Nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng sinh học một số dẫn chất hydroxyethyl của curcumin

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI - - HOÀNG THỊ THÙY DUNG MÃ SINH VIÊN: 1101084 NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC MỘT SỐ DẪN CHẤT HYDROXYETHYL CỦA CURCUMIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2016 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI - - HOÀNG THỊ THÙY DUNG MÃ SINH VIÊN: 1101084 NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC MỘT SỐ DẪN CHẤT HYDROXYETHYL CỦA CURCUMIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Phạm Thị Hiền Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dược Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2016 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Văn Hải ThS Phạm Thị Hiền, người thầy trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt cho kiến thức, kinh nghiệm u trình h c tập nghi n cứu v h Tôi xin chân thành u v tạ n th nh h i điều iện gi p đ t i uận tốt nghiệp n ơn PGS.TS Nguyễn Đình Luyện ThS Nguyễn Văn Giang nhiệt t nh gi p đ động viên khích lệ v tạ điều kiện tốt để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp n Tôi xin chân thành thầ c gi ơn Ban Giám hiệu Nh trường toàn thể Trường Đại h c Dược Hà Nội u n tạ điều kiện tốt cho suốt trình h c tập trường Trong trình thực khóa luận t i nhận gi p đ cán thuộc Phòng phân tích, Kiểm nghiệ v Tương đương sinh h c, Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia, cán Phòng thí nghiệ H dược, Khoa Hóa h c Trường Đại h c Tự nhiên - Đại h c Quốc gia Hà Nội cán Phòng Thử nghiệm sinh h c, Viện Công nghệ sinh h c, Viện Hàn lâm Khoa h c Công nghệ Việt Nam, xin chân thành ơn Cuối cùng, xin gửi lời ơn đặc biệt đến gi đ nh v ạn bè - người u n động viên, khích lệ sống h c tập! Do thời gian làm thực nghiệ iến thức thân hạn chế, nên khóa luận không tránh khỏi nhiều thiếu sót Tôi mong nhận góp ý thầy cô, bạn è để khóa luận hoàn thiện Xin chân thành ơn! Hà Nội ng 12 th ng 05 nă 2016 Sinh viên Hoàng Thị Thùy Dung MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ CURCUMIN 1.1.1 Cấu trúc hóa học curcumin 1.1.2 Phƣơng pháp điều chế curcumin 1.1.2.1 Chiết xuất curcumin từ củ nghệ 1.1.2.2 Tổng hợp hóa học 1.1.3 Tính chất hóa lý curcumin 1.1.4 Độ ổn định curcumin 1.1.5 Tác dụng sinh học curcumin 1.2 BÁN TỔNG HỢP CÁC DẪN CHẤT MỚI NHẰM TĂNG TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CURCUMIN .11 1.3 LỰA CHỌN HƢỚNG NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC .15 CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 NGUYÊN LIỆU - HÓA CHẤT 16 2.2 DỤNG CỤ - THIẾT BỊ 16 2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 18 2.4 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.4.1 Tổng hợp hóa học 18 2.4.2 Kiểm tra độ tinh khiết 19 2.4.3 Xác định cấu trúc hóa học 19 2.4.4 Thử hoạt tính sinh học 20 2.4.4.1 Thử tác dụng chống oxy hóa theo phƣơng pháp DPPH 20 2.4.4.2 Thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ dòng tế bào ung thƣ gan (HepG2) theo phƣơng pháp MTT 21 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24 3.1 TỔNG HỢP HÓA HỌC .24 3.1.1 Tổng hợp dẫn chất di-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin (DH-1) 24 3.1.2 Tổng hợp dẫn chất mono-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin (DH-2) 25 3.1.3 Tóm tắt kết tổng hợp hóa học 27 3.2 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC .28 3.2.1 Kết phân tích phổ khối lƣợng (MS) 28 3.2.2 Kết phân tích phổ hồng ngoại (IR) 29 3.2.3 Kết phân tích phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) 30 3.3 THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC 31 3.3.1 Thử tác dụng chống oxy hóa 31 3.3.2 Thử tác dụng gây độc tế bào ung thƣ gan (HepG2) 32 3.4 BÀN LUẬN 32 3.4.1 Về tổng hợp hóa học 32 3.4.1.1 Nhận xét phản ứng tạo dẫn chất hydroxyethyl curcumin 32 3.4.1.2 Về phản ứng tổng hợp di-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin (DH-1) 33 3.4.1.3 Về phản ứng tổng hợp mono-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin (DH-2) 33 3.4.2 Về xác định cấu trúc 34 3.4.2.1 Cấu trúc DH-1 34 3.4.2.2 Cấu trúc DH-2 35 3.4.3 Về thử hoạt tính sinh học 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT H-NMR AR H - Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy (Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton) Analytical reagent (Tinh khiết phân tích) CTCT Công thức cấu tạo CTPT Công thức phân tử DH-1 di-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin DH-2 mono-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin DMSO Dimethyl sulfoxid DPPH 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl đvC Đơn vị cacbon g Gam HIV Human immunodeficiency virus (Virus gây suy giảm miễn dịch ngƣời) HPLC Hpƣ High-performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) Hiệu suất phản ứng IC50 Inhibition concentration at 50% (Nồng độ ức chế 50% đối tƣợng thử) IR Infrared spectroscopy (Phổ hồng ngoại) KLsp Khối lƣợng sản phẩm LDL Low densitylipoprotein (cholesterol có tỉ trọng phân tử thấp) MS Mass spectrometry (Phổ khối lƣợng) MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromid PMA Paramethoxyamphetamin Rf Retention factor (Hệ số lƣu giữ) SC50 Scavenging concentration at 50% (Nồng độ trung hòa đƣợc 50% gốc tự do) SKLM Sắc ký lớp mỏng t1/2 Thời gian bán thải Tonc Nhiệt độ nóng chảy DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Danh mục nguyên liệu - hóa chất 16 Bảng 2.2 Danh mục dụng cụ - thiết bị 17 Bảng 3.1 Kết khảo sát phản ứng tạo DH-2 .27 Bảng 3.2 Kết tổng hợp hoá học 28 Bảng 3.3 Kết phân tích phổ khối lƣợng (CH3OH) DH-1 DH-2 .28 Bảng 3.4 Kết phân tích phổ hồng ngoại (KBr) DH-1 DH-2 29 Bảng 3.5 Kết phân tích phổ 1H - NMR DH-1 DH-2 30 Bảng 3.6 Kết thử hoạt tính chống oxy hóa 31 Bảng 3.7 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ gan HepG2 32 Bảng 3.8 Kết xác định log P hoạt tính sinh học 37 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1 Công thức cấu tạo curcumin Hình 1.2 Sơ đồ tổng hợp curcumin theo K Babu .3 Hình 1.3 Sơ đồ tổng hợp curcumin theo J Pavolini Hình 1.4 Phản ứng imin hóa β-diceton curcumin .4 Hình 1.5 Dạng hỗ biến ceton - enol curcumin dung dịch Hình 1.6 Phản ứng curcumin với gốc tự Hình 1.7 Phản ứng khử curcumin thành tetrahydrocurcumin .6 Hình 1.8 Các dạng tồn curcumin theo pH dung dịch Hình 1.9 Sự phân hủy curcumin môi trƣờng kiềm Hình 1.10 Sự phân hủy curcumin dƣới tác dụng oxy ánh sáng Hình 1.11 Các vị trí tác động để thay đổi cấu trúc curucmin 12 Hình 1.12 Dẫn chất glycosyl-curcumin 13 Hình 1.13 Một số dẫn chất acyl hóa curcumin 14 Hình 1.14 Dẫn chất hydroxyethyl curcumin 14 Hình 1.15 Một số dẫn chất khác curcumin 15 Hình 1.16 Sơ đồ tổng hợp dẫn chất hydroxyethyl curcumin C Changtam cộng (2010) 15 Hình 2.1 Sơ đồ tổng hợp dẫn chất hydroxyethyl curcumin 18 Hình 3.1 Sơ đồ phản ứng tổng hợp DH-1 sử dụng tác nhân 2-bromoethanol 24 Hình 3.2 Sơ đồ phản ứng tổng hợp DH-2 sử dụng tác nhân 2-cloroethanol 25 Hình 3.3 Dạng hỗ biến ceton - enol 34 ĐẶT VẤN ĐỀ Từ lâu, ngƣời biết sử dụng nghệ để làm thuốc chữa bệnh, làm gia vị, làm phẩm màu cho việc chế biến thực phẩm Trong y học cổ truyền, nghệ đƣợc dùng để chữa bệnh nhƣ: loét dày, loét da, hen suyễn, bỏng [2] Hiện nay, có nhiều nghiên cứu curcuminoid nhóm hoạt chất tạo nên tác dụng sinh học quan trọng củ nghệ Hỗn hợp curcuminoid gồm curcumin, demethoxycurcumin bisdemethoxycurcumin curcumin thành phần [5] Curcumin có nhiều tác dụng sinh học nhƣ: chống oxy hóa, chống viêm, chống đái tháo đƣờng, ức chế phát triển khối u, hỗ trợ điều trị bệnh Alzheimer Hơn nữa, với có mặt nhóm β-diceton trung tâm phân tử, tạo phức chelat với nhiều ion kim loại nặng nhƣ đồng, thủy ngân… thể ngƣời giúp làm giảm triệu chứng bệnh tật [18] Các nghiên cứu curcumin có độ an toàn cao, không gây tác dụng phụ nào, không độc đến liều g/ngày [29] Tuy có nhiều tác dụng nhƣ nhƣng việc ứng dụng curcumin lâm sàng lại gặp khó khăn độ tan curcumin nƣớc pH acid sinh lý thấp, độ ổn định kém, bị chuyển hóa nhanh chóng sử dụng theo đƣờng uống dẫn đến sinh khả dụng curcumin thấp [12] Với hạn chế đó, nhiều nghiên cứu đƣợc thực để biến đổi cấu trúc curcumin nhƣ sửa đổi chuỗi bên aryl, chức diceton, liên kết đôi, tạo phức kim loại curcumin, nhằm bán tổng hợp dẫn chất curcumin làm tăng sinh khả dụng, phát huy tác dụng curcumin Trên sở đó, thực đề tài “Nghiên cứu tổng hợp thử tác dụng sinh học số dẫn chất hydroxyethyl curcumin” với hai mục tiêu: Tổng hợp số dẫn chất hydroxyethyl curcumin Thử hoạt tính sinh học chất tổng hợp đƣợc: hoạt tính chống oxy hóa theo phƣơng pháp DPPH hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ gan HepG2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ CURCUMIN 1.1.1 Cấu trúc hóa học curcumin  Công thức cấu tạo curcumin (Hình 1.1) Hình 1.1 Công thức cấu tạo curcumin  Tên khoa học: (1E,6E)-1,7-bis(4-hydroxyl-3-methoxylphenyl)hepta-1,6dien-3,5-dion  Tên khác: Diferuloymethan, curcumin I  Công thức phân tử: C21H20O6  Khối lƣợng phân tử: 368,39 đvC [36] 1.1.2 Phƣơng pháp điều chế curcumin 1.1.2.1 Chiết xuất curcumin từ củ nghệ Curcumin hợp chất thiên nhiên đƣợc phân lập từ củ nghệ (Curcuma longa L., họ gừng - Zingiberaceae) Quy trình chiết xuất curcumin từ củ nghệ vàng khô (do công ty Cafecontrol thu mua Bắc Giang cung cấp) nhƣ sau: + Chiết xuất, phân lập: củ nghệ khô xay thành bột, trích ly siêu âm với ethanol 96% Thu hồi dung môi, cao cô đặc đƣợc chiết với n-hexan, sau lớp cao đƣợc để lạnh kết tinh thu đƣợc curcuminoid thô + Tinh chế: sản phẩm curcuminoid thô đƣợc tiến hành sắc kí cột silica gel tinh chế sắc kí lỏng điều chế cột C-18 thu đƣợc curcumin tinh khiết + Xây dựng liệu chuẩn curcumin phổ hồng ngoại, phổ tử ngoại - khả kiến, xác định cấu trúc, độ tinh khiết, định lƣợng curcumin HPLC Kết thu đƣợc curcumin có độ tinh khiết cao (>99%), hiệu suất thu đƣợc khoảng 2,2% [5] 31 Salto S., et al (1993), "Inhibition of the HIV - and HIV - protease by curcumin and curcumin boron complexes", Bioorganic and Medicinal Chemistry, (1), pp.415-422 32 Sharma R.A., et al (2005), "Curcumin: The story so far", European Journal of Cancer, 41, pp.1955-1968 33 Shen L., et al (2007), “ Theoretical study on physicochemical properties of curcumin, spectrochimica Acta Part A”, Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 67, pp.619-623 34 Shim J.S., et al (2002), “Hydrazinocurcumin, a novel synthetic curcumin derivative, is a potent inhibitor of edotheliar cell proliferation”, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 10, pp.2987-2992 35 Soheil Z., et al (2014), “A Review on Antibacterial, Antiviral and Antifungal Activity of Curcumin”, BioMed Research International, Article ID 186864, 12 pages 36 The Merk Index 14th ed (2008), Merk & Co., Inc, Whitehouse Station, NJ, USA 37 Vyas A., et al (2013), “Perspectives on new synthetic curcumin analogs and their potential anticancer properties”, Curr Pharm Des., 19(11), pp.20472069 38 Wu N.C (2003), "Safety and anti - inflammatory activity of curcumin: A component of tumeric (Curcuma longa)", The Journal of alternative and complementary medicine, 9(1), pp.161-168 39 Yuvaraj P., et al (2013), “Attenuation of expression of cytokines, oxidative stress and inflammation by hepatoprotective phenolic acids from Thespesia populnea Soland ex Correa stem bark”, Annals of Phytomedicine, 2(2), pp 47-56 40 Zhang F., et al (2011), "A novel solubility‐enhanced curcumin formulation showing stability and maintenance of anticancer activity", Journal of pharmaceutical sciences, 100(7), pp.2778-2789 PHỤ LỤC Phụ lục Phổ MS positive chất DH-1 Phụ lục Phổ IR chất DH-1 Phụ lục Phổ 1H-NMR chất DH-1 Phụ lục Phổ 1H-NMR giãn chất DH-1 Phụ lục Phổ 1H-NMR giãn chất DH-1 (tiếp theo) Phụ lục Phổ 1H-NMR giãn chất DH-1 (tiếp theo) Phụ lục Phổ MS positive chất DH-2 Phụ lục Phổ IR chất DH-2 Phụ lục Phổ 1H-NMR chất DH-2 Phụ lục 10 Phổ 1H-NMR giãn chất DH-2 Phụ lục 11 Phổ 1H-NMR giãn chất DH-2 (tiếp theo) Phụ lục 12 Kết thử tác dụng chống oxy hóa Phụ lục 13 Kết thử tác dụng kháng tế bào ung thƣ gan HepG2 Phụ lục Phổ MS positive chất DH-1 Phụ lục Phổ IR chất DH-1 Phụ lục Phổ 1H-NMR chất DH-1 Phụ lục Phổ 1H-NMR giãn chất DH-1 Phụ lục Phổ 1H-NMR giãn chất DH-1 (tiếp theo) Phụ lục Phổ 1H-NMR giãn chất DH-1 (tiếp theo) Phụ lục Phổ MS positive chất DH-2 Phụ lục Phổ IR chất DH-2 Phụ lục Phổ 1H-NMR chất DH-2 Phụ lục 10 Phổ 1H-NMR giãn chất DH-2 Phụ lục 11 Phổ 1H-NMR giãn chất DH-2 (tiếp theo) Phụ lục 12 Kết thử tác dụng chống oxy hóa Phụ lục 13 Kết thử tác dụng kháng tế bào ung thư gan HepG2