Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến kích thước tiểu phân hỗn dịch phức hợp lipid amphotericin b

Khảo sát sự ảnh hưởng của MTPT đến độ ổn định của hỗn dịch phức hợp lipid – AMB .... Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ tiểu phân đến độ ổn định của hỗn dịch phức hợp lipid – AMB .... Vì

LIPID – AMPHOTERICIN B

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2017

Sau đó, em xin gửi lời cám ơn đến anh Nguyễn Văn Khanh và chị Phạm Thị

Lê Na, là người trực tiếp chỉ bảo em từng thao tác thực nghiệm, hướng dẫn em cách

sử dụng thiết bị, là cơ sở để em có thể tự mình thực hiện nghiên cứu

Em cũng xin cám ơn toàn thể các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên của bộ môn Bào chế - Đại học Dược Hà Nội đã luôn tạo điều kiện giúp đỡ em trong thời gian nghiên cứu thực nghiệm

Nhân đây, em cũng xin gửi lời cám ơn các thầy cô trong ban giám hiệu, các phòng ban và cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã tạo điều kiện giúp em tiếp thu tri thức trong suốt 5 năm học tập tại trường

Cuối cùng, em xin gửi lời cám ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã luôn quan tâm, động viên, giúp em đi đến bước cuối cùng của công việc nghiên cứu và hoàn thành khóa luận

Hà Nội, tháng 5 năm 2017

Sinh viên

Chu Thị Hạnh

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Amphotericin B 2

1.1.1 Công thức hóa học 2

1.1.2 Đặc tính lý hóa 2

1.1.3 Tác dụng dược lý 2

1.2 Phức hợp phospholipid chứa AMB 3

1.2.1 Nguyên lý hình thành phức hợp phospholipid AMB 3

1.2.2 Tá dược tạo phức 4

1.2.3 Một số nghiên cứu về phức hợp lipid AMB 5

1.3 Sự ổn định KTTP của hỗn dịch 7

1.3.1 DLVO lý thuyết về sự ổn định hệ keo 8

1.3.2 Sự ổn định tĩnh điện – cơ chế ổn định electrostatic 10

1.3.3 Sự ổn định bởi lực đẩy giữa các bề mặt hydrat hóa – cơ chế ổn định steric 12

1.3.4 Sự ổn định bởi phân tử polyme tự do – cơ chế ổn định depletion 13

1.3.5 Ảnh hưởng của nồng độ tiểu phân đến độ ổn định 14

1.3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới độ ổn định 15

1.3.7 Ảnh hưởng của KTTP tới độ ổn định 15

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu 16

2.2 Phương pháp nghiên cứu 17

2.2.1 Phương pháp bào chế phức hợp lipid AMB 17

2.2.2 Phương pháp làm giảm KTTP 19

2.2.3 Phương pháp tinh chế hỗn dịch 19

2.2.4 Phương pháp đánh giá hỗn dịch phức hợp lipid AMB 20

Chương 3 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 23

3.1 Khảo sát phương pháp làm giảm KTTP 23

3.1.1 Phương pháp đồng nhất hóa ở áp suất cao 23

3.1.2 Phương pháp đồng nhất hóa ở áp suất cao kết hợp đùn qua màng 25

3.2 Khảo sát môi trường pha loãng trong phương pháp đo KTTP 26

3.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của MTPT đến độ ổn định của hỗn dịch phức hợp lipid – AMB 28

3.3.1 Khảo sát sự ảnh hưởng của MTPT lên một số đặc tính của hỗn dịch phức hợp lipid – AMB 28

3.3.2 Theo dõi độ ổn định của các mẫu tạo bởi MTPT khác nhau 31

3.4 Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ tiểu phân đến độ ổn định của hỗn dịch phức hợp lipid – AMB 34

3.5 Khảo sát sự ảnh hưởng của điều kiện bảo quản đến độ ổn định của chế phẩm 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

DSPG Distearoylphosphatidylcholin

HSPC Phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa

(Hydrogenated soy phosphatidylcholine) DMPC Dimyristoylphosphatidylcholin

DMPG Dimyristoylphosphatidylglycerol

DPPC Dipalmitoylphosphatidylcholin

TFR Tổng tốc độ dòng (Total flow rate)

(Polydispersity index) DĐVN IV Dược điển Việt Nam IV

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1 Nguyên liệu 16Bảng 3.1 KTTP và phân bố KTTP của mẫu sau các chu kì đồng nhất khác nhau 23Bảng 3.2 KTTP và phân bố KTTP của mẫu sau khi làm giảm KTTP bằng phương pháp đồng nhất hóa ở áp suất cao kết hợp đùn qua màng 25Bảng 3.3 KTTP và phân bố KTTP của các mẫu trong môi trường đo KTTP khác nhau 27 Bảng 3.4 Một số đặc tính hỗn dịch phức hợp lipid – AMB với các MTPT khác nhau 29 Bảng 3.5 KTTP, phân bố KTTP và hiệu suất tạo phức hợp của các mẫu CT1, CT3, CT4 tại các thời điểm khác nhau 32 Bảng 3.6 KTTP và phân bố KTTP của mẫu trước khi LTT và sau khi LTT tại các thời điểm khác nhau 35Bảng 3.7 Một số đặc tính của mẫu bảo quản ở nhiệt độ 2 – 8oC và nhiệt độ phòng thí nghiệm tại các thời điểm khác nhau 38

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Cấu trúc giả định của phức hợp lipid AMB 3Hình 1.2 Phân tử HSPC và DSPG 4Hình 1.3 Biểu đồ DLVO điển hình 9 Hình 1.4 Ảnh hưởng trên biểu đồ DLVO khi: A Thêm chất điện ly đến nồng độ thấp; B.Thêm chất điện ly đến nồng độ trung bình; C.Thêm chất điện ly đến nồng độ cao 10 Hình 1.5 Quá trình chuyển đổi từ dạng “hỗn loạn” sang dạng ổn định của hỗn dịch latex theo cơ chế tĩnh điện 11 Hình 2.1 Mô hình thiết bị trộn vi dòng chảy tạo phức hợp lipid AMB 18 Hình 2.2 Quy trình bào chế phức hợp lipid – AMB theo phương pháp vi dòng chảy 18 Hình 2.3 Cơ chế của phương pháp LTT [16] 19 Hình 2.4 Hệ thống LTT Sartoflow Slice 200 Benchtop 20Hình 3.1 Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi KTTP và phân bố KTTP của mẫu sau các chu

kì đồng nhất khác nhau 24 Hình 3.2 Biểu đồ KTTP và phân bố KTTP của mẫu sau khi đồng nhất hóa ở áp suất cao kết hợp đùn qua màng 25 Hình 3.3 Biểu đồ KTTP và phân bố KTTP của các mẫu với môi trường đo KTTP khác nhau tại thời điểm ban đầu và sau 1 tháng bảo quản 27Hình 3.4 Biểu đồ KTTP và phân bố KTTP hỗn dịch phức hợp lipid – AMB với các MTPT khác nhau 30Hình 3.5 Biểu đồ hiệu suất tạo phức hợp của phức hợp lipid – AMB với các MTPT khác nhau 30Hình 3.6 Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi KTTP và phân bố KTTP của các mẫu CT1, CT3, CT4 theo thời gian 32

Hình 3.7 Mẫu phức hợp lipid AMB với MTPT là dung dịch NaCl 0,9% trước và sau khi LTT đến nồng độ 5 mg/ml 35Hình 3.8 Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi KTTP và phân bố KTTP của mẫu trước và sau khi LTT theo thời gian 36Hình 3.9 Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi KTTP và phân bố KTTP của mẫu sau khi LTT bảo quản ở hai điều kiện khác nhau 38 Hình 3.10 Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hiệu suất tạo phức hợp của mẫu sau khi LTT bảo quản ở hai điều kiện khác nhau 39

Tại Việt Nam cũng đã có nhiều nghiên cứu về các hệ mang dược chất khác nhau của AMB ThS Dương Thị Thuấn đã nghiên cứu bào chế phức hợp lipid AMB theo phương pháp tiêm polyol Phương pháp bào chế này còn nhiều hạn chế như cách tiến hành phức tạp, quy trình phối hợp hai pha kéo dài gây mất thời gian, khó nâng cấp quy mô sản xuất Để khắc phục những nhược điểm trên, DS Phạm Thị Lê Na đã nghiên cứu phương pháp bào chế tiêm vi dòng chảy và đã thu được những kết quả tích cực Mặc dù vậy, kích thước tiểu phân (KTTP) tạo thành theo cả hai phương pháp trên còn lớn và độ ổn định vật lý chưa được nghiên cứu Vì vậy, để góp phần ứng dụng phức hợp lipid làm chất mang cho dược chất trị nấm có độc tính cao, chúng tôi thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến kích thước tiểu phân hỗn dịch phức

hợp lipid – Amphotericin B” nhằm mục tiêu:

- Nghiên cứu phương pháp làm giảm KTTP đạt tiêu chuẩn thuốc tiêm hỗn dịch

- Nghiên cứu một số yếu tố hạn chế sự tăng KTTP trong quá trình bảo quản

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Amphotericin B

- Bột kết tinh màu vàng hoặc vàng cam [1]

- Độ tan: Thực tế không tan trong nước, hòa tan trong DMSO và trong propylen glycol, hơi tan trong dimethylformamid, rất ít tan trong methanol, thực tế

không tan trong ethanol 96% [14]

 Hóa tính: Do AMB có hệ dây nối đôi luân phiên, nhóm amin và nhóm carboxylic tự do nên AMB có tính chất sau:

rò rỉ các chất bên trong tế bào ra ngoài và cuối cùng làm chết tế bào nấm AMB cũng

có thể liên kết với các cholesterol trên màng tế bào người, điều này là nguyên nhân chính gây tác dụng phụ nghiêm trọng của AMB Ái lực của AMB với ergosterol màng lớn hơn với cholesterol màng nên AMB thể hiện tác dụng chống nấm chủ yếu nhưng vẫn tiềm tàng tác dụng phụ nghiêm trọng, đặc biệt là tổn thương thận với các biểu hiện: suy thận, tăng creatinin và ure huyết, rối loạn chuyển hóa, tăng kali máu,… [2]

1.2 Phức hợp phospholipid chứa AMB

1.2.1 Nguyên lý hình thành phức hợp phospholipid AMB

Phân tử AMB có tính lưỡng thân, một đầu chứa nhiều nhóm hydroxyl thân nước, một đầu là một chuỗi hydrocacbon chứa nhiều nối đôi đơn luân phiên thân dầu Trong môi trường nước và ở điều kiện thích hợp, khi tỉ lệ %mol AMB/phospholipid dưới 25%, AMB sẽ liên kết giới hạn ở dạng monome với phospholipid tạo thành liposome Nhưng ở tỉ lệ %mol AMB/phospholipid từ 25% – 100%, AMB sẽ liên kết với phospholipid để tạo thành cấu trúc dạng chuỗi [19]

Hình 1.1 Cấu trúc giả định của phức hợp lipid AMB [15], [19]

Bằng các phương pháp quan sát thích hợp, các nhà nghiên cứu đã suy đoán rằng, khi tỉ lệ %mol AMB/phospholipid tăng quá 25%, AMB đủ khả năng phá vỡ màng phospholipid kép và chen vào màng làm phá vỡ cấu trúc liposome Mặt khác,

AMB cố định phospholipid bằng cách đan xen vào lớp phospholipid kiểu ngón tay đan vào nhau Phần polyen thân dầu của phân tử AMB liên kết với chuỗi hydrocacbon của lipid, phần thân nước chứa các nhóm hydroxyl hướng về phía lõi, gốc phosphat của phân tử lipid hướng về phía nhóm amin của phân tử AMB, hình thành một hình trụ tròn Các hình trụ tròn xếp cạnh nhau hình thành phức hợp lipid AMB có hình dải ruy băng [19]

1.2.2 Tá dược tạo phức

Phospholipid sử dụng để chế tạo phức hợp lipid bao gồm: phosphatidylcholin, phosphatidylglucerol, phosphatidylethanolamin, phosphatidylserin, phosphatidylinositol, acid phosphatidic, sphingomyelin, có thể sử dụng đơn độc hoặc phối hợp Các phospholipid có thể là phospholipid tự nhiên hoặc chiết xuất từ tự nhiên như từ trứng, đậu nành Đại diện tốt nhất là hỗn hợp DMPC và DMPG với tỷ lệ mol tương ứng DMPC: DMPG 7 :3 Các phospholipid bão hòa như là HSPC có thể sử dụng HSPC cũng được dùng phối hợp với DSPG và tốt nhất ở tỉ lệ mol HSPC : DSPG7 : 3 [19]

Hình 1.2 Phân tử HSPC và DSPG Một số ưu điểm của HSPC: bền về hóa học hơn so với phosphatidylcholin đậu nành chưa hydrogen hóa do hạn chế được các quá trình peroxyd hóa gốc acid béo chưa no, giúp màng lipid bền vững hơn, hạn chế hỏng màng gây rò rỉ dược chất [18]

DSPG đóng vai trò quan trọng trong cơ chế hình thành của phức hợp lipid AMB theo cơ chế sau: ở pH trung tính, DSPG có một nhóm phosphat bị ion hóa do

đó, phân tử tích điện âm Khi AMB được phân tán trong dung môi được acid hóa, các proton trong môi trường sẽ có xu hướng chuyển giao cho các nhóm amin của AMB Kết quả là các phân tử AMB tích điện dương Do đó sự tích điện trái dấu, các phân

tử hút nhau, các nhóm tích điện trái dấu của chúng tạo thành một cặp ion Như vậy,

sự hấp dẫn phân tử giữa AMB và phân tử DSPG được tăng lên rất nhiều Các chuỗi hydrocacbon béo của các phospholipid bị thu hút bởi tương tác kị nước vào chuỗi dài của liên kết đôi không có nhóm thế của polyen [23]

Sự khác biệt trong tương tác giữa AMB và DPPC với sự có mặt của K+ và Na+

có thể ảnh hưởng bởi tác động khác nhau của các ion này lên cách sắp xếp phân tử dược chất Những tác động này có thể liên quan tới sự khác nhau về kích thước ion

Độ mạnh của những tương tác này yếu hơn rõ ràng đối với lớp đơn hỗn hợp phân tán trong môi trường Na+ Sự hiện diện của ion K+ có thể là một yếu tố quan trọng trong việc tạo điều kiện thuận lợi cho sự tương tác giữa các phân tử với các màng lipid và tăng hiệu quả vận chuyển qua màng tế bào của các ion này mà không có sự tương tác với các sterol So sánh năng lượng tự do phụ thuộc hàm lượng AMB với sự có mặt của K+ và Na+ cho thấy độ ổn định cao hơn của các lớp đơn phân tử trong môi trường

có ion K+ Theo hướng đi của bàn luận này, dường như ion K+ liên kết hiệu quả với AMB hơn ion Na+, do ion K+ có liên kết với nhóm -COO- của AMB mạnh hơn so với Na+ [8]

1.2.3 Một số nghiên cứu về phức hợp lipid AMB

Các nghiên cứu ở nước ngoài

Janoff và cộng sự (1988) đã nghiên cứu về cấu trúc của phức hợp lipid có tỉ lệ mol DMPC : DMPG = 7 : 3 cố định nhưng thay đổi tỉ lệ mol AMB/lipid Kết quả cho thấy với tỉ lệ mol AMB < 5%, cấu trúc pha gel của phospholipid ở 20oC sẽ bị sang pha tinh thể lỏng ở nhiệt độ 25oC Nhưng với tỉ lệ mol AMB 25% và 50%, phức hợp lipid không

có nhiệt chuyển pha ở 40oC [20]

Janoff và cộng sự (2002) cũng đã tiến hành bào chế phức hợp lipid AMB bằng phương pháp hydrat hóa film Dung môi hòa tan dược chất được sử dụng là DMSO hoặc methanol Lipid sử dụng là DMPC và DMPG với tỉ lệ mol là 7 : 3 Dung dịch hydrat hóa film là đệm phosphat, hoặc dung dịch muối hoặc dung dịch đệm glycin Bằng phương pháp này, tỉ lệ phần trăm mol dược chất/lipid để tạo phức hợp là từ 6 – 50%, tốt nhất là từ 30 – 50% Máy nghiền keo đã được sử dụng trong khoảng 30 phút

để làm giảm kích thước tiểu phân Để chọn lựa các tiểu phân trong khoảng tối ưu, tác giả dùng phương pháp lọc tiếp tuyến với hai cỡ lỗ lọc khác nhau, lần đầu lọc với màng tiếp tuyến có kích cỡ lỗ lọc 5 µm, dịch lọc lại tiếp tục lọc qua màng lọc tiếp tuyến có kích cỡ 2 µm [21]

Larabi và cộng sự (2004) đã bào chế phức hợp lipid chứa AMB bằng phương pháp bốc hơi dung môi pha đảo, sử dụng hai lipid DMPC và DMPG Tỉ lệ mol các thành phần AMB: DMPC: DMPG 5: 7 :3 , tương tự như thành phần của Abelcet AMB được hòa tan trong methanol sau đó cho vào dung dịch DMHC chứa lipid đã được hòa tan Thêm nước tinh khiết và khuấy từ ở nhiệt độ phòng Cô áp suất giảm loại dung môi thu được phức hợp lipid Soi kính hiển vi điện tử cho thấy cấu trúc hình đĩa mỏng, khác với chế phẩm Abelcet có cấu trúc dạng chuỗi dài [22]

Các nghiên cứu trong nước

Nguyễn Thị Mỹ (2014) đã nghiên cứu bào chế phức hợp lipid AMB có tỉ lệ mol HSPC : DSPG7 : 3, môi trường phân tán (MTPT) là đệm phosphat pH 7,4, tỉ lệ mol dược chất/lipid là 25% cho hiệu suất tạo phức hợp cao (87,06%), kích thước tiểu phân là 648,3 nm, phân bố KTTP tương đối đồng đều (PDI = 0,363) Tác giả cũng nghiên cứu sơ bộ tính ổn định của phức hợp lipid AMB, theo dõi một số công thức trong thời gian 3 tuần bảo quản ở điều kiện 2 – 8oC Kết quả là các tiểu phân trong phức hợp có xu hướng kết tụ với nhau tạo các tiểu phân lớn hơn, phân bố KTTP kém tập trung hơn [4]

Dương Thị Thuấn (2016) đã phát triển tiếp hướng nghiên cứu của Nguyễn Thị

Mỹ, xây dựng được phương pháp bào chế phức hợp lipid AMB là tiêm polyol, MTPT

là natri clorid 0,9%, dung môi hòa tan dược chất là ethanol, tỉ lệ mol dược chất/lipid

là 100% Đồng thời tác giả cũng đã nghiên cứu một số phương pháp làm giảm KTTP của hỗn dịch lipid AMB Trong đó, phương pháp đồng nhất hóa ở áp suất cao (5000 psi) kết hợp đùn qua màng polycarbonat 0,8 μm 100 lần cho kết quả tốt nhất về KTTP

và phân bố KTTP Phức hợp tạo thành có kích thước < 5 μm với chỉ số phân bố tiểu phân span < 2 Tuy nhiên phương pháp này tốn kém thời gian và không áp dụng được trên quy mô lớn [6]

Phạm Thị Lê Na (2016) đã nghiên cứu phương pháp bào chế hỗn dịch phức hợp lipid AMB theo phương pháp vi dòng chảy Kết quả cho thấy phương pháp này tiết kiệm thời gian hơn so với phương pháp tiêm polyol, phức hợp thô tạo ra có kích thước 20,1 μm, chỉ số phân bố tiểu phân span < 1 [5]

Trong các nghiên cứu trên chưa có công trình nào nghiên cứu các biện pháp làm giảm KTTP để đạt tiêu chuẩn thuốc tiêm một cách khả thi và cũng chưa nghiên cứu nào tìm hiểu các yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định vật lý của hỗn dịch phức hợp lipid AMB

1.3 Sự ổn định KTTP của hỗn dịch

Những thuốc không tan trong nước phân tán tạo thành hệ phân tán kị dung môi Bởi vì năng lượng bề mặt cao nên chúng kém bền về mặt động học và có xu hướng kết tụ Trong hệ phân tán của các hạt mịn trong chất lỏng (hoặc của hạt mịn trong khí) thường xuyên xảy ra tương tác do:

- Chuyển động Brown

- Tạo kem hoặc đóng bánh

- Sự đối lưu [12]

Theo định luật Stokes, tốc độ sa lắng (hoặc tạo kem), v, của một hạt hình cầu

trong một lượng chất lỏng, độ nhớt η, được cho bởi [12], [13]:

Sự tạo kem của hệ nhũ tương hoặc sự sa lắng của hỗn dịch có thể giảm thiểu bằng nhiều cách:

- Giảm kích thước tiểu phân (giảm a)

- Tăng độ nhớt của pha liên tục (tăng η)

- Cân bằng tỷ trọng hai pha (lý tưởng là ρ1 = ρ2)

Khi các tiểu phân tiến đến gần nhau, sự va chạm có thể dẫn đến liên kết bền chặt của tiểu phân rắn hoặc sự hợp nhất của các giọt chất lỏng Từ đó hệ keo sẽ phá hủy chính nó thông qua sự phát triển của pha phân tán và tăng cường tạo kem hoặc

sa lắng của những tiểu phân lớn Những va chạm sẽ dẫn đến liên kết bền chặt hoặc các tiểu phân tự phục hồi và duy trì trạng thái tự do phụ thuộc vào lực tương tác giữa các tiểu phân (cả lực hút và đẩy) và bản chất bề mặt tiểu phân [13]

Cân bằng tỷ trọng hai pha hiển nhiên là phương pháp đơn giản nhất làm chậm lại sự sa lắng, thể hiện rõ trong công thức: nếu ρ1 = ρ2, v = 0 Tuy nhiên, phương pháp này chỉ sử dụng giới hạn trong một số trường hợp và chỉ có thể áp dụng đối với hệ

mà sự khác biệt tỷ trọng không nhiều Ví dụ, với nhiều chất rắn hữu cơ có tỷ trọng 1,1 – 1,3 phân tán trong nước, một số hợp chất như đường hay glycerol có thể được hòa tan trong MTPT để làm tăng tỷ trọng đến mức mong muốn [28]

1.3.1 DLVO lý thuyết về sự ổn định hệ keo

Lực tương tác giữa các hạt keo bao gồm: lực Van der Waals (lực hút), lực tĩnh điện (lực đẩy), lực Born – chủ yếu là tầm ngắn (lực đẩy), lực steric (lực đẩy) do các phân tử hấp phụ (đặc biệt là các đại phân tử) tại bề mặt hạt, lực solvat (lực đẩy) do giảm hydrat hóa các phân tử khi tiến đến gần nhau

Sự nghiên cứu lực đẩy tĩnh điện và lực hút van der Waals của Deryagin, Landau, Verwey và Overbeek (DLVO) đã dẫn đến một lý thuyết về sự ổn định của

hệ thống treo kị nước Thuyết DLVO nghiên cứu hai hạt hình cầu bán kính a, cách nhau khoảng cách H

Trong lý thuyết này:

- Sự kết hợp của lực đẩy (VR) mang giá trị dương với lực hấp dẫn (VA) mang giá trị âm cho tổng thế năng tương tác: Vtổng = VA + VR

- Lực hấp dẫn phát sinh từ lực van der Waals giữa các hạt cùng loại Khi kích thước các hạt này tương đối lớn so với khoảng cách giữa chúng, lực hấp dẫn được viết như sau: VA Aa

12H

  (A là hằng số Hamaker)

- Lực đẩy phát sinh từ sự tích điện trên bề mặt các hạt, là do sự ion hóa bề mặt hoặc

sự hấp phụ các ion: Bề mặt tiểu phân có điện tích âm hấp phụ một lớp ion dương lên bề mặt của nó trong lớp Stern, hình thành một lớp khuếch tán hoặc lớp điện kép, chứa cả các ion dương và âm Lực tĩnh điện phát sinh từ sự tương tác của các

lớp điện kép bao quanh các hạt lơ lửng trong hỗn dịch, gây ra lực đẩy nếu các hạt

có cùng điện tích dương hay âm bề mặt

Phương trình gần đúng cho VR khi điện thế bề mặt nhỏ và giá trị κ nhỏ là:

2

hằng số điện môi,  là thế Stern (có giá trị xấp xỉ thế zeta), 1/κ là chiều dài Debye – Hückel [12]

Hình 1.3 Biểu đồ DLVO điển hình Hình dạng của đường cong V – H được minh họa hình trên, chỉ ra ba điểm quan trọng: một cực đại sơ cấp, một cực tiểu sơ cấp và một cực tiểu thứ cấp

Tại khoảng cách H nhỏ, độ sâu của cực tiểu sơ cấp tăng khi giá trị tuyệt đối của VA tăng nhiều hơn VR Khi khoảng cách giữa các tiểu phân đạt đến phạm vi này, chúng sẽ kết tụ và không thể tách rời nhau

Tại khoảng cách H trung bình, giá trị tuyệt đối của VR lớn hơn nhiều VA, kết quả là hình thành đại Vmax Độ lớn của Vmax phụ thuộc vào thế zeta, nồng độ chất điện

ly và bán kính hạt Nếu cực đại sơ cấp quá nhỏ, tương tác giữa hai tiểu phân có thể đạt được cực tiểu sơ cấp, kết quả là các tiểu phân trong hỗn dịch kết tụ nhanh chóng

và không phân tán đều trở lại được Ngược lại, nếu cực đại sơ cấp cao đáng kể (cao gấp hàng chục lần năng lượng chuyển động nhiệt kT, k là hằng số Boltzmann, T là nhiệt độ), hai tiểu phân không thể tiếp xúc gần lại Khi đó hỗn dịch bền về mặt động học

Tại khoảng cách H xa, VR là một hàm mũ, giảm nhanh hơn so với sự giảm VA, dẫn đến hình thành một cực tiểu thứ cấp Độ sâu của cực tiểu thứ cấp tăng theo sự tăng bán kính tiểu phân và hệ số Hamaker của hỗn hợp Độ sâu của cực thiểu thứ cấp

có vai trò quan trọng, quyết định sự ổn định của hệ thống Nếu cực tiểu thứ cấp nhỏ hơn năng lượng chuyển động nhiệt kT, các hạt tiểu phân sẽ luôn đẩy nhau [12], [13],[27] Ngược lại, hỗn dịch có thể kết bông [28]

1.3.2 Sự ổn định tĩnh điện – cơ chế ổn định electrostatic

Hình 1.4 Ảnh hưởng trên biểu đồ DLVO khi:

A Thêm chất điện ly đến nồng độ thấp

B Thêm chất điện ly đến nồng độ trung bình

C Thêm chất điện ly đến nồng độ cao Hình 1.4 cho thấy tác động của chất điện ly đến một biểu đồ DLVO điển hình Những thay đổi trong biểu đồ phát sinh do sự nén lại của lớp điện tích kép bởi nồng

độ chất điện ly tăng, dẫn đến tăng κ, vì vậy giảm 1/ κ

Đường cong A: Ở nồng độ chất điện ly thấp, vùng điện kép lớn và VR mở rộng đến khoảng cách xa hơn giữa hai tiểu phân Tổng của VR và VA hình thành đường cong năng lượng tổng cộng có một cực đại sơ cấp cao nhưng không có cực tiểu thứ cấp

Đường cong B: Sự gia tăng lớp điện kép khi có nhiều chất điện ly thêm vào dẫn đến sự suy yếu của VR và kết quả là một cực đại sơ cấp nhỏ, nhưng quan trọng hơn là một cực tiểu sơ cấp Nồng độ này của chất điện ly sẽ hình thành một hỗn dịch

ổn định do xảy ra sự kết bông tại cực tiểu thứ cấp [13] và nếu cực đại sơ cấp lớn hơn nhiều năng lượng chuyển động nhiệt, các tiểu phân sẽ không kết tụ tại cực tiểu sơ cấp [7]

Đường cong C: Ở nồng độ chất điện ly cao, vùng giá trị VR sẽ bé đến mức lực hút Van der Waals chi phối hình dạng của đường cong năng lượng Đường cong sẽ không có cực đại sơ cấp hay cực tiểu thứ cấp [13]

Hình 1.5 Quá trình chuyển đổi từ dạng “hỗn loạn” sang dạng ổn định của hỗn dịch latex theo cơ chế tĩnh điện

Nồng độ và loại chất điện ly quyết định sự mở rộng của lớp điện kép và ảnh hưởng đến độ ổn định của hỗn dịch Trong ví dụ ở hình 1.5, hỗn dịch latex đã sulphat hóa, sau khi thẩm tách hoặc trao đổi ion để loại đi hầu hết các ion, chuyển thành dạng sắp xếp ổn định do có lực đẩy tĩnh điện tầm xa giữa các tiểu phân Điều này chỉ ra rằng các hạt latex tích điện có thể tương tác mạnh từ khoảng cách xa gấp nhiều lần

kích thước của chúng theo cơ chế ổn định tĩnh điện Như vậy, sự loại bỏ hoặc thêm chất điện ly có thể ứng dụng để kiểm soát độ ổn định của một hỗn dịch [27]

Ngoài ra, nồng độ điện tích còn ảnh hưởng đến KTTP Theo một nghiên cứu của Amro M El Badawy và các cộng sự, sự tăng lực ion làm tăng KTTP của H2-AgNPs Theo thuyết về lớp điện kép, sự giảm độ dày của lớp điện kép kèm theo sự tăng lực ion Điều này làm tăng tương tác giữa các tiểu phân, dẫn đến tăng mức độ tập hợp và tiểu phân sa lắng Đối với các mẫu hỗn dịch khác, sự tăng nồng độ NaNO3

từ 10 mM đến 100 mM đều làm tăng KTTP, trừ tại một số điểm pH xác định, giá trị KTTP không khác biệt nhau nhiều [9] Trong một nghiên cứu khác của J Sabin và các cộng sự (2006) đã chỉ ra rằng nồng độ ion Na+ và K+ tác động lên KTTP của liposome phosphatidylcholin trong lòng đỏ trứng gà Tại nồng độ thấp của các ion này, các tác giả quan sát thấy sự giảm đường kính liposome Điều này có thể giải thích do chênh lệch gradient nồng độ ở hai bên màng sinh ra áp lực thẩm thấu và bởi

vì màng không thấm một vài ion, liposome tương tác loại bớt các phân tử nước, làm giảm kích thước [24]

Có khi định luật DLVO không thể áp dụng để giải thích sự ổn định của liposome Nếu liposome bền vững ngay cả khi không có lực đẩy electrostatic, điều

đó có nghĩa là một lực khác có vai trò giữ các tiểu phân đủ xa để tránh được lực hút van der Waals Lực này có thể là lực hydrat hóa [24]

1.3.3 Sự ổn định bởi lực đẩy giữa các bề mặt hydrat hóa – cơ chế ổn định steric

Hình 1.6 Cơ chế ổn định steric [25]

Ngoài lực đẩy tĩnh điện, chất keo cũng có thể ổn định bởi lực đẩy hình thành

từ sự hấp thu phân tử lớn và chất diện hoạt lên bề mặt của chúng Trong các dung dịch nước các phân tử hấp phụ sẽ được ngậm nước

Sự ổn định hình thành do 3 tác động:

 Ảnh hưởng entropy: Sự tiếp cận của hai tiểu phân được hấp phụ chuỗi chất ổn định dẫn đến tương tác steric khi các chuỗi tương tác với nhau Hiệu ứng steric không xuất hiện cho đến khi H = 2, vì vậy tương tác tăng đột biến cùng với sự giảm khoảng cách Sự cố định cấu trúc dẫn đến sự thay đổi entropy âm (S) Mỗi chuỗi bị cố định cấu trúc một phần, góp phần làm tăng năng lượng tự do của hệ, dẫn đến lực đẩy Hiệu ứng steric phụ thuộc vào: (1) chiều dài của chuỗi phân tử hấp thụ (2) tương tác của dung môi với chuỗi; và (3) số lượng chuỗi trên một đơn vị diện tích bề mặt tương tác

 Thẩm thấu: Hiệu ứng thẩm thấu xuất hiện khi chuỗi đại phân tử trên tiểu phân kế bên lấn vào không gian của nhau làm tăng nồng độ của chuỗi trong các khu vực đan xen Lực đẩy xuất hiện do áp lực thẩm thấu của dung môi có xu hướng pha loãng nơi

có nồng độ cao: điều này chỉ có thể đạt được khi tiểu phân di chuyển ra ngoài

 Ổn định enthalpy: Trong sự tiếp cận gần của các tiểu phân, phân tử nước hydrat hóa hấp phụ trên bề mặt phân tử được tách ra, gây ra sự tăng enthalpy dẫn đến hình thành lực đẩy [13]

1.3.4 Sự ổn định bởi phân tử polyme tự do – cơ chế ổn định depletion

Hình 1.7 Cơ chế ổn định depletion

Sự ổn định depletion của tiểu phân keo được tạo bởi đại phân tử tự do trong dung dịch [25] Hầu hết các thuyết về sự tạo tủa bông depletion đều dựa vào mô hình của Asakura và Oosawa Theo mô hình này, khi hai tiểu phân tiến đến gần nhau với một khoảng cách nhỏ hơn đường kính của polyme tự do, sự loại bỏ các phân tử polyme khỏi khe hở giữa các tiểu phân dẫn đến sự hình thành vùng không có polyme

Từ đó hình thành lực hấp dẫn liên quan đến việc giảm áp suất thẩm thấu trong vùng giữa các tiểu phân Tại tỷ lệ polyme tự do thích hợp, hỗn dịch xảy ra hiện tượng tủa bông [26]

1.3.5 Ảnh hưởng của nồng độ tiểu phân đến độ ổn định

Một hỗn dịch có thể được coi là loãng nếu chuyển động nhiệt của các hạt chiếm

ưu thế hơn so với ảnh hưởng của lực tương tác giữa các tiểu phân Chuyển động chuyển dịch của tiểu phân (thường được xem là chuyển động Brown) rộng và trong các hỗn dịch như vậy chỉ xảy ra va chạm không thường xuyên giữa các tiểu phân, có nghĩa là các tiểu phân không “nhìn thấy nhau” cho đến khi một va chạm xảy ra Nói theo cách khác, trong một hỗn dịch loãng, khoảng cách trung bình giữa các tiểu phân lớn hơn nhiều so với phạm vi của lực tương tác Trong trường hợp này, tương tác giữa các tiểu phân có thể được đại diện bởi va chạm giữa hai tiểu phân Giả định rằng lực hấp dẫn có thể bỏ qua, có nghĩa là các tiểu phân không sa lắng, đặc tính của hệ pha loãng phần lớn không phụ thuộc vào thời gian [27]

Khi nồng độ của tiểu phân trong hỗn dịch tăng, khả năng tương tác giữa các tiểu phân tăng và lực tương tác giữa chúng đóng một vai trò quan trọng trong việc quyết định đặc tính của hệ Cùng với việc tăng nhiều hơn nữa nồng độ tiểu phân, lực đẩy tạo ra sự sắp xếp trật tự các tiểu phân, đến mức đạt được một cấu trúc được tổ chức cao Trong trường hợp này, bất cứ tiểu phân nào trong hệ cũng có tương tác với những tiểu phân xung quanh và biên độ dao động nhỏ so với kích thước của nó Như trong trường hợp của hỗn dịch loãng, đặc tính của những hỗn dịch đặc này không phụ thuộc nhiều vào thời gian [27] Ngoài ra, hỗn dịch đặc kết bông có độ nhớt cao ở trạng thái tĩnh, do có lực hấp dẫn cao [7]

Khi xảy ra quá trình kết bông, các tiểu phân có cấu trúc lỏng lẻo trong toàn hệ thống Tình huống như vậy có tầm quan trọng thực tiễn và xảy ra với nhiều hỗn dịch đặc Bằng cách lắc bình chứa, cấu trúc kết bông này dễ dàng bị phá vỡ và hình thành

hệ hỗn dịch đồng nhất Hiểu theo cách khác, dạng kết bông ngăn cản sự sa lắng Bởi

vì sự kết bông phụ thuộc vào nồng độ tiểu phân trong hệ, sự hình thành cấu trúc này xảy ra dễ dàng tại nồng độ chất rắn cao hơn Thêm vào đó, hỗn dịch loãng thường xảy ra sự “chống kết bông” tự phát, do cả nồng độ chất điện ly và nồng độ tiểu phân giảm đến mức mà không thể xảy ra sự kết bông [28]

1.3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới độ ổn định

Sự ổn định vật lý được đánh giá trên các tiêu chí về KTTP, chỉ số PDI, sự tích điện bề mặt Trong quá trình bảo quản, có thể xảy ra kết tụ các tiểu phân phức hợp lipid [3] Độ nhớt cao ngăn cản sự kết hợp của các lớp màng sau khi các tiểu phân va chạm Độ nhớt là một yếu tố phụ thuộc vào nhiệt độ Khi nhiệt độ tăng lên, độ nhớt giảm, dẫn đến sự mất ổn định của các tiểu phân [10]

Tính thấm của phức hợp lipid cũng giống như liposome phụ thuộc vào nhiều yếu tố: loại phospholipid, hàm lượng và tính chất của dược chất cũng như điều kiện bảo quản Trong đó, yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng đến sự sắp xếp của các tá dược trên màng Sự tăng nhiệt độ có thể khiến màng lipid có cấu trúc lỏng lẻo hơn, dẫn đến sự

rò rỉ dược chất, kết tập các hạt và tăng KTTP [10] Như vậy, bảo quản ở nhiệt độ thấp làm cho phospholipid ổn định hơn và kéo dài được tuổi thọ của chế phẩm [3]

1.3.7 Ảnh hưởng của KTTP tới độ ổn định

Kiểm soát KTTP có vai trò rất quan trọng đối với độ ổn định của hỗn dịch Làm giảm KTTP là cần thiết để ngăn cản sự sa lắng Ngoài ra, KTTP cũng có những tác động khác đến độ ổn định Đối với hỗn dịch đặc, tương tác tiểu phân – tiểu phân lớn đáng kể, điều này có thể làm tăng độ nhớt của hỗn dịch Các tiểu phân nhỏ có tác động lớn hơn đối với sự tăng độ nhớt của hệ bởi vì chúng có tổng diện tích bề mặt lớn hơn các tiểu phân lớn Sự phân bố KTTP cũng đóng một vai trò quan trọng trong việc quyết định độ nhớt của hỗn dịch Hỗn dịch có phân bố KTTP rộng cho độ nhớt thấp hơn với hỗn dịch có phân bố KTTP hẹp [7]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: phức hợp lipid AMB

- Nguyên liệu:

Bảng 2.1 Nguyên liệu STT Tên nguyên liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn

2 Acid hydrochlorid đặc Trung Quốc BP 2013

8 Natri chlorid 0,9% Việt Nam DĐVN IV

11 Kali dihydrophosphat Trung Quốc TKHH

- Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu:

+ Hệ thống cất quay Rovapor R – 210 (Buchi, Đức), bình cầu NS 29/32, dung tích 1000 ml (Buchi, Đức)

+ Hệ thống phân tích kích thước Mastersizer 3000E (Malvern, Anh)

+ Máy đồng nhất áp suất cao EmulsiFlex – C5 (Avestin, Canada)

+ Hệ thống lọc tiếp tuyến (LTT) Sartoflow Slice 200 Benchtop, màng polysulfon 30 kD (Sartorius, Đức)

+ Máy đồng nhất kết hợp đùn qua màng LiposoFast LF 50 (Avestin, Canada)

+ Máy đo pH InoLab (WTW, Đức)

+ Bơm nhu động FLEXFLO ® A – 100N (Blu – White Industries, Mỹ) + Bơm nhu động FLOCON – 1003 (Frankfurt, Đức)

+ Kim tiêm 26G x 1/2” (Việt Nam)

+ Túi thẩm tích Spectrumlab/Por4, MWCO: 12 – 14 kD (Spectrum Labs – Mỹ)

+ Cân phân tích Satorius BP121S (Satorius, Đức)

+ Tủ sấy, tủ lạnh

+ Bể siêu âm Wiseclean (Wisd laboratory instrument, Đức)

+ Các dụng cụ thủy tinh, lọ thủy tinh trung tính, nút cao su, nắp nhôm, màng FTFE 5 μm, màng cellulose acetat 0,45 μm

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp bào chế phức hợp lipid AMB

Phức hợp lipid – AMB được bào chế bằng phương pháp vi dòng chảy Hòa tan AMB trong ethanol đã được acid hóa đến pH khoảng 0,5 – 1 bằng dung dịch HCl 2,5N trong cùng DMHC, siêu âm cho tan hoàn toàn, được dung dịch 1 Cân và hòa tan bằng siêu âm HSPC, DSPG với tỉ lệ mol tá dược HSPC: DSPG 7 :3 trong hỗn hợp CHCl3 : C2H5OH (tỉ lệ thể tích 1 : 1), được dung dịch 2 Phối hợp hai dung dịch

1 và 2, siêu âm để thu được dung dịch đồng nhất 3 Phối hợp dung dịch 3 (pha DMHC)

và pha nước bằng cách sử dụng hai bơm nhu động, trong đó bơm Flexflo bơm dung dịch 3, bơm Flocon bơm pha nước Tốc độ bơm pha nước là 14,2 ml/phút và pha DMHC là 7,5 ml/phút Các thông số kĩ thuật như sau: nhiệt độ phối hợp hai pha là 60 – 70oC, sử dụng đầu kim có kích thước 0,102 mm, bốc hơi dung môi bằng bằng hệ thống cất quay dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 60oC đến khi loại hết DMHC

Hỗn dịch thu được tiếp tục đem làm giảm KTTP theo phương pháp mô tả ở mục 2.2.2

Hình 2.1 Mô hình thiết bị trộn vi dòng chảy tạo phức hợp lipid AMB

Hình 2.2 Quy trình bào chế phức hợp lipid – AMB theo phương pháp vi dòng chảy

môi hữu cơ

2.2.2 Phương pháp làm giảm KTTP

Phức hợp lipid AMB sau khi bào chế được đồng nhất hóa để làm giảm kích

thước tiểu phân bằng các phương pháp sau:

- Phương pháp đồng nhất hóa áp suất cao trên máy EmulsiFlex - C5: hỗn dịch được đồng nhất nhiều chu kì ở áp suất 5000 psi

- Phương pháp đồng nhất hóa áp suất cao kết hợp đùn qua màng: hỗn dịch sau khi đồng nhất trên máy đồng nhất hóa áp suất cao ở áp suất 5000 psi một số chu kì thích hợp tiếp tục đùn qua màng PTFE kích cỡ lỗ lọc 5 μm với số lần thích hợp, thực hiện trên máy LiposoFast LF-50

2.2.3 Phương pháp tinh chế hỗn dịch

Dùng hệ thống LTT để loại bớt dung môi, ion hòa tan, phân tử AMB hòa tan

để làm đặc hỗn dịch đến nồng độ 5 mg/ml Tiến hành trên hệ thống LTT Sartoflow Slice 200 Benchtop, màng polysulfon, kích thước lỗ lọc 30 kD (Sartorius Stedim Biotech GmbH, Đức)

Hình 2.3 Cơ chế của phương pháp LTT [16]

Hình 2.4 Hệ thống LTT Sartoflow Slice 200 Benchtop [17]

Cho hỗn dịch phức hợp lipid AMB ban đầu vào bình chứa, hoạt động hệ thống

ở chế độ đẳng dòng 100ml/phút đến khi đạt thể tích yêu cầu

2.2.4 Phương pháp đánh giá hỗn dịch phức hợp lipid AMB

2.2.4.1 Đánh giá hình thức

Bằng cảm quan, hỗn dịch thuốc tiêm chứa phức hợp lipid AMB phải là hỗn dịch màu vàng sáng, không có tinh thể kết tủa, để lâu có thể sa lắng nhưng phân tán lại đồng nhất khi lắc nhẹ

2.2.4.2 Đánh giá KTTP bằng phương pháp tán xạ laser

- Mục đích: Đánh giá KTTP qua các thông số D[4,3], Dv(90), Span

- Thiết bị: Máy Mastersizer 3000E

- Tiến hành: Cho khoảng 400 ml môi trường phù hợp vào cốc có mỏ 500 ml Đặt cốc vào máy đo Mastersizer 3000E Nhỏ hỗn dịch phức hợp lipid AMB vào cốc có mỏ cho đến khi độ đục đạt khoảng 10%

- Ý nghĩa của các thông số:

+ D[4,3] (μm): KTTP trung bình theo thể tích

+ Dv(90) (μm): 90% tiểu phân có kích thước dưới giá trị Dv(90)