Nghiên cứu chiết rút laminaran từ rong nâu s oligocystum bằng phương pháp khuếch tán làm giàu

Chẳng hạn, rong nâu là nguồn cung cấp các loại đường galactose, manose, xylose,…, 17 axít amin, các axít béo không no, các chất khoáng, các loại vitamin cần thiết cho cơ thể sống, các hợ

HUỲNH THỊ THU THÚY

NGHIÊN CỨU CHIẾT RÚT LAMINARAN

TỪ RONG NÂU S OLIGOCYSTUM BẰNG PHƯƠNG PHÁP

KHUẾCH TÁN LÀM GIÀU

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

CÁN BỘ HƯƠNG DẪN:

1) PGS.TS Vũ Ngọc Bội 2) ThS Nguyễn Thị Mỹ Trang

KHÁNH HÒA - 2017

HUỲNH THỊ THU THÚY

NGHIÊN CỨU CHIẾT RÚT LAMINARAN

TỪ RONG NÂU S OLIGOCYSTUM BẰNG PHƯƠNG PHÁP

KHUẾCH TÁN LÀM GIÀU

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được đề tài này,

Trước hết, em xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm khoa Công nghệ Thực phẩm, Phòng Đào tạo lòng biết ơn và niềm kính trọng,

sự tự hào được học tập tại trường trong 4 năm qua

Sự biết ơn sâu sắc nhất em xin được giành cho thầy PGS.TS Vũ Ngọc Bội - Trưởng khoa Công nghệ Thực phẩm, ThS Nguyễn Thị Mỹ Trang đã tài trợ kinh phí, tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp này

Xin cám ơn các thầy cô phản biện đã cho em những lời khuyên quí báu để công trình nghiên cứu được hoàn thành có chất lượng

Xin chân thành cảm ơn tất cả các thầy cô trong khoa Công nghệ Thực phẩm đã truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong suốt thời gian em học tập tại trường trong những năm qua

Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất đến gia đình đã tạo điều kiện cho em được đi học và xin cám ơn bạn bè đã chia sẻ, động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian qua

Nha Trang, tháng 7 năm 2017

Sinh viên thực hiện

Huỳnh Thị Thu Thúy

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC VIẾT TẮT iv

DANH MỤC HÌNH v

LỜI NÓI ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ RONG NÂU – PHAEOPHYTA: 3

1.1.1 Giới thiệu chung về rong nâu 3

1.1.2 Thành phần hóa học trong rong nâu 4

1.1.2.1 Sắc tố: 4

1.1.2.3 Protein: 5

1.1.2.4 Chất khoáng: 5

1.1.3 Tình hình nghiên cứu và sử dụng rong nâu: 5

1.1.3.1Tình hình sử dụng rong nâu trên thế giới 5

1.1.3.2 Tình hình sử dụng, chế biến rong nâu ở Việt Nam 7

1.1.4 Giới thiệu chung về rong mơ 8

1.1.5 Sự phân bố của rong S.oligocystum 10

1.1.7 Công dụng và vai trò sinh học của rong mơ 12

1.1.7.1 Công dụng của rong mơ 12

1.1.7.2 Vai trò sinh học của rong mơ 12

1.2 Tổng quan về laminaran: 13

1.2.1 Giới thiệu về Laminaran 13

1.2.2 Đặc điểm cấu tạo: 13

1.2.3 Tính chất: 14

1.2.4 Ứng dụng của Laminaran 14

1.2.5 Phương pháp chiết Laminaran 15

1.2.5.1 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước 15

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 NGUYÊN LIỆU 20

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.2.1 Phương pháp phân tích 20

2.2.1.1 Phương pháp định lượng laminaran: 20

2.2.1.2 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa 20

2.2.1.3 Phương pháp chiết và tinh sạch laminaran 21

2.3 HÓA CHẤT VÀ CÁC THIẾT BỊ CHỦ YẾU ĐÃ SỬ DỤNG 28

2.3.1 Hóa chất 28

2.3.2 Thiết bị chủ yếu đã sử dụng 28

2.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 28

3.1 Xác định các thông số thích hợp cho quy trình chiết rút laminaran từ rong nâu S oligocystum bằng phương pháp khuếch tán làm giàu 29

3.1.1 Ảnh hưởng của số lần chiết 29

3.1.2 Ảnh hưởng của thời gian chiết 35

3.1.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ DM/NL: 38

3.1.4 Ảnh hưởng của pH dung môi: 43

3.1.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết: 48

3.2 ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH CHIẾT LAMINARAN TỪ RONG NÂU

S OLIGOCYSTUM BẰNG PHƯƠNG PHÁP KHUẾCH TÁN LÀM GIÀU 51

3.3 ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG LAMINARAN THU NHẬN TỪ RONG NÂU S OLYGOCYSTUM 55

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58

KẾT LUẬN 58

KIẾN NGHỊ 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

PHỤ LỤC 1

-DANH MỤC VIẾT TẮT

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Rong S.oligocystum tươi 11

Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của laminaran 14

Hình 2.1 Hình ảnh về rong mơ S oligocystum đã sấy khô 20

Hình 2.2 Quy trình dự kiến chiết xuất laminaran từ rong Sargassum oligocystum 22

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định số lần chiết 23

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian chiết laminaran 24

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định pH chiết 25

Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ DM/NL 26

Hình 3.1 Ảnh hưởng của số lần chiết đến hàm lượng laminaran thu nhận từ rong mơ S oligocystum 29

Hình 3.2 Ảnh hưởng của số lần chiết đến hoạt tính chống oxi hóa tổng của dịch chiết laminaran từ rong mơ S oligocystum 30

Hình 3.3 Ảnh hưởng của số lần chiết đến hoạt tính khử sắt của dịch chiết laminaran từ rong mơ S oligocystum 30

Hình 3.4 Sự tương quan giữa hàm lượng laminaran và hoạt tính chống oxy hoá tổng của dịch chiết laminaran từ rong mơ S oligocystum 33

Hình 3.5 Sự tương quan giữa hàm lượng laminaran và hoạt tính khử sắt của dịch chiết laminaran từ rong mơ S oligocystum 34

Hình 3.6 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng laminaran thu nhận từ rong mơ S oligocystum 35

Hình 3.7 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hoạt tính chống oxi hóa tổng của dịch chiết laminaran từ rong mơ S oligocystum 36

Hình 3.8 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hoạt tính khử sắt của dịch chiết laminaran từ rong mơ S oligocystum 36

Hình 3.9 Ảnh hưởng của tỷ lệ DM/NL đến hàm lượng laminaran thu nhận từ rong mơ S oligocystum 39

chiết laminaran từ rong mơ S oligocystum 39

Hình 3.11 Ảnh hưởng của tỷ lệ DM/NL đến hoạt tính khử sắt của dịch chiết laminaran từ rong mơ S oligocystum 40

Hình 3.12 Sự tương quan giữa hàm lượng laminaran và hoạt tính chống oxy hoá tổng của dịch chiết laminaran từ rong mơ S oligocystum 42

Hình 3.13 Sự tương quan giữa hàm lượng laminaran và hoạt tính khử sắt của dịch chiết laminaran từ rong mơ S oligocystum 43

Hình 3.14 Ảnh hưởng của pH dung môi đến hàm lượng laminaran thu nhận từ rong mơ S oligocystum 44

Hình 3.15 Ảnh hưởng của pH dung môi đến hoạt tính chống oxi hóa tổng của dịch chiết laminaran từ rong mơ S oligocystum 44

Hình 3.16 Ảnh hưởng của pH dung môi đến hoạt tính khử sắt của dịch chiết laminaran từ rong mơ S oligocystum 45

Hình 3.17 Sự tương quan giữa hàm lượng laminaran và hoạt tính chống oxy hoá tổng của dịch chiết laminaran từ rong mơ S oligocystum 47

Hình 3.18 Sự tương quan giữa hàm lượng laminaran 48

và hoạt tính khử sắt của dịch chiết laminaran từ rong mơ S oligocystum 48

Hình 3.19 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng laminaran thu nhận từ rong mơ S oligocystum 49

Hình 3.20 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hoạt tính 49

chống oxi hóa tổng của dịch chiết laminaran từ rong mơ S oligocystum 49

Hình 3.21 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hoạt tính khử sắt của dịch chiết laminaran từ rong mơ S oligocystum 50

Hình 3.22 Quy trình chiết laminaran từ rong mơ Sargassum oligocystum 52

Hình 3.23 Quy trình sản xuất nước uống bổ sung laminaran 55

Hình 3.24 Nước uống bổ sung laminaran 57

LỜI NÓI ĐẦU

Việt Nam có bờ biến dài trên 3200km, rất thuận lợi cho việc khai thác, nuôi trồng và chế biến các loại rong biển Trong số loài thực vật biển sống dọc bờ biển Việt Nam, các đảo và các dải đá ngầm có khoảng 1000 loài thực vật biển sinh sống

Trong đó có 638 loài rong biển bao gồm: Rhodophyta với 229 loài, Phaeophyta với khoảng 120 loài, Chlorophyta với khoảng 150 loài, Cyanobacteria với 76 loài và 14

loài cỏ biển Trong số đó có khoảng 200 loài rong tảo có khả năng sử dụng trong đời sống của chúng ta Hiện đã có khoảng 60 loài được sử dụng làm thực phẩm, trong y học dân gian và để chế biến các loại keo rong biển

Trong rong biển, rong nâu là một trong số các loài thực vật biển có khả năng

tự tái tạo đáng được lưu ý nhất Rong nâu có chứa nhiều các hợp chất thiên nhiên có giá trị dinh dưỡng và dược dụng cao Chẳng hạn, rong nâu là nguồn cung cấp các loại đường (galactose, manose, xylose,…), 17 axít amin, các axít béo không no, các chất khoáng, các loại vitamin cần thiết cho cơ thể sống, các hợp chất có hoạt tính sinh học như polyphenol có khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ bảo vệ cơ thể loại trừ các gốc tự do nguy hiểm, fucoidan có khả năng kích thích hệ miễn dịch, chống viêm nhiễm, ngăn ngừa ung thư, đồng thời làm tăng chỉ số chức năng gan, alginate là chất giải độc thiên nhiên và laminaran là chất chống đông tụ máu và ung thư

Theo các nhà khoa học Nga, rong nâu được coi là nguồn lợi polysacarit có ứng dụng hết sức rộng rãi nhờ các đặc điểm cấu trúc và tính chất đặc thù của chúng Polysacarit tồn tại trong rong nâu được chia làm 2 nhóm chính: nhóm tan trong kiềm

là axit alginic có hàm lượng lớn nhất, đã được nghiên cứu từ những năm 30 của thế

kỷ trước và được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp, thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm Nhóm tan trong nước bao gồm fucoidan, laminaran và polyuronan là những chất có nhiều hoạt tính sinh học quí giá mới được nghiên cứu

sử dụng trong khoảng vài thập kỷ trở lại đây Trong số đó, laminaran là một chất không độc, có khả năng kích hoạt hệ miễn dịch, kháng ung thư, kháng khuẩn, và hiện laminaran đang được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Tuy vậy việc nghiên cứu, khai thác laminaran từ rong mơ còn khá hạn chế và hiện có rất ít công

trình công bố nghiên cứu về laminaran từ rong mơ Từ thực tế này và được sự đồng

ý của giáo viên hướng dẫn, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu chiết rút laminaran

từ rong nâu S oligocystum bằng phương pháp khuếch tán làm giàu”

Nội dung của đề tài:

1) Xác định các thông số thích hợp cho quy trình chiết rút laminaran từ rong nâu S oligocystum bằng phương pháp khuếch tán làm giàu

2) Đề xuất quy trình chiết rút laminaran từ rong nâu S oligocystum bằng phương pháp khuếch tán làm giàu

3) Đánh giá chất lượng laminaran thu nhận từ rong nâu S oligocystum

Do thời gian thực hiện đề tài có hạn và do lần đầu tiếp cận với công tác nghiên cứu nên báo cáo đồ án không tránh khỏi thiếu sót, em rất mong nhận được các ý kiến góp ý của quý thầy cô và các bạn để báo cáo thêm hoàn chỉnh Em xin chân thành cám ơn

Nha Trang, tháng 7 năm 2017

Sinh viên thực hiện

Huỳnh Thị Thu Thúy

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ RONG NÂU – PHAEOPHYTA:

1.1.1 Giới thiệu chung về rong nâu:[1]

Ngành Rong Nâu có khoảng trên 190 chi, hơn 900 loài phần lớn sống ở biển, số chi, loài, tìm thấy trong nước ngọt không nhiều lắm

Rong có cấu tạo nhiều tế bào, dạng màng giả (Pseudoparenchma), dạng phiến,

dạng sợi đơn giản một hàng tế bào chia nhánh, dạng ống hoặc phân hóa phức tạp hơn thành dạng cây có gốc rễ thân và lá Trong chu kì sống có sự chuyển tiếp giữa giai đoạn cây bào tử với cây phối tử khác nhau rõ rệt về hình thái cấu tạo

Rong sinh trưởng ở đỉnh như ở Dicyota, sinh trưởng ở giữa như ở Laminaria, sinh trưởng ở gốc các lông như ở Ectocarpus, ngoài ra do các tế bào da của rong dạng

phiến chia cắt sinh trưởng khuếch tán gọi là sinh trưởng bề mặt

Vỏ tế bào: lớp trong là xenllulo, lớp ngoài là keo fucoidin hay fucin, một số loại rong trong vỏ còn có chất chai sừng, khảm canxi hay sắt lắng đọng

Chất nguyên sinh trong Rong Nâu thường có nhiều bao dịch nhỏ độ pH của dịch

thường rất thấp 4,6 – 6,8, có khi bằng 1 như ở Desmarestia

Hạt tế bào Rong Nâu thường lớn hơn các loại rong khác trừ một số loài trong

chi Laminaria ra, còn các loài khác chỉ có 1 hạt, trong hạt có nhân dễ nhuộm màu,

trong nhân có cấu tạo mạng lưới và chất nhiễm sắc, có một số loài hạt có hai nhân Thể sắc tố hạt thường sát bên vỏ, dạng sao, dạng dai xoắn hoặc đai chia nhánh, cũng có loại có thể sắc tố dạng phiến dẹp Nhìn chung thể sắc tố của rong nâu có dạng đĩa tròn Một số loại khi ánh sáng yếu thể sắc tố dời ra thành vỏ ngoài mặt, khi ánh sáng mạnh quá nó về thành vỏ bên, khi nồng độ dung dịch cao sắc tố ở mặt ngoài, nồng độ thấp lại dời về thành bên Sắc tố trong Rong Nâu gồm chlorophyll, xanthophyll, carotin và fucoxanthyll – loại sắc tố có riêng trong rong nâu, có màu nâu, không tan rong nước, nhưng hàm lượng của sắc tố này ở các giống khác nhau cũng có hiện tượng ít nhiều khác nhau

Hạt tinh bột: ở những loài Rong Nâu bậc thấp như Ectocarpus, tìm thấy những

hạt tròn hình cầu giống như hạt tạo bột, nhưng ở các loài cao hơn chưa tìm thấy Hạt tinh bột của Rong Nâu không vùi trong thể sắc tố như ở Chlorophyta, mà nó thành hình quả lê hoặc hình cầu dùng cuống hoặc đầu hẹp dính trên bề mặt của sắc tố, hoặc dùng sợi chất nguyên sinh nối với thể sắc tố

Sản phẩm đồng hóa của Rong Nâu là mannitol, laminarin, glucoza,… từ những chất này sau chuyển hóa thành polysaccharide, một trong những đặc tính của Rong Nâu là có túi đường Fucusan vesicles trong chứa đường fucosan, nằm chung quanh hạt tế bào của các loại tế bào sinh sản, sinh trưởng và quang hợp…chất đường trong túi có tính chất tanin, có thể đó là sản phẩm của quá trình trao đổi chất Iốt trong một

số loại Rong Nâu có hàm lượng lớn, 4mg/kg, gấp từ 80-90 lần so với nước biển Sinh sản: Rong Nâu sinh sản bằng 3 hình thức khác nhau

Sinh sản dinh dưỡng: ngoài đặc tính phát triển ừ những phần đứt của cơ thể

thành cây mới như các loài rong khác ra còn có một số chi như Sphaelaria, hình thành

nhánh sinh sản dinh dưỡng dạng chạc hai, chạc ba hoặc tam giác…khi rụng nhánh bám trên vật bám phát triển thành rong mới

Sinh sản vô tín bằng bào tử động và bào tử không động hình thành trong các túi bào tử một ngăn, và túi bào tử nhiều ngăn

Sinh sản hữu tính bằng hình thức giao phối giữa phối tử đực và cái theo kiểu isogamia và oogamia

1.1.2 Thành phần hóa học trong rong nâu.[2]

1.1.2.1 Sắc tố:

Sắc tố trong rong là chlorophyl, xantophyl, fucoxanthin, corotene Sắc tố ở rong

mơ khá bền

1.1.2.2 Glucid:

 Monosaccharide: monosaccharide quan trọng nhất trong rong là đường

Manitol với hàm lượng cao nhất khoảng 11,3-16,73% so với trọng lượng khô, tùy thuộc vào thời gian sinh trưởng trong năm của rong và đạt cao nhất vào đầu mùa hè

 Polysaccharide:

 Alginic: là một polysaccharide tập trung ở vách tế bào, là thành phần chủ yếu tạo thành tầng bên ngoài của màng tế bào rong Hàm lượng khoảng 29,98-39,30% so với trọng lượng khô và đạt cao nhất vào tháng 4

 Fuxinic: có tính chất gần giống với alginic Acid fuxinic tác dụng với acid sunfuric tạo hợp chất màu phụ thuộc vào nồng độ sunfuric

 Fucoidan: là hợp chất muối giữa acid fucoidinic với các kim loại hóa trị khác nhau như Ca, Cu, Zn Fucoidan có tính chất gần giống với acid alginic, nhưng hàm lượng thấp hơn

 Laminaran: là tinh bột của rong laminaran thường ở dạng bột không màu, không mùi có 2 loại là tan trong nước và không tan trong nước

 Cellulose: là thành phần tạo nên vỏ cây rong

1.1.2.3 Protein:

Protein trong rong không cao lắm nhưng khá hoàn hảo Protein kết hợp với Iod hữu cơ rất có giá trị trong y học

1.1.2.4 Chất khoáng:

Hàm lượng các nguyên tố khoáng trong rong mơ thường lớn hơn nước biển Có

23 nguyên tố là Al, Si, Mg, Ca, Sr, Ba, Fe, V, Mor, Ti, Co, Ni, Cr, Sn, As, Bi, Cu,

Pb, Zn, Ga, Be, Na và K Ðặc biệt, rong mơ chứa một lượng khá lớn nguyên tố strontium (Sr), cao hơn khoảng 100 lần hàm lượng trong nước biển Vì Sr là thành phần của chất thải phóng xạ nên tính chất này của rong mơ góp phần làm sạch chất thải phóng xạ trong nước biển Người ta còn phát hiện chất natri alginate chiết từ rong

mơ có thể chữa được bệnh nhiễm phóng xạ vì chất này uống vào sẽ hấp thu Sr phóng

xạ đã bị nhiễm trong cơ thể rồi thải ra ngoài

1.1.3 Tình hình nghiên cứu và sử dụng rong nâu:

1.1.3.1 Tình hình sử dụng rong nâu trên thế giới

Rong biển đã được sử dụng từ rất sớm, khoảng 2700 năm trước công nguyên ở

Trung Quốc 600 năm trước công nguyên, rong biển đã được chế biến thành một món

ăn quý dành cho vua chúa Thuốc “trường sinh bất tử” được Tần Thuỷ Hoàng vị hoàng đế đầu tiên của Trung Hoa sử dụng vào năm 200 trước công nguyên, nhưng mãi hơn 2000 năm sau khoa học hiện đại mới chứng minh được đó chính là thành phần của rong nâu Trong mười năm gần đây, chính quyền Trung Quốc đã chi phí đến 12 triệu USD để phát triển một loại thuốc trị AIDS từ rong nâu với tên thương phẩm là FUCOIDAN GLYCOCALYX (FGC) Loại thuốc tự nhiên này có khả năng diệt virút HIV, tăng cường hệ miễn dịch Ngày 01 tháng 01 năm 2003 loại thuốc này

đã được chính phủ Trung Quốc cấp phép sản xuất và đưa vào sử dụng

Tại Nhật Bản rong nâu đã được sử dụng làm thức ăn từ thế kỷ thứ V [3], cuối năm 2001 cơ quan quản lý thực phẩm và dược phẩm đã xem xét và cấp phép cho các sản phẩm thực phẩm chức năng của Nhật được bổ sung thêm thành phần fucoidan để tăng cường hệ miễn dịch, giảm cholesterol, giảm mỡ máu… và trở thành thực phẩm

hỗ trợ điều trị bệnh nan y ngay cả ung thư

Theo số liệu công bố hằng năm của tổ chức FAO, rong biển ngày càng được ưa chuộng sử dụng nhiều hơn trên thế giới và trong vòng 30 năm trở lại đây sản lượng rong biển đã tăng lên 4 lần đạt gần 10 triệu tấn tươi/năm, trong đó chỉ khoảng 10% là nhờ khai thác tự nhiên, còn lại hơn 90% là nhờ canh tác Các sản phẩm polysacarit công nghiệp chính từ rong biển là agar, agarose, carrageenan và alginate Chúng được

sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm để làm chất phụ gia thức ăn, thực phẩm chức năng, đồ uống, sản xuất bia, chế biến thịt, cá hộp, sản xuất sữa và bánh kẹo, trong mỹ phẩm, nha khoa và y dược, trong các ngành công nghiệp, dệt may, công nghệ sinh học v.v…

Các polysacarit từ rong nâu được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, công nghệ sinh học và y học Ngoài ra trong công nghiệp chế biến phức hợp rong biển ta cũng có thể thu nhận các thành phần có giá trị khác như: fucoidan, laminaran

và những chất chuyển hóa phân tử thấp như mannitol, các axít amin tự do, polyphenol, các hợp chất chứa iốt, các vitamin và axít béo

1.1.3.2 Tình hình sử dụng, chế biến rong nâu ở Việt Nam

Mặc dù được thiên nhiên ưu đãi về biển nhưng sự đầu tư phát triển nuôi trồng, chế biến khai thác rong biển ở Việt Nam còn hạn chế và chưa có hiệu quả Sinh khối của rong nâu của nước ta là rất lớn và đa dạng, song thành phần, cấu trúc và tính chất của các chất chứa trong đó lại chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ, ngay cả những đối tượng đã được quan tâm như fucoidan, laminaran Chính vì vậy đã làm hạn chế việc sử dụng rong nâu như là nguồn cung cấp các hợp chất có phổ hoạt tính sinh học rộng

Alginate cũng được nghiên cứu và sản xuất tại Hải Phòng, Nha Trang và thành phố Hồ Chí Minh, song chất lượng còn non kém, số lượng chưa đủ đáp ứng nhu cầu cho các ngành công nghiệp trong nước Ngoài thị trường còn bắt gặp khá nhiều alginate của nước ngoài như: Đức, Mỹ, Nhật, Trung Quốc,…

Vào những năm 70, Bộ Thủy sản đã nghiên cứu ban hành quy trình sản xuất alginate bằng phương pháp formol Trường đại học Thủy sản năm 1997 đã nghiên cứu đưa ra quy trình sản xuất alginate bằng phương pháp CaCl2 trên các loài rong nâu ở vùng biển Nha Trang và quy trình sản xuất alginate bằng phương pháp xử lý formol trên hai loại rong S.mcclurei và S.kjellmanianum vùng biển Nha Trang – Khánh Hòa

Về nghiên cứu ứng dụng cũng được một số cơ quan chú ý để phát triển đầu ra cho công nghệ sản xuất alginate

Nhìn chung công nghệ sản xuất alginate của Việt Nam còn rất non yếu Chúng

ta có nhiều tiềm năng về rong nâu nhưng phải nhập khẩu sản phẩm keo rong nâu alginate phục vụ cho 21 ngành công nghiệp trong nước[2]

Trên thế giới, một số nước đã nghiên cứu và cho ra đời sản phẩm fucoidan Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã thực hiện đề tài

“Nghiên cứu công nghệ và thiết bị sản xuất fucoidan quy mô pilot từ một số loài rong nâu Việt Nam” cho kết quả tốt Được biết, trong quá trình thực hiện đề tài, sản phẩm fucoidan đã được Viện thử nghiệm bước đầu trên một số bệnh nhân mắc bệnh: ung

thư, dạ dày, viêm gan C,… cho kết quả rất khả quan

Năm 2001, tác giả Khổng Trung Thắng đã hoàn thành đề tài “Nghiên cứu hoàn thiện quy tình chiết tách alginate natri từ rong Nâu qua xử lý CaCl2 và ứng dụng làm chất mang cố định tế bào trong lên men dịch chiết dứa” [4]

Năm 2004, các tác giả Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn, Ngô Đăng Nghĩa trường Đại học Nha Trang cho xuất bản các kết quả nghiên cứu của mình trong cuốn Chế biến rong biển tại nhà xuất bản Nông nghiệp-Tp.Hồ Chí Minh.[2]

Năm 2006, các tác giả Nguyễn Duy Nhất, Bùi Minh Lý-phân viện Khoa học Vật liệu tại Nha Trang, Nguyễn Mạnh Cường, Trần Văn Sung-Viện Hóa học trong

đề tài nghiên cứu “Phân lập và đặc điểm của fucoidan từ năm loài rong Mơ ở miền Trung”.[5]

Năm 2010, TS Lê Như Hậu-Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang cùng cộng sự đã nghiên cứu đề tài “Tiềm năng rong biển làm nguyên liệu sản xuất ethanol nhiên liệu tại Việt Nam.[6]

Năm 2013, PGS.TS Vũ Ngọc Bội cùng cộng sự đã nghiên cứu đề tài “Sàng lọc hoạt tính kháng oxi hóa của một số loài rong nâu Surgassum ở Khánh Hòa, Việt Nam.[7]

Năm 2014, các tác giả Đặng Xuân Cường, Vũ Ngọc Bội, Trần Thanh Vân, Bùi Minh Lý đã nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu chiết Phlorotanin có hoạt tính chống oxi hóa từ rong nâu Surgassum mcclurei bằng phương pháp ngâm chiết có hỗ trợ vi sóng.[8]

1.1.4 Giới thiệu chung về rong mơ:[2]

Rong Mơ là loài rong to mọc thành bụi, gồm vài trục chính quanh nhánh, nhánh mang phiến có dạng của lá, phiến có răng mịn giống như lá mơ do đó có tên là rong

lá mơ hay gọi tắc là rong mơ Các loài rong mơ đều có phao, phao nhiếu ít to nhỏ khác nhau, hình dạng của phao là hình cầu hay hình trái xoan, đường kính của phao nhỏ khoảng 0,5-0,8mm, phao lớn khoảng 5-10mm phao có thể mang cánh hoặc

Rong mơ là loài có kích thước cá thể lớn và trữ lượng cao nhất trong các loài rong biển ở Việt Nam

Rong mơ mọc trên tất cả các loài vật bám cứng, trên các vách đá dốc đứng, các bãi đá tảng, các vùng có đá ngầm hay rạng san hô ngầm nhưng thích nghi nhất là trên vật bám đá san hô Cấu trúc của các quần thể rong Mơ trên các vật bám khác nhau rõ rệt Trên các bề đá dốc đứng, chúng phân bố thành đai hẹp ở dưới mức triều thấp đến sâu khoảng 0,5m Ở các bề biển đá tảng nằm trên nền cát hay đá cuội, chúng mọc thành các khóm dày trên các tảng đá Trên vùng san hô chết, chúng mọc thành quần thể dày, phân bố tương đối đều, mật độ khi rong trưởng thành có thể đạt 10 cá thể/dm2, cho nên vào mùa phát triển của chúng rất ít các loài rong biển khác có thể mọc chen được vào trong quần thể rong này

Đa số các loài rong đều thích mọc nơi có sóng mạnh, ở đảo, bờ phía đông chúng mọc dày và phong phú hơn bờ phía Tây Ở các bãi đá hướng ra biển khơi, chúng phát triển mạnh và sinh lượng cao hơn nhiều do với các bãi rong trong các vũng, vịnh yên sóng Các bãi rong trên bề biển dốc thềm san hô chết, đá vôi đóng vai trò quan trọng trong nguồn lợi của rong Mơ, nhiều vùng rộng 30-50ha hay hàng trăm ha, kéo dài vài chục km, thường gặp ở ven biển miền Trung, nhất là từ quảng Ngãi đến Bình Thuận Mùa vụ rong Mơ có sự khai khác chút ít tùy thuộc từng loài, nơi phân bố, tùy các điều kiện môi trường sống, nhưng nhìn chung quy luật về mùa vụ khá rõ rệt Chúng tăng trưởng rất mạnh từ tháng 2 đến tháng 3, đa số các loài có kích thước tối

đa vào tháng 3, 4 và hình thành các cơ quan sinh sinh sản, sau đó sẽ bị sóng nhổ tấp vào bờ và tàn lụi Đến tháng 7 hầu hết các bãi rong đều trơ trụi Một số loài mọc lên

cao hay phân bố trên cao (vùng triều thấp) như S.mucclurei, S.kjellmanianum, S.polystum phát triển và tàn lụi sớm (tháng 4) Trong khi đó các loài mọc vùng dưới triều như S.binderi, S.microcystum,… mọc chậm hơn, đến tháng 6,7 đôi nơi vẫn còn các quần thể rong này Một vài loài thích nghi trong các vũng vịnh yên sóng có thể tồn tại và phát triển tốt vào tháng 7 như S.polycystum và S.longicaulis

Rong trưởng thành và phóng thích giao tử vào các tháng 3,4,5 vào thời điểm này kích thước của rong đạt đến tối đa và sinh lượng đạt cao nhất Mặc khác hàm lượng acid Alginic cũng cao nhất Các đặc điểm này rất quan trọng, phù hợp và có lợi cho việc khai thác nguồn lợi từ tháng 4 trở đi Việc khai thác đúng mùa vụ hoàn toàn có khả năng bảo vệ nguồn giống tự nhiên, giúp cho rong tái phát triển vào mùa

vụ sau Ngoài ra việc khai thác bằng cách cắt rong từng 10 cm giúp cho một số nhánh còn sót lại tiếp tục phát triển tạo ra các cơ quan sinh sản

Các bãi rong Mơ mọc trên các thềm san hô chết có diện tích rộng lớn, mật độ dày, sinh lượng cao (trên 12kg rong tươi/m2) rất quan trọng đối với nguồn lợi, tìm thấy ở các tỉnh Quảng Ninh, Quảng Ngãi,Bình Định, Khánh Hòa, Ninh Thuận và Bình Thuận Các bãi rong rộng lớn nằm gần trục giao thông rất thuận lợi cho việc khai thác và vận chuyển Sản lượng hàng năm ước tính có thể đạt 10000 tấn rong tươi

1.1.5 Sự phân bố của rong S.oligocystum[9]

Trên thế giới:

Rong mơ được tìm thấy khắp các vùng biển nhiệt đới, ngoài ra còn phân bố ở Trung Quốc, Nhật Bản, Philippines, Úc với hàng trăm loài rong mơ và 10 ngàn loài

rong biển khác Tên Sargassum được các thủy thủ Bồ Đào Nha đặt tên vì tìm thấy

nhiều rong mơ ở biển Sargasso gần Bồ Đào Nha

Ở Việt Nam, tìm thấy hơn 50 loài mơ, trong đó trữ lượng lớn nhất có các loài

S.carpophyllum, S crassifolium, S cristaefolium [= S duplicatum], S glaucescens,

S graminifolium, S henslowianum, S mcclurei, S oligocystum, S polycystum, S vachellianum Rong phát triển trên vùng bãi triều nền cứng Các nguồn dự trữ lớn

nhất của Sargassum tập trung ở phía Bắc ở vịnh Bắc bộ, ở miền Trung và ven bờ biển

phía Nam Việt Nam ở vịnh Thái Lan

Ở Ninh Thuận:

Biển Ninh Thuận được trải dài hơn 105 km, diện tích vùng biển nội thủy 1.800 km2, vùng lãnh hải rộng 18.000 km2, vùng đặc quyền kinh tế 24.000 km2 Theo kết quả điều tra trước đây của Viện Hải Dương học Nha Trang về nguồn lợi thủy sản thì

vùng biển Ninh Thuận có 188 loài rong biển Trong đó chỉ rong mơ Sargassum

khoảng 18 loài, có trữ lượng lớn nhất Các loài phổ biến ở Ninh Thuận như rong lá

mơ (S oligocystum), rong mơ nhiều phao (S polysystum), rong lá mơ Mcclurei (S

mcclurei), rong mơ lá dày (S crassifolium), rong mơ phao nhỏ (S microcystum), rong

mơ bìa đôi (S duplicatum), rong lá mơ (S denticarpum), rong lá mơ Swartz (S

swartzii)

1.1.6 Đặc điểm của rong S.oligocystum[10]

Hình 1.1 Rong S.oligocystum tươi

Sargassum oligocystum dài 40-60 cm Đĩa bám rộng khoảng 1 cm, thường mọc

liên kết 2-3 đĩa bám chung Đĩa bám có xẻ thùy nhưng không sâu Trục chính hình

trụ ngắn khoảng 0,2-0,5 cm Nhánh chính hình trụ không có gai, to khoảng 0,3-0,7

cm, các nhánh bên mọc cách nhau 1-3 cm, dài 5-10 cm, lá hơi dài và dai chắc có hình bầu dục kéo dài, dài 3-5.5 cm, mép lá có răng cưa nhọn Gân giữa không rõ, cuống lá ngắn Phao nhiều, hình elip, to 0,3-0,4 cm thường nằm trong 1 lá hình dạng rất biến thiên Khi rong còn non hay ở phần gốc, phao có cánh bao quanh, hình dạng giống như lá

S.oligcystum thích nghi rộng với các dạng vật bám và điều kiện môi trường khác

nhau Chúng có thể mọc trên vách đá dốc đứng hay bãi san hô bằng phẳng

Chu kỳ sống của rong mơ S.oligocystum là một năm kể từ khi bắt đầu mọc S

oligocystum có xu hướng tăng trưởng rất chậm về chiều dài, giai đoạn này tương ứng

với việc rong hoàn thành giai đoạn phát triển trục chính Từ tháng 1 trở đi, các nhánh chính của rong phát triển nhanh về chiều dài và đạt kích thước tối đa vào tháng 4, giai đoạn này tương ứng với thời kỳ rong phát triển nhanh chóng các nhánh thứ cấp Sau khi đạt kích thước tối đa, rong sẽ dần tàn lụi vào tháng sau đó

1.1.7 Công dụng và vai trò sinh học của rong mơ

1.1.7.1 Công dụng của rong mơ:[11]

- Rong mơ được coi là thực phẩm rất bổ dưỡng, có thể phòng ngừa và điều trị một số bệnh, đặc biệt là bệnh bứu cổ do rong mơ chứa nhiều Iod

- Rong Mơ là nguyên liệu chính cho sản xuất keo alginate, rất quý cho công nghiệp, được dùng để bao viên thuốc, làm huyết thanh nhân tạo, làm chỉ khâu vết mổ, chất sát trùng, thuốc cầm máu…vv

- Trong công nghiệp, dùng để chế phẩm in hoa, hồ vải, dán gỗ, chế tơ nhân tạo, làm diêm Trong nông nghiệp dùng làm phân bón, pha chế thuốc trừ sâu, thay thế phèn chua

- Trong thực phẩm, dùng để chế các loại rựu, bánh kẹo, đồ uống Ngoài ra, bã rong mơ có thể tận dụng để chế than hoạt tính dùng trong y dược

1.1.7.2 Vai trò sinh học của rong mơ

Rong mơ có vai trò rất quan trọng về mặt sinh thái học Cùng với các nhóm

rong biển cỏ biển khác, rong mơ đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa, cân bằng hệ sinh thái ven biển Rong mơ hấp thu chất dinh dưỡng, làm sạch nước, là một mắc xích quan trọng trong mối quan hệ hữu cơ và có sự tương tác giữa các thành tố trong hệ sinh thái rạn san hô Đặc biệt các bãi rong mơ chính là nơi cư ngụ, ươm nuôi ấu trùng, sinh trưởng và sinh sản của rất nhiều loài thủy hải sản như cá chuồn,

cá dìa, mực…vv

1.2 Tổng quan về laminaran:

1.2.1 Giới thiệu về Laminaran:[12]

Laminaran là polysaccharide tạo thành từ glucose, tên thường gọi là laminarin, tên gọi theo danh pháp quốc tế là 1,3-β-D-glucan

Lamiaran có hàm lượng từ 1-15% hàm lượng rong khô tùy thuộc vào từng loại rong, vị trí địa lý và môi trường sinh sống của từng loại rong

Laminaram làn đầu tiên được phân lập từ Laminariaceae bởi Schmiedeberg (1885)

Laminaran về cơ bản là một loại β- Glucan có chứa trọng lượng thấp bao gồm 1,3-B-D glucan[13]

1.2.2 Đặc điểm cấu tạo:

Laminaran được hình thành từ các gốc D-glucan kết hợp với nhau bằng các liên kết β-1 3 và một ít liên kết β-1 6, gốc đường cuối mạch của một số phân tử

có thể có các gốc mannitol (M-series) hoặc vẫn là glucose (G-serise) Các laminaran

từ các loài rong khác nhau sẽ khác nhau về tỉ lệ các liên kết β-1 3 và β-1 6 cũng như cách thức nối các liên kết này trong chuỗi glucan.[14]

Thành phần Laminaran thay đổi phụ thuộc vào nhiệt độ nước, độ mặn, sóng, dòng nước biển và độ sâu.[13]

Công thức phân tử: (C6H10O5)n ; n= 20-30

Cấu trúc hóa học của laminaran:

Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của laminaran 1.2.3 Tính chất: [15]

Laminaran ở dạng bột màu trắng (98% chất khô) và có màu be (89%) chất khô), không mùi Laminaran không phân ly trong nước và ổn định với ánh sáng Laminaran không có đặc tính làm dày và gel.[16]

Laminaran có trọng lượng phân tử từ 5-10 kDa và mức độ trùng hợp trong khoảng 20-25 glucose

Laminaran bị kết tủa trong ethanol khi nồng độ 80%

Mật độ tương đối: 1,502 (98% chất khô)

Độ hòa tan trong nước: 301,5g/l ở 23ºC

Độ hòa tan trong dung môi hữu cơ: ở 20ºC

bức xạ của chất chiết xuất từ rong biển thiên nhiên này đã đem lại niềm hy vọng cho những người đang dùng tia phóng xạ chữa trị các khối u gây ung thư trong cơ thể Ngoài ra, laminaran còn có tác dụng tăng sức đề kháng với nhiễm trùng và thúc đẩy sửa chữa vết thương

Laminaran với những đặc tính của một alpha amylase gây ra sự kích hoạt các enzym có mặt trong quá trình tăng trưởng ở thực vật và sự kích thích của hoạt động phân giải protein của các tế bào được xử lý Nên hiện nay laminaran được nghiên cứu để sử dụng như là một chất thúc đẩy hạt giống nảy mầm và tăng tốc độ tăng trưởng cây trồng

1.2.5 Phương pháp chiết Laminaran

Laminaran được lấy từ tảo nâu thông qua các quá trình chiết xuất nhằm liên tục loại bỏ các thành phần khác ngoài Laminaran (polysacarit như axít alginic, fucoidan, muối,…) Các quá trình này sử dụng các bước liên quan đến xay, kết tủa bằng CaCl2, cồn 96º và thẩm tách

Đặc tính để tách chiết laminaran: Laminaran bị tủa trong ethanol khi nồng độ ethanol ≥ 80%

1.2.5.1 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước

a Một số nghiên cứu của nước ngoài

Chiết laminaran từ rong nâu Laminaria jobonica theo phương pháp của Klarzynsky (2000)

Laminaria jobonica được chiết bằng nước nóng trong 3 giờ Dịch chiết được phân đoạn bởi một hệ thống siêu lọc, hệ thống này sử dụng một tấm màng có diện tích 0,1 m2, kích thước lỗ lọc là 100 kDa, tốc độ lọc khoảng 0,9 lít/giờ Dịch chiết tiếp tục đưa qua một màng lọc có kích thước 1 kDa Khối lượng phân tử trung bình của laminaran được phân tách bởi hệ thống lọc sắc kí dạng gel

Chiết laminaran từ rong nâu Laminaria japonica (LP) theo phương pháp của X.Zha, J.Xiao, H.Zhang và cộng sự (2012) [16]

Laminaria japonica (LP) được chiết với các điều kiện tối ưu như sau: tỷ lệ

nguyên liệu / nước 1:50 (w / v), nhiệt độ 60 ° C và thời gian chiết tách 60 phút Dùng Tryp-sinase (6 U / ml) kết hợp với thuốc thử sevag để loại bỏ protein khỏi LP thô Cuối cùng dùng ethanol để kết tủa

Chiết xuất từ rong Laminaria theo quy trình được mô tả trong sáng chế độc quyền của Pháp số 74 35162.74 35.162

Lấy 300g rong tươi loại Saccharina Laminaria đem cắt nhỏ 0,5 1 cm Cho 0,9 lít dung dịch axít sulfuric 0,3% vào lượng rong ở trên Quá trình chiết xuất được thực hiện ở nhiệt độ khoảng 80°C, kết hợp với khuấy đảo trong 1 giờ Quá trình chiết này được thực hiện hai lần Sau khi trung hòa, dịch chiết thu được được xử lý với polyvinylpyrrolidone (PVP) ở hàm lượng khoảng 10% so với trọng lượng của dịch, hỗn hợp được khuấy trong 30 phút và sau đó được lọc trong điều kiện chân không Dịch chiết tiếp tục được lọc trên một ống màng carbon đất sét với kích thước lỗ khí 50.000 Dalton Trong quá trình lọc, áp suất trên cột được duy trì ở mức 1 bar Sau khi lọc, dịch chiết còn lại có thể tích khoảng 0,8 lít và pH là 5,5 được đem đi thẩm tách trên một màng cellulose ester với kích thước lỗ khí là 500 hoặc 1000 Dalton Sau khi thẩm tách, dịch được đem đi sấy khô và thu được 7g laminaran tinh khiết

Quy trình thay thế cho phương pháp chiết xuất Laminaran từ tảo Laminaria 300g rong tươi loại Nodosum Ascophyllum được nghiền cho đến khi rong có đường kính hạt nhỏ hơn 1 mm 0,9 lít dung dịch canxi clorua 2% được cho vào lượng rong ở trên để kết tủa các alginate

Lần chiết xuất đầu được thực hiện ở nhiệt độ khoảng 60°C, kết hợp khuấy đảo trong vòng 7 giờ Dịch được đưa qua một hệ thống lọc, dịch lọc được thu hồi còn bã thì được chiết lần thứ 2 ở các điều kiện tương tự như lần chiết xuất đầu tiên nhưng thời gian chiết là để qua đêm Sau đó, dịch chiết xuất lần thứ hai cũng bị thu hồi bởi quá trình lọc

Dịch thu được sau hai lần chiết được trộn lẫn với nhau và được đưa qua một màng siêu lọc có kích thước lỗ 1.000 Dalton để loại bỏ các muối khoáng Tách bỏ hàm lượng ion còn lại trong dịch bằng xử lý trên một cột nhựa trao đổi anion

Sau khi tái sinh với natri hydroxit và rửa bằng nước khử khoáng, nhựa được đưa vào một cột thủy tinh có đường kính 2 3 cm, chiều cao 20 cm Dịch lọc được đưa vào từ trên đỉnh cột và xâm nhập từ từ vào hạt nhựa Các ion không được giữ lại trong các hạt nhựa theo nước đi ra khỏi cột Cột sau đó được rửa bằng nước khử khoáng Dịch thu được sau khi rửa cột được thẩm tách trên một màng cellulose ester

có kích thước lỗ 500 hoặc 1000 Dalton Dịch sau khi thẩm tách được sấy khô và thu được 7 g bột khô laminaran tinh khiết

b Các nghiên cứu trong nước

Đề tài “Tách chiết và phân tích thành phần các polysacarit tan trong nước từ một số loài rong nâu Việt Nam” của Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang với mục đích chiết tách các polysacarit bao gồm: fucoidan, laminaran và axít alginic từ một số loài rong nâu có giá trị kinh tế ở vùng biển Nha Trang và nghiên cứu thành phần hoá học, đặc điểm cấu trúc của các polysacarit: fucoidan, laminaran

và axít alginic từ rong nâu Việt Nam làm cơ sở cho việc xây dựng công nghệ phức hợp chiết xuất các hợp chất đường có hoạt tính sinh học từ rong nâu Việt Nam theo định hướng dược liệu nhằm phục vụ sức khoẻ cộng đồng, phát triển kinh tế xã hội, khoa học các tỉnh ven biển phía Nam Việt Nam

Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng laminaran trong các mẫu rong nghiên cứu đều nhỏ hơn 0,8% và thay đổi hàm lượng theo các chi rong với thứ tự sau: Sargassum > Padina > Turbinaria Đặc biệt loài rong Turbina ornata không có laminaran Hàm lượng laminaran trong các loài rong thuộc cùng một chi rong Sargasum khác nhau không nhiều, chỉ dao động trong khoảng 0,51 – 0,79% So sánh với hàm lượng laminaran có trong một số loài rong nâu thu thập tại vùng ôn đới như Nga, Nhật Bản, Canada, Pháp… thì hàm lượng laminaran trong rong nâu Việt Nam

có hàm lượng ít hơn rất nhiều Ví dụ như: Với loài rong thuộc chi Padina thu thập tại Pháp hàm lượng laminaran lên đến 14% Điều này có thể giải thích do điều kiện sinh trưởng của rong nâu tại vùng nhiệt đới không thích hợp cho việc sinh tổng hợp laminaran

Đề tài “Các thông số chất lượng của Fucoidan và một số sản phẩm khác được phân lập từ rong mơ (Surgassm) Thừa Thiên Huế.” Của Trần Thị Văn Thi, Lê Trung Hiếu, Lê Thị Lành Trường Đại học Khoa hoc, Đại học Huế với mục đích tách chiết fucoidan cùng với các sản phẩm khác như alginate, laminaran, mannitol, các hợp chất màu chlorophyll, carotenoid đã được tách chiết từ rong mơ (Sargassum) và cấu tạo của chúng đã được xác nhận bằng UV-Vis, IR, 13C-NMR Các thông số chất lượng của fucoidan được xác định bằng phương pháp phenol-axit sulfurictrắc quang, Kjeldahl, F-AAS, ICP-MS, tạo dẫn xuất-GC-MS… đã cho thấy fucoidan đạt yêu cầu của sản phẩm thương mại

Tách mannitol, chất màu chlorophyll, carotenoid và các chất ít phân cực khác: Dung môi được sử dụng cho giai đoạn này là cồn 96º Sau đó, tiến hành chưng cất thu hồi cồn để tái sử dụng Tiến hành tách mannitol thô, tinh chế bằng cách kết tinh lại và kết tinh phân đoạn nhiều lần để loại chất màu và muối ăn Tinh chế chất màu bằng ete petrol, sử dụng sắc ký cột dùng hệ dung môi cloroform/metanol với các tỷ

lệ khác nhau để phân lập thành hỗn hợp các chlorophyll và hỗn hợp các carotenoid Chiết tổng fucoidan, laminaran và alginate theo thứ tự bằng các dung môi phân cực khác nhau: dung dịch NaCl 0,05 M, nhiệt độ 80-85ºC, dung dịch HCl 0,01 M, nhiệt độ phòng, dung môi Na2CO3 3 %, nhiệt độ 70-75ºC

Tách alginate ra khỏi dịch chiết chứa fucoidan, laminaran và thu hồi alginate Đối với dịch chiết NaCl và HCl: dùng tác nhân là muối CaCl2 để tạo kết tủa Ca-alginate Đối với dịch chiết Na2CO3: tách alginate ra khỏi dịch chiết dưới dạng kết tủa axit alginic Chuyển aginate về dạng Na-alginate bằng tác nhân Na2CO3 2,1% và tinh chế

Kết tủa fucoidan và laminaran bằng C2H5OH 96º: Sử dụng cồn 96º để kết tủa laminaran và fucoidan từ dịch chiết, lọc lấy kết tủa, sau đó hòa tan kết tủa bằng nước cất Kết tủa fucoidan bằng CTAB 3%: Cho từ từ CTAB 3% và dịch chứa laminaran

và fucoidan để kết tủa fucoidan dưới dạng CTAB-fucoidan Lọc lấy kết tủa và thu dịch chứa laminaran

Thu hồi laminaran từ dịch chiết và tinh chế: Sử dụng C2H5OH 96º để kết tủa laminaran rồi tinh chế bằng cách thẩm tách

Chuyển kết tủa CTAB-fucoidan sang Na-fucoidan và tinh chế sản phẩm: Sử dụng dung dịch NaCl 3 M để chuyển fucoidan về dạng Na-fucoidan Sau đó tinh chế sản phẩm bằng cách thẩm tách

Kết quả hàm lượng mannitol trong các mẫu rong nghiên cứu tương đối cao so với các tài liệu tham khảo, cao nhất là mẫu C (12,66%) Hàm lượng alginate dao động trong khoảng 16,84-41,63% so với nguyên liệu khô, trong đó cao nhất là loài

D (Sargassum polycystum C Ag.) (41,63%), cao hơn so với kết quả mà các tác giả khác đã công bố trước đây Hàm lượng fucoidan trong các mẫu rong dao động trong khoảng 5,36- 8,43%, cao nhất cũng là mẫu D (8,43%) Hàm lượng laminaran thấp hơn so với các tài liệu tham khảo (3,72-4,42%).[18]

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU

Rong mơ S.olygocystum nguyên liệu được thu mẫu tại vùng biển Ninh Thuận

Rong mơ sau khi thu mẫu, được rửa sạch bằng nước biển sau đó vận chuyển về phòng thí nghiệm, ngâm để loại muối theo phương pháp của PGS TS Vũ Ngọc Bội và sấy khô bằng kỹ thuật sấy lạnh kết hợp với bức xạ hồng ngoại ở nhiệt độ sấy 500C, tốc

độ gió 2m/s trong thời gian khoảng 3,5 giờ đến độ ẩm < 16% thì thu rong khô (hình 2.1) và đóng gói bằng bao bì PE, bảo quản ở nhiệt độ thường để dùng trong suốt quá trình nghiên cứu

Hình 2.1 Hình ảnh về rong mơ S oligocystum đã sấy khô

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp phân tích

2.2.1.1 Phương pháp định lượng laminaran: Theo phương pháp của Angelika và cộng sự, 2016

2.2.1.2 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa

+ Hoạt tính chống oxy hóa tổng (TA): Được xác định theo phương pháp của

Prieto và cộng sự, (1999): lấy 100µl mẫu bổ sung 900µl nước cất và thêm 3 ml dung dịch bao gồm: H2SO4 0,6M, sodium phosphate 28mM và ammonium molybdate 4mM Hỗn hợp được nâng nhiệt lên 950C, giữ ổn định trong thời gian 90 phút và đo

độ hấp thụ ở bước sóng 695nm với chất chuẩn là acid ascorbic

+ Hoạt tính khử Fe (RP): được xác định theo Zhu và cộng sự, (2002): bổ sung

0,5ml đệm phosphate pH 7,2 và 0,2 ml K3[Fe(CN)6] 1% vào 500µl dịch mẫu Giữ hỗn hợp 20 phút ở 500C Sau đó thêm vào 500µl CCl3COOH 10%, 300µl nước cất và 80µl FeCl3 0,1% Lắc đều và đo ở bước sóng 655 nm với chất chuẩn là FeSO4

2.2.1.3 Phương pháp chiết và tinh sạch laminaran

* Phương pháp chiết khuếch tán làm giàu

Quá trình chiết rút laminaran từ rong mơ được thực hiện theo phương pháp chiết khuếch tán làm giầu Về bản chất phương pháp chiết khuếch tán làm giầu cũng giống như các phương pháp chiết khác, chẳng hạn phương pháp ngâm chiết,… nhưng phương pháp này khác biệt ở chỗ người ta chia khối nguyên liệu cần chiết ra thành nhiều phần và chứa đựng trong các dụng cụ chứa đựng riêng biệt Sau đó dịch chiết rút ra từ khối nguyên liệu trong dụng cụ chứa đựng đầu tiên sẽ trở thành dung môi để chiết ở khối nguyên liệu thứ 2 và quá trình được lặp lại cho đến hết nguyên liệu Nhờ

đó mà nguyên liệu được chiết nhiều lần và dịch chiết được làm giầu chất tan khi được dùng như là dung môi trong quá trình chiết Chính vì thế, tổng lượng dung môi sử dụng ít hơn và dịch chiết chứa hàm lượng chất chiết cao hơn Do quá trình chiết tốn

ít dung môi và lượng chất tan được chiết rút ra khỏi nguyên liệu nhiều nhất, nên giá thành rẻ hơn (theo Hóa sinh Công nghiệp, Lê Ngọc Tú và các tác giả, 1987)

* Phương pháp tinh sạch laminaran

Dịch chiết lamminaran từ rong mơ, được làm sạch alginic acid bằng cách cho

từ từ dung dịch CaCl2 2M vào cho đến khi alginic acid bị kết tủa hoàn toàn dưới dạng alginate calcium Sau đó hỗn hợp được bảo quản ở điều kiện lạnh trong 12h để tạo điều kiện cho alginate calcium kết tủa, lắng đọng xuống đáy Sau đó, tiến hành ly tâm loại bỏ alginate calcium và thu dung dịch Sau đó tiếp tục kết tủa loại bỏ fucoidan ra khỏi dung dịch này bằng cách cho vào dung dịch một lượng cồn 96º gấp 2 lần thể tích dung dịch và bảo quản hỗn hợp ở điều kiện lạnh trong 12h Sau đó, tiến hành ly tâm loại bỏ fucoidan, tiếp tục kết tủa laminaran trong dung dịch bằng cồn 96º với tỷ lệ

cồn/dịch là 1/1 và lưu giữ hỗn hợp ở điều kiện lạnh trong 12h Sau đó, tiến hành ly tâm thu laminaran và sấy khô ở 50ºC đến độ ẩm 12%

2.2.1.4 Phương pháp phân tích một số thành phần khác

+ Phương pháp xác định độ ẩm của nguyên liệu: Độ ẩm nguyên liệu được

xác định bằng phương pháp sấy khô đến khối lượng không đổi

2.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm

2.2.2.1 Quy trình dự kiến chiết rút laminaran từ rong S oligocystum

Đề tài dự kiến quy trình chiết rút laminaran từ rong S oligocystum trình bày ở

hình 2.2

* Giải thích quy trình

+ Rong khô: rong mơ tươi được sấy bằng kỹ thuật sấy bơm nhiệt, đến hàm ẩm

16% và bảo quản ở điều kiện khô ráo dùng làm nguyên liệu chiết rút laminaran

Hình 2.2 Quy trình dự kiến chiết xuất laminaran từ rong Sargassum

oligocystum

+ Nghiền: rong được nghiền nhỏ với kích thước khoảng 0,2 cm nhằm thuận lợi

cho quá trình chiết rút Việc làm nhỏ rong nhằm mục đích làm tăng diện tích tiếp xúc

Nghiền Rong khô

bề mặt của nguyên liệu với dung môi, đồng thời phá vỡ cấu trúc của rong, tạo điều kiện thuận lợi cho các chất hòa tan trong dung môi

+ Chiết: để thu nhận laminaran từ rong mơ, đề tài sẽ tiến hành các thí nghiệm

khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng chiết laminaran: nhiệt

độ, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu, thời gian, pH và số lần chiết

+ Lọc: tiến hành lọc thu nhận dịch chiết laminaran Sau khi lọc, lấy mẫu dịch

chiết để xác định hàm lượng laminaran, tính chống oxy hóa tổng và tính khử sắt để xác định các thông số thích hợp cho quá trình chiết

2.2.2.2 Bố trí thí nghiệm xác định các thông số của quy trình

* Ảnh hưởng của số lần chiết

Bã rong

Dịch chiết 2 Chiết lần 2

ảnh hưởng đến hoạt tính của laminaran, ít tốn dung môi và năng lượng nhất

Dựa vào kết quả hàm lượng laminaran, hoạt tính chống oxy hóa tổng và hoạt tính khử sắt để chọn số lần chiết thích hợp nhất cho quá trình chiết laminaran

* Ảnh hưởng của thời gian chiết:

 Sơ đồ bố trí thí nghiệm:

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian chiết laminaran

 Mục đích: Chọn được thời gian thích hợp cho hiệu quả chiết cao, không quá

dài gây tốn năng lượng và lẫn nhiều tạp chất

Chọn thời gian thích hợp

Dựa vào kết quả hàm lượng laminaran, họat tính oxy hóa tổng và khử sắt

để xác định thời gian chiết thích hợp nhất cho quá trình chiết laminaran

* Ảnh hưởng của pH dung môi

Sơ đồ bố trí thí nghiệm:

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định pH chiết

 Mục đích:

Chọn pH của dung môi thích hợp để thu được hàm lượng Laminaran nhiều nhất

mà ít ảnh hưởng đến hoạt tính của laminaran, ít tốn dung môi, năng lượng và gây khó

7 Chiết

Lọc Dịch chiết

Đánh giá: Hàm lượng laminaran, hoạt tính chống oxy hóa tổng và

hoạt tính khử sắt

Chọn pH thích hợp

khăn cho các quá trình sau

 Cách tiến hành

Sau khi đã xác định được thời gian và số lần chiết thích hợp từ 2 thí nghiệm trên (hình 2.3, 2.4), ta cho mẫu vào 3 bình tam giác đã chuẩn bị sẵn, cho dung môi vào lần lượt mỗi cốc với tỷ lệ 32/1 với các giá trị pH= 7 (hình 2.4) Sau đó cho lần lượt mỗi cốc lên máy khuấy từ gia nhiệt và điều chỉnh ở nhiệt độ 70˚C Sau đó lọc và lấy dịch chiết là dung môi để chiết rong mới cũng với thời gian, nhiệt độ, pH và nhiệt độ như trên Tiếp theo đem dịch chiết đi lọc và xác định hàm lượng Laminaran, hoạt tính chống oxy hóa tổng và hoạt tính khử sắt

Dựa vào kết quả hàm lượng laminaran, hoạt tính chống oxy hóa và khử sắt để chọn pH thích hợp cho quá trình chiết laminaran

* Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu:

Đánh giá: Hàm lượng laminaran, hoạt tính chống oxy hóa tổng và

hoạt tính khử sắt Chọn tỷ lệ DM/NL thích hợp

 Cách tiến hành

Sau khi đã xác định được thời gian, số lần chiết và pH thích hợp từ 3 thí nghiệm trên (hình 2.3, 2.4, 2.5), ta cho mẫu vào 4 cốc thủy tinh đã chuẩn bị sẵn Sau đó cho dung môi đã chọn mỗi cốc với các tỷ lệ khác nhau (hình 2.6) Sau đó cho lần lượt mỗi cốc lên máy khuấy từ gia nhiệt và điều chỉnh ở nhiệt độ 70˚C Sau đó lọc và lấy dịch chiết là dung môi để chiết rong mới cũng với thời gian, nhiệt độ, pH và nhiệt độ như trên Tiếp theo đem dịch chiết đi lọc và xác định hàm lượng Laminaran, hoạt tính chống oxy hóa tổng và hoạt tính khử sắt

Dựa vào kết quả xác định hàm lượng Laminaran, hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính khử sắt để lựa chọn tỷ lệ DM/NL thích hợp nhất

* Ảnh hưởng của nhiệt độ

 Cách tiến hành

Sau khi đã xác định được thời gian, số lần chiết, pH và tỉ lệ DM/NL thích hợp

từ 4 thí nghiệm trên (hình 2.3, 2.4, 2.5, 2.6), ta cho mẫu vào 5 cốc thủy tinh đã chuẩn bị sẵn Sau đó cho lần lượt mỗi cốc lên máy khuấy từ gia nhiệt và điều chỉnh nhiệt độ khác nhau (hình 2.7) Sau đó lọc và lấy dịch chiết là dung môi để chiết rong mới cũng với thời gian, pH, tỉ lệ DM/NL và nhiệt độ như trên Tiếp theo đem dịch chiết đi lọc

và xác định hàm lượng Laminaran, hoạt tính chống oxy hóa tổng và hoạt tính khử sắt Dựa vào kết quả xác định hàm lượng Laminaran, hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính khử sắt để lựa chọn nhiệt độ thích hợp nhất

2.3 HÓA CHẤT VÀ CÁC THIẾT BỊ CHỦ YẾU ĐÃ SỬ DỤNG

2.3.1 Hóa chất

- Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu: HCl, Na2CO3, H2SO4, sodium phosphate, ammonium molybdate, đệm phosphate, K3[Fe(CN)6], CCl3COOH, FeCl3, chất chuẩn là FeSO4 và acid ascorbic, phloroglucinol,…, DPPH, ethanol, n-hexan, ethyl acetate, chloroform, đều là các hóa chất tinh khiết đạt tiêu chuẩn dùng cho phân tích do Merck - Đức và Sigma - Mỹ cung cấp

- Ethanol 96%do Việt Nam sản xuất

- Các loại phụ gia thực phẩm: acid citric, acid ascorbic, carrageenan, xanthan gum, saccharose đều là phụ gia tinh khiết đạt tiêu chuẩn sử dụng làm dược phẩm và thực phẩm do Merck - Đức cung cấp

2.3.2 Thiết bị chủ yếu đã sử dụng

Sử dụng các thiết bị chủ yếu hiện có trong phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học - Trung tâm Thực hành phân tích - Trường Đại học Nha Trang và phòng thí nghiệm Hóa phân tích và Triển khai Công nghệ của Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang gồm: Thiết bị ổn nhiệt - Memment (Đức), máy đo pH (Mỹ), Thiết bị Cô quay chân không (Đức), Máy so mầu UV- VIS (Mỹ),…

2.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU

Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê, mỗi thí nghiệm làm 3 lần Kết quả là trung bình cộng các lần thí nghiệm Sử dụng phần mềm MS Excel 2013 và SPSS 16.0

để xử lý số liệu và vẽ đồ thị

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 Xác định các thông số thích hợp cho quy trình chiết rút laminaran từ

rong nâu S oligocystum bằng phương pháp khuếch tán làm giàu

3.1.1 Ảnh hưởng của số lần chiết

Tiến hành lấy 8g mẫu bột rong mơ S oligocystum để nghiên cứu chiết rút

laminaran theo phương pháp chiết khuếch tán làm giầu và quá trình chiết thực hiện

trên 2 bình tam giác 250ml Tại bình tam giác thứ nhất: lấy 4g mẫu bột rong mơ S

oligocystum cho vào 128ml nước cất Quá trình chiết rút laminaran từ rong mơ được

thực hiện trên máy khuấy từ gia nhiệt ở 70˚C Sau 60 phút chiết rút, tiến hành lọc lấy dịch chiết, lấy mẫu dịch chiết xác định hàm lượng laminaran và dùng dịch chiết làm dung môi để chiết laminaran tiếp ở bình tam giác thứ 2 cũng chứa 4g bột rong mơ và cho thêm nước cất vào cho đúng tỷ lệ 32/1 Quá trình chiết rút laminaran từ rong mơ cũng được thực hiện trên máy khuấy gia nhiệt ở nhiệt độ 70˚C, sau 60 phút tiến hành lọc dịch chiết, lấy mẫu dịch chiết để xác định hàm lượng laminaran, hoạt tính chống oxy hóa tổng, hoạt tính khử sắt Bã rong còn lại của 2 bình tam giác tiếp tục được chiết lần 2 và lần 3 theo đúng nguyên tắc tương tự như trên Kết quả phân tích hàm lượng laminaran, hoạt tính chống oxy hóa tổng, hoạt tính khử sắt được thể hiện ở các hình 3.1 ÷3.3

Hình 3.1 Ảnh hưởng của số lần chiết đến hàm lượng laminaran thu nhận từ

rong mơ S oligocystum

b

a

a

0,000 0,005 0,010 0,015 0,020 0,025 0,030