Chọn lọc và nuôi cấy một số chủng tảo dunaliella dọc bờ biển một số tỉnh miền trung nam bộ cho hàm lượng carotenoid cao (tt)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VÕ HỒNG TRUNG CHỌN LỌC VÀ NUÔI CẤY MỘT SỐ CHỦNG TẢO DUNALIELLA DỌC BỜ BIỂN MỘT SỐ TỈNH MIỀN TRUNG – NAM BỘ CHO HÀM LƯỢNG CAROTENOID CAO Ngành: Sinh lý học Thực vật Mã số ngành: 62 42 30 05 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH SINH HỌC Tp Hồ Chí Minh – Năm 2017 Cơng trình hồn thành tại: Phịng thí nghiệm Công nghệ Tảo, Đại học Quốc tế, Đại học Quốc gia TP HCM Phịng thí nghiệm Sinh lý Thực vật, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP HCM Người hướng dẫn khoa học: HDC: PGS TS Bùi Văn Lệ HDP: TS Trần Ngọc Đức Phản biện 1: PGS TS Trương Thị Đẹp Phản biện 2: TS Lê Thị Thúy Ái Phản biện 3: TS Đào Thanh Sơn Phản biện độc lập 1: TS Nguyễn Thị Thanh Xuân Phản biện độc lập 2: TS Lê Thị Thúy Ái Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp nhà nước họp Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG - HCM vào hồi ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Thư viện Tổng hợp Quốc gia Tp.HCM Thư viện trường Đại học Khoa học Tự Nhiên-HCM Chương - MỞ ĐẦU Dunaliella vi tảo lục đơn bào, có khả chống chịu với độ muối khác Dunaliella trở thành sinh vật mơ hình sử dụng cho nghiên cứu thích ứng muối thực vật Các lồi Dunaliella diện môi trường nước biển, hồ muối khắp giới (Oren Shilo, 1982; Oren, 2005) D salina coi nguồn β-carotene tốt quan trọng số sinh vật quang hợp Chúng tích lũy βcarotene lên đến 50 mg/g trọng lượng khô điều kiện ức chế thích hợp (Ben-Amotz Avron, 1983; Borowitzka, 1989; Boussiba Vonshak, 1991; Chen 2009) Carotenoid có số vai trò quan trọng giúp tăng cường thị lực người, phòng trị bệnh ung thư, viêm lt, chống lão hóa v.v Ngồi sắc tố cịn sử dụng cơng nghiệp thực phẩm chất phụ gia tạo màu, chất chống oxy hóa, tăng cường hệ miễn dịch (Pisal Lele, 2005) Việt Nam nước nhiệt đới có tiềm biển lớn với bờ biển dài 3200km vùng ruộng muối tiếng Sa Huỳnh, Đề Gi, Ninh Diêm, Cam Ranh, Long Điền, Cần Giờ Do đa dạng sinh học vi tảo, đặc biệt Dunaliella phong phú Khả tìm, phân lập xác định chủng vi tảo có dinh dưỡng khả tích lũy carotenoid cao điều kiện môi trường khác lớn Chúng chọn đề tài “Chọn lọc nuôi cấy số chủng tảo Dunaliella dọc bờ biển số tỉnh miền Trung - Nam Bộ cho hàm lượng carotenoid cao” nhằm chọn lọc chủng Dunaliella có khả tổng hợp carotenoid cao điều kiện nuôi cấy khác làm sở cho nghiên cứu khai thác ứng dụng sau Chương - VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 2.1 Phương pháp thu mẫu 2.1.1 Vị trí thu mẫu Mẫu tảo thu vùng ruộng muối vùng biển tỉnh Trung Nam Bộ, gồm tỉnh Quãng Ngãi, Bình Định, Khánh Hịa, Bình Thuận, Bà Rịa – Vũng Tàu, TP Hồ Chí Minh 2.1.2 Phương pháp thu mẫu Mẫu tảo thu nhiều phương pháp khác ruộng muối vùng biển tỉnh Trung Nam Bộ 2.2 Phương pháp phân lập Mẫu thu phân lập môi trường thạch với độ muối tương ứng với độ muối nơi thu mẫu theo Chitlaru Pick (1989) phịng thí nghiệm (hình 2.3) 2.3 Phương pháp chọn lọc định danh Dunaliella Các chủng tảo sau phân lập nuôi cấy môi trường MD4, 1,5M đến cạn kiệt dinh dưỡng (khoảng 20 ngày), dịch nuôi tế bào chủng có màu vàng, đỏ da cam cho thấy có khả tích lũy carotenoid Xác định Dunaliella dựa đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa điều kiện ức chế muối 3,5M NaCl (hình 2.5) Đồng thời kết hợp với phương pháp sinh học phân tử, giải trình tự ITS giúp cho q trình định danh xác Dunaliella (hình 2.6) 2.4 Các phương pháp phân tích 2.4.1 Quan sát hình thái phát huỳnh quang tế bào Hình thái tế bào Dunaliella phát huỳnh quang lipid (nhuộm với Nile Red sau 10 phút) quan sát KHV quang học Nikon ECLIPSE Ni-U (X40) bước sóng 595 nm 2.4.2 Xác định mật độ tế bào Mật độ tế bào tảo đếm trực tiếp buồng đếm hồng cầu Mật độ tế bào mL tính theo cơng thức Guillard Sieracki (2005) 2.4.3 Xác định tốc độ tăng trưởng đặc hiệu suất tế bào Mật độ sinh khối tế bào hai thời điểm khác trình tăng trưởng mẫu dùng để tính tốc độ tăng trưởng đặc hiệu (G: tế bào/ngày) suất tế bào (P: tế bào x 106/mL/ngày) khoảng thời gian khảo sát (Levasseur cs.,1993) 2.4.4 Xác định hàm lượng carotenoid tổng diệp lục tố Dịch nuôi ly trích xác định dựa theo phương pháp Shaish cs (1992) Prieto cs (2011) 2.4.5 Xác định khả chống oxy hóa Khả chống oxy hóa dịch ni xác định phương pháp DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) (Romeilah cs., 2010; Das cs., 2011) Khả chống oxy hóa (I%) tính dựa khả ức chế xạ tự DPPH theo công thức sau (Yaltirak cs., 2009; Albayrak cs., 2010) I% = (AĐối chứng – AMẫu)/AĐối chứng x 100 2.4.6 Xác định hàm lượng phenolic tổng Hàm lượng phenolic tổng xác định thuốc thử FolinCiocalteau’s phenol (Lim cs., 2002; Li cs., 2007; Stankovic, 2011; Goiris cs., 2012) Hàm lượng phenolic tương đương với lượng acid gallic/g (Hemalatha cs., 2013) 2.4.7 Xác định sinh khối tế bào Dịch nuôi cấy tảo lọc qua màng sợi thủy tinh sấy khô 103°C suốt tiếng trọng lượng khô không đổi [A (g)] Trọng lượng khô tiếp tục đốt 550oC để tạo tro [B (g)] (khoáng chất) Sinh khối [C (g)] phần khác biệt khối lượng khô phần khoáng sau đốt (C=A-B) (Zhu Lee, 1997; Lee Shen, 2004) 2.4.8 Đánh giá khả tích lũy lipid tương đối Tín hiệu lipid đọc bước sóng kích thích 480/20 nm bước sóng lọc 590/35 nm (Cooksey cs., 1987; Lee cs., 1998; Chen cs., 2009; Chen cs., 2011; Kou cs., 2013, Tran cs., 2014) 2.5 Phương pháp bố trí thí nghiệm 2.5.1 Chọn lọc mơi trường tự nhiên bổ sung dinh dưỡng cho tăng trưởng Dunaliella Chủng D bardawil ngoại nhập sử dụng để nghiên cứu môi trường Sáu môi trường MD1, MD2, MD3, MD4, MD5, MD6 với thành phần dinh dưỡng khác nhau, độ muối 1,5 M NaCl ánh sáng 50 μmol photon/m2/s liên tục sử dụng để tiến hành chọn lọc môi trường 2.5.2 Bổ sung dinh dưỡng cho môi trường MD4 nuôi Dunaliella Để kéo dài giai đoạn tăng trưởng tăng sinh khối tảo, thí nghiệm bổ sung thành phần dinh dưỡng thực môi trường MD4 lựa chọn D bardawil nuôi môi trường MD4, 1,5M NaCl, sau ngày nuôi cấy bổ sung thành phần dinh dưỡng NPK, KNO3, KH2PO4 kết hợp KNO3 với KH2PO4 với nồng độ khác 2.5.3 Khảo sát độ muối ánh sáng cho tăng trưởng Dunaliella 16 chủng D salina nội địa, chủng D salina CCAP 19/18 D bardawil khảo sát ảnh hưởng độ muối khác (1; 1,5 2M) cường độ ánh sáng khác (50, 100, 150 µmol photon/m2/s) 2.5.4 Đánh giá sơ hàm lượng carotenoid chủng Dunaliella salina nội địa Thí nghiệm đánh giá sơ hàm lượng carotenoid 16 chủng D salina nội địa chủng D salina ngoại nhập thực theo giai đoạn: giai đoạn ni tăng trưởng giai đoạn ức chế tích lũy carotenoid 2.5.5 Chọn lọc chủng Dunaliella salina nội địa tích lũy carotenoid cao, đánh giá khả chống oxy hóa hàm lượng phenolic Để tiếp tục chọn lọc chủng Dunaliella điều kiện ni cấy tối ưu cho tích lũy carotenoid cao, thành phần sinh hóa khác, chúng tơi tiến hành nghiên cứu điều kiện ức chế gồm dinh dưỡng, ánh sáng cao độ muối cao chủng Dunaliella nội địa chọn lọc chủng Dunaliella ngoại nhập 2.5.6 Đo cường độ quang hợp hô hấp tế bào chủng Dunaliella salina Cường độ quang hợp hô hấp chủng D salina đo máy Hansatech giai đoạn tăng trưởng tảo, với 1,5 mL mẫu cho lần đo, cường độ ánh sáng 50, 150, 300, 500 800 µmol photon/m2/s, tốc độ khuấy vịng/phút 2.5.7 Ảnh hưởng ánh sáng xanh dương lên tăng trưởng Dunaliella salina D salina A9 chủng Dunaliella ngoại nhập lựa chọn để khảo sát ảnh hưởng ánh sáng xanh dương lên tăng trưởng với cường độ 30, 50 100 µmol photon/m2/s liên tục, với đối chứng (ĐC) ánh sáng trắng 50 µmol photon/m2/s 2.5.8 Ảnh hưởng ánh sáng UV D salina A9 chủng D salina ngoại nhập lựa chọn để khảo sát ảnh hưởng ánh sáng UV-A lên tăng trưởng, tích lũy carotenoid, khả chống oxy hóa, hàm lượng phenolic tổng tín hiệu lipid tương đối 2.6 Phân tích liệu Tất liệu lưu trữ xử lý với phần mềm Microsoft office Excel 2010 Phần mềm SPSS (Statistical Program Scientific System) phiên 11.5 dùng cho Windows dùng để tính độ tin cậy giá trị khác biệt, với xác suất 95% (p < 0,05) Chương –KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 3.1 KẾT QUẢ 3.1.1 Chọn lọc môi trường tự nhiên bổ sung dinh dưỡng cho tăng trưởng Dunaliella 3.1.1.1 Chọn lọc môi trường nuôi cấy D bardawil tăng trưởng tốt môi trường MD4 với mật độ, sinh khối tế bào tốc độ tăng trưởng cao so với mơi trường cịn lại Sinh khối (g/L) (hình 3.1, 3.2) 1,2 0,8 0,6 0,4 0,2 MD1 MD2 MD3 MD4 MD5 MD6 12 15 Ngày 18 21 24 Hình 3.1 Sinh khối tế bào D bardawil nuôi sáu môi trường khác Tốc độ tăng trưởng (g/L/ngày) 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 MD1 MD2 MD3 MD4 Môi trường MD5 MD6 Hình 3.2 Tốc độ tăng trưởng D bardawil nuôi sáu môi trường khác 3.1.1.2 Bổ sung dinh dưỡng cho MD4 nuôi Dunaliella Mơi trường MD4 cần tiếp tục tối ưu hóa sinh khối Do NPK, nitơ phosphor bổ sung theo 13 nghiệm thức Các nghiệm thức bổ sung dinh dưỡng NPK (0,05 g/L, 0,1 g/L 0,15 g/l) giúp Dunaliella tăng trưởng tốt nghiệm thức lại nghiệm thức (NPK 0,15 g/L) giúp Dunaliella tăng trưởng tốt (hình 3.7) Tốc độ tăng trưởng (tế bào/ngày) 0,1 (b) 0,08 0,06 0,04 0,02 Nghiệm thức Đối chứng NPK 0,05g/L NPK 0,1g/L NPK 0,15g/L KNO3 0,25g/L KNO3 0,5g/L KNO3 0,75g/L KH2PO4 0,0135g/L KH2PO4 0,027g/L KH2PO4 0,0405g/L Kết hợp Kết hợp Kết hợp Hình 3.7 Tốc độ tăng trưởng sau (ngày 8-18) (b) D bardawil 13 nghiệm thức bổ sung dinh dưỡng khác 3.1.2 Phân lập chọn lọc vi tảo lục Dunaliella Khoảng 200 chủng vi tảo khuẩn phân lập môi trường thạch Dựa thay đổi màu sắc dịch ni hình thái tế bào (màu vàng/cam) sau nuôi cấy cạn kiệt dinh dưỡng tế bào chủng chuyển sang màu vàng/da cam lựa chọn 3.1.3 Xác định số chủng Dunaliella Việt Nam 3.1.3.1 Xác định Dunaliella dựa hình thái, sinh lý sinh hóa Các chủng Dunaliella chia thành nhóm dựa kích thước tế bào tích lũy carotenoid, nhóm (D sp1) gồm chủng Dunaliella có kích thước nhỏ từ 4-5 µm chiều rộng 7-8 µm chiều dài (S, Y, F, H, A, L, I) nhóm (D sp2) gồm 16 chủng có kích thước lớn từ 10-15 µm chiều rộng 12-20 µm chiều dài (J, K, M, N, O, P, Q, R, D, E, G, A9, A10, A11, A12, A13) chủng D salina ngoại nhập (CCAP bardawil) (ảnh 3.3) Ảnh 3.3 Hình thái kích thước tế bào Dunaliella thuộc hai nhóm: nhóm 1, D sp1 (a); nhóm 2, D sp2 (b); D salina CCAP (c) D bardawil (d) Dựa hình thái, khả chống chịu với độ muối tín hiệu lipid tương đối thấy có lồi khác nhau: D salina có tế bào vàng, mật độ tế bào thấp tín hiệu lipid tế bào cao (nhóm 2, D sp2 J, K, M, N, O, P, Q, R, D, E, G, A9, A10, A11, A12, A13); lồi có tế bào xanh, mật độ tế bào cao tín hiệu lipid tế bào thấp (nhóm 1, D sp1 S, Y, F, H, A, L) lồi có tế bào xanh, mật độ tế bào cao tín hiệu lipid tế bào cao (nhóm 3, D sp1, I) (ảnh 3.4) 3.1.8 Ảnh hưởng ánh sáng xanh dương lên tăng trưởng Dunaliella salina Sự tăng trưởng tối ưu cường độ ánh sáng xanh phụ thuộc vào loài, D salina A9 tăng trưởng tốt cường độ 50 μmol photon/m2/s, D salina CCAP 100 μmol photon/m2/s D bardawil 30 μmol photon/m2/s 3.1.9 Ảnh hưởng ánh sáng UV Tế bào chủng D salina sau ức chế ánh sáng trắng 500 µmol photon/m2/s riêng rẽ kết hợp UV-A, tế bào chuyển sang màu vàng (hoặc da cam), kích thước tế bào lớn hình dạng thay đổi Sự tăng trưởng D salina A9 D bardawil giảm sau bị ức chế Ngược lại, D salina CCAP tăng trưởng tăng sau ức chế Hàm lượng carotenoid (hình 3.32), khả chống oxy hóa, hàm lượng phenolic tổng tín hiệu lipid tương đối tăng sau ức chế ánh sáng trắng 500 µmol photon/m2/s riêng Carotenoid (µg/mL) rẽ kết hợp UV-A 50 45 40 35 30 25 20 15 10 D salina A9-500 D salina A9-500+UV D salina CCAP-500 D salina CCAP-500+UV D bardawil-500 D bardawil-500+UV Ngày - Ngày - sau Ngày 12 trước ức chế ức chế sau ức chế Hình 3.32 Hàm lượng carotenoid thể tích D salina trước sau ức chế ánh sáng trắng 500 µmol photon/m2/s riêng rẽ kết hợp UV W/m2 liên tục 13 3.2 THẢO LUẬN 3.2.1 Chọn lọc môi trường tự nhiên bổ sung dinh dưỡng cho tăng trưởng Dunaliella 3.2.1.1 Chọn lọc môi trường nuôi cấy Các số liệu mật độ tế bào, sinh khối diệp lục tố Dunaliella môi trường thống với (hình 3.1, 3.3) Trong mơi trường MD4 bổ sung NPK tạo tăng trưởng tốt cho Dunaliella (hình 3.2) Mơi trường MD4 bổ sung nitrogen phosphor từ phân bón NPK giúp tế bào tăng trưởng tốt với tốc độ tăng trưởng sinh khối cao sau 14 ngày nuôi cấy D bardawil tăng trưởng tốt mơi trường MD4 (bổ sung phân bón NPK) để tạo chất hữu cao so với mơi trường cịn lại Nitrogen dinh dưỡng đa lượng quan trọng cho tăng trưởng biến dưỡng, thành phần protein, vật liệu di truyền q trình biến dưỡng lipid, acid béo nhiều lồi vi tảo (Griffiths Harrison, 2009) Ngồi thành phần quan trọng tổng hợp diệp lục tố protein hệ thống quang hợp LHCII apoprotein Vì việc cung cấp nitrogen có ảnh hưởng lên thành phần cấu trúc sinh lý quang hợp vi tảo (Tan cs., 2016) Tương tự, phosphor yếu tố cần thiết cho tăng trưởng vi tảo, đặc biệt cho hình thành vận chuyển lượng chuyển hóa Phosphor diện ribosome giàu phosphor nơi mà protein liên quan đến quang hợp tổng hợp Vì phosphor bị hạn chế làm giảm hoạt tính quang hợp dẫn đến tốc độ tăng trưởng giảm (Pudaite, 2015) Ngoài dinh dưỡng vi lượng đa lượng phân bón cần thiết cho phát triển sinh vật phù du (Boyd, 1979; Boney, 1983) chúng giúp trì hàm lượng nitrogen môi trường nước (Davies cs., 2006) Mặc dù carotenoid khơng có nitrogen, tổng hợp chúng bị ức chế mạnh trình thiếu nitrogen Sự dimer hóa geranyl-geranyl 14 pyrophosphate bước giới hạn tổng hợp carotenoid giai đoạn thiếu nitrogen Việc tổng hợp chuỗi prenyl bị ảnh hưởng thiếu nitrogen (Lichtenthaler Verbeek, 1973) Nhìn chung mơi trường nước biển biến đổi bổ sung NPK (MD4) dường có nhiều ưu điểm so với môi trường đối chứng (MD1) mơi trường khác (MD2,3,5,6) chi phí sản xuất (phụ lục A2, A6), tăng trưởng thành phần sinh hóa khác hàm lượng diệp lục tố, carotenoid khả chống oxy hóa Vì vậy, phân bón thành phần thay tuyệt vời sử dụng cho nuôi sinh khối vi tảo 3.2.1.2 Bổ sung dinh dưỡng cho môi trường MD4 nuôi Dunaliella Nitrogen phosphor hai dinh dưỡng đa lượng quan trọng cho tăng trưởng biến dưỡng tế bào tảo Sự hạn chế dinh dưỡng quan trọng làm thay đổi đường biến dưỡng tế bào Đối với cạn kiệt nitrogen phosphor làm thay đổi biến dưỡng lipid từ tổng hợp lipid màng thành dự trữ lipid trung tính Điều lần lược làm tăng hàm lượng lipid tảo lục (Juneja cs., 2013) Vì để trì tăng trưởng tăng sinh khối vi tảo cần bổ sung nitrogen phosphor vào giai đoạn giới hạn hai dinh dưỡng vào môi trường ni cấy Các nghiệm thức bổ sung phân bón NPK sau ngày nuôi cấy giúp Dunaliella tăng trưởng tốt nồng độ NPK cao tảo tăng trưởng tốt (hình 3.6, 3.7) Bổ sung NPK với nồng độ (0,15 g/L) không ức chế tăng trưởng, giúp trì thời gian dài hơn, lên đến tuần sau bổ sung khơng có khác biệt đáng kể tăng trưởng nghiệm thức bổ sung NPK (hình 3.7bc) Trong điều kiện nồng độ nitrogen cao môi trường vi tảo dự trữ nitrogen dạng diệp lục tố nồng độ nitrogen mơi trường giảm có chuyển dịch nitrogen từ diệp lục tố vào protein để giúp trì tăng trưởng vi tảo (McGlathery Pedersen, 1999) 15 Hàm lượng diệp lục tố (µg/mL) 13 nghiệm thức tăng tương ứng với tăng trưởng tế bào D bardawil Sự tích lũy carotenoid D bardawil gần phù hợp với tăng trưởng hàm lượng diệp lục tố (hình 3.6, 3.7, 3.8, 3.9) Điều nghiệm thức bổ sung dinh dưỡng không tạo điều kiện ức chế tổng hợp carotenoid Hàm lượng diệp lục tố thấp nhóm Chlamydomonas reinhardtii bị cạn kiệt nitrogen (N) nitrogen-phosphor (NP) Sự giảm cạn kiệt nitrogen tảo Acid 5-aminolevulinic tiền chất diệp lục tố tổng hợp từ kết hợp succinate glycin trực tiếp từ glutamate Việc cung cấp hạn chế nitrogen vào tế bào bị đói N NP ảnh hưởng lên khả tổng hợp acid amin glycin glutamate tế bào, làm hạn chế tổng hợp acid 5-aminolevulinic dẫn đến hàm lượng diệp lục tố thấp tế bào Tương tự hàm lượng diệp lục tố, hàm lượng carotenoid thấp nhóm cạn kiệt N NP; điều cho thấy nồng độ nitrogen ảnh hưởng lên hàm lượng carotenoid tế bào Hàm lượng sắc tố giảm tế bào cạn kiệt N NP không giảm tế bào cạn kiệt P, kết cho thấy nitrogen yếu tố cần thiết cho tổng hợp diệp lục tố carotenoid (Kamalanathan cs., 2015) 3.2.2 Xác định chủng Dunaliella Việt Nam Dunaliella salina nguồn sản xuất β-carotene giá trị Việc phân lập xác định xác D salina quan trọng Marker phân tử công cụ phổ biến cho việc xác định xác Dunaliella (Polle cs., 2009; Preetha cs., 2012) Nhiều nghiên cứu cho thấy Dunaliella tích lũy hàm lượng lipid trung tính cao bị ức chế độ muối cao, cường độ ánh sáng cao, cạn kiệt dinh dưỡng,…Vì chúng tơi sử dụng đặc điểm tín hiệu lipid dấu hiệu bổ sung để phân biệt D salina Dữ liệu tín hiệu lipid trước sau ức chế muối giúp xác định D salina với hỗ trợ hình thái khả chống chịu độ muối 16 23 chủng Dunaliella bao gồm 16 chủng vàng/cam chủng xanh lựa chọn từ khoảng 200 chủng (ảnh 3.1, 3.2) sau tháng nuôi cạn kiệt dinh dưỡng Theo Ben Amotz cs (1982), Phadwal Singh (2003) chủng Dunaliella chuyển màu vàng/cam điều kiện cạn kiệt dinh dưỡng cho D salina tích lũy carotene So sánh đặc điểm hình thái, kích thước thay đổi màu sắc tế bào sau nuôi cấy cạn kiệt dinh dưỡng 23 chủng Dunaliella nội địa D salina CCAP 18/19, D bardawil DCCBC 15, D viridis tác giả đưa nhận định: chủng Dunaliella nhóm D sp2 D salina nhóm D sp1 D salina (ảnh 3.3, 3.4) Trong điều kiện ni cấy 1,5M nhóm D sp1 tăng trưởng nhanh so với chủng nhóm D sp2 Tuy nhiên nhóm D sp2 có khả chống chịu độ muối cao tốt so với nhóm D sp1 thể mật độ tế bào ổn định sau ức chế (ảnh 3.4; hình 3.10, 3.11) Khả tăng trưởng đặc tính sinh học tế bào (Geidervà cs., 1986) Sự tích lũy lipid chủng Dunaliella tăng lên sau ức chế muối 3,5M NaCl Trong đó, tín hiệu lipid tế bào (lipid/tb) D salina cao so với D viridis D tertiolecta (ảnh 3.4; hình 3.11b) Tín hiệu lipid tế bào chủng Dunaliella tăng sau ức chế muối phù hợp với nghiên cứu trước Chen cs (2011) Trong điều kiện bất lợi môi trường độ muối cao, cường độ ánh sáng cao, cạn kiệt dinh dưỡng,…carotenoid thứ cấp tích lũy cấu trúc đặc biệt nằm bên stroma lục lạp (như giọt chứa β-carotene D bardawil) bên lục lạp (như hạt oleosome tế bào chất H pluvialis) Các cấu trúc chứa carotenoid thứ cấp tổng hợp với tham gia chủ yếu lipid trung tính (Triacylglycerol, TAG) (Solovchenko, 2013) 17 Dựa kết phân tích đoạn ADN ITS cho thấy, nhóm tế bào xanh, có kích thước nhỏ tăng trưởng nhanh, có khả chống chịu độ muối thấp xác định thuộc D viridis D tertiolecta Trong đó, chủng Dunaliella vàng/cam, có kích thước lớn chịu độ muối tốt xác định D salina (hình 3.12) 3.2.3 Khảo sát độ muối ánh sáng cho tăng trưởng Dunaliella salina Độ muối cường độ ánh sáng yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến tăng trưởng tối ưu tích lũy carotenoid D salina Kết cho thấy hầu hết chủng D salina tăng trưởng tốt độ muối 1,5M NaCl cường độ ánh sáng 50 µmol photon/m2/s với mật độ tế bào tốc độ tăng trưởng đạt cao so với điều kiện cịn lại Ở điều kiện ni cấy giúp tế bào D salina hấp thu tốt dinh dưỡng từ môi trường, tổng hợp sắc tố quang hợp hiệu hoạt động máy quang hợp đạt cao Tốc độ tăng trưởng tảo bị ảnh hưởng tương tác ánh sáng dinh dưỡng, tỷ lệ carbon thể chức ánh sáng dinh dưỡng Sự tăng trưởng tảo tăng gắn với việc sử dụng hiệu dinh dưỡng môi trường điều kiện ánh sáng thấp (Juneja cs., 2013) Hình 3.13 3.14 cho thấy hầu hết chủng có tốc độ tăng trưởng cao độ muối 1,5M NaCl Dunaliella có khả chịu độ muối từ 0,5M đến 5M NaCl Sự đáp ứng tăng trưởng Dunaliella tương tác phức tạp với nhiều yếu tố môi trường nhiệt độ, độ muối cường độ ánh sáng (Ben-Amozt, 2009) Các chủng D salina tăng trưởng tốt cường độ ánh sáng 50 µmol photon/m2/s, với mật độ tế bào, tốc độ tăng trưởng suất tế bào cao so với cường độ ánh sáng cao (100 150 µmol photon/m2/s) (hình 3.15, 3.16) Đặc biệt, D salina CCAP tăng trưởng cao tốt 18 cường độ ánh sáng 50, 100 µmol photon/m2/s (hình 3.16, bảng 3.5) Theo Liu Shen (2004) Mofeed (2015) cường độ ánh sáng yếu tố quan trọng góp phần vào sản xuất sắc tố quang hợp, cường độ ánh sáng cao làm tăng tổng hợp diệp lục tố a cường độ ánh sáng thấp D salina Ở D viridis hàm lượng diệp lục tố a carotenoid tế bào cao cường độ ánh sáng 50 µmol photon/m2/s hàm lượng sắc tố giảm mạnh tăng cường độ ánh sáng Ở cường độ ánh sáng cao tăng trưởng nhanh tích lũy sắc tố khơng tăng (Ak cs., 2008) 3.2.5 Chọn lọc chủng Dunaliella salina nội địa tích lũy carotenoid cao Tám chủng D salina nội địa có hàm lượng carotenoid cao ni cấy điều kiện ức chế cường độ ánh sáng 150 µmol photon/m2/s kết hợp độ muối 4,0M NaCl chọn để tiếp tục phân tích hàm lượng carotenoid khả chống oxy hóa với điều kiện ức chế khác Trong điều kiện ức chế ánh sáng cao AS500, AS800 AS500+4M tích lũy carotenoid chủng D salina cao so với điều kiện ức chế N/P, muối 4M AS300 (hình 3.22) Kết cho thấy ánh sáng yếu tố ảnh hưởng đến khả tích lũy carotenoid D salina phù hợp với kết trước khả kích thích tạo carotene ánh sáng kết hợp với yếu tố khác độ muối cao cạn kiệt dinh dưỡng Dunaliella số tảo khác (Pisal Lele, 2005; Park cs., 2013) Điều kiện ức chế AS500 D salina A9 tích lũy carotenoid cao chủng nội địa cịn lại, đặc tính D salina A9 nhạy cảm với cường độ ánh sáng cao Khi tiếp xúc với cường độ ánh sáng cao tế bào Dunaliella sử dụng đường tổng hợp carotenoid chế bảo vệ chống lại tổn thương ánh sáng (Xu cs., 2016) 19 Các nghiệm thức ức chế kết hợp độ muối cao (4M NaCl) ánh sáng cao (500 µmol photon/m2/s) gây tích lũy carotenoid cao so với nghiệm thức ức chế muối riêng rẽ (4M NaCl) Tuy nhiên so với nghiệm thức ức chế ánh sáng cao riêng rẽ (500 800 µmol photon/m2/s) hàm lượng carotenoid nghiệm thức kết hợp khơng có khác biệt rõ rệt Như kết cho thấy ức chế ánh sáng cao có khả kích thích tổng hợp carotenoid D salina tốt so với độ muối cao Ngoài kết cho thấy ức chế ánh sáng 800 µmol photon/m2/s hàm lượng carotenoid hầu hết chủng D salina không cao so với ức ánh sáng 500 µmol photon/m2/s riêng rẽ kết hợp độ muối (4M NaCl) Điều cường độ ánh sáng cao 800 µmol photon/m2/s gây ức chế tổng hợp carotenoid chủng D salina Các nghiên cứu cho thấy liên quan ROS đến cảm ứng tổng carotenoid ROS tạo điều kiện ức chế ánh sáng cao điều kiện ức chế khác, đóng vai trị chất truyền tín hiệu thứ để hoạt hóa đường tổng hợp carotenoid ROS sản phẩm chuyển hóa chúng hoạt hóa enzyme tiền tổng hợp carotenoid cảm ứng biểu gen tương ứng (Solovchenko, 2013) 3.2.6 Khả chống oxy hóa hàm lượng phenolic tổng chủng Dunaliella salina Các kết cho thấy khả chống oxy hóa (hình 3.23) hàm lượng phenolic tổng (hình 3.24) chủng D salina điều kiện ức chế muối ánh sáng cao so với điều kiện ức chế khác Carotenoid chất chống oxy hóa mạnh khử gốc tự Carotenoid thứ cấp (astaxanthin ester với acid béo) vi tảo khử hiệu ROS tạo màng thylakoid chúng nằm bên màng thylakoid Carotenoid thứ cấp bảo vệ chống lại peroxide hóa lipid dự trữ oleosome ngăn khác tế bào nhân Chính người ta 20 thấy oleosome chứa carotenoid thứ cấp nằm quanh nhân để tạo rào cản lý hóa hấp thụ ROS bảo vệ ADN tránh tổn thương oxy hóa Sự tổng hợp carotenoid chứa oxy vi tảo làm giảm nồng độ oxy tế bào ngăn khác tế bào Một yếu tố quan trọng kiểm sốt hình thành ROS điều kiện nuôi cấy bất lợi chất nhận electron từ plastoquinone chuỗi vận chuyển điện tử lục lạp đến oxidase cuối lạp thể (PTOX) thông qua desaturase đường tổng hợp carotenoid Đồng thời oxy phân tử lục lạp khử tạo thành H2O, làm giảm khả tạo ROS (Solovchenko, 2013) 3.2.7 Cường độ quang hợp hô hấp tế bào chủng Dunaliella salina Cường độ quang hợp (trên thể tích, tế bào diệp lục tố) chủng D salina có khác biệt: cường độ quang hợp D salina A9, O tăng với tăng cường độ ánh sáng từ 50 lên 800 μmol photon/m2/s; D salina E, G, J, CCAP cường độ quang hợp đạt cực đại 150, 300 μmol photon/m2/s Trong chủng D salina A10, N D bardawil cường độ quang hợp giảm tăng cường độ ánh sáng từ 50 đến150 μmol photon/m2/s, sau tăng tăng cường độ ánh sáng từ 150 đến 500 μmol photon/m2/s (hình 3.25) Kết cho thấy chủng D salina khác có khác biệt đáng kể đáp ứng với ức chế ánh sáng độ nhạy chủng với ánh sáng khác Ánh sáng thiết yếu cho quang hợp, mức gây tổn thương nhiều thành phần máy quang hợp, chủ yếu PSII, làm giảm hiệu quang hợp (Bùi Trang Việt, 2016) Khi lục lạp tiếp xúc với điều kiện ánh sáng cao gây hư hại PSII ánh sáng tốc độ hư hại vượt khả sửa chữa tổn hại dẫn đến quang ức chế giảm hiệu suất quang hợp (Xu cs., 2016) Ngoài ra, khác biệt tốc độ phân chia, thể tích tế bào D salina CCAP 19/18 D 21 bardawil dẫn đến khác biệt cường độ quang hợp (trên tế bào) hai chủng (Pack cs., 2013) Ánh sáng mạnh làm tổn thương PSI chuyển electron vượt khả nhận electron NADP+, dẫn đến sản xuất ROS gây tổn thương PSI tác dụng phân hủy protein, lipid acid nucleic tế bào (Bùi Trang Việt, 2016) 3.2.8 Ảnh hưởng ánh sáng xanh dương lên tăng trưởng Dunaliella salina Tảo chứa diệp lục tố a b nhạy cảm với ánh sáng xanh dương đỏ Nhiều nghiên cứu cho thấy tảo lục tăng trưởng tốt điều kiện ánh sáng xanh dương đỏ chúng chứa diệp lục tố a b nhạy cảm với bước sóng ánh sáng (Singh Singh, 2015) Sự tăng trưởng chủng D salina tăng mạnh điều kiện ánh sáng xanh dương với mật độ tế bào cao sau ngày ni cấy (hình 3.27) Sự đáp ứng với cường độ ánh sáng xanh dương phụ thuộc vào loài D salina khác nhau: D salina A9 tăng trưởng tốt cường độ 50 µmol photon/m2/s (hình 3.27a, 3.28), D salina CCAP 100 µmol photon/m2/s (hình 3.27b, 3.29) D bardawil 30 µmol photon/m2/s (hình 3.27c, 3.30) Ánh sáng xanh dương cần thiết cho phân chia tế bào tảo C reinhardtii Những nghiên cứu thấy ánh sáng xanh dương đỏ giúp tảo tăng trưởng tổng hợp polysaccharide có hiệu tốt lên quang hợp Chlorella (Juneja cs., 2013) Ánh sáng xanh ảnh hưởng đến q trình chuyển hóa vi tảo mà không làm giảm tốc độ tăng trưởng tế bào, hàm lượng diệp lục tố a cường độ quang hợp cao (Marchetti cs., 2013) 3.2.9 Ảnh hưởng ánh sáng UV Sau ức chế kết hợp ánh sáng cao 500 μmol photon/m2/s UV-A (5 W/m2) hình thái màu sắc tế bào D salina có thay đổi rõ rệt, tế bào 22 chủng D salina chuyển từ màu xanh sang vàng/da cam, hình trứng sang hình trịn (đối với D bardawil) hình trứng kéo dài (đối với D salina A9 D salina CCAP) (ảnh 3.10) Những thay đổi dấu hiệu cho thấy tổng hợp carotenoid D salina sau ức chế ánh sáng cao (hình 3.32) kết phù hợp với nghiên cứu Park cs (2013) Sự tăng trưởng D salina A9 giảm sau bị ức chế, D bardawil tăng sau ngày ức chế sau giảm dần Ở điều kiện ức chế kết hợp 500 μmol photon/m2/s UV W/m2 làm giảm tăng trưởng mạnh so với điều kiện ức chế ánh sáng trắng 500 μmol photon/m2/s riêng rẽ Ngược lại, D salina CCAP D bardawil tăng trưởng tăng sau ức chế (hình 3.31) Bức xạ UV-A khơng có hoạt tính quang hợp có ảnh hưởng lớn đến điều hịa suất sinh học hệ thống thủy sinh, có khả ảnh hưởng đến đồng hóa chất dinh dưỡng, quang hợp sửa chữa tổn thương ánh sáng phân tử tảo (Arts cs., 2000; Zhou cs., 2009) ADN mục tiêu xạ bước sóng ngắn tảo Sự hình thành nhiều CPD (cyclobutane–pyrimidine dimer) tổn thương tiếp xúc với ánh sáng UV-B gây ức chế q trình tái ADN (García-Gómez cs., 2012) Hàm lượng carotenoid phụ thuộc vào loài ảnh hưởng ức chế ánh sáng UV UV-A rõ ràng gây tích lũy lượng lớn β-carotene D salina Theo Mogedas cs (2009) loại carotenoid, β-carotene thành phần có hàm lượng cao, tiếp đến violaxanthin zeaxanthin có hàm lượng thấp tế bào Dunaliella nuôi cấy điều kiện ức chế có UV-A Việc tăng hàm lượng zeaxanthin giúp tế bào đáp ứng lại với stress oxy hóa Zeaxanthin violaxanthin sắc tố liên quan đến chu trình xanthophyll phổ biến thực vật bậc cao có vai trị bảo vệ chống lại tổn thương ánh sáng Zeaxanthin đóng vai trị 23 chất chống oxy hóa phản ứng tế bào chống lại tổn thương oxy hóa gây ánh sáng cao có khả giải phóng lượng dư thừa cách tỏa nhiệt Ngoài hiệu chống oxy chu trình xanthophyll với zeaxanthin đóng vai trị chất khử oxy singlet Khả chống oxy hóa chủng D salina tăng lên sau ức chế ánh sáng cao (hình 3.34) phù hợp với nghiên cứu trước (Chen cs., 2011) Hàm lượng phenolic tổng chủng D salina tăng lên sau ức chế tương ứng với tăng khả chống oxy hóa (hình 3.35) D salina ni cấy điều kiện ức chế cạn kiệt nitrogen kết hợp với ức chế muối ánh sáng UV-B gây tích lũy hàm lượng lớn chất chống oxy hóa tan lipid (carotenoids α-tocopherol), tan nước (glutathione ascorbic acid) tăng hoạt tính enzyme chống oxy hóa (superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) peroxidase (POD) Sự tăng hàm lượng chất chống oxy hóa cho thấy tế bào tảo thích nghi với stress quang oxy hóa cách điều hòa tổng hợp sửa chữa protein tăng cường hệ thống chống oxy hóa (El-Baky cs., 2004) Tín hiệu lipid tương đối chủng D salina tăng lên sau ức chế ánh sáng cao Ở D bardawil tín hiệu lipid tương đối cao so với chủng D salina lại tương ứng với tổng hợp carotenoid (hình 3.32, 3.36) Bức xạ UV-A làm tăng hàm lượng lipid/diệp lục tố N oculata sau ngày ức chế UV-A giảm dinh dưỡng có tác dụng hiệp đồng lên tích lũy lipid (Srinivas Ochs, 2012) 24 Chương – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN - Các mẫu tảo thu thập vùng ruộng muối thuộc tỉnh ven biển Trung - Nam Bộ, Việt Nam phân lập môi trường thạch với độ muối tương ứng với độ muối nơi thu mẫu chiếu sáng liên tục thu lượng lớn vi tảo (khoảng 200 chủng phân lập), đặc biệt chủng Dunaliella, cho thấy đa dạng nhóm vi tảo có giá trị sinh học vùng ruộng muối - Môi trường nước biển biến đổi MD4 bổ sung phân bón NPK 0,15g/L có giá thành thấp, D salina tăng trưởng tốt với mật độ tế bào tốc độ tăng trưởng cao nuôi dười điều kiện độ muối 1,5M NaCl cường độ ánh sáng 50 μmol photon/m2/s liên tục - Điều kiện ức chế muối cao 3,5M NaCl gây thay đổi hình thái, màu sắc, kích thước, sinh lý sinh hóa nhóm Dunaliella khác Sự tích lũy lipid thơng qua phát huỳnh quang lipid (các tế bào sau 10 phút nhuộm Nile Red) tăng Dunaliella sau ức chế muối Định danh Dunaliella dựa giải trình tự ADN ITS xác định 16 chủng D salina nội địa có khả tích lũy carotenoid với tế bào chuyển sang màu vàng/cam, kích thước lớn hơn, chống chịu tốt tín hiệu lipid tế bào cao sau ức chế Vì tín hiệu phát huỳnh quang lipid sử dụng công cụ quan trọng để xác định lượng lớn vi tảo có khả tích lũy carotenoid cao - Tế bào D salina tăng trưởng cao cường độ ánh sáng xanh dương khác nhau, D salina A9 tăng trưởng tốt cường độ 50 µmol photon/m2/s, D salina CCAP 100 µmol photon/m2/s D bardawil 30 µmol photon/m2/s với mật độ tế bào, tốc độ tăng trưởng suất tế bào đạt cao sau ngày nuôi cấy 25 - Trong điều kiện ức chế cường độ ánh sáng cao 500 µmol photon/m2/s riêng rẽ hay kết hợp với độ muối cao (4M NaCl) 800 µmol photon/m2/s chủng D salina nội địa tích lũy lượng lớn carotenoid Trong D salina A9 có hàm lượng carotenoid cao chủng khác điều kiện ức chế cường độ ánh sáng cao 500 µmol photon/m2/s riêng rẽ Ức chế cường độ ánh sáng cao 800 µmol photon/m2/s gây ức chế tổng hợp carotenoid hầu hết chủng D salina nội địa Ngoài điều kiện ức chế ánh sáng cao D salina có hàm lượng phenolic hoạt tính chống oxy hóa cao so với điều kiện ức chế khác - Điều kiện ức chế ánh sáng cao 500 µmol photon/m2/s kết hợp với ánh sáng UV-A 5W/m2 liên tục gây ức chế tăng trưởng (D salina A9) kích thích tăng trưởng (D salina CCAP D bardawil) Đồng thời tích lũy hàm lượng lớn carotenoid, phenolic, khả chống oxy hóa tín hiệu lipid tăng chủng D salina 4.2 KIẾN NGHỊ - Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện ức chế khác nhiệt độ, pH, CO2 lên tích lũy carotenoid D salina - Nghiên cứu thành phần carotenoid chất chống oxy hóa acid ascorbic, enzyme chống oxy hóa, hợp chất phenolic điều kiện ức chế khác - Nuôi thử nghiệm quy mô pilot cho số chủng D salina nội địa có khả tích lũy carotenoid cao 26 DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Trung Vo, Duc Tran, Anh Pham, Phuc Luu, Anh Bui and Le Bui (2015), “Conditions for simultaneous exploitation of total carotene, phenolics and antioxidant capacity of Dunaliella salina A9”, Journal of Advances in Food Science & Technology, Vol 2(1), p 29-33 Nguyen C Nguyen, Duc Tran, Hoa Nguyen, Hai Nguyen and Trung Vo (2015), “Selection of Dunaliella salina and light stress conditions for carotene, phenolics and antioxidant capacity”, Journal of Advances in Food Science & Technology, Vol 2(3), p 97-102 Duc Tran, Truc Mai, Trung Vo, Andrew Ward, Hai Nguyen, Xuan Hoang (2014), “Lipid Signal Can Be An Additional Marker For The Detection Of Dunaliella salina”, Wulfenia Journal, Vol 21(12), p 216233 Suong Nguyen, Duc Tran, Sixto Portilla, Trung Vo (2014), “Medium improvement for higher growth and longer stationary phase of Dunaliella”, Journal of Plant Sciences, Vol 2(1), p 9-13 Trung Vo, Duc Tran (2014), “Carotene and Antioxidant Capacity of Dunaliella salina Strains”, Journal of Nutrition and Health, Vol 2(2), p 21-23 Trung Vo, Duc Tran (2014), “Effects of Salinity and Light on Growth of Dunaliella Isolates”, Journal of Applied & Environmental Microbiology, Vol 2(5), p 208-211 Duc Tran, Trung Vo, Clifford Louime, Sixto Portilla, Nguyen Doan, Truc Mai, Dat Tran and Trang Ho (2013), “Phylogenetic study of some Dunaliella strains”, American Journal of Environmental Science, Vol 9(4), p 317-321 Duc Tran, Clifford Louime, Trung Võ, Mario Giordano, Sixto Portilla, Nguyen Doan, Dat Tran, Truc Mai, Le Bui (2013), “Identification of Dunaliella Viridis Using its Markers”, International Journal of Applied Science and Technology, Vol 3(4), p 118-126 ... chủng vi tảo có dinh dưỡng khả tích lũy carotenoid cao điều kiện môi trường khác lớn Chúng chọn đề tài ? ?Chọn lọc nuôi cấy số chủng tảo Dunaliella dọc bờ biển số tỉnh miền Trung - Nam Bộ cho hàm. .. lũy carotenoid 2.5.5 Chọn lọc chủng Dunaliella salina nội địa tích lũy carotenoid cao, đánh giá khả chống oxy hóa hàm lượng phenolic Để tiếp tục chọn lọc chủng Dunaliella điều kiện ni cấy tối... biển số tỉnh miền Trung - Nam Bộ cho hàm lượng carotenoid cao? ?? nhằm chọn lọc chủng Dunaliella có khả tổng hợp carotenoid cao điều kiện nuôi cấy khác làm sở cho nghiên cứu khai thác ứng dụng sau