Nghiên cứu nhân giống vô tính in vitro giống lan Dendrobium Aduncum

LỜI CẢM ƠNĐồ án được hoàn thành là kết quả của quá trình tìm tòi học hỏi của bản thân và sự giúp đỡ động viên của gia đình, bạn bè, đặc biệt là sự hướng dẫn chỉ bảo tận tình của quý thầy cô. Em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến tất cả các quý thầy cô giảng viên trong bộ môn Công nghệ Sinh học, các quý thầy cô trong khoa Hoá của trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng, các quý thầy cô trong nhà trường những người đã tận tình dạy dỗ và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập tại trường.Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. Đặng Đức Long tổ trưởng bộ môn Công nghệ Sinh học, khoa Hóa, trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em trong quá trình nghiên cứu.Em xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Hoàng Trung Hiếu trong suốt thời gian làm đồ án vừa qua đã tận tình giúp đỡ, động viên em vượt qua mọi khó khăn để đi đến kết quả cuối.Em cũng xin chân thành cảm ơn đến anh Tuấn và chị Thảo cùng các bạn trong nhóm nghiên cứu đã giúp đờ em trong quá trình nghiên cứu đề tài.Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè những người đã luôn động viên giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành đồ án.Đà Nẵng, ngày 11 tháng 6 năm 2012 Sinh viên Trần Thị MơMỤC LỤCLỜI MỞ ĐẦU1CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU21.1. Giới thiệu chung về Dendrobium21.1.1. Phân loại21.1.2. Đặc điểm hình thái31.1.2.1. Cơ quan dinh dưỡng31.1.2.2. Cơ quan sinh sản31.1.3. Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng lan Dendrobium51.1.3.1. Nhiệt độ51.1.3.2. Độ ẩm61.1.3.3. Ánh sáng61.1.3.4. Nhu cầu phân bón61.1.3.5. Sâu bệnh và các vấn đề khác71.2. Một số nghiên cứu về nhân giống lan Dendrobium91.2.1. Trên thế giới91.2.2. Ở Việt Nam121.4. Các phương pháp nhân giống trên cây lan131.4.1. Các phương pháp nhân giống truyền thống131.4.1.1. Nhân giống vô tính131.4.1.2. Nhân giống hữu tính131.4.2. Phương pháp nhân giống vô tính in vitro141.5. Sơ lược về kỹ thuật nhân giống in vitro151.5.1. Lịch sử151.5.2. Các kỹ thuật nhân giống in vitro161.5.3. Quy trình nhân giống171.5.3.1. Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây làm vật liệu gốc171.5.3.2. Giai đoạn 2: Thiết lập hệ thống nuôi cấy vô trùng171.5.3.3. Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi181.5.3.4. Giai đoạn 4: Tạo rễ181.5.3.5. Giai đoạn 5: Đưa cây ra vườn ươm181.6. Các yếu tố ảnh hưởng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật191.6.1. Đảm bảo điều kiện vô trùng191.6.1.1. Ý nghĩa của vô trùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật191.6.1.2. Nguồn tạp nhiễm201.6.2. Chọn môi trường dinh dưỡng201.6.3. Chọn mô cấy và xử lý mô cấy21CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU222.1. Đối tượng nghiên cứu222.2. Phương pháp nghiên cứu232.2.1. Môi trường nuôi cấy232.3. Thiết kế thí nghiệm242.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với NAA đến sự nhân nhanh protocorm.242.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với NAA đến sự nhân nhanh chồi lan.242.3.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA đến khả năng hình thành rễ của cây lan.252.3.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ IAA và Kin đến khả năng hình thành rễ lan.252.4. Thời gian và địa điểm thí nghiệm262.5. Xử lý số liệu26CHƯƠNG 3: KẾT VÀ QUẢ VÀ THẢO LUẬN273.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với NAA đến sự nhân nhanh protocorm.273.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với NAA đến sự nhân nhanh chồi lan.303.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA đến khả năng hình thành rễ của cây lan.343.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ IAA và Kin đến khả năng hình thành rễ lan.38KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ43TÀI LIỆU THAM KHẢO45PHỤ LỤC48DANH MỤC HÌNH ẢNHHìnhTên hìnhTrangHình 1.1Cấu tạo cơ quan sinh sản5Hình 2.1Lan Dendrobium Aduncum22Hình 3.1Protocorm sau 30 ngày nuôi cấy29Hình 3.2Chồi lan sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường P4 33Hình 3.3Chồi lan sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường P533Hình 3.4Rễ lan sau 4 tuần cấy trên nuôi môi trường V5 37Hình 3.5Rễ lan sau 4 tuần cấy trên nuôi môi trường V6 37Hình 3.6Rễ lan phát triển sau 4 tuần nuôi cấytrên môi trường… 42DANH MỤC BẢNGBảngTên bảngTrangBảng 3.1Kết quả nhân nhanh protocorm sau 4 tuần nuôi cấy27Bảng 3.2Kết quả của việc nhân nhanh chồi sau 4 tuần nuôi cấy30Bảng 3.3Kết quả ra rễ lan sau 4 tuần nuôi cấy34Bảng 3.4Kết quả ra rễ lan sau 4 tuần nuôi cấy38DANH MỤC BIỂU ĐỒBiểu đồTên biểu đồTrangBiểu đồ 1Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến sự nhân nhanh chồi lan31Biểu đồ 2Ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA đến sự phát triển của rễ lan35Biểu đồ 3Ảnh hưởng của nồng độ IAA đến sự phát triển của rễ lan39Biểu đồ 4Ảnh hưởng của nồng độ IAA và Kin đến sự phát triển của rễ lan39CÁC CHỮ VIẾT TẮT2,4D: 2,4 diclopheoxyacetic acidAC: Activated charcoalBA: N6 benzyl adenineBAP: 6 benzyl amino purincs: Cộng sựCW: Coconut waterĐHST: Chất điều hòa sinh trưởngIAA: Indole 3 acetic acidIBA: Indole 3 butyric acidKin: KinetinKC: Knodson CMS: Murashige và Skoog,1962TDZ: Thidiazuron

Đồ án tốt nghiệp 1 LỜI MỞ ĐẦU Ngày nay, hoa cảnh không những đóng vai trò quan trọng trong đời sống tinh thần mà còn ảnh hưởng sâu sắc đến tâm hồn con người và làm đẹp cho cảnh quan môi trường. Do đó, quan tâm phát triển hoa cảnh là vấn đề cần thiết. Hoa lan là một trong những loại hoa được ưa chuộng nhất vì hình dáng, màu sắc, kích thước phong phú và đa dạng nên chúng được trồng và sản xuất khá phổ biến. Dendrobium aduncum hay còn gọi là Hồng câu hay Thạch hộc móc, lan móc, Hoàng thảo thân gãy, Câu trạng thạch hộc. Đây là loài lan rừng có hoa nhỏ mọc thành chùm, nằm trong chi Lan Hoàng Thảo. Lan Dendrobium aduncum hay phong lan nói chung hiện đang được nhiều người ưa chuộng trong nước cũng như trên thế giới. Ở Việt Nam phần lớn lan được trồng hiện nay là được đem từ rừng về hoặc nhân giống bằng phương pháp truyền thống như tách nhánh, gieo hạt,…Tuy nhiên, việc nhân giống này cho hiệu quả không cao, chất lượng cây giống không đảm bảo. Do đó, không đáp ứng đủ nhu cầu cho người tiêu dùng trong nước cũng như xuất khẩu. Việc ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy invitro vào quá trình nhân giống cây phong lan là vấn đề đáng được quan tâm và nghiên cứu. Kỹ thuật này không những giải quyết được những vấn đề khó khăn đang gặp phải trong việc nhân giống lan mà còn giúp chúng ta chủ động sản xuất một số lượng lớn cây giống có chất lượng cao, đồng đều và sạch bệnh. Dựa trên cơ sở đó và kế thừa các công trình nghiên cứu trước chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Nghiên cứu nhân giống vô tính in vitro giống lan Dendrobium Aduncum” nhằm tìm được môi trường thích hợp mang lại hiệu quả cao cho quá trình nhân giống cây Dendrobium aduncum. Nhân nhanh giống lan Dendrobium Aduncum bằng công nghệ in vitro Đồ án tốt nghiệp 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về Dendrobium 1.1.1. Phân loại Phong lan có vùng phân bố rộng lớn. Họ phong lan (Orchidaceae) với 750 chi và hơn 25000 loài là họ lớn thứ hai sau họ cúc (Asteraceae) trong ngành hạt kín (Angiospermae) và cũng là họ lớn nhất trong lớp một lá mầm [14]. Việc phân loại phong lan khá phức tạp. Theo truyền thống cổ điển các nhà khoa học trước đây phân loại Dendrobium thuộc tông Epidendreae, họ phụ Epiden droideae, phân họ Orchidaceae. Theo Nguyễn Xuân Linh (1998) phân loại lan Dendrobium như sau: - Dendrobium crassinode (Hoàng thảo u lồi). - Dendrobium draconis (Hoàng thảo nhất điểm hồng). - Dendrobium farmeri (Hoàng thảo thủy tiên). - Dendrobium hercoglossum (Hoàng thảo tím huế). - Dendrobium heterocrrpun (Hoàng thảo nhất điểm hoàng). - Dendrobium (Hoàng thảo dẹt). - Dendrobium parciflorum (Hoàng thảo xương cá). - Dendrobium parisshii (Hoàng thảo tím hồng). - Dendrobium parishii (Hoàng thảo hạc vĩ). - Dendrobium primulim (Hoàng thảo long tu). - Dendrobium pumilum (Hoàng thảo phù dung) [7]. Nhân nhanh giống lan Dendrobium Aduncum bằng công nghệ in vitro Đồ án tốt nghiệp 3 1.1.2. Đặc điểm hình thái 1.1.2.1. Cơ quan dinh dưỡng  Rễ: Rễ lan thuộc loại rễ bì sinh, chung quanh rễ thật được bao bọc bởi một lớp mô xốp (màng) giúp cây dễ dàng hút nước, muối khoáng và ngăn chặn ánh sang mặt trời gay gắt. Chóp rễ có màu xanh lá cây, ở phần rễ có các sắc lạp không bị ngăn bởi mô xốp nên có thể giúp cây quang hợp.  Thân: Lan Dendrobium thuộc loài đa thân có giả hành rất dài, hình trụ, hình múi hay hình dẹt, có nhiều đốt thân. Thân có dạng mọc thẳng hoặc rũ xuống.  Giả hành: Giả hành là những đoạn phình to, bên trong có các mô mềm chứa dịch nhày làm giảm sự mất nước và dự trữ chất dinh dưỡng để nuôi cây trong điều kiện khô hạn khi cây sống bám trên cao. Ngoài ra, giả hành còn chứa diệp lục tố nên có thể quang hợp. Hình dạng và kích thước của giả hành rất đa dạng từ nhỏ đến lớn, hình cầu thuôn dài hay hình trụ xếp chồng lên nhau tạo thành thân giả có lá mọc xen kẽ.  Lá: Các lá lan mọc xen kẽ nhau và ôm lấy thân giả do lá có tận cùng bằng một cuống hay thuôn dài thành bẹ ôm thân. - Hình dạng và cấu trúc của lá rất đa dạng. Lá có hình kim, trụ có rãnh hay phiến mỏng. Dạng lá mềm mại, mang nước, nạc, dai, có màu xanh bóng sẫm hay nhạt là tùy thuộc vào vị trí sống của cây. - Phiến lá trải rộng hay gập theo gân vòng cung như cái quạt hay chỉ gấp lại theo gân giữa như hình chữ V. Những lá sát dưới gốc đôi khi giảm đi chỉ còn những bẹ không phát triển hay giảm hẳn thành vảy [6; 7]. 1.1.2.2. Cơ quan sinh sản  Hoa: Hoa lan Dendrobium thuộc nhóm phụ ra hoa ở nách lá. Chồi hoa mọc từ các mắt ngủ giữa các đọt lá trên thân gần ngọn và cả trên ngọn, cả trên thân ngọn cây gọi là Keikei. Nhân nhanh giống lan Dendrobium Aduncum bằng công nghệ in vitro Đồ án tốt nghiệp 4 - Biểu hiện trước khi ra hoa có sự khác biệt như: có nhiều loài rụng hết lá trước khi ra hoa, thời gian ra hoa đầu mùa mưa hay đầu tết. - Hoa mọc thành chùm đơn hay chùm kép hay từng hoa riêng lẻ. Cành hoa dạng rũ xuống hay thẳng đứng. Giống Dendrobium thường có hoa lâu tàn, trung bình từ 1-2 tháng. Thời gian nở hoa có khi là suốt năm. - Cấu trúc hoa thì cực kì phong phú và hấp dẫn về hình dạng cũng như màu sắc, tuy nhiên chúng luôn có các điểm chung sau: +) Bao hoa có 2 vòng và 3 mảnh bao gồm 3 cánh đài và 3 cánh tràng. 3 cánh đài thường có dạng 3 cánh hoa giống nhau hay cánh lưng dài hơn 2 cánh bên. Các cánh đài dựng đứng hay trải ra. 3 cánh tràng có 2 cánh bên rất giống với các cánh đài rời hay dính với cánh đài bên, cánh tràng bên được gọi là cánh môi có màu sắc biến đổi sặc sỡ, hấp dẫn côn trùng giúp hoa thụ phấn. Cánh môi có dạng như: nguyên, chia thùy, khía răng, có ta viền hay chia thành các sợi mảnh. +) Ở Dendrobium và hầu hết các chi phong lan khác có cấu tạo nhị, nhụy nằm chính giữa hoa là dấu hiệu cơ bản để định dạng loại hoa phong lan. Trong khoang nhỏ của cột nhị có đính 1 khối phấn có hàng trăm nghìn hạt phấn dính lại. Khối phấn có thể chia thành 2 hay 4 được xếp thành từng đôi một trong khoang. Thường có tinh bột, sáp hoặc có sừng cứng bao quanh khối phấn.  Trái (quả): Quả lan thuộc loại quả nang. Khi chín các nang bung ra chỉ còn dính lại với nhau ở đỉnh và gốc. Ở một số loài, khi chín quả không nứt ra nên hạt chỉ ra khỏi vỏ khi quả bị mục nát.  Hạt: Một quả chứa từ 10.000 đến 100.000 hạt, đôi khi đến 3 triệu hạt nên hạt lan có kích thước rất nhỏ, phôi hạt chưa phân hóa. Sau 12-18 tháng hạt chín phát tán nhờ gió. Khi gặp nấm cộng sinh tương thích trong điều kiện phù hợp hạt sẽ nảy mầm [6; 7]. Nhân nhanh giống lan Dendrobium Aduncum bằng công nghệ in vitro Đồ án tốt nghiệp 5 Hình 1.1: Cấu tạo cơ quan sinh sản a. Cấu tạo hoa chi tiết; b. Quả lan chín 1.1.3. Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng lan Dendrobium 1.1.3.1. Nhiệt độ Nhiệt độ tác động ở cây lan qua con đường quang tổng hợp, cường độ quang hợp gia tăng theo nhiệt độ, thường nhiệt độ tăng 10% thì tốc độ quang hợp tăng lên gấp đôi. Nhiệt độ còn ảnh hưởng đến sự ra hoa ở một số loại lan như lan Bạch câu đòi hỏi giảm nhiệt độ khoảng 5-6 0 C trong vài giây thì 9 ngày sau sẽ nở hoa đồng loạt,… Căn cứ vào nhu cầu nhiệt độ có thể tạm chia Dendrobium thành các nhóm chính sau: - Nhóm Dendrobium ưa lạnh sinh trưởng và phát triển tốt ở nhiệt độ lý tưởng là 15 0 C gồm các giống được lấy từ các vùng cao nguyên của Việt Nam và Miến Điện trên cao độ 1000m như: các loài Vảy cá (Dendrobium Linlleyi), Thủy Tiên Tím (Dendrobium amabile), Long nhãn kim điệp (Dendrobium fimbriatum). Các loài này nếu được trồng ở nhiệt độ cao hơn hoặc bằng 25 0 C, thì cây vẫn sống, nhưng phát triển yếu hơn và hiếm bao giờ ra hoa. - Nhóm Dendrobium ưa nóng, gồm đa số các giống Dendrobium rừng của Châu {c, Indonesia, Malaysia và các loài của giống Dendrobium lai hiện được trồng tại thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh phía Nam, nhiệt độ thích hợp cho Nhân nhanh giống lan Dendrobium Aduncum bằng công nghệ in vitro Đồ án tốt nghiệp 6 các loài của nhóm này là 25 0 C. Tuy nhiên các giống Dendrobium lai chịu được một nhiệt độ cao hơn nhiều. - Ngoài ra còn có một nhóm Dendrobium trung gian có thể sống ở cả vùng lạnh và vùng nóng, những ở vùng lạnh cây sinh trưởng và ra hoa nhiều hơn như: các loài Dendrobium Primulinum, Dendrobium fanmeri, Dendrobium chrysotoxum nhiệt độ lý tưởng của các loài này là 20 0 C [6; 7; 20]. 1.1.3.2. Độ ẩm Các cây lan, nhất là phong lan sống bám trên các cây cao, chúng lấy nước từ các trận mưa, từ hơi nước trong không khí. Chính độ ẩm quyết định sự hiện diện của các loài phong lan. Thông thường độ ẩm tương đối tối thiểu 70% thích hợp cho sự tăng trưởng của nhiều loài. Cấu tạo giá thể quá ẩm và úng là điều kiện bất lợi cho sự sinh trưởng của giống Dendrobium vì có thể toàn bộ rễ bị thối và biểu hiện là các cây con mọc từ phần ngọn của thân. Tuy nhiên độ ẩm lý tưởng nhất vẫn là độ ẩm của vùng bản xứ mà loài đó được tìm thấy [6]. 1.1.3.3. Ánh sáng Ánh sáng là điều kiện cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của cây lan thông qua quá trình quang hợp. Đây là yếu tố quyết định sự trổ hoa của lan. Dendrobium là giống ưa sáng, có thể trồng trong điều kiện ánh sáng trực tiếp hay khuếch tán. Ánh sáng hữu hiệu cho giống Dendrobium là 70%. Nếu thiếu ánh sáng, cây lan bị thoái hóa r~ rệt, số lượng hoa cũng rất ít, cây èo ọt. Trái lại, nếu thừa ánh sáng cây xấu đi vì bị vàng lá hoặc các giả hành trơ trụi, teo lại nhưng cây sẽ thích nghi dần và vẫn đảm bảo cây ra hoa nhiều và đẹp [6]. 1.1.3.4. Nhu cầu phân bón Dendrobium thân đứng là loài lan đòi hỏi dinh dưỡng cao, chúng cần rất nhiều phân bón và có thể dùng rất nhiều dạng phân bón khác nhau. Còn các loại Dendrobium thân thòng ăn phân yếu phải dùng nồng độ thật loãng. Nhân nhanh giống lan Dendrobium Aduncum bằng công nghệ in vitro Đồ án tốt nghiệp 7 Các loại phân hữu cơ như: phân heo, bánh dầu khô, phân tôm cá, phân trâu bò khô,…có thể dùng rất tốt bằng cách pha loãng với nước rồi tưới hoặc vò chặt thành từng viên đặt trên bề mặt giá thể, rễ lan sẽ hấp thu dần dần các dưỡng chất được phóng thích qua quá trình tưới nước. Các loại phân vô cơ được dùng, thường có công thức 30-10-10 dùng 3 lần/1 tuần với nồng độ 1 muỗng cà phê/4lít. Trong suốt mùa tăng trưởng (từ đầu tháng 5 đến cuối tháng 1) một tháng trước khi bước vào mùa nghỉ (trong suốt tháng 2) ta bón phân 10-20-30 làm 2 lần/1 tuần để tạo một sức chịu đựng cho cây trước khi bước vào mùa nghỉ. Trong mùa tăng trưởng nếu cây có nụ hoa, ta thay phân 30-10-10 bằng phân 10-20-20 với chu kỳ bón như trên cho đến kho hoa tàn. Trong mùa nghỉ hoàn toàn không bón phân cho Dendrobium, hay đúng hơn giảm và không bón phân cho Dendrobium khi cây hoàn tất thời kỳ tăng trưởng hằng năm của nó [6; 7]. 1.1.3.5. Sâu bệnh và các vấn đề khác Vì lan Dendrobium cần được bón nhiều loại phân hữu cơ khác nhau và môi trường xơ dừa sẽ mục nát sau một thời gian ngắn được trồng. Đây là 2 nguyên nhân gây ra nhiều sâu bệnh hại cho các loài dán và cuốn chiếu cắn phá rễ trong giá thể. Cách phòng trừ sâu bệnh: a) Bệnh hại trên lan: - Bệnh đen thân cây lan: Do nấm Fusarium sp. gây nên. Phòng trị: Nên tách những cây bị bệnh để riêng và dùng thuốc phòng trừ hay nhúng cả cây vào thuốc trị nấm. Nếu cây lớn hơn thì cắt bỏ phần thối rồi phun thuốc diệt nấm như Carboxin 1/2000; Zineb 3/2000; Benlat 1/2000. - Bệnh đốm lá: Do nấm Cercospora sp. gây nên. Bệnh thường phát sinh mạnh trên cây lan Dendrobium sp., gây hại trong mùa mưa ở những vườn lan có độ ẩm cao. Phun thuốc trừ nấm (như trên). Nhân nhanh giống lan Dendrobium Aduncum bằng công nghệ in vitro Đồ án tốt nghiệp 8 - Bệnh thán thư: do nấm Collectotrichicum sp. gây ra. Bệnh phát triển mạnh vào mùa mưa nên phải phòng trừ trước. Thường cắt bỏ lá vàng rồi phun thuốc diệt nấm 5 – 7 ngày/1 lần. - Bệnh thối mềm vi khuẩn: Do vi khuẩn Pseudomonas gladioli gây ra. Vết bệnh có hình dạng bất định, ủng nước, màu trắng đục, thường lan rộng theo chiều rộng của lá. Gặp thời tiết ẩm ướt mô bệnh bị thối úng, thời tiết khô hanh mô bệnh khô tóp có màu trắng xám.  Để phòng trừ bệnh do nấm, trước hết cần bảo đảm cho cây đủ dinh dưỡng và tỷ lệ N:P:K phải cân đối. Dư N và thiếu K thường làm cho lá mềm, dễ nhiễm bệnh. Ánh sáng phải đầy đủ để giữ độ cứng cho lá. Lá bị gãy do dư N, thiếu K hay do thiếu ánh sáng. Không tưới dư nước vì dễ làm cho rễ và đọt úng. Phun thuốc phòng ngừa thường xuyên 1 tháng 1 lần đến 2 lần. Nếu thấy bệnh xuất hiện cần phun nhiều hơn (1 tuần 2 đến 3 lần) cho đến khi triệu chứng bệnh giảm thì trở lại phun theo cách phòng ngừa. Các thuốc có thể sử dụng là: . Aliette 2/1000; Rovral 2/1000: trừ bệnh thối đọt, thối cổ rễ ở cây con. . Zineb 2/1000, Maneb 2/1000, Captan 2/1000; Benlate 1/1000; cerezan 1/1000 Các thuốc có chứa gốc Cu (Đồng) chỉ nên sử dụng ở cây trưởng thành và không nên dùng nhiều lần trong một thời gian ngắn. Lá bị gãy do dư N, thiếu K hay do thiếu ánh sáng. b) Sâu hại lan: Rệp vảy: Rệp thường bám trên các thân giả hành còn non. Phòng trị bằng cách: Dùng bàn chải chà xát rồi phun dung dịch thuốc Malathion 50 pha loãng. Bọ trĩ: Gây hại chủ yếu trong mùa nắng. Dùng Malathion 5 mg/bình 4 lít nước, phun 1 tuần/lần, phun liên tiếp liên tục trong 3 tuần [6; 7; 20]. Nhân nhanh giống lan Dendrobium Aduncum bằng công nghệ in vitro Đồ án tốt nghiệp 9 1.2. Một số nghiên cứu về nhân giống lan Dendrobium 1.2.1. Trên thế giới Hiện nay nhu cầu về hoa lan trên thị trường thế giới rất lớn, ngày càng tăng nên việc nghiên cứu nhân giống lan Dendrobium rất được quan tâm và phát triển mạnh mẽ. Tháng 6 năm 2006, S. Aktar & cs tại Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học USDA, Sở Công nghệ sinh học, Đại học Nông nghiệp Bangladesh, Mymensingh đã nghiên cứu khả năng hình thành rễ lan Dendrobium trong môi trường có chứa nồng độ khác nhau của IBA (0, 0.5, 1.0, 1.5 và 2.0 mg/l) và 1% than hoạt tính. Kết quả ra rễ tốt nhất thu được từ môi trường chứa 1,0 mg/l IBA [11]. Tháng 4 năm 2011, Sana Asghar & cs đã tiến hành nghiên cứu nhân nhanh chồi giống lan Dendrobium nobile var. Emma từ chồi nách sử dụng môi trường có bổ sung benzylaminopurine (BAP) ở các nồng độ 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 và 3,0 mg/l và kinetin (Kin) cũng như nước dừa (CW) với các thể tích khác nhau 50, 100, 150, 200, 250 và 300 ml. Qua nghiên cứu họ nhận thấy ở môi trường có chứa 1,5 mg/l BAP kết hợp với Kin cho kết quả nhân chồi cao nhất. Tạo cây hoàn chỉnh tốt nhất trên môi trường chứa 2 mg/l IBA với tỷ lệ phần trăm rễ (97,5%) số lượng rễ (4,70) và chiều dài cây (3,47 cm) hiệu quả hơn so với NAA. Nồng độ cao hơn của IBA và NAA (3,0 mg/l) cho thấy khả năng hình thành rễ kém [12]. Tháng 8 năm 2010, M. Maridass & cs đã tiến hành nhân giống in vitro phong lan Dendrobium nanum từ nguồn vật liệu ban đầu là thân rễ. Nghiên cứu này được đăng trên Tạp chí Công nghệ sinh học quốc tế (2010). Vật liệu thân rễ được rửa bằng nước cất, rửa qua ethanol 70% trong 30 giây, tiếp theo khử trùng với hypoch natri 3% (bổ sung 2-3 giọt Tween 80 EAC ml) trong 20 phút và sau đó rửa sạch cho 4-5 lần bằng nước cất vô trùng. Thân rễ được trẻ ra cắt miếng nhỏ (5mm) và các mảnh rễ được cấy trên môi trường cơ bản của MS có bổ sung các kích thích tố như NAA, BAP và kinetin. Các mẫu hình thành protocorm tốt Nhân nhanh giống lan Dendrobium Aduncum bằng công nghệ in vitro Đồ án tốt nghiệp 10 trên môi trường có chứa 2.0μM / l NAA và 1,2 μM / l kinetin. Sau đó protocorm phát sinh chồi tốt nhất trên môi trường MS + 0.5μM / l BAP [13]. Năm 2011, trên tạp chí của trường đại học Khoa học & Công nghệ Assam S. Dutta1, A. Chowdhuryl và cs đã đăng công trình nghiên cứu của mình về việc phát triển và nhân nhanh giống lan Dendrobium aphyllum. Vật liệu được sử dụng trong nghiên cứu này là các hạt lan Dendrobium aphyllum. Các quả lan mười lăm tuần tuổi sau khi khử trùng, các hạt được tách ra và gieo trực tiếp lên môi trường MS cơ bản. Sau năm tuần theo d~i nhóm nghiên cứu đã ghi nhận kết quả với tỷ lệ nảy mầm và hình thành protocorm của hạt đạt 90,6%. Các protocorm tiếp tục được cấy chuyển sang môi trường mới là môi trường MS cơ bản có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng IAA và Kin riêng rẽ và kết hợp với các nồng độ khác nhau. Kết quả ghi lại sau hai tuần theo d~i cho thấy các protocorm (PLBs) có sự phát triển rễ và chồi. Kết quả này có sự khác biệt đáng kể giữa các môi trường. Từ chiều dài trung bình của rễ và chồi được ghi lại cho thấy sự phát triển tốt nhất trên môi trường kết hợp MS + 0.05mL (50µg/100mL) IAA+0.15mL (50µg/100mL) Kin với thông số chiều dài rễ và chồi là (0,50 cm và 0,78 cm) [14]. Với Maslini Japar Ali, Rosmah Murdad and Mariam Abd. Latip tai trường Đại học Sabah Malaysia. Vừa qua năm 2011, họ đã tiến hành nghiên cứu xác định môi trường và điều kiện ánh sáng thích hợp nhất cho sự nảy mầm hạt giống in vitro của Dendrobium tetrachromum và Dendrobium hamaticalcar. Hạt từ quả trưởng thành (120 ngày sau khi thụ phấn) được tách và nuôi cấy thí nghiệm trên các môi trường: ½MS, MS và KC. Những ảnh hưởng của các loại phụ gia hữu cơ như nước dừa(5, 10, 15, 20%), peptone, chiết xuất từ khoai tây, và men bia nồng độ khác nhau (1, 2, 4 và 6g/L) đến hạt giống nảy mầm cũng đã được nghiên cứu. Các kết quả thu được trong các thí nghiệm cho thấy rằng hạt giống các loài D.tetrachromum nảy mầm rất tốt trên tất cả các môi trường cơ bản đã thử nghiệm với hơn 50% sự nảy mầm diễn ra khi theo d~i sau 30 ngày và 100% sau 70 ngày. Đối với D. hamaticalcar, ½MS là môi trường tốt nhất cho nảy mầm hạt giống. Khi bổ sung CW 15% hoặc 2 GL-1 peptone vào môi trường ½ MS thấy chúng Nhân nhanh giống lan Dendrobium Aduncum bằng công nghệ in vitro [...]... vô tính in vitro Do các phương pháp nhân giống truyền thống thường cho hiệu quả nhân giống thấp và chất lượng cây giống không cao nên trong phòng thí nghiệm chúng tôi đã tiến hành nhân giống lan Dendrobium bằng phương pháp nhân giống vô tính in vitro Phương pháp này có các ưu điểm sau: - Hệ số nhân giống nhanh - Cho ra các cá thể tương đối đồng nhất về mặt di truyền Nhân nhanh giống lan Dendrobium Aduncum. .. : Dendrobium [20; 21] Hình 2.1: Lan Dendrobium Aduncum Nhân nhanh giống lan Dendrobium Aduncum bằng công nghệ in vitro Đồ án tốt nghiệp 23 2.2 Phương pháp nghiên cứu  Quy trình nhân giống cây lan Dendrobium Aduncum (Nguồn vật liệu tự nhiên) 4 - 8 tuần (Protocorm) 4 - 8 tuần (Chồi phát sinh từ protocorm) 4 - 8 tuần (Nhân chồi) 4 -8 tuần 4 - 8 tuần (Cây hoàn chỉnh) (Vườn ươm) Nhân nhanh giống lan Dendrobium. .. đã được sử dụng để nghiên cứu tác động đến sự phát triển PLBs [18] Nhân nhanh giống lan Dendrobium Aduncum bằng công nghệ in vitro Đồ án tốt nghiệp 12 1.2.2 Ở Việt Nam Hiện nay, ngoài các có các công trình nghiên cứu về cây lan Dendrobium trên thế giới, tại nước ta công việc nghiên cứu để nhân nhanh giống lan này cũng đang rầm rộ phát triển Dưới đây là một vài công trình nghiên cứu điển hình Năm 2006,... PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu trong thí nghiệm này là nguồn mẫu invitro giống lan Dendrobium Aduncum có sẵn trong phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật tại trường ĐH Bách Khoa Đà Nẵng Dendrobium Aduncum là loài lan rừng có hoa nhỏ mọc thành chùm Tên Khoa học: Dendrobium aduncum Wall ex Lindl Tên tiếng Việt: Hoàng Thảo Thân gãy, Thập hoa, Hồng câu, Thạch hộc móc, lan móc,... và dớn cho cây lan Dendrobium sinh trưởng tốt nhất [1] Vũ Ngọc Lan và cs (2010), khi nghiên cứu giá thể trồng lan Hoàng thảo (Dendrobium hancockii) cho thấy loại lan này sống thích hợp nhất trên giá thể gỗ nhãn [4] 1.4 Các phương pháp nhân giống trên cây lan 1.4.1 Các phương pháp nhân giống truyền thống 1.4.1.1 Nhân giống vô tính a) Tách bụi: - Phương pháp này dùng để tách các chậu lan quá đầy, đồng... Spss inc Headquarter - Xuất xứ: United States 2007 Nhân nhanh giống lan Dendrobium Aduncum bằng công nghệ in vitro Đồ án tốt nghiệp 28 CHƯƠNG 3: KẾT VÀ QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với NAA đến sự nhân nhanh protocorm Nhân nhanh protocorm cũng là một giai đoạn quan trọng mang tính chất quyết định đến hệ số nhân nhanh trong việc nhân giống vô tính invitro... phân sinh ngọn, tượng tầng, đầu rễ, phôi đang phat triển, thịt quả non, cuống hoa, đế hoa, mô phân sinh đốt,…) khi đặt vào môi trường có chứa một lượng chất kích thích sinh trưởng thích hợp đều có khả năng tạo mô sẹo Để nghiên cứu nhân giống vô tính một cây nhất định, trước tiên người ta chú ý đến các chồi nách và mô phân sinh ngọn [2; 5] Nhân nhanh giống lan Dendrobium Aduncum bằng công nghệ in vitro. .. đúng phương pháp khử trùng sẽ đưa lại tỷ lệ sống cao và môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt tốc độ sinh trưởng nhanh [2] Nhân nhanh giống lan Dendrobium Aduncum bằng công nghệ in vitro Đồ án tốt nghiệp 18 1.5.3.3 Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi Quá trình nhân giống in vitro là quá trình tạo ra hệ số nhân chồi cao nhất Để tăng hệ số nhân giống thì thành phần môi trường và các điều kiện nuôi cấy phải được... đỉnh chồi từ 0.5 mm - 2 mm thì thông dụng hơn và thích hợp trong việc nhân giống (Hartmann & Kester, 1983) Thường nuôi cấy đỉnh chồi trong môi trường có chứa auxin kết hợp với cytokinin, nồng độ cytokinin sẽ tăng lên trong những lần cấy chuyền [2] Nhân nhanh giống lan Dendrobium Aduncum bằng công nghệ in vitro Đồ án tốt nghiệp 17  Nhân giống bằng chồi bất định Chồi bất định là một cấu trúc thân và lá... sống bám trên cây hoặc trên giá thể trồng Vì vậy, việc nghiên cứu giá thể trồng thích hợp cho loại lan này là điều hết sức quan Nhân nhanh giống lan Dendrobium Aduncum bằng công nghệ in vitro Đồ án tốt nghiệp 13 trọng Năm 2007, nhóm tác giả tại TP Hồ Chí Minh do Huỳnh Thanh Hùng chủ trì đã nghiên cứu và đưa ra một loại giá thể trồng phù hợp với lan Dendrobium Tác giả nhận thấy trồng trên giá thể phối