Nghiên cứu tổng hợp dẫn chất phosphat của curcumin

BỘ Y TẾ TRƯ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘ ỘI - - NÔNG THỊ BÍCH VÂN MÃ SINH VIÊN: 1201696 NGHIÊN CỨU C TỔNG HỢP P DẪN CHẤT T PHOSPHAT CỦA CURCUMIN KHÓA LUẬN LU TỐT NGHIỆP DƯỢC CS SĨ HÀ NỘI - 2017 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI - - NÔNG THỊ BÍCH VÂN MÃ SINH VIÊN: 1201696 NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP DẪN CHẤT PHOSPHATCỦA CURCUMIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Nguyễn Văn Hải ThS Phạm Thị Hiền Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dược Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI – 2017 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Văn Hải ThS.Phạm Thị Hiền, người thầyđã trực tiếp hướng dẫn, tận tình truyền đạt, bảo cho tôinhững kiến thức, kinh nghiệm quý báu tạo điều kiện giúp đỡ suốt quãng thời gian thực khóa luận Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Đình Luyện vàThS Nguyễn Văn Giang nhiệt tình giúp đỡ, động viên khích lệ tạo điều kiện tốt để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Nhà trường toàn thể thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện tốt cho suốt trình học tập trường Trong trình thực khóa luận nhận giúp đỡ cán thuộc Phòng phân tích, Kiểm nghiệm Tương đương sinh học, Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia, cán Phòng NMR Viện Hóa học cán Phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, xin chân thành cảm ơn Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến gia đình, người bạn giúp đỡ, chia sẻ, động viên, khích lệ sống học tập! Do thời gian làm thực nghiệm kiến thức thân hạn chế, nên khóa luận không tránh khỏi nhiều thiếu sót Tôi mong nhận góp ý thầy cô, bạn bè để khóa luận hoàn thiện Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 18 tháng 05 năm 2017 Sinh viên Nông Thị Bích Vân MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan curcumin 1.1.1 Cấu trúc, tính chất curcumin 1.1.2 Vai trò curcumin với sức khỏe 1.2 Các dẫn chất bán tổng hợp curcumin 1.3 Lựa chọn hướng nghiên cứu tổng hợp thử tác dụng sinh học 12 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Nguyên liệu - hóa chất 15 2.2 Dụng cụ - thiết bị 16 2.3 Nội dung nghiên cứu 17 2.4 Phương pháp nghiên cứu 17 2.4.1 Tổng hợp hóa học 17 2.4.2 Kiểm tra độ tinh khiết 18 2.4.3 Xác định cấu trúc hóa học 18 2.4.4 Thử hoạt tính sinh học 18 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22 3.1 Tổng hợp hóa học 22 3.1.1 Tổng hợp dẫn chất mono-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin (CV-1) 22 3.1.2 Tổng hợp dẫn chất 2-(curcumin-O-yl)ethyl dihydrophosphat (CV-2) 25 3.2 Xác định cấu trúc 29 3.2.1 Kết phân tích phổ CV-1 29 3.2.2 Kết phân tích phổ CV-2 29 3.3 Thử hoạt tính sinh học 31 3.3.1 Thử hoạt tính ức chế sinh NO 31 3.3.2 Thử hoạt tính chống oxy hóa hệ DPPH (1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl) 32 3.4 Bàn luận 33 3.4.1 Về tổng hợp hóa học 33 3.4.2 Về xác định cấu trúc CV-2 36 3.4.3 Về thử hoạt tính sinh học 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT 13 C-NMR Cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 (Carbon 13 nuclear magnetic resonance) H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton(1H - Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy) AR Tinh khiết phân tích (Analytical reagent) CTCT Công thức cấu tạo CTPT Công thức phân tử CV-1 mono-O-(2-Hydroxyethyl)-curcumin CV-2 2-(Curcumin-O-yl)ethyl dihydrophosphat DMEM Môi trường nuôi cấy Dulbecco (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) DMSO Dimethyl sulfoxid DPPH 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl đvC Đơn vị carbon FBS Huyết bào thai bò (Fetal bovine serum) g Gam h Giờ HIV Virus gây suy giảm miễn dịch người (Human immunodeficiency virus) IC50 Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử(Inhibition concentration at 50%) L-NMMA NG-methyl-L-arginin acetat logP Hệ số phân bố dầu nước LPS Lipopolysaccharids MS Phổ khối lượng (Mass spectrometry) MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromid Rf Hệ số lưu giữ(Retention factor) SC50 Nồng độ trung hòa 50% gốc tự do(Scavenging concentration at 50%) SKLM Sắc ký lớp mỏng δ Độ chuyển dịch hóa học RAW 264.7 Dòng đại thực bào chuột 264.7 T°nc Nhiệt độ nóng chảy SOD Chất chống oxy hóa phân giải dây chuyền (superoxide dismutase) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Sơ lược số hướng biến đổi cấu trúc curcumin 10 Bảng 2.1 Danh mục nguyên liệu – hóa chất 15 Bảng 2.2 Danh mục dụng cụ – thiết bị 16 Bảng 3.1 Kết khảo sát tỷ lệ mol 2-bromoethanol : curcumin 23 Bảng 3.2 Kết khảo sát nhiệt độ phản ứng tạo CV-1 24 Bảng 3.3 Kết khảo sát tỷ lệ mol POCl3 : CV-1 28 Bảng 3.4 Kết khảo sát nhiệt độ, thời gian phản ứng tạo CV-2 28 Bảng 3.5 Kết phân tích phổ khối lượng (CH3OH) CV-1 29 Bảng 3.6 Kết phân tích phổ khối lượng (CH3OH) CV-2 30 Bảng 3.7 Kết phân tích phổ 1H- NMR (DMSO) CV-2 30 Bảng 3.8 Kết phân tích phổ 13C-NMR (DMSO) CV-2 31 Bảng 3.9 Khả ức chế sản sinh NO lên dòng tế bào RAW 264.7 32 Bảng 3.10 Tác động mẫu nghiên cứu đến sống sót tế bào RAW 264.7 32 Bảng 3.11 Kết thử hoạt tính chống oxy hóa 32 Bảng 3.12 Giá trị logP CV-2, CV-1 curcumin .37 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Công thức cấu tạo curcumin Hình 1.2 Dạng hỗ biến ceton - enol curcumin dung dịch Hình 1.3 Phản ứng khử curcumin thành tetrahydrocurcumin Hình 1.4 Sự phân hủy curcumin tác dụng ánh sáng .4 Hình 1.5 Sự phân hủy curcumin môi trường kiềm Hình 1.6 Sơ đồ tổng hợp curcumin theoPabon Hình 1.7 Phản ứng curcumin với gốc tự .7 Hình 1.8 Các đích phân tử chế chống viêm curcumin Hình 1.9 Các vị trí biến đổi cấu trúc curcumin Hình 1.10 Công thức số dẫn chất curcumin .11 Hình 1.11 Một số tiền thuốc phosphat .13 Hình 1.12.Cấu tạo curcumin-O-yl dihydrophosphat 13 Hình 1.13 Sơ đồ tổng hợp 2-(curcumin-O-yl)ethyl dihydrophosphat (CV-2) 14 Hình 2.1 Sơ đồ tổng hợp CV-1 CV-2 17 Hình 3.1 Sơ đồ phản ứng tổng hợp CV-1 22 Hình 3.2 Sơ đồ tổng hợp CV-2 acid phosphoric .25 Hình 3.3 Sơ đồ tổng hợp phosphoryl oxyclorid .26 Hình 3.4 Sơ đồ phản ứng tổng hợp CV-2 phosphoryl oxyclorid 27 Hình 3.5 Công thức cấu tạo CV-2 .30 Hình 3.6 Cơ chế phản ứng phosphat hóa alcol acid phosphoric .34 Hình 3.7 Phản ứng tạo sản phẩm phụ 34 Hình 3.8 Cơ chế phản ứng phosphat hóa phosphoryl oxyclorid .35 Hình 3.9 Đồ thị phần trăm ức chế sinh NO theo nồng độ (µg/ml) 38 ĐẶT VẤN ĐỀ Nghệ vị thuốc truyền thống lâu đời nước phương Đông, từ xa xưa, người biết sử dụng thân rễ nghệ nghiền thành bột để làm thuốc chữa bệnh, làm gia vị, mỹ phẩm hay làm phẩm màu Hiện nay, nghiên cứu curcuminoid nhóm hoạt chất tạo nên tác dụng sinh học quan trọng củ nghệ Hỗn hợp curcuminoid gồm curcumin, demethoxycurcumin bisdemethoxycurcumin curcumin thành phần chính[31] Curcumin có nhiều hoạt tínhsinh học như: chống oxy hóa, chống viêm, kháng khuẩn, phòng hỗ trợ điều trị ung thư, suy giảm rối loạn chức thần kinh…[2, 28] Các nghiên cứu curcumin có độ an toàn cao, không gây tác dụng phụ nào, không độc đến liều g/ngày[28] Tuy có nhiều tác dụng trênnhưng việc ứng dụng curcumin lâm sàng lại gặp khó khăn độ tan curcumin nước pH acid sinh lý thấp, độ ổn định kém, bị chuyển hóa nhanh chóng sử dụng theo đường uống dẫn đến sinh khả dụng curcumin thấp[31] Kết bán tổng hợp dẫn chất nhằm tăng độ tan curcumin cho thấy dẫn chất cấu trúc nhóm –OH phenol cho hoạt tính sinh học tốt[15] Trong đó, dẫn chất mono-O-(2hydroxyethyl)-curcumin đánh giá có hoạt tính chống oxy hóa hệ DPPH hoạt tính kháng tế bào ung thư gan HepG2 cao curcumin Tuy độ tan dẫn chất chưa cải thiện nhiều [3] Các nghiên cứu cho thấy, gắn nhóm phosphat, độ tan số chất tăng lên đáng kể [11] Trên sở đó, thực đề tài “Nghiên cứu tổng hợp dẫn chất phosphat curcumin” với hai mục tiêu: Tổng hợpđược dẫn chất phosphat curcumin Thử hoạt tính sinh học dẫn chất tổng hợp được: hoạt tính ức chế sinh NO hoạt tính chống oxy hóahệ DPPH PHỤ LỤC Phụ lục Phổ MS positive c CV-1 Phụ lục Phổ MS negative c CV-2 Phụ lục Phổ 1H-NMR NMR c chất CV-2 Phụ lục Phổ 1H-NMR NMR giãn c chất CV-2 Phụ lục Phổ 1H-NMR NMR giãn c chất CV-2 (tiếp theo) Phụ lục Phổ 13C-NMR NMR c chất CV-2 Phụ lục Phổ 13C-NMR NMR giãn c chất CV-2 Phụ lục Phổ 13C-NMR NMR giãn c chất CV-2 (tiếp theo) Phụ lục Phổ MS positive c CV-1 Phụ lục 10 Phổ MS negative CV-2 Ph Phụ lục 11 Phổ 1H-NMR chất CV-2 Phụ lục 12 Phổ 1H-NMR giãn chất CV-2 Phụ lục 13 Phổ 1H-NMR giãn chất CV-2 (tiếp theo) Phụ lục 14 Phổ 13C-NMR chất CV-2 Phụ lục 15 Phổ 13C-NMR giãn chất CV-2 Phụ lục 16 Phổ 13C-NMR giãn chất CV-2 (tiếp theo) VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC _ Địachỉ: 18 Hoang Quoc Viet, Caugiay, Hanoi, Vietnam Tel: 844-38361774; Fax: 844-38363144; Email: thaodo@ibt.ac.vn KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH ỨC CHẾ NITRIC OXIDE (NOs INHIBITION) CHỐNG OXI HÓA HỆ DPPH (Kết thử nghiệm có giá trị với mẫu đem thử) - Tên mẫu: Mẫu Curcumin phosphate (CV-1), Curcumin, Mono-O-(2hydroxyethyl) curcumin (CV-0) - Mẫu thử: Ở dạng chất tinh Trên nhãn ghi tên mẫu rõ ràng - Ngày sản xuất: - Người gửi mẫu: Trường đại học Dược Hà Nội - Thời hạn thử nghiệm: tháng 5/2017 - Tài liệu tham khảo:        Liao H, Banbury L, Liang H, Wang X, Lü X, Hu L, Wu J (2014) Effect of Honghua (Flos Carthami) on nitric oxide production in RAW 264.7 cells and α-glucosidase activity Journal of Traditional Chinese Medicine 34(3): 362-368 Combet S, Balligand JL, Lameire N, Goffin E, Devuyst O (2000) A specific method for measurement of nitric oxide synthase enzymatic activity in peritoneal biopsies Kidney International57(1):332-8 Tsai PJ, Tsai TH, Yu CH, Ho SC (2007) Comparison of NO-scavenging and NOsuppressing activities of different herbal teas with those of green tea Food Chemistry, 103(1), 181-187 Bernardes NR, Heggdorne-Araújo M, Borges IF, Almeida FM, Amaral EP, Lasunskaia EB, Muzitano MF, Oliveira DB (2014) Nitric oxide production, inhibitory, antioxidant and antimycobacterial activities of the fruits extract and flavonoid content of Schinus terebinthifolius Revista Brasileira de Farmacognosia, 24(6), 644-650 Cheenpracha S, Park EJ, Rostama B, Pezzuto JM, Chang LC (2010) Inhibition of nitric oxide (NO) production in lipopolysaccharide (LPS)-activated murine macrophage RAW 264.7 cells by the norsesterterpene peroxide, epimuqubilin A Marine drugs, 8(3), 429-437 Brighente I M C, Dias M, Verdi L G, Pizzolatti M G (2007) Antioxidant Activity and total phenolic content of some Brazilian species Pharmaceutical Biology, Vol 45, No 2, pp 156–161 Kamran G, Yosef G, Mohammad A, Ebrahimzadeh (2009 ) Antioxidants Activity, flavonoids phenol and contents peels and 13 of citrus species tissues Pak J Pharm Sci., Vol.22, No.3, pp.277-281    L B S Kardono, C K Angerhofer, S Tsauri, K Padmawinata, J M Pezzuto, A D Kinghorn (1991): Cytotoxic and antimalarial constituents of the roots of Eurycoma longifolia; J Nat Prod., No 5, Vol 54, 1360-1367 Yuvaraj P, Subramoniam A, Louis T, Madhavachandran V, Narasu ML (2013) Attenuation of expression of cytokines, oxidative stress and inflammation by hepatoprotective phenolic acids from Thespesia populnea Soland ex Correa stem bark Annals of Phytomedicine, 2(2): 47-56 Peiyuan Li, Lini Hou, Wei Su, Rumei Lu, Chaocheng Deng, Liangquan Liu, Yongkun Deng, Nana Guo, Chengsheng Lu and Chunling He (2011) Free radicalscavenging capacity, antioxidant activity and phenolic content of Pouzolzia zeylanica Journal of the Serbian Chemical Society, Vol 76, No 5, pp 709-717 I VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.1 Vật liệu - - Lipopolysaccharides (LPS) từEscherichia- colicủa Sigma Chemical Co (St Louis, MO, USA) Dulbecco’s ModifiedEagle’s Medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS) hãng Life Technologies, Inc.,(Gaithersburg, MD, USA) Sodium nitrite, sulfanilamide, N-1napthylethylenediaminedihydrochloride and dimethyl sulphoxide (DMSO) Sigma ChemicalCo (St Louis, MO, USA) hóa chất cần thiết khác hãng Sigma, GIBCO, Invitrogen, Promega v.v Dòng tế bào: RAW 264.7 GS TS J M Pezzuto, Trường Đại học Hawaii GS Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia cung cấp 1.2 Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro - - Dòng tế bào RAW264.7 nuôi cấy môi trường DMEM với thành phần kèm theo gồm mM L-glutamine, 10 mM HEPES, 1,0 mM sodium pyruvate, bổ sung 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO) Tế bào cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) nuôi tủ ấm CO2 điều kiện 37oC, 5% CO2 1.3 Phương pháp xác định khả ức chế sản sinh NO tế bào macrophage RAW 264.7 - Tế bào RAW 274.7 đưa vào đĩa 96 giếng nồng độ x 104tb/giếng nuôi tủ ấm 37oC 5% CO2 24h Tiếp theo, môi trường nuôi cấy loại bỏ, thay môi trường DMEM FBS 3h Tế bào sau ủ mẫu nghiên cứu nồng độ khác 2h trước kích thích sản sinh yếu tố NO LPS (1μg/mL) 24h - - - - Một số giếng không ủ mẫu mà sử dụng dung dịch pha mẫu coi đối chứng âm Trong đối chứng dương sử dụng NG-Methyl-Larginine acetate (L-NMMA) (Sigma) Nitrite (NO2-), xem thị cho việc tạo NO, xác định nhờ Griess Reagent System (PromegaCooperation, WI, USA) Cụ thể là, 100 μL môi trường nuôi tế bào (ủ mẫu) chuyển sang đĩa 96 thêm vào 100 μL Griess reagent: 50 μL of 1% (w/v) sulfanilamide 5% (v/v) phosphoric acid 50 μL 0.1% (w/v) N-1-naphthylethylenediamine dihydrochloride pha nước Hỗn hợp ủ tiếp nhiệt độ phòng 10 phút hàm lượng nitrite đo máy microplate reader bước song 540 nm Môi trường DMEM không FBS sử dụng giếng trắng (blank) Hàm lượng nitrite mẫu thí nghiệm xác định nhờ vào đường cong hàm lượng chuẩn NaNO2 so sánh % với mẫu chứng âm (LPS) Khả ức chế sản sinh NO mẫu xác định nhờ công thức : % ức chế =100%- [hàm lượng NOsample/hàm lượng NOLPS]*100 Phép thử lặp lại lần để đảm bảo tính xác Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% hình thành NO) xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4 1.4 Phép thử sinh học xác định khả gây độc tế bào MTT - - - Chất thử (20 l) đưa vào giếng khay 96 giếng để có nồng độ tương tự nồng độ thí nghiệm NO - Sau điều chỉnh để có mật độ tế bào phù hợp, hút 180 l tế bào vào giếng khay 96 giếng có chất thử Trên đĩa thử, bố trí số giếng để làm đối chứng mẫu thử, có dung môi pha mẫu DMSO10% - Để đĩa nuôi cấy vào tủ ấm CO2 điều kiện 37oC, 5% CO2, nuôi thời gian 72 Sau 72 giờ, 10µl MTT (nồng độ cuối 5mg/ml) cho vào giếng Sau 4h, loại bỏ môi trường, tinh thể formaran hòa tan 50µl (DMSO) 100% Giá trị OD đo bước sóng 540nm máy quang phổ Lượng tế bào sống sót tính theo công thức: OD(chất thử)-OD(đối chứng trắng) % ức chế = 100% OD(DMSO)-OD(đối chứng trắng) 1.5.Phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa DPPH Được tiến hành theo phương pháp P Yuvaraj cộng (2013) có chỉnh sửa nhỏ Cụ thể là: - - - Mẫu thử pha stock DMSO, sau pha thành dải nồng độ thử mẫu sau400; 200; 100; 50; 25; 12,5µg/ml (tùy mẫu) với nước cất khử ion Ascorbic acid (đối chứng tham khảo) pha thành dải nồng độ 100;50; 25; 12,5; 6,25µg/ml với nước cất khử ion DPPH pha methanol (100%) nồng độ 0,25 µM Hút mẫu nghiên cứu pha nồng độ vào ống thủy tinh Thêm dung dịch DPPH chuẩn bị vào ống có sẵn mẫu nghiên cứu (tỉ lệ 1:1) Ống mẫu thử có 1ml nước ml DPPH Ủ nhiệt độ phòng 30 phút Xác định độ hấp thụ dung dịch sau phản ứng bước sóng 517 nm Vì mẫu nghiên cứu dung dịch DPPH đưa vào ống theo tỷ lệ 1:1, nên nồng độ mẫu nghiên cứu ống có DPPH giảm nửa 200; 100; 50; 25; 12,5; 6,25 µg/ml Và nồng độ Ascorbic acid (VitC) ống có DPPH giảm nửa 100; 50, 25; 12,5; 6,25; 3,125µg/ml Ống có dung môi hòa mẫu nghiên cứu dung dịch DPPH xem đối chứng Ống có sử dụng Ascorbic acid chất đối chứng tham khảo Khả trung hòa gốc oxy hóa tự (Scavenging Activities - SA) sinh từ DPPH mẫu thử tính theo công thức sau: % SA = (ODđối chứng – ODmẫu thử)*100/ODđối chứng (%) Trong đó: ODđối chứng : Độ hấp thụ giếng không chứa chất thử ODmẫu thử : Độ hấp thụ giếng chứa chất thử - Giá trị SC50 (Scavenging Concentration at 50% - nồng độ trung hòa 50% gốc tự DPPH) xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Hoạt tính ức chế sinh NO Nhiều nghiên cứu NO phân tử quan trọng tham gia điều chỉnh nhiều trình sinh lý thể phản ứng phòng vệ vật chủ chống lại tác nhân gây bệnh, liên kết thần kinh, giãn mạch v.v Tuy nhiên, sản xuất nhiều NO gây tổn thương mô liên quan đến trình viêm cấp viêm mạn tính Do ức chế sản sinh NO góp phần giảm phản ứng viêm Khả kháng viêm mẫu thí nghiệm thông qua khả ức chế sản sinh NO thực mô hình tế bào RAW 264.7 kích thích LPS 0.6 y = 0.010x + 0.056 R² = 0.998 Giá trị OD 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 10 20 30 40 50 60 Nồng độ NaNO2 (µM) Hình đường chuẩn NaNO2 Dựa phương trình đường chuẩn NaNO2 (hình 1), xác định hàm lượng NO sinh ủ mẫu thí nghiệm với tế bào macrophage (RAW 264.7) kích thích LPS Từ % ức chế sản sinh NO mẫu thí nghiệm tính toán thể qua bảng 1: Bảng Khả ức chế sản sinh NO mẫu nghiên cứu % ức chế sinh NO Nồng độ (µg/ml) 50 25 12.5 6.25 3.125 IC50 Curcumin phosphate (CV-1) Curcumin Mono-O-(2hydroxyethyl)curcumin (CV-0) L-NMMA 97.23 99.70 97.09 92.19 97.16 98.11 98.98 75.18 79.33 92.67 95.49 63.47 65.50 67.07 70.01 30.01 57.06 50.61 48.03 2.09 ±0.14 2.76 ±0.08 3.82 ±0.12 7.63 ±0.52 Bảng 2: Tác động mẫu nghiên cứu đến sống sót tế bào RAW 264.7 % tế bào sống Nồng độ (µg/ml) 50 25 12.5 Curcumin phosphate (CV-1) Curcumin Mono-O-(2hydroxyethyl)curcumin (CV-0) L-NMMA 43.10 19.32 19.32 87.92 102.99 10.05 19.92 95.01 108.16 83.12 113.22 Kết cho thấy: nồng độ 50 μg/ml, mẫu nghiên cứu ức chế tế bào phát triển mức >50% Vì vậy, giá trị IC50 mẫu tính từ nồng độ thấp Kết phép thử ức chế NO mẫu cho thấy mẫu nghiên cứu thể hoạt tính mạnh với giá trị IC50 từ 2.09 – 3.82 μg/ml Các mẫu lại cho thấy hoạt tính yếu Chất đối chứng dương L-NMMA hoạt động ổn định thí nghiệm Hoạt tính chống oxy hóa thông qua hệ DPPH 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) gốc tự có màu tím, có độ hấp thu cực đại bước sóng 517 nm Khi có mặt chất chống oxi hóa, bị khử thành 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazine(DPPH-H), có màu vàng Đo độ giảm độ hấp thu bước sóng 517nm để xác định khả khử gốc DPPH chất chống oxi hóa Kết xác định hoạt tính chống oxi hóa thông qua phép thử trung hòa gốc tự DPPH trình bày bảng sau: Bảng Hoạt tính chống oxi hóa hệ DPPH Hoạt tính chống oxi hóa Nồng độ (µg/ml) Curcumin phosphate (CV-1) Nồng độ (µg/ml) Ascorbic acid (VitC) 200 81,78 50 91,66 100 63,82 25 79,65 50 43,19 12.5 62,17 25 31,44 6.25 31,30 12.5 18,04 3.125 22,56 SC50 61.64 ±3.40 9.69 ±1.15 Kết cho thấy mẫu Curcumin phosphate (CV-1) thể hoạt tính chống oxi hóa thông qua phép thử trung hòa gốc tự DPPH với SC50 61.64 ±3.40 µg/ml Đối chứng tham khảo Ascorbic acid (VitC) hoạt động ổn định thí nghiệm Dưới hình ảnh kết thí nghiệm: chất CV-1 thể hoạt tính chống oxi hóa nên làm giảm màu DPPH, từ màu tím chuyển sang màu vàng Ascorbic acid CV-1 Hình Ảnh thí nghiệm chống oxi hóa DPPH KẾT LUẬN  Trong phép thử ức chế NO mẫu cho thấy mẫu nghiên cứu thể hoạt tính mạnh với giá trị IC50 từ 2.09 – 3.82 μg/ml;  Mẫu Curcumin phosphate (CV-1) thể hoạt tính chống oxi hóa thông qua phép thử trung hòa gốc tự DPPH với SC50 61.64 ±3.40 µg/ml Hà Nội, ngày Xác nhận Viện Công nghệ sinh học tháng năm 2017 Trưởng phòng PGS.TS Đỗ Thị Thảo ... chất tăng lên đáng kể [11] Trên sở đó, thực đề tài Nghiên cứu tổng hợp dẫn chất phosphat curcumin với hai mục tiêu: Tổng hợp ược dẫn chất phosphat curcumin Thử hoạt tính sinh học dẫn chất tổng. .. 500 µL Mỹ 16 2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Tổng hợp hóa học:  Tổng hợp dẫn chất mono-O-(2-hydroxyethyl) -curcumin (CV-1)  Tổng hợp dẫn chất 2- (curcumin- O-yl)ethyl dihydrophosphat (CV-2) -Sơ kiểm... BÀN LUẬN 22 3.1 Tổng hợp hóa học 22 3.1.1 Tổng hợp dẫn chất mono-O-(2-hydroxyethyl) -curcumin (CV-1) 22 3.1.2 Tổng hợp dẫn chất 2- (curcumin- O-yl)ethyl dihydrophosphat (CV-2)