CÁC PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH TRONG CHUẨN đoán VI SINH

Kháng huyết thanh có thể chứa nồng độ kháng thể cao kết hợp với kháng nguyên nhưng không gây ra ngưng kết; những kháng thể này được gọi là các kháng thể không hoàn toàn incomplete antibo

CÁC PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH TRONG CHUẨN ĐOÁN

VI SINH

I KHÁI NIỆM :

1 Miễn dịch là gì ?

Miễn dịch (MD) là trạng thái bảo vệ đặt biệt của cơ thể chống lại các yếu tố gây bệnh (các vi sinh vật, độc tố của vi sinh vật, các phân tử lạ…) khi chúng xâm nhập vào cơ thể

II CÁC PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH TRONG CHUẨN ĐOÁN VI SINH :

CÁC PHẢN ỨNG NGƯNG KẾT (AGGLUTINATION REACTIONS)

a) Khái niệm:

Ngưng kết: Tương tác giữa kháng thể và một kháng nguyên dạng hạt (particulate

antigen) tạo thành cục Các kháng thể tạo ra các phản ứng đó gọi là các ngưng kết tố

Các phản ứng ngưng kết có nguyên tắc tương tự các phản ứng kết tủa, chúng dựa vào liên kết chéo của các kháng nguyên đa hóa trị

Giống như sự dư thừa kháng thể kìm hãm các phản ứng kết tủa, sự dư thừa này cũng

có thể kìm hãm các phản ứng ngưng kết; sự kìm hãm này được gọi là hiệu ứng tiền vùng (prozone effect)

Hiệu ứng tiền vùng có thể được gặp trong rất nhiều thử nghiệm miễn dịch Một vài cơ chế có thể tạo nên hiệu ứng tiền vùng Đầu tiên, các nồng độ kháng thể cao, số vị trí bắt cặp của kháng thể có thể vượt quá giới hạn số lượng các epitop nhiều Dẫn đến hầu hết các kháng thể chỉ bắt cặp với kháng nguyên đơn hóa trị thay vì đa hóa trị Các kháng thể kết hợp đơn hóa trị không thể liên kết chéo kháng nguyên này với kháng nguyên khác Hiệu ứng tiền vùng dễ dàng chẩn đoán bằng việc thực hiện thử nghiệm

ở nhiều nồng độ kháng nguyên (kháng thể) khác nhau Khi pha loãng đến một nồng

độ kháng thể tối ưu sẽ thấy mức độ ngưng kết cao hơn Khi sử dụng kháng thể đơn dòng hiện tượng tiền vùng cũng có thể xảy ra vì một số lý do Kháng huyết thanh có thể chứa nồng độ kháng thể cao kết hợp với kháng nguyên nhưng không gây ra ngưng kết; những kháng thể này được gọi là các kháng thể không hoàn toàn (incomplete antibodies) thường là lớp IgG Ở nồng độ cao của IgG, kháng thể không hoàn toàn có thể chiếm giữ hầu hết các vị trí kháng nguyên Hiện tượng này không thấy với sự ngưng kết của kháng thể đơn dòng Sự thiếu hụt hoạt tính ngưng kết của một kháng thể không hoàn toàn có thể là do tính linh hoạt của vùng bản lề (hinge region) bị giới hạn, làm khó khăn cho kháng thể chiếm lấy góc cần thiết cho liên kết chéo tối ưu của epitop trên hai hay nhiều kháng thể dạng hạt Như một lựa chọn, mật độ phân bố của epitop hay vị trí của một vài epitop trong túi sâu của một kháng thể dạng hạt có thể

gây khó khăn cho các kháng thể đặc hiệu cho những epitop này để ngưng kết các kháng nguyên dạng hạt Có thể giải quyết cả hai vấn đề này bắng cách thử các kháng thể khác nhau, chúng có thể phản ứng với các epitop của kháng nguyên mà không xuất hiện những giới hạn này

b) Phân loại:

 Phản ứng kết tủa - Ngưng kết hồng cầu trong việc xác định kiểu máu

(Hemagglutination Is Used in Blood Typing)

Ngưng kết vi khuẩn được dùng đẻ chẩn đoán sự nhiễm trùng (Bacterial Agglutination Is Used To Diagnose Infection)

 Ngưng kết thụ động thì hữu ích với các kháng nguyên hòa tan (Passive

Agglutination Is Useful with Soluble Antigens)

 Phản ứng kết hợp bổ thể

1 Phản ứng kết tủa:

a Khái niệm:

Khi cho kháng thể đặc hiệu phản ứng với kháng nguyên hòa tan ở liều lượng chuẩn sẽ

xuất hiện kết tủa có liều lượng chuẩn sẽ nhìn thấy bằng mắt thường Phản ứng này được dùng phổ biến để phát hiện kháng nguyên khi đã có sẵn kháng thể đặc hiệu hoặc hoặc để phát hiện kháng thể khi có sẵn kháng nguyên hòa tan đặc hiệu

b Phân loại – ứng dụng:

• Ngưng kết (phản ứng kết tủa ) hồng cầu trong việc xác định kiểu máu ( Hemagglutination Is Used in Blood Typing ).

Các phản ứng ngưng kết thường được thực hiện để định loại các tế bào hồng cầu (red blood cells - RBCs) (hình 3.6)

Trong việc định kiểu các kháng nguyên ABO, RBCs được trộn trên một phiến kính với kháng huyết thanh với kháng nguyên nhóm máu A hay B Nếu kháng nguyên hiện diện trong các tế bào, chúng ngưng kết tạo thành dạng cục có thể nhìn thấy được trên phiến kính Việc xác định kháng nguyên hiện diện trong RBCs của người cho và người nhận là nền tảng cho việc lựa chọn nhóm máu thích hợp trong truyền máu

Hình 3.6 Ngưng kết hồng cầu dùng các kháng thể kháng các tế bào hồng cầu cừu (SRBCs) Ống đối chứng (10) chỉ chứa SRBCs đọng lại thành cục Các ống thí nghiệm 1-9 chứa lượng SRBCs không đổi cộng với dãy huyết thanh kháng SRBCs pha loãng hai lần Ống 3 có phản ứng ngưng kết hồng cầu dương tính

[Louisiana State University Medical Center/MIP Courtesy of Harriet C W Thompson.].

• Ngưng kết vi khuẩn được dùng để chuẩn đoán sự nhiễm trùng ( Bacterial Agglutination Is Used To Diagnose Infection)

Sự nhiễm khuẩn thường kích thích việc sản xuất huyết thanh chứa kháng thể đặc hiệu cho kháng nguyên bề mặt trên các tế bào vi khuẩn Sự hiện diện của các kháng thể này

có thể được phát hiện bởi các phản ứng ngưng kết vi khuẩn Huyết thanh từ bệnh nhân nghi ngờ nhiễm khuẩn với vi khuẩn được pha loãng thành một dãy các ống nghiệm sau đó vi khuẩn được thêm vào Ống nghiệm cuối cùng cho thấy sự ngưng kết có thể nhận thấy sẽ phản ánh hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của bệnh nhân Hiệu giá ngưng kết được định nghĩa là nghịch đảo của độ pha loãng huyết thanh cao nhất gây

ra phản ứng ngưng kết dương tính Ví dụ, nếu dãy mẫu được pha loãng hai lần và nếu

độ pha loãng 1/640 thấy có ngưng kết nhưng độ pha loãng 1/1208 thì không, khi đó hiệu giá ngưng kết huyết thanh của bệnh nhân là 640 Trong một số trường hợp huyết thanh có thể pha loãng tới 1/50.000 mà vẫn thấy sự ngưng kết vi khuẩn

Hiệu giá ngưng kết của một kháng nguyên có thể được dùng để chẩn đoán sự nhiễm khuẩn Bệnh nhân bệnh thương hàn là một ví dụ, cho thấy sự tăng đáng kể hiệu giá

ngưng kết với Salmonella typhi Các phản ứng nhưng kết cũng cung cấp cách để phân loại vi khuẩn Ví dụ, các loài vi khuẩn Salmonellakhác nhau có thể được phân biệt

bằng các phản ứng ngưng kết với một rãnh các loại kháng huyết thanh

2 Ngưng kết thụ động:

a Khái niệm:

Nhưng kết thụ động còn gọi là phản ưng ngưng kết Phản ứng này cần kháng nguyên

hữu hình Đó là những kháng nguyên có kích thước lớn như hồng cầu và tế bào vi sinh vật

b Phân loại - ứng dụng:

• Ngưng kết thụ động thì hữu ích với các kháng nguyên hòa tan (Passive Agglutination Is Useful with Soluble Antigens)

Sự nhạy và đơn giản của các phản ứng ngưng kết có thể được mở rộng với các kháng nguyên hòa tan bởi kỹ thuật ngưng kết hồng cầu thụ động Trong kỹ thuật này các tế bào hồng cầu được gắn kháng nguyên bằng cách trộn kháng nguyên hòa tan với các tế bào hồng cầu đã được xử lý với tannic acid hoặc chromium chloride, cả hai đều gia tăng khả năng hấp thụ của kháng nguyên với bề mặt tế bào Huyết thanh chứa kháng thể được pha loãng thành một dãy trong các giếng trên đĩa, và sau đó các tế bào hồng cầu đã được gắn kháng nguyên được thêm vào từng giếng; ngưng kết được đánh giá bởi kích thước của các tế bào hồng cầu được ngưng kết ở đáy giếng giống như các kiểu trong các phản ứng ngưng kết (hình 3.6)

Những năm gần đây, các tế bào hồng cầu đã được thay thế bằng các hạt tổng hợp như

là hạt nhựa, là giá thể cho phản ứng ngưng kết Khi mà các kháng nguyên được bắt

cặp vào các hạt nhựa thì các hạt này có thể đem sử dụng ngay hoặc đem bảo quản để dùng sau Việc sử dụng các hạt tổng hợp mang lại nhiều lợi ích như ổn định, đồng nhất và bền Hơn nữa các phản ứng ngưng kết thực hiện trên các hạt tổng hợp có thể được đọc nhanh hơn, thường trong 3 đến 5 phút của hỗn hợp các hạt với mẫu thử Dù trên các tế bào hồng cầu hay các hạt tổng hợp đa năng và tiện lợi thì các phản ứng ngưng kết vẫn dễ thực hiện, không đòi hỏi thiết bị đắt tiền và có thể phát hiện lượng nhỏ kháng thể (nồng độ ng/l)

3 Phản ứng kết hợp bổ thể:

a Nguyên lý:

Kháng thể đặc hiệu với sự tham gia của bổ thể sẽ gây ly giải tế bào vi khuẩn hoặc một số tế bào động vật khác

b Các giai đoạn tiến hành phản ứng kết hợp bổ thể:

Gồm hai hệ thống:

• Kháng thể - kháng nguyên – bổ thể

• Hồng cầu cừu, huyết thanh kháng hồng cầu cừu đã đun nóng để phá vỡ bổ thể

Hệ thống 1: kháng thể - kháng nguyên – bổ thể Nếu kháng nguyên đặc hiệu với kháng thể thì sẽ kết hợp được vs bổ thể, nên bổ thể có ở dạng tự do Do phản ứng không nhìn thấy được nên phải làm hệ thống 2 làm chỉ thị

Hệ thông 2: bao gồm hồng cầu cừu, huyết thanh kháng hồng cầu cừu đang đun nóng

để phá vỡ bổ thể

c Cơ chế:

 Nếu ở hệ thống 1 kháng nguyên đặc hiệu với kháng thể thì sẽ không kết hợp với bổ thể ở trạng thái tự do.khi thêm hệ thống 2 vào phần phản ứng, hồng cầu cừu không bị tan: phản ứng dương tính

 Ngược lại nếu ở phản ứng xét nghiệm ( hệ thống 1 ) kháng nguyên không đặc hiệu với kháng thể sẽ không kết hợp với bổ thể Khi thêm hệ thống 2, bổ thể tự

do sẽ kết hợp với hệ thống 2 làm tan hồng cầu cừu: phan ứng âm tính

Kháng thể chống vi sinh vật (và độc tố của chúng) trung hòa tác dụng gây hại của những tác nhân này; đồng thời hoạt hóa chúng đề đại thực bào ăn cũng như để bị tiêu diệt bởi phản ứng ADCC; kháng thể còn hoạt hóa bổ thể Các chức năng hiệu quả này

có thể được trung gian bởi những isotyp kháng thể khác nhau.

Web: http://elearning.lrc-hueuni.edu.vn/coe/mod/resource/view.php?id=1477

CÁC PHẢN ỨNG TRUNG HÒA

1.Khái niệm :

Phản ứng trung hòa: xảy ra khi kết tủa bao vây, trung hòa ngoại độc tố vi khuẩn hoặc bao vây virus

Ví dụ: kết tủa bao quanh virut và ngưng kết virut

2 Nguyên lý:

Kháng thể đặc hiệu có khả năng trung hoà độc tố của vi sinh vật làm mất đi một tính chất nào đó của vi sinh vật hoặc sản phẩm của nó

3.Phân loại :

a) Phản ứng trung hòa độc tố:

Khi tiêm vào cơ thể động vật với một liều lượng lớn độc tố được hỗn hợp với một lượng thích nghi kháng độc tố thích hợp thì con vật không bị nguy hiểm Tính độc của độc tố đã bị kháng độc tố trung hòa Phản ứng này rất đặc hiệu (một độc tố chỉ trung hòa với một kháng độc tố tương ứng Lượng kháng độc tố cần thiết để trung hòa một lượng độc tố phụ thuộc vào cách thức hỗn hợp 2 cấu trúc với nhau vì tùy theo điều kiện thí nghiệm độc tố có khả năng kết hợp với kháng độc tố ở những tỷ lệ khác nhau Thay vì cho một lượng độc tố đã biết vào một lượng kháng độc tố để trung hòa, người

ta cho lượng độc tố hai lần vào lượng kháng độc tố thì hỗn hợp không trung hòa đối với động vật thí nghiệm Đó là hiện tượng Danysz Nếu cho nửa lượng độc tố vào kháng độc tố thì độc tố kết hợp với nhiều kháng độc tố hơn và do đó số lượng phân tử kháng độc tố tự do còn lại ít không đủ để trung hòa lượng độc tố còn lại

b) Phản ứng trung hòa virus:

Hiện tượng tế bào bệnh lý xuất hiện khi các loài virus phát triển ở nuôi cấy tế bào phá hủy tế bào Đề hiện tượng tế bào bệnh lý không xảy ra ta cho kháng thể virus vào đồng thời với virus thì virus bị trung hòa không nhân lên được

Phản ứng này được sử dụng để xác định hàm lượng kháng thể trong huyết thanh cũng như định kiểu virus.Mặt khác cũng có thể định lượng kháng thể của virus ở trong huyết thanh bằng cách hỗn hợp kháng huyết thanh với virus rồi tiêm hỗn hợp vào một nhóm động vật nhạy cảm Nếu động vật thử nghiệm không cho thấy triệu chứng bệnh thì sự hiện diện của kháng thể trung hòa đã được chứng minh

c)Phản ứng trung hòa enzyme:

Nhiều enzyme của vi khuẩn có tính chất sinh kháng tốt và kích thích sự tạo thành kháng thể như streptolysin O, streptokinase của liên cầu khích động sự tạo thành kháng streptolysin O (antistreptolysin O - ASO), kháng streptokinase (anti streptokinase - ASK) Ta có thể định lượng kháng streptolysin O (ASO), kháng streptokinase (ASK) có trong huyết thanh của bệnh nhân để chẩn đoán nhiễm liên cầu dựa trên nguyên tắc phản ứng trung hòa.Đặc biệt phản ứng ASO phát hiện kháng thể kháng streptolysin O được sử dụng trong chẩn đoán bệnh thấp tim và viêm cầu thận cấp sau nhiễm liên cầu nhóm A

PHẢN ỨNG ELISA

I.PHẢN ỨNG ELISA :

1.Khái miệm :

ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm

Nguyên tắc của kĩ thuật ELISA giống như kĩ thuật MD huỳnh quang, nhưng khác ở chỗ thay vì gắn kháng thể với thuốc nhuộm huỳnh quang thì người ta gắn kháng thể với một enzyme Khi cho thêm cơ chất thích hợp vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân

cơ chất thành một chất có màu Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu kháng thể với kháng nguyên, và thong qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên cần phát hiện

Hiện nay ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y

học,nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lượng các sản phẩm sinh học

2.Nguyên lý :

Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể và gồm các bước cơ bản như sau:

(1) Kháng nguyên - antigen (KN) chưa biết được gắn trên một bề mặt;

(2) Kháng thể - antibody (KT) biết trước được "rửa" qua bề mặt đó Kháng thể này được gắn kết với enzyme;

(3) Thêm vào một cơ chất (substance); enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu

có thể xác định được

Đối với các ELISA phát quang, ánh sáng sẽ được phát ra từ mẫu chứa KN-KT Sự hiện diện của phức hợp KN-KT sẽ quyết định cường độ sáng phát ra

Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định sự có mặt hay không có mặt cũng như lượng

KN trong mẫu nghiên cứu

http://vi.wikipedia.org/wiki/ELISA

II.PHÂN LOẠI PHẢN ỨNG ELISA :

1 ELISA trực tiếp (Direct ELISA ) :

Đây là dạng đơn giản nhất của phương pháp ELISA Trong đó, kháng nguyên cần

phát hiện sẽ được gắn trực tiếp lên bề mặt giá thể và sẽ được phát hiện bằng một kháng thể duy nhất (kháng thể này đã được gắn enzyme)

- Ưu điểm: Đơn giản nhất

- Nhược điểm:

+ Độ đặc hiệu bị giới hạn vì thường thì kháng nguyên có ít nhất là 2 epitope (trình diện kháng nguyên) mà phương pháp này chỉ sử dụng 1 kháng thể gắn vào một epitope

+ Phải đánh dấu cho từng kháng thể chuyên biệt với từng đối tượng

2 ELISA gián tiếp (Indirect ELISA):

Phương pháp này khác Direct ELISA ở chỗ kháng thể bắt kháng nguyên không được gắn enzyme mà nó là mục tiêu gắn đặc hiệu của một kháng thể khác (kháng thể này mới là kháng thể được gắn với enzyme)

- Ưu điểm: Kháng thể gắn enzyme có thể sử dụng để đánh dấu cho nhiều loại kháng nguyên nên tiện lợi và kinh tế hơn, dễ dàng thương mại hóa

- Nhược điểm: Độ đặc hiệu của từng kháng huyết thanh là khác nhau Điều này dẫn đến kết quả khác nhau giữa các thí nghiệm và do đó cần phải thử nghiệm với nhiều kháng huyết thanh khác nhau để kết quả có thể tin tưởng được

III CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KẾT QUẢ ELISA :

- Nếu các đối chứng âm cho kết quả dương tính thì có thể do sự nhiễm từ chất tạo màu hoặc từ kháng thể được đánh dấu hoặc chính các đối chứng bị nhiễm

- Nếu màu không xuất hiện đối với đối chứng dương hoặc đối với mẫu thì phải kiểm tra lại tất cả hoá chất bao gồm: hạn sử dụng, nồng độ, điều kiện bảo quản

-Nếu màu xuất hiện quá thấp đối với đối chứng dương và cả mẫu kiểm tra thì phải kiểm tra lại kháng thể được gắn enzyme và nồng độ của chất tạo màu

-Nếu có tạo màu đối với mẫu nhưng không tạo màu với đối chứng dương thì có thể kiểm tra lại nguồn gốc đối chứng, hạn sử dụng và điều kiện bảo quản

-Khi chạy lại một thử nghiệm trong điều kiện đang gặp sự cố thì chỉ nên thay đổi một yếu tố thí nghiệm

IV.ỨNG DỤNG :

1.Trong thực phẩm :

Phương pháp elisa được sử dụng để đánh giá dư lượng kháng sinh trong thủy sản.

Bảng 1 Yêu cầu của các thị trường về giới hạn phát hiện của

phương pháp phân tích một số kháng sinh cấm

TT Kháng sinh cấm Chỉ tiêu kiểm tra Giới hạn phát hiện tối thiểu

1 Chloramphenicol Chloramphenicol (CAP) 0.3 ppb 0.3 ppb 0.5 ppb

2 Malachite

green/Leucomalachite

green

Malachite green / Leucomalachite green (MG/LMG)

2.0 ppb 2.0 ppb 2.0 ppb

3 Furazolidone 3-amino-2-oxazolidone

4 Furaltadone

5-methylamorfolino-3-amino-2-oxazolidone (AMOZ)

1.0 ppb 1.0 ppb 1.0 ppb

5 Nitrofurantoin 1-aminohydantoin (AHD) 1.0 ppb 1.0 ppb 1.0 ppb

6 Nitrofurazone Semicarbazide (SEM) 1.0 ppb 1.0 ppb 1.0 ppb

2 Trong nông nghiệp :

- Phân tích tồn dư quinolone (là một trong những nhóm kháng sinh tổng hợp hóa

học có khả năng khuếch tán tốt trong mô bào, nhanh chóng tiêu diệt vi khuẩn

thông qua ức chế AND.Tuy nhiên nó tác động xấu đến môi trường và sức khỏe

con người) trong tôm

- Xác định một số virus gây bệnh trên cây trồng

3 Trong y tế :

- Nghiên cứu sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp cho ELISA-IgM và ELISA-IgG

để chuẩn đoán bệnh sởi

- Phân tích quan hệ phả hệ,vai trò truyền bệnh của các thành viên trong phức hợp

Anophenes minimus và Anophenes dirus bằng các chỉ thị di truyền (phân tích

mối quan hệ di truyền,các quan hệ phả hệ giữa các quần thể trong loài và giữa

các thành viên trong phức hợp loài An.mininus và An.dirus; xác định vai trò

truyền bệnh sốt rét của từng thành viên trong hai phức hợp loài An.mininus và

An.dirus bằng kĩ thuật ELISA.)

- Sự phát hiện ra kháng nguyên Úc châu bởi Blumberg và nhận dạng như là

kháng nguyên bề mặt của virus B (HBsAg) tượng trưng một ý nghĩa quan trọng

xuyên phá để hiểu biết về bệnh viêm gan và viêm gan huyết thanh Người ta

biết rằng việc sàng lọc kiểm tra hiện diện của kháng nguyên này trong máu của