường Khi có nhiều nhân lên cách cắt đốt, đốt mang Mỗi đốt cấy vào ống nghiệm 12 x 100 mmcó chứa 3,5 ml mơi trường Nếu khoai tây khó rễ bổ sung than hoạt tính vào mơi trường.Cây khoai tây tạo thành chẩn đốn bệnh thị Gomphrena globosa (virus X), Chenopodium amaranticolor (virus S X), Solanum demissum (virus Y) Khi chắn khơng virus khoai tây khoai tây bệnh đưa vào nhân giống đại trà 4.6.1.3 Nhân giống khay cát Cây khoai tây ống nghiệm cắt thành đốt, đốt mang lá, cắm vào khay cát ẩm Khoảng cách cắm x cm Che nắng, giữ ẩm cho đốt giâm ngày đầu Khi đốt giâm rễ, tưới dung dịch NPK loãng lần/ngày Phun thuốc trừ sâu bệnh thường xuyên.Sau tháng, cắt giâm vào luống đất Phần lại chăm sóc cũ Sau cắt 5-7 ngày, chồi bên bật lên tiếp tục tăng trưởng Các chồi bên cắt trồng đất Khay cát giữ khoảng 12 tháng để thu chồi 4.6.1.4 Nhân luống đất Chồi khay cát cấy vào luống đất Đất phân hoại trộn theo tỷ lệ phần đất: phần phân Hỗn hợp đất phân khử trùng sơ để khử bớt mầm gây bệnh Luống đất trải rộng 80cm, dài 5-10m chiều cao luống 6-8 m Khoảng cách cắm chồi 5x5 cm Sau 20 ngày bắt đầu cắt để cấy vào bầu đất Chồi bên thu cấy vào bầu đất Có thể cắt liên tục 6-7 tháng đến mạ hóa già 4.6.1.5 Cây bầu đất Bầu đất làm chuối kích thước 5x 12 cm bên có chứa đất Chồi chồi bên thu từ luống mạ cắm vào bầu đất Che nắng giữ ẩm 4-5 ngày đầu Khi chồi rễ tăng trưởng bỏ lưới che tưới dung dịch NPK loãng ngày Sau 15-20 ngày ( kể từ cấy chồi vào bầu ) khoai tây phát triển mạnh, thân mập, có rễ hồn chỉnh, sẵn sàng đưa trồng ruộng 4.6.1.6 Trồng ruộng để tạo củ giống: Cây khoai tây bầu đất trồng ruộng với mật độ cao (100.000 cây/ha) để hạn chế tăng trưởng củ Với mật độ trồng thu nhiều củ nhỏ trọng lượng 15-50 g/củ Khi củ nảy mầm đem trồng với mật độ 30.000-40.000 cây/ha Sau thu hoạch, củ khoai tây lớn bán cho người tiêu thụ, củ nhỏ trung bình bán để làm giống 4.6.2 Vi nhân giống chuối 4.6.2.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Đỉnh sinh trưởng chuối nuôi cấy phương pháp hủy đỉnh Củ chuối thu từ chuối tháng tuổi, cắt gọn, vỏ tách bỏ , chừa lại khoảng lớp bên Củ chuối ngâm dung dịch khử trùng hypoclorit sodium tủ cấy vơ trùng Sau mẫu lau bơng gòn có thấm nước cất vô trùng tách bớt lớp vỏ bên ngồi dao nhọn sắc đến lại lớp vỏ ngưng tách Hủy đỉnh sinh trưởng để bỏ ưu ngọn, chồi nách bao phát sinh thành nhiều chồi Kích thước mẫu tách có đường kính 1-1,5 cm, dày 0,7-1,3 cm Mãu sau tách cấy vào bình tam giác thể tích 300 ml chứa mơi trường MS đặc có bổ sung BA ppm, IAA 0,5 ppm, tyrosine 100 ppm nước dừa 15% Mẫu nuôi điều kiện nhiệt độ 25-28 oC, cường độ chiếu sáng 3.000 lux, độ ẩm 70-80% thời gian chiếu sáng giờ/ngày Sau 45 ngày, chồi xuất cao khoảng cm, trung bình mẫu cấy có 5-8 chồi 4.6.2.2 Tạo cụm chồi Các chồi mẫu tách riêng rẽ chồi Mỗi chồi đơn lại tách bao hủy đỉnh tương tự cấy vào bình tam giác có chứa mơi trường tạo chồi Mơi trường tạo chồi điều kiện nuôi cấy giống bước Sau 30 ngày tù chồi đơn phát triển thành cụm chồi gồm 3-4 chồi nhỏ 4.6.2.3 Nhân cụm chồi Cụm chồi nuôi cấy vào môi trường nhân chồi Môi trường nhân chồi giống môi trường tạo chồi nồng độ BA IAA giảm xuống ( BA 2-3 ppm, IAA 0,2-0,3 ppm) Cụm chồi cấy chuyền sau tuần Số lần cấy chuyền tổng cộng Trong lần cấy chuyền, chồi lớn hủy đỉnh chồi chồi nhỏ giữ thành cụm có từ 2-3 chồi Sau lần cấy chuyền nhân chồi, từ củ chuối ban đầu cho 2000 chuối in vitro 4.6.2.4 Tái sinh in vitro Sau lần cấy chuyền, chồi chuối chuyển sang môi trường tái sinh Môi trường tái sinh mơi trường MS có bổ sung NAA 0,1 ppm than hoạt tính g/l Sau 30 ngày, chuối có thân phát triển mạnh chuyển luống ươm Hình 4.4 Ni cấy mô chuối thông qua nuôi cấy phát sinh phôi (A) Đỉnh chồi (B) Cụm tế bào phôi (C) Dịch lỏng tế bào phôi (D) Cây tái sinh thông qua ni cấy phát sinh phơi Hình 4.5 Ni cấy phát sinh hình thái chuối Từ trái sang phải: Nuôi cấy phát sinh sau 1,2, chu kì 4.6.2.5 Thuần hóa Cây chuối sau đưa khỏi bình cấy luống ươm có chất xơ dừa Cây giữ ẩm phun thuốc kích thích rễ Sau 15-20 ngày, rễ, phát triển thân khỏe mạnh, cao 5-7 cm 4.6.2.6 Chăm sóc vườn ươm Sau giai đoạn hóa, chuyển trồng luống xử lý thuốc trừ nấm bệnh Cây bổ sung dinh dưỡng dung dịch NPK (20-20-20) loãng lần tuần Sau 20 ngày chuyển đến nông trường trồng chuối 4.6.2.7 Cây bầu đất Cây cấy vào bầu đất trước chuyển Bầu đất có chứa phân hữu với đất với tỉ lệ 1:5 Cây phun ure 5g/l lần tuần, phun thuốc phòng bệnh, đặt nơi ánh sáng mạnh, tưới giữ ẩm Sau 45 ngày chuẩn bị đưa ruộng Các tăng trưởng yếu ớt khơng bình thường bị loại bỏ 4.7.Nhân giống thân gỗ 4.7.1.Vi nhân giống thân gỗ non Cây non trồng từ hạt năm tuổi Nhân giống thông qua hai đường nuôi cấy quan nuôi cấy phôi Thông dụng nuôi cấy quan nuôi cấy quan nuôi cấy phôi khác chỗ phát sinh chồi hay chồi bên sau phát triển rễ, hồn chỉnh tái tạo Trong ni cấy phơi phơi phát sinh sau hình thành mấm rễ, giai đoạn nảy mầm thành hoàn chỉnh 4.7.1.1 Nuôi cấy quan Các bước nhân giống mơi trường bước - Hình thành chồi từ mẫu đưa vào nuôi cấy - Vươn thân nhân giống - Tạo rễ - Thuần hoá in vitro Chọn môi trường nuôi cấy cho bước phụ thuộc vào loại cây, từ nồng độ thấp đến cao Thường người ta bổ sung môi trường chọn lựa trước phù hợp cho loại bước nhân giống + Tạo chồi: Mẫu phát triển cho khả tạo chồi cao Mẫu non chứa nhiều dinh dưỡng có nhu mơ phân sinh có khả tạo chồi cao chồi mầm từ hạt non có khả tạo chồi nhiêu già Phôi hợp tử trưởng thành,lá mầm, phần mầm chồi bên lá, phận chứa nhiều mô phân sinh, tạo chồi hay chồi bên Chồi thường tạo môi trường có Cytokinin với nơng độ 0,5-5 phương pháp, phương pháp chồi chồi bên xuất chậm lại sau 4-6 tháng + Vươn thân nhân giống Môi trường cho vươn thân giống môi trường nhân giống khơng có cytokinin Sử dụng than hoạt tính (0,5-1%) cần thiết cho vươn thân Đường Sacaroza 3% thích hợp cho vươn thân nhân giống, 2% cho tạo rễ Môi trường lỏng hay môi trường lỏng lớp agar thích hợp cho vươn thân Hình 4.6 Vi nhân giống caphe Nhân giống thực hai phương pháp: Phưong pháp cắt đốt có hay khơng có cytokinin Phương pháp nhân theo cụm chồi, có sử dụng cytokinin kích thích chồi phát sinh phát triển phương pháp thường dùng đốI với thân gỗ + Tạo rễ hoá Sự tạo rễ chịu ảnh hưởng Auxin, cách xử lí Auxin, chất lượng chồi tuổI sinh lý, giống nhiệt độ Để tạo rễ thường cấy vào mơi trường có Auxin IBA, NAA hay hai loại với nồng độ 0,1-5 phương phápm cho IBA 0,1-5 phương phápm cho NAA Nồng độ thời gian sử lí phọ thuộc vào giống Tạo rễ hố thường đơi với Trong thời gian hóa non cần trì tình trạng tự dưỡng, giảm độ ẩm từ 90% đến xuống 30-50%, dày lên rễ phát triển 4.7.1.2 Nuôi cấy phôi + Các bước nhân giống môi trường Tạo từ phôi trải qua bước Tạo phôi Nhân phôi Phát triển trường thành phôi Nảy mầm phơi Thuần hố in vitro Mơi trường nuôi cấy giống môi trường nuôi cấy quan Thêm ABA vào môi trường cho phát triển phôi trưởng thành cần thiết + Phát sinh phôi nhân phôi: Phôi hợp tử chưa trường thành, 3-5 tuần dùng làm nguyên liệu tạo phôi BA (0,5-5 phương phápm) 2,4D (1-10phương phápm) dùng để tạo phôi Auxin cần thiết cho phát sinh phát triển phôi trưởng thành đồng Nhân phôi môi trường lỏng sử dụng phổ biến + Sự phát triển trường thành phôi Để phơi phát triển trưỏng thành cần có ABA (10-20phương phápm) ABA kích thích hình thành nơi dự trữ lipít, protein, carbohydrat phát triển phơi cần thiết cho phơi nảy mầm mơi trường có áp suất thẩm thấu cao, trao đỏI tốt O2 CO2 cảI thiện chất lượng số lượng phôi tạo Dùng đường Saccaroza 12% tạo áp suất thẩm thấu lớn, tăng trưởng thành làm khô phơi Đối với thân gỗ, hình thành phơi mơi trường khơng có Auxin + Sự nảy mầm phôi Sự nảy mầm phôi thường thực môi trường agar, khă tái sinh từ phôi thân gỗ thấp Tái sinh phơi cầu giấy đặt mơi trường lỏng có ẩm độ cao cảI thiện khả tái sinh Đưa đồng ruộng Thể nhân giống tâi sinh từ chồi hay in vitro phải đưa thử nghiệm đồng ruộng so sánh với từ hạt giâm cành Nhưng sinh trưởng phát triển thể nhân giống khác sinh lý di truyền xuất trình nhân giống Nên cẩn thận nuôi cấy thể nhân giống đồng ruộng trước nhân hàng loạt + Nhân thể nhân giống qua phát sinh quan - Nhân giống thân gỗ sinh trường từ hạt - Thể nhân giống từ chồi non có trạng thái chín tốt có khuynh hướng tạo chồi sát nhau, có chiều cao giống nhau, đường kính nhỏ - Cây từ giâm cành thường tốt thể nhân giống + Nhân thể nhân giống qua phát sinh phơi: Sự hình thành thể nhân giống qua phát sinh phôi chưa thử nghiệm hoàn chỉnh 4.7.2 Vi nhân giống thân gỗ trưởng thành Nhân giống vơ tính trưởng thành khó non Có hai loại mẫu dùng: Mô non gần gốc Chồi trưởng thành đỉnh 4.7.2.1.Ni cấy quan: +Xử lí mẹ Cây mẹ có tuổi trưởng thành lớn tuổI đem giâm cành, chiết cành trước đưa vào ni cấy in vitro nhằm để tạo mơ non hố + Có bước nhân giống Tạo chồi Vươn thân nhân giống Tạo rễ Thuần hố in vitro Mơi trường nhân giống ni cấy non Trên mơi trường bổ sung than hoạt tính giúp vươn thân + Tạo chồi: Chọn mẫu tăng trưởng, có nhu mơ đỉnh hay chồì bên kích thích tạo chồi, mẫu cấy có sẵn 1-2 mm Chọn chồi non vươn ánh sáng khả tạo chồi cao + Vươn thân nhân giống Mơi trường chồi vươn thân khơng có chất kích thích sinh trưởng bổ sung than hoạt tính (0,5-2%), vươn thân có rễ đem nhân giống ĐốI với nhiều thân gỗ,khi chồi xuất hiện, thường tách cấy mơi trường có nồng độ chất sinh trưởng thấp BA (0,202 ppm) BA+IBA, BA+IBA+GA3 Tuy nhiên mẫu nuôi cấy môi trường có cytokinin+ than hoạt tính hay khơng có cytokinin trẻ hoá + Tạo rễ hoá Đối với mẫu già, Auxin cần thiết cho tạo rễ thường dùng IBA hay IBA+ NAA để tạo rễ Nhân tố định đến rễ: Dùng chồi có chất lượng, chất xốp, phun sương giữ ẩm giảm nhiệt độ ban ngày, tách mô sẹo gốc mơi trường ni cấy tạo rễ có 6% đường Sacaroza + Thử ngiệm đồng ruộng trẻ hoá: Khả làm trẻ lại thực xử lí mẹ kĩ thuật nơng học, chọn mẫu nuôi cấy, nuôi cấy in vitro mơi trường hay xử lí mang tính chất vật lí khác Phụ thuộc vào mục tiêu sử dụng thể nhân giống: Trẻ lại hay trẻ lại mức độ đó, có tc hình thái trẻ cho thấy cần thiết trồng khu rùng Các thể nhân giống chín cần thiết để hoa kết hạt + Chỉ thị hoá sinh: Để tránh nhiều tháng chờ đợi hàng nhiều năm để quan sát ảnh hưởng xl khác hình thái, sinh lý, tập tính tái sinh thể nhân giống tử trưởng thành, phương pháp thị hoá sinh sử dụng để nghiên cứu Nghiên cứu tỉ lệ K/Ca mô chịu ảnh hưởng cytokinin mức độ trẻ chồi nuôi cấy Sử dụng phương pháp sinh học phân tử để nghiên cứu ảnh hưởng trưởng thành đến đặc tính hình thái quang hợp trưởng thành giúp ta phát thị trẻ lại 4.8 Thực hành nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 4.8.1 Nuôi cấy phát triển thành trực tiếp a Nguyên liệu thực vật - Đỉnh sinh trưởng hông (Paulownia fortunei) - Đỉnh sinh trưởng keo lai (Acasia hybrid) b Môi trường nuôi cấy - MS đầy đủ - Saccharose 3% - Agar 0,8% - BAP mg/L - NAA mg/L - pHmôi trường ∼ 5,8 c Tiến hành  Pha môi trường dinh dưỡng (1 L) Chia mơi trường vào 20 40 bình tam giác loại 250 100 mL, tương ứng Nút miệng bình giấy nhơm, sau đem khử trùng 121 oC (1 atm)/15-30 phút (môi trường chuẩn bị trước từ ngày trở lên)  Rửa đỉnh sinh trưởng xà phòng dòng nước chảy, cắt bỏ chung quanh để lại vài lá, cho vào lọ thủy tinh vô trùng để chuẩn bị khử trùng mẫu vật  Trước cấy, laminar phải bật đèn khử trùng 30 phút Các dụng cụ cần thiết cho trình cấy (forceps, kéo, dao, bình khử trùng, cồn, giấy thấm ) đặt laminar trước bật đèn  Khử trùng sơ cồn 90% từ 30 giây đến phút, sau HgCl 0,1 % phút, cuối rửa HgCl2 nước cất vô trùng từ 4-5 lần (các thao tác này thực hiện laminar)  Lấy mẫu vật thấm khô giấy thấm vơ trùng bóc bỏ chung quanh, giữ lại đỉnh sinh trưởng (những phần mô thấm dung dịch khử trùng cần phải cắt bỏ) Sau đó, cấy mẫu vào bình tam giác chứa mơi trường dinh dưỡng chuẩn bị sẵn Các bình mơi trường cấy mẫu đặt phòng ni với nhiệt độ 25 ± oC, thời gian chiếu sáng 8-10 giờ/ngày với cường độ 2000-3000 lux Sau 3-4 tuần, đỉnh sinh trưởng phát triển thành nhờ trình kéo dài chồi 4.8.2 Ni cấy phát triển thông qua giai đoạn protocorm a Nguyên liệu thực vật - Đỉnh sinh trưởng chồi nách hoa lan Dendrobium b Môi trường nuôi cấy - Lan: MS đầy đủ Saccharose 2% Agar 0,8% Nước dừa 15% NAA 0,1 mg/L BAP 1,0 mg/L pHmôi trường ∼ 5,8 c Tiến hành Các bước tiến hành tương tự trường hợp nuôi cấy phát triển thành trực tiếp Nhưng lưu ý thêm: - Đỉnh sinh trưởng loài lan thường bẩn nên phải rửa thật kỹ xà phòng dòng nước chảy - Lan có khả sinh trưởng mạnh nên thời gian khử trùng đỉnh sinh trưởng chúng lâu đối tượng khác (khoảng 7-10 phút) để đảm bảo tỷ lệ nhiễm bẩn thấp Các bình mơi trường cấy mẫu đặt phòng ni với thời gian chiếu sáng 8-10 giờ/ngày, cường độ ánh sáng 2000-3000 lux, nhiệt độ phòng 25 ± 2oC ... nắng 4.4 .2 Các bước vi nhân giống Nhân giống vơ tính trồng thường trải qua bước sau: • Ni cấy đỉnh sinh trưởng • Tạo thể nhân giống invitro • Nhân giống invitro • Tái sinh thành hồn chỉnh invitro... truyền 4.3 Các phương pháp nhân giống invitro 4.3 .1.Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh hay đỉnh phân sinh 4.3 .1.1 Đỉnh sinh trưởng Hình 4.1 Đỉnh sinh trưởng Mô phân sinh đỉnh chứa tế bào đỉnh sinh trưởng... citric acid (25-150 mg/l) 4.4 .2.2 Tạo thể nhân giống in vitro Mẫu nuôi cấy cấy môi trường chọn lọc đặc biệt nhằm mục đích tạo thể nhân giống in vitro Có hai thể nhân giống in vitro: thể chồi (multiple