Kỹ thuật phân tích tinh dầu

Giới thiệu ........................................................................................................ 3 2. Kỹ thuật phân tích cổ điển............................................................................ 4 3. Các kỹ thuật phân tích hiện đại ................................................................. 11 3.1 Sử dụng chỉ số độ bền tuyến tính của Sắc ký khí trong phân tích dầu....... 11 3.2 Sắc ký khí khối phổ ................................................................................... 12 3.3 Phương pháp phân tích sắc kí khí nhanh (fast GC) trong phân tích tinh dầu .......................................................................................................................... 12 3.4 Phương pháp Gas chromatographyOlfactometry (GCO) cho việc đánh giá các hợp chất hoạt động tạo mùi của tinh dầu.................................................... 15 3.5 Phương pháp sắc kí khí xác định các tinh dầu có tính chất đồng phân quang học..................................................................................................................... 19 3.6 Sắc kí lỏng và sắc kí lỏng ghép khối phổ (LC và LCMS) trong phân tích tinh dầu ............................................................................................................. 22 3.7 Sắc kí khí đa chiều (MDGC) ...................................................................... 23 3.8 Sắc ký lỏng hiệu năng cao .......................................................................... 29 4. Những lưu ý chung trong phân tích tinh dầu ............ Các sản phẩm tinh dầu được công nghiệp hóa lần đầu tiên vào nửa đầu thế kỷ XIX, do nhu cầu tăng lên đối với các loại thành phần mùi và chất thơm. Thành phẩn chủ yếu trong tinh dầu là mono, sesquiterpene và dẫn xuất oxy của nó, cùng với axit béo, rượu, ester. Terpene được coi là có cấu trúc đa dạng nhất của các sản phẩm tự nhiên, có nguồn gốc từ sự hợp nhất lặp lại của nhánh 5C( isoprene). Trong trường hợp này, phương pháp phân tích áp dụng cho tinh dầu có đặc tính chứa 1 lượng lớn phân tử. Cấu trúc hóa học của tinh dầu có liên quan chặt chẽ đến các phương pháp chiết xuất và sử dụng, do đó việc lựa chọn 1 phương pháp chiết xuất phù hợp trở nên quan trọng. Trên cơ sở các đặc tính của thực vật, các kỹ thuật tách chiết sau có thể áp dụng: chưng cất hơi nước ( SD), chưng cất phân đoạn, trích ly bằng dung môi (SE), phân đoạn của dung môi chiết, ngâm, ép, enfleurage( pp tách hương liệu của hoa), trích ly bằng chất lỏng siêu tới hạn( SFE), kỹ thuật Soxhlet, kỹ thuật hỗ trợ loại nước bằng vi sóng ( MAHD), kỹ thuật headspace tĩnh và động ( DHS,SHS), kỹ thuật bay hơi bằng dung môi( SAFE), kỹ thuật siêu trích ly pha rắn( SPME), kỹ thuật giả hấp thu nhiệt trực tiếp( DTD)….. Ngoài sự quan tâm lớn trong việc thực hiện các nghiên cứu có hệ thống về các loại tinh dầu, thì cần phải theo dõi về vấn đề làm giả tinh dầu, chủ yếu là các loại dầu quan trọng về kinh tế. Như quan sát, hầu hết các thay đổi thị trường về sản phẩm thương mại có sẵn xảy ra nhanh chóng, ảnh hưởng đến cây trồng hoặc quy trình công nghiệp. Nhìn chung, cạnh tranh thị trường cũng làm hạn chế sự quan tâm của người tiêu dung về chất lượng dầu, có thể khiến các nhà sản xuất là

Tiểu luận: Phương pháp phân tích tinh dầu TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI ViỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ****** TIỂU LUẬN Học phần: Công nghệ chất thơm Đề tài: Các phương pháp phân tích tinh dầu Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Hoàng Yến – 20123716 Vũ Thị Hồng Vân - 20123716 Hà Văn Thênh - 20149596 Công nghệ chất thơm Page Tiểu luận: Phương pháp phân tích tinh dầu MỤC LỤC Giới thiệu Kỹ thuật phân tích cổ điển Các kỹ thuật phân tích đại 11 3.1 Sử dụng số độ bền tuyến tính Sắc ký khí phân tích dầu 11 3.2 Sắc ký khí- khối phổ 12 3.3 Phương pháp phân tích sắc kí khí nhanh (fast GC) phân tích tinh dầu 12 3.4 Phương pháp Gas chromatography-Olfactometry (GC-O) cho việc đánh giá hợp chất hoạt động tạo mùi tinh dầu 15 3.5 Phương pháp sắc kí khí xác định tinh dầu có tính chất đồng phân quang học 19 3.6 Sắc kí lỏng sắc kí lỏng ghép khối phổ (LC LC-MS) phân tích tinh dầu 22 3.7 Sắc kí khí đa chiều (MDGC) 23 3.8 Sắc ký lỏng hiệu cao 29 Những lưu ý chung phân tích tinh dầu 30 Công nghệ chất thơm Page Tiểu luận: Phương pháp phân tích tinh dầu Giới thiệu Các sản phẩm tinh dầu công nghiệp hóa lần vào nửa đầu kỷ XIX, nhu cầu tăng lên loại thành phần mùi chất thơm Thành phẩn chủ yếu tinh dầu mono, sesquiterpene dẫn xuất oxy nó, với axit béo, rượu, ester Terpene coi có cấu trúc đa dạng sản phẩm tự nhiên, có nguồn gốc từ hợp lặp lại nhánh 5C( isoprene) Trong trường hợp này, phương pháp phân tích áp dụng cho tinh dầu có đặc tính chứa lượng lớn phân tử Cấu trúc hóa học tinh dầu có liên quan chặt chẽ đến phương pháp chiết xuất sử dụng, việc lựa chọn phương pháp chiết xuất phù hợp trở nên quan trọng Trên sở đặc tính thực vật, kỹ thuật tách chiết sau áp dụng: chưng cất nước ( SD), chưng cất phân đoạn, trích ly dung môi (SE), phân đoạn dung môi chiết, ngâm, ép, enfleurage( pp tách hương liệu hoa), trích ly chất lỏng siêu tới hạn( SFE), kỹ thuật Soxhlet, kỹ thuật hỗ trợ loại nước vi sóng ( MAHD), kỹ thuật headspace tĩnh động ( DHS,SHS), kỹ thuật bay dung môi( SAFE), kỹ thuật siêu trích ly pha rắn( SPME), kỹ thuật giả hấp thu nhiệt trực tiếp( DTD)… Ngoài quan tâm lớn việc thực nghiên cứu có hệ thống loại tinh dầu, cần phải theo dõi vấn đề làm giả tinh dầu, chủ yếu loại dầu quan trọng kinh tế Như quan sát, hầu hết thay đổi thị trường sản phẩm thương mại có sẵn xảy nhanh chóng, ảnh hưởng đến trồng quy trình công nghiệp Nhìn chung, cạnh tranh thị trường làm hạn chế quan tâm người tiêu dung chất lượng dầu, khiến nhà sản xuất làm giả mặt hàng họ việc bổ sung thành phần có giá trị thấp Các loại làm giả gặp: thêm thành phần đơn giản tự nhiên tổng hợp với mục đích Công nghệ chất thơm Page Tiểu luận: Phương pháp phân tích tinh dầu tạo loại dầu đặc trưng giá trị cụ thể nồng độ, góc quay cực, tỉ lệ dư lượng, ester Trong trường hợp sau: thành phần thiên nhiên tổng hợp thêm vào để nâng cao giá trị dầu, cố gắng trì chất lượng, chí định lượng, thành phần dầu tự nhiên vấn đề phát làm giả nhiệm vụ khó khăn Do đó, việc khai thác phương pháp phân tích đại sắc ký khí ( GC) kỹ thuật có liên quan cần thiết Thêm vào đó, quy định tiêu chuẩn quốc tế chất lượng tinh dầu ban hành Nó giới thiệu đặc tính cụ thể tinh dầu, yêu cầu hóa lý nguồn thực vật học Các thông tin chuẩn tạo để thuận lợi cho việc đánh giá chất lượng; ví dụ ISO 3761 ( 1997) quy định hàm lượng tinh dầu gỗ cẩm lai Brazin, nồng độ cồn khoảng 84-93%, xác định linalool, yêu cầu Hơn nữa, hướng dẫn phân tích tinh dầu tồn tại, ví dụ đo số khúc xạ ( ISO 280,1198)và góc quay cực ( ISO 592, 1998), phân tích sắc ký khí sử dụng cột mao quản[ISO GC(ISO8432,1987)] Các hiệp hội tiêu chuẩn Pháp ( AFNOR) phát triển tiêu phương pháp tiêu chuẩn dành riêng cho lĩnh vực nghiên cứu tinh dầu, với mục đích đánh giá chất lượng liên quan đến tính chất vật lý, cảm quan, hóa học, sắc ký Chương cung cấp nhìn tổng quan kỹ thuật phân tích đại truyền thống thường áp dụng riêng cho tinh dầu Kỹ thuật đại tập trung vào kỹ thuật sắc ký bao gồm khía cạnh lý thuyết lẫn ứng dụng Kỹ thuật phân tích cổ điển Các nghiên cứu tinh dầu dựa mối liên quan tính chất vật lý tính chất hóa học chúng, thường hoàn thành việc đánh giá chất lượng cảm quan Các phương pháp phân tích áp dụng việc điều tra tinh dầu thường tập trung vào khía cạnh Công nghệ chất thơm Page Tiểu luận: Phương pháp phân tích tinh dầu chất lượng, liên quan chủ yếu tính chất, cụ thể chất độ tinh khiết Các kỹ thuật sau áp dụng phổ biến để đánh giá tính chất vật lý tinh dầu: trọng lượng riêng (SG) đặc trưng cho tính chất hóa lý định nghĩa tỉ số mật độ loại dầu định nước điều kiện nhiệt độ xác định Các giá trị đạt đặc trưng cho tinh dầu thường dao động khoảng 0,696 1,18 15oC Trong trường hợp mà chuẩn hóa liệu thực nhiệt độ khác, yếu tố chuyển đổi sử dụng để chuẩn hóa liệu Việc đo góc quay cực, quay phải quay trái, công nhận rộng rãi Hoạt động quang học xác định cách sử dụng phân cực, với góc quay phụ thuộc loạt thông số, chẳng hạn chất dầu, chiều dài cột mà qua ánh sáng đi, bước sóng áp dụng, nhiệt độ Mức độ hướng quay quan trọng để đánh giá độ tinh khiết, họ có liên quan đến cấu trúc nồng độ phân tử bất đối mẫu Mỗi hoạt chất quang học có góc quay cụ thể riêng mình, định nghĩa luật Biot : [𝛼]𝑇𝜆 = 𝛼 𝜆𝑇 𝑐.𝑙′ Trong đó: α: góc quay cực T: nhiệt độ L: chiều dài quãng đường (dm) λ: bước sóng C: nồng độ (g/100ml) Công nghệ chất thơm Page Tiểu luận: Phương pháp phân tích tinh dầu Một ống tiêu chuẩn 100 mm sử dụng trường hợp dầu màu tối nhẹ dầu phân tích, dài ngắn ống sử dụng tương ứng, góc quay nên ngoại suy cho ống l00 mm dài Hơn nữa, trước đo, tinh dầu nên làm khô với Na2SO4 khan lọc Việc xác định số khúc xạ đại diện cho số vật lý đặc trưng loại dầu, thường từ 1,450 đến 1,590 Chỉ số thể tỷ số sine góc tới với sine góc khúc xạ (e) chùm ánh sáng từ môi trường dày đặc vào môi trường dày đặc hơn, chẳng hạn từ không khí với tinh dầu sin 𝑖 𝑁 = sin 𝑒 𝑛 N, n số tương ứng môi trường Các loại khúc xạ kế yêu cầu với nguồn đơn sắc Na, khuyến khích để phân tích tinh dầu thường xuyên, dụng cụ hiệu chỉnh thông qua phân tích nước cất 20oC với số khúc xạ 1,333 Trong trường hợp phép đo thực khác 20oC, ta phải hiệu chỉnh thêm bớt tương ứng Một quy trình áp dụng để đánh giá độ tinh khiết tinh dầu dựa độ tan nước, kiểm tra, cho thấy diện chất phân cực rượu, glycols, este chúng, glycerin acelates, thực sau: dầu thêm vào dung dịch bão hòa NaCl, sau đồng chia thành hai pha, khối lượng dầu nên không thay đổi: giảm thể tích diện dầu hữu cơ, mặt khác, độ hòa tan, không trộn lẫn được, tinh dầu nước chất hòa tan chất lượng Xét tinh dầu tan nước ethanol cho thấy nhiều xác định số lượng ethanol nước pha loãng trộn với ethanol, theo yêu cầu độ tan nước hoàn Công nghệ chất thơm Page Tiểu luận: Phương pháp phân tích tinh dầu toàn khối lượng dầu phân tích thực 20oC, dầu chất lỏng nhiệt độ Các loại dầu giàu hợp chất dễ dàng tan ethanol loãng so với hydrocacbon Việc ước tính nóng chảy khả đông tụ điểm, phạm vi sôi loại tinh dầu, quan trọng để đánh giá sắc độ tinh khiết Đánh giá điểm nóng chảy để kiểm soát độ tinh khiết tinh dầu số lượng lớn phân tử thường bao gồm loại tinh dầu tan chảy phạm vi 0,5 ° C hoặc, trường hợp phân hủy, phạm vi nhiệt độ hẹp Mặt khác, việc xác định điểm đông tụ thường áp dụng trường hợp tinh dầu chủ yếu gồm phân tử, chẳng hạn dầu đinh hương có chứa khoảng 90% eugenol Trong trường hợp sau, xét nghiệm cho phép việc đánh giá số lượng tỷ lệ phần trăm hợp chất dồi Tại thời điểm đông tụ, kết tinh xảy kèm theo giải phóng nhiệt, dẫn đến gia tăng nhanh chóng nhiệt độ mà sau ổn định gọi khả đông tụ Một phương pháp đánh giá độ tinh khiết đại diện khoảng sôi qua tỷ lệ dầu chưng cất nhiệt độ định phạm vi nhiệt độ điều tra Một kiểm tra bổ sung thường thực phân tích thiết yếu dư lượng bốc hơi, tỷ lệ dầu không giải phóng 100 ° C xác định Các phương pháp cổ điển áp dụng rộng rãi để đánh giá tính chất hóa học tinh dầu, chẳng hạn việc xác định diện hydrocarbon halogen hóa kim loại nặng Sự diện hợp chất halogen thường thêm vào loại dầu cho mục đích làm giả Trong thực tế, dây đồng làm ổ ghi lửa Bunsen để tạo thành lớp phủ oxit đồng Sau nhúng mẫu thử nghiệm lần làm nóng lửa Một xét nghiệm dương Công nghệ chất thơm Page Tiểu luận: Phương pháp phân tích tinh dầu tính định màu xanh gây hình thành halogen đồng Một thay cho phương pháp Beilstein thử nghiệm natri phản ứng tổng hợp, dầu khoáng đầu tiên, trường hợp hydrocarbon halogen hóa, có mặt, dư lượng natri halogen hình thành, hòa tan axit nitric, kết tủa bạc tương ứng halogen cách cho thêm lượng nhỏ dung dịch nitrat bạc Liên quan đến việc phát kim loại nặng có, số xét nghiệm mô tả để điều tra đảm bảo đặc biệt đồng chì Một phương pháp dựa việc khai thác tinh dầu với dung dịch axit hydrochloric pha loãng, sau hình thành pha nước để có dung dịch đệm thioacetamide thêm vào Các thuốc thử sau dẫn đến hình thành ion sulfite sử dụng việc phát kim loại nặng Việc xác định este có nguồn gốc từ axit phthalic mối quan tâm lớn việc đánh giá độc tính tinh dầu Xét este thường chứa loại tinh dầu có nguồn gốc từ axit Ban đầu, xà phòng hóa thực thông qua việc bổ sung dung dịch kali hydroxit ethanol Việc hình thành kali phthalate, mà hòa tan ethanol, tạo kết tủa tinh thể Để mô tả xác loại tinh dầu, ta cần quan tâm đến định tính định lượng Phương pháp cổ điển thường tập trung vào phương pháp hóa học đánh giá thông tin định lượng thông qua chuẩn độ áp dụng rộng rãi Các phương pháp bisulfit khuyến khích cho loại tinh dầu giàu hợp chất aldebydic, sả, hạnh nhân đắng, quế, thử nghiệm sulfite trung lập phù hợp cho tinh dầu giàu xeton, bạc hà, ca-rum, dầu Đối với loại dầu chứa lượng nhỏ xeton sử dụng phương pháp hydroxylamine Trong trường hợp sau, Công nghệ chất thơm Page Tiểu luận: Phương pháp phân tích tinh dầu thành phần aldehyde ketone xác định thông qua việc bổ sung dung dịch trung hòa hydrochloride hydroxylamine, chuẩn độ với axit chuẩn (phương pháp Stillman-Reed); quy trình phân tích trước đây, thành phần aldehyde ketone xác định thông qua việc bổ sung dung dịch hydrochloride hydroxylamine, trung hòa với sản phẩm phản ứng, là, kiềm axit clohiđric Những phương pháp áp dụng việc xác định citral tinh dầu chanh carvone dầu ca-rum Liên quan đến việc xác định phenol, eugenol dầu đinh hương thymo carvacrol dầu cỏ xạ hương với, thí nghiệm thường thực thông qua việc bổ sung dung dịch kali hydroxit, tạo thành muối hòa tan nước Nó rằng, bên cạnh phenol, thành phần khác hòa tan dung dịch kiềm nước Tinh dầu thường phân tích theo phương pháp sắc ký Nói chung, nguyên tắc sắc ký dựa phân bố thành phần tách pha; pha tĩnh với diện tích bề mặt lớn, pha động vận chuyển chất cần phân tích vào cột Một phương pháp cổ điển để phân tích tinh dầu sắc ký lớp mỏng TLC sắc ký giấy (PC) Phương pháp sắc ký mỏng TLC: kĩ thuật sắc ký dùng để tách chất hỗn hợp[ Phương pháp sắc kí lớp mỏng bao gồm pha tĩnh lớp mỏng chất hấp phụ, thường silica gel, aluminium oxide, cellulose phủ mặt phẳng chất trơ Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích hòa tan dung môi thích hợp hút lên sắc kí mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa tính phân cực thành phần dung dịch -Phương pháp thực hiện: Công nghệ chất thơm Page Tiểu luận: Phương pháp phân tích tinh dầu Phương pháp tiến hành giống với sắc kí giấy với lợi nhanh hơn, tách hỗn hợp hiệu hơn, có lựa chọn "pha tĩnh" khác Bởi tính đơn giản nhanh, sắc kí lớp mỏng thường dùng để giám sát phản ứng hóa học phân tích chất lượng sản phẩm phản ứng.Một vệt nhỏ dung dịch chứa mẫu thử thấm lên sắc kí, khoảng cm từ lên Bản sắc kí sau nhúng vào dung môi thích hợp, ethanol nước, đặt vào vật chứa có nắp Dung môi di chuyển lên sắc kí mao dẫn, gặp phải mẫu thử dịch chuyển mẫu thử lên sắc kí Các hợp chất khác hỗn hợp mẫu thử dịch chuyển với tốc độ khác chúng có sức hút khác pha tĩnh, độ tan khác dung môi Các hợp chất tách dựa cạnh tranh chất tan pha động để có chỗ liên kết với pha tĩnh Thí dụ, silica gel dùng pha tĩnh, xem phân cực Cho trước hợp chất có tính phân cực khác nhau, chất có tính phân cực lớn có liên kết với silica gel lớn có khả đẩy pha động khỏi chỗ liên kết Do đó, hợp chất có tính phân cực nhỏ di chuyển lên cao sắc kí (kết hệ số lưu Rf lớn hơn) Nếu pha động thay dung môi phân cực hỗn hợp dung môi, có khả để đẩy chất tan khỏi chỗ liên kết với silica gel, tất hợp chất sắc kí dịch chuyển lên cao Trên thực tế, dùng hỗn hợp ethyl acetate heptane pha động, tăng thêm ethyl acetate cho hệ số lưu Rf cao cho tất hợp chất sắc kí Thay đổi độ phân cực pha động không làm hợp chất có thứ tự di chuyển ngược lại sắc kí Nếu muốn có thứ tự ngược lại sắc kí, pha tĩnh không phân cực sử dụng, C18-chức hóa silica Công thức tính hệ số lưu Rf : Công nghệ chất thơm Page 10 Tiểu luận: Phương pháp phân tích tinh dầu + Bộ phận bơm mẫu (Injector) + Cột sắc kí khí (GC): phân tách hỗn hợp mùi thành chất mùi riêng lẻ + Cổng chia dòng (column flow spliter): cung cấp đồng thời chất hoạt động mùi tới phần dò (detector) cổng khứu giác + Bộ phận dò (detector): thường dùng đầu dò khối phổ (MS) detector ion hóa lửa (FID) + Không khí ẩm (humidified air) + Dây dẫn gia nhiệt ( heated transfer line) + Cổng khứu giác (Sniffing port): nơi tiếp xúc chất tạo mùi khứu giác người + Bộ phận tạo tính hiệu (signal generator) Đặc biệt, làm việc với hệ thống GC-O trang bị đầu dò không cung cấp thông tin cấu trúc, số lưu trữ (retention indexes) thường liên quan đến mô tả mùi Phương pháp GC-O sử dụng rộng rãi phân tích tinh dầu kết hợp với phương pháp cảm quan/khứu giác (olfactometric) phức tạp phát triển để thu thập xử lý liệu GC-O qua để đánh giá việc xây dựng cảm quan hợp chất hoạt động mùi riêng lẻ Công nghệ chất thơm Page 16 Tiểu luận: Phương pháp phân tích tinh dầu Các phương pháp đo lường liệu GC-O phân thành loại: pha loãng, thời gian-cường độ, tần số phát hiện, posterior intensity + Phân tích pha loãng (dilution) phương pháp áp dụng nhiều Phương pháp dựa pha loãng thành công dịch chiết hương thơm không mùi cảm nhận thấy thành viên cảm quan Quy trình thường thực số lượng định chuyên gia thực chủ yếu phương pháp: CHARM (combined hedonic aroma response method) AEDA ( aroma extraction dilution analysis) Phương pháp AEDA: Các chuyên gia cảm quan đánh giá mẫu gia tăng độ pha loãng đánh giá ảnh hưởng hợp chất mùi hoạt động tạo giá trị hệ số pha loãng (FD factor) tương ứng FD factor= độ pha loãng cuối mà hợp chất hoạt động mùi phát Công nghệ chất thơm Page 17 Tiểu luận: Phương pháp phân tích tinh dầu Phương pháp CHARM: Trong phương pháp CHARM, độ pha loãng thực thành viên cảm qua lựa chọn để tránh ảnh hưởng tới kết phân tích Các thành viên cảm quan ghi chép điểm bắt đầu kết thúc mùi phát Khoảng thời gian phát thành viên ghi chép biểu đồ hương thơm tạo cách vẽ biểu đồ khoảng thời gian cảm nhận mùi dựa vào giá trị độ pha loãng Công thức tính số CHARM: c = dn-1 Trong đó: c: số CHARM n: số câu trả lời trùng hợp thành viên cảm quan d: giá trị pha loãng Công nghệ chất thơm Page 18 Tiểu luận: Phương pháp phân tích tinh dầu + Phương pháp thời gian-cường độ (time-intensity method): Kỹ thuật thời gian- cường độ phát triển dựa ước lượng trực tiếp cường độ mùi chất mùi hỗn hợp mùi Kỹ thuật sử dụng phương pháp OSME OSME: sử dụng thiết bị ghép nối cross-modal để ghi chép liên tục liệu cường độ chất mùi cảm nhận thất cổng khứu giác Các thành viên cảm quan di chuyển đai gạt điện trở biến thiên hàm số liệu cường độ, sau cung cấp peak mùi Sự mô tả miệng peak mùi ghi chép thời điểm + Kỹ thuật tần suất phát hiện: Kĩ thuật tần suất phát sử dụng để đánh giá cường độ mùi dựa ghi chép mùi tìm thấy từ người cảm ngửi Phương pháp tần suất phát tính toán peak tần suất phát từ mùi cảm nhận để tăng tin cậy biểu đồ chất thơm Để so sánh tần số phát hiện, chiều cao peak diện tích peak sử dụng Khi chiểu cao peak sử dụng để so sánh gọi NIF (nasal impact frequency) Khi sử dụng vùng diện tích peak để so sánh gọi SNIF (surface of nasal impact frequency) + Kỹ thuật cường độ sau 3.5 Phương pháp sắc kí khí xác định tinh dầu có tính chất đồng phân quang học ( Gas chromatographic enantiomer characterization of essential oils) Sắc kí khí mao dẫn phương pháp lựa chọn để phân tích đồng phân tinh dầu phương pháp Sắc kí khí chọn lọc đồng phân (enantioselectiveGC) (Es-GC) trở thành công cụ cho phân tích lập thể sau phát dẫn xuất cyclodextrin pha tĩnh đồng phân quang học Công nghệ chất thơm Page 19 Tiểu luận: Phương pháp phân tích tinh dầu (CSPs: Chiral stationary phases) vào năm 1983 Sybilska and Kosceielski trường đại học Warsaw - Một hạn chế GC thường: + Không thể sử dụng để phân riêng đồng phân quang học (Enantiomer) + Đồng phân quang học hình ảnh gương trùng khít lên Các phân tử không đối xứng chứa nhóm khác liên kết với nguyên tử C (cacbon) + Các phân tử đồng phân quang học có tính chất giống nên rửa giải thời gian sử dụng phương pháp GC thường - Phương pháp GC phân tách chất đồng phân quang học nhờ nguyên tắc: + sử dụng dẫn xuất có gắn với chất đồng phân quang học phụ + sử dụng chất bổ sung vào pha động => để tạo thành phức chất không tính chất đồng phân quang học, chất mà sau phân tách pha tĩnh có gắn phân tử không đối xứng + sử dụng pha tĩnh có gắn chất đồng phân quang học (racemic chiral stationary phase) (CSP) Công nghệ chất thơm Page 20 Tiểu luận: Phương pháp phân tích tinh dầu - CSP phương pháp sắc kí khí phân thành nhóm dựa lựa chọn chất đồng phân quang học khác nhau: + sử dụng dẫn xuất amino acid đồng phân quang học qua liên kết hydro + sử dụng hợp chất gắn kim loại có tính chất đồng phân quang học quan liên kết tạo phức + sử dụng dẫn suất cyclodextrin Tất dẫn xuất liên kết hóa học với polysiloxane - Một số lượng lớn loại tinh dầu phát phương pháp Es-GC sử dụng CSP khác biệt Tuy nhiên, chọn lọc đồng phân quang học phổ quát với khả phân tách diện rộng chất đồng phân được, hiệu tách quang học tất hợp chất đồng phân quag học có mặt hỗn hợp đạt sử dụng cột tách đồng phân quang học đơn lẻ Năm 1997, Bicchi công bố việc sử dụng cột có gắn chất phân tách đông phân quang học cụ thể, đưa lưu ý CSP định ưu tiên giải đồng phân quan học định Do đó, chất 2,3-di-O-ethyl-6-O-tert-butyldimethylsilyl-ß-CD pha polymethylphenylsiloxane (PS086) cho phép xác định tính chất tinh dầu lavender họ có múi bao gồm: lynalyl oxides, linalool, linalyl acetate, borneol, borneol acetate, α-terpineol, cis- and transnerolidol Mặt khác, tinh dầu tiêu phân tích tốt sử dụng chất 2,3-diO-methyl-6-O-tert-butyldimethylsilyl-ß-CD pha PS086 đặc biệt chất α-và ß-pinene, limonene, menthone, iso menthone, menthol, iso menthol, pulegone, methyl acetate Công nghệ chất thơm Page 21 Tiểu luận: Phương pháp phân tích tinh dầu Hiện nay, có khoảng 100 pha tĩnh với lựa chọn đồng phân quang học cố định nghiên cứu Để việc phân tách tinh dầu tốt hơn, ta sử dụng phương Es-Gc hai lần, lần với cột phủ dẫn xuất cyclodextrin khác Việc đổi phương pháp phân tích ES-Gc không quan tâm tới việc phát triển áp dụng CSPs phân biệt mà phát triển kĩ thuật phân tích đồng phân quang học lựa chọn phân biệt ES-GC/MS, Es-GC-O, enantioselective multidimensional gas chromatography (Es-MDGC)… 3.6 Sắc kí lỏng sắc kí lỏng ghép khối phổ (LC LC-MS) phân tích tinh dầu Một số hỗn hợp phức tạp tự nhiên không cần phải chuẩn bị mẫu trước phân tích GC, ví dụ, loại tinh dầu Nhìn chung, chúng thường chứa thành phần dễ bay hơi, việc chuẩn bị mẫu thực tinh dầu có múi chiết xuất máy lạnh-ép ngoại lệ Hỗn hợp tinh dầu có chứa 200 thành phần dễ bay không bay Các phần dễ bay chiếm 90-99% toàn dầu, đại diện mono- sesquiterpene hydrocarbon chất dẫn oxygen, với andehit béo, rượu, este Các phần không bay chiếm 1-10% dầu, đại diện chủ yếu hydrocarbon, axit béo, sterol, carotenoid, sáp hợp chất dị vòng oxy Trong số trường hợp cụ thể, thông tin thu nhận phương pháp GC không đủ để mô tả loại tinh dầu có múi, việc phân tích phần không bay yêu cầu Các hợp chất dị vòng ôxy, với họ flavonoid phân biệt, có vai trò quan trọng việc xác định loại tinh dầu ép lạnh việc kiểm soát chất lượng tính xác thực Việc phân tích hợp chất thường thực phương pháp LC, phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao với Công nghệ chất thơm Page 22 Tiểu luận: Phương pháp phân tích tinh dầu pha bình thường (NP-HPLC) pha đảo ngược (RP-HPLC) Các phương pháp cũ thường sử dụng chất phân tích quan tâm phân cực, tách chất phân tích dựa độ phân cực cách sử dụng pha tĩnh phân cực pha động không phân cực Mức độ hấp phụ pha tĩnh phân cực tăng chất có tính phân cực, mở rộng tương tác có ảnh hưởng lớn đến thời gian rửa giải Nhìn chung, độ mạnh tương tác có liên quan đến chất nhóm chức cần phân tích yếu tố không gian Mặt khác, RP-HPLC dựa việc sử dụng pha tĩnh không phân cực dung dịch nước, mà rửa giải dễ dàng Hơn nữa, thời gian lưu giữ tăng lên cách cho thêm dung môi phân cựcvào pha động, giảm việcbổ sung dung môi kỵ nước 3.7 Sắc kí khí đa chiều (MDGC) Sắc ký khí đa chiều bao gồm kỹ thuật sắc ký nhằm tách mẫu sở dử dụng phối hợp nhiều cột tách (mắc nối tiếp) với dung lượng độ chọn lọc khác Áp dụng trường hợp mẫu hỗn hợp phức tạp có chứa nhiều cấu tử với khác biệt lớn nồng độ, độ bay phân cực Dù tối ưu hóa phương pháp sắc kí đơn chiều (một cột tách kép mắc song song) không đạt kết áp dụng phương pháp sắc kí đa chiều Một số kỹ thuật thường sử dụng : kỹ thuật thổi ngược (backflushing), kỹ thuật bẫy lạnh để làm giàu mẫu (cold- trapping for sample enrichment), kỹ thuật tắt (by-passing), kỹ thuật cắt trung tâm (heart-cutting),… Để thực kỹ thuật này, thường phải cải tạo máy sắc kí khí có sẵn, sử dụng khóa nhiều chiều, phải lắp them lò phụ máy điều nhiệt phụ  Column switching: Công nghệ chất thơm Page 23 Tiểu luận: Phương pháp phân tích tinh dầu Nguyên tắc : nhóm cấu tử cần quan tâm thực hỗn hợp ban đầu tách tối ưu Tiết kiệm thời gian phân tách, không cần phải chờ đợi đến tất cấu tử rữa giải khỏi cột hoàn toàn * Quá trình tách xác định cấu tử dễ bay hỗn hợp - Trên sở sắc đồ tổng thể, tìm cấu tử nhẹ mà không quan tâm đến cấu tử nặng Thông thường nhờ chương trình nhiệt độ khí mang thỏa mãn Nhưng thời gian rút ngắn nhờ chương trình nhiệt độ chữa đáp ứng yêu cầu kĩ thuật dựa tang nhiệt độ nên cấu tử dễ bị đẩy nhanh so với trình chạy đẳng nhiệt Giai đoạn ổn định nhiệt độ ban đầu để trở lại trình bơm mẫu nhiều thời gian Ngoài ra, xuất phương pháp dồn tất cấu tử nặng không mông muốn vào pic mà không ảnh hưởng đến kq xác định cấu tử cần quan tâm - Kỹ thuật cột ghép nối tiếp (khác với ghép song song để bù trừ đường kt chương trình nhiệt độ) Bao gồm khâu chuẩn bị mẫu trước trình tách thật có phần cấu tử quan tâm tách khỏi toàn hh nhờ cột tách thứ (tt giai đoạn chuẩn bị mẫu) Sau đó, phần đưa sang tách chi tiết cột thứ hai với pha tĩnh thích hợp Giữa hai cột có khóa chuyển Khi cấu tử cần quan tâm rời khỏi cột thứ để vào cột thứ hai bắt đầu xoay khóa thay đổi đường khí mang hệ thống sắc kí cho cấu tử cần quan tâm tiếp tục vào tách cột thứ hai vào dectector B Còn cấu tử nặng lúc nằm cột tách thứ đuổi khổi cột tách nhanh để sau cho sắc đồ một nhóm pic chung đại diện cho phần lại mà không cần tách thêm Trường hợp cấu tử nặng bị giữ lại cột tách thứ sử dụng kỹ thuật đảo cột Công nghệ chất thơm Page 24 Tiểu luận: Phương pháp phân tích tinh dầu (backflushing) Phương pháp phân tích phương pháp tiết kiệm thời gian tốt - Trường hợp cấu tử nặng nằm phần cuối cột thứ tiếp tục đẩy chúng theo hướng cũ không cần thiết phải qua cột thứ hai Quá trình theo dỗi nhờ dectector A, phần khí mang chứa mẫu đưa tới (kỹ thuật tắ by-passing), cấu tử cần quan tâm tách chi tiết cột thứ hai phát nhờ dectecto B *Những phương pháp khác kĩ thuật phối hợp nhiều cột tách: Nếu khóa chuyển Z thêm dectecto thứ hai (A) xác định định lượng cấu tử nặng cột thứ nhất, với điều kiện hiệu cột tách cột đủ tốt Trường hợp thuognwf sử dụng xác định lượng cấu tử thuộc nhóm chức khác Ví dụ, xác định hỗn hợp olefin parfin, olefin giữ lại chọn lọc cột thứ tách thứ có tẩm muối bạc, n-parafin chuyển vào cột tách thứ hai có pha tĩnh DC-550 tách Trong thời gian n-parafin rửa giải sắc đồ, olefin bị khóa chuyển giữ lại cột nằm phần chờ, sau chúng đẩy tách tiếp cột chứa pha tĩnh β,β’- dioxypropionitril Bằng cách thu hai sắc đồ tách tối ưu đồng thời cấu tử mẫu ban đầu Trong phương pháp cần phải lựa chọn chiều dài cột tách, hàm lượng pha tĩnh, tốc độ dòng, nhiệt độ tối ưu cho cột tách nên có trường hợp phải sử dụng đến buồng điều nhiệt khác Có thể tiến hành chạy đẳng nhiệt mà theo chương trình nhiệt độ cho cột thích hợp cột tách Trong phân tích định lượng , sử dụng kỹ thuật phối hợp nhiều cột tách, giá trị nồng độ cấu tử xác định chih xác Công nghệ chất thơm Page 25 Tiểu luận: Phương pháp phân tích tinh dầu phần sắc kí đồ có chứa chất nội chuẩn với nồng độ xác định trước mẫu, không xác định giá trị nông độ tương đối  Kỹ thuật bẫy lạnh để làm giàu mẫu (cold trapping) Nguyên tắc đưa thêm khâu chuẩn bị mẫu, thông thường thực riêng Ví dụ, dòng khí có chứa lượng vết cấu tử nhẹ qua cột tách nhiệt độ thấp tương ứng Tất cấu tử nhẹ tách nhiệt độ thích ứng cột Sau thời gian lại tang nhanh nhiệt độ (nhờ lò nung điện quấn xung quanh thỏi qua dòng khí nuto nống) để đẩy mẫu vào cột thứ hai Chỉ trường hợp tích góp mẫu nhiệt độ thấp đốt nóng xảy nhanh mời tạo xung chất đủ hẹp để thu sắc đồ đắn Trường hợp cột gọi bẫy lạnh Một khả khác hiệu lắp bẫy lạnh cột mà thân chữa pha tĩnh Công nghệ chất thơm Page 26 Tiểu luận: Phương pháp phân tích tinh dầu Các cẩu tử cần tách cột tách tích lại bẫy lạnh suốt trình tách sơ cột tách nhờ việc đóng mở tương ứng hai khóa nối với bẫy lạnh giai đoạn nhờ việc đốt nống nhanh bẫy lạnh mở thêm đường khí mang mẫu từ bẫy lạnh chuyển sang cột tách Cột tách coi tiền cột thường đc sử dụng cho cột nhồi, cột tách hai cột tách cột mao quản lượng mẫu Kỹ thuật bẫy lạnh đc dùng phỏ biến để tách vết khí nhẹ mẫu nước, kk, Kỹ thuật thường hay dùng sắc ký mao quản Thep Grab, bơm mẫu nên mở buồng điều nhiệt, sau đóng buồng điều nhiệt khởi động chương trình nhiệt độ lượng mẫu vừa tích góp đồng thời đẩy vào cột nên pic trở nên gọn đẹp  KT tuần hoàn nhằm kéo dài cột tách không cần phải thổi ngược Đối với cột tách dài điều không thẻ áp udngj cho cột nhồi độ chênh lệnh áp suất đầu cuối tăng theo tỉ lệ thuận với chiều dài cột tách Do kỹ thuật tuần hoàn sử dụng sau : dùng hai cột ngắn tẩm pha tĩnh lắp vào khóa chuyển sau chiều Mẫu sau qua cột tách đưa tiếp vào cột tách Song, trước cấy tử vào dectecto (phải thử cột trước) xoay khóa đổi hai vị trí nối với nối với để mẫu quay lại cột tách theo hướng ban đầu Sau cấu tử chạy qua cột tách lại chuyển khóa vị trí ban đầu để cấu tử chạy vào cột tách Quá trình tuần hoàn lặp lại phân giải tối ưu thí cho dòng khí mang dẫn cấu tử vào dectector Công nghệ chất thơm Page 27 Tiểu luận: Phương pháp phân tích tinh dầu  Kỹ thuật cắt trung tâm (heart-cutting) Tối thiểu phải dung ba cột tách mà cột gọi cột trung tâm (cột tim) Ở thời điểm đó, cột trung tâm tách độc lập khỏi hệ thống cột tách sắc kí khí mang tắt từ cột tách sang thẳng cột tách khí mag qua cột trung tâm dẫn đến dectecto, bỏ qua cột lại Trong nhiều trường hợp cột tách gọi tiền cột bị thổi ngược lúc tiến hành cắt cột trung tâm khổi hệ thống nên cột tách đc gọi cột ngược  KT không gian (head-space) Trong kỹ thuật này, cân tạo pha pha lỏng có chứa mẫu bình cầu gia nhiệt khuấy chế độ định để tạo nồng độ cấu tử không gian phía pha lỏng Nhờ hệ thống chuyển cách dung xylanh, phần không gian rút để đưa vào cột tách Phương pháp áp dụng có hiệu xác định loại khí chất dễ bay hòa tan dung dịch lỏng Việc tính toán định lượng trường hợp qui mẫu ban đầu điều kiện tiêu chuẩn Một số thiết bị dung kỹ thuật mô tả hình Công nghệ chất thơm Page 28 Tiểu luận: Phương pháp phân tích tinh dầu 3.8 Sắc ký lỏng hiệu cao HPLC chữ viết tắt chữ đầu tiếng Anh phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography), trước gọi phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography) Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) đời năm 1967-1968 sở phát triển cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển HPLC phương pháp chia tách pha động chất lỏng pha tĩnh chứa cột chất rắn phân chia dạng tiểu phân chất lỏng phủ lên chất mang rắn, hay chất mang biến liên kết hóa học với nhóm chức hữu Phương pháp ngày sử dụng rộng rãi phổ biến nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả định lượng tốt, thích hợp tách hợp chất khó bay dễ phân hủy nhiệt Phạm vi ứng dụng phương pháp HPLC rộng, phân tích hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, chất phụ gia thực phẩm lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường… Dựa vào khác chế tách chiết sử dụng HPLC, người ta chia HPLC thành loại:  Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography)  Sắc ký phân bố (partition chromatography)  Sắc ký ion (ion chromatography)  Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography) Trong đó, sắc ký phân bố (SKPB) ứng dụng nhiều phân tích hợp chất từ không phân cực đến hợp chất phân Công nghệ chất thơm Page 29 Tiểu luận: Phương pháp phân tích tinh dầu cực, hợp chất ion có khối lượng phân tử không lớn (