Chọn lọc và nuôi cấy một số chủng tảo dunaliella dọc bờ biển một số tỉnh miền trung nam bộ cho hàm lượng carotenoid cao (tt)

Chúng tôi chọn đề tài “Chọn lọc và nuôi cấy một số chủng tảo Dunaliella dọc bờ biển một số tỉnh miền Trung - Nam Bộ cho hàm lượng carotenoid cao” nhằm chọn lọc các chủng Dunaliella có kh

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Công trình được hoàn thành tại: Phòng thí nghiệm Công nghệ Tảo, Đại

học Quốc tế, Đại học Quốc gia TP HCM và Phòng thí nghiệm Sinh lý Thực vật, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP HCM

Người hướng dẫn khoa học:

1 HDC: PGS TS Bùi Văn Lệ

2 HDP: TS Trần Ngọc Đức

Phản biện 1: PGS TS Trương Thị Đẹp

Phản biện 2: TS Lê Thị Thúy Ái

Phản biện 3: TS Đào Thanh Sơn

Phản biện độc lập 1: TS Nguyễn Thị Thanh Xuân

Phản biện độc lập 2: TS Lê Thị Thúy Ái

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp nhà nước họp tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG - HCM

vào hồi giờ ngày tháng năm

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

1 Thư viện Tổng hợp Quốc gia Tp.HCM

1

Chương 1 - MỞ ĐẦU

Dunaliella là vi tảo lục đơn bào, có khả năng chống chịu với các độ muối khác nhau Dunaliella đã trở thành một sinh vật mô hình sử dụng cho nghiên cứu thích ứng muối ở thực vật Các loài Dunaliella hiện diện trong

các môi trường nước biển, các hồ muối trên khắp thế giới (Oren và Shilo, 1982; Oren, 2005)

D salina đã được coi là một trong những nguồn β-carotene tốt và quan

trọng nhất trong số các sinh vật quang hợp Chúng có thể tích lũy carotene lên đến 50 mg/g trọng lượng khô trong điều kiện ức chế thích hợp (Ben-Amotz và Avron, 1983; Borowitzka, 1989; Boussiba và Vonshak, 1991; Chen 2009)

β-Carotenoid có một số vai trò quan trọng như giúp tăng cường thị lực của con người, phòng và trị bệnh như ung thư, viêm loét, chống lão hóa v.v Ngoài ra các sắc tố còn được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm như chất phụ gia tạo màu, chất chống oxy hóa, tăng cường hệ miễn dịch (Pisal

và Lele, 2005)

Việt Nam là nước nhiệt đới có tiềm năng biển rất lớn với bờ biển dài hơn 3200km và các vùng ruộng muối nổi tiếng như Sa Huỳnh, Đề Gi, Ninh Diêm, Cam Ranh, Long Điền, Cần Giờ Do đó sự đa dạng sinh học vi tảo,

đặc biệt Dunaliella là rất phong phú Khả năng tìm, phân lập và xác định

các chủng vi tảo có dinh dưỡng và khả năng tích lũy carotenoid cao dưới các điều kiện môi trường khác nhau là rất lớn

Chúng tôi chọn đề tài “Chọn lọc và nuôi cấy một số chủng

tảo Dunaliella dọc bờ biển một số tỉnh miền Trung - Nam Bộ cho hàm lượng carotenoid cao” nhằm chọn lọc các chủng Dunaliella có khả năng

tổng hợp carotenoid cao trong các điều kiện nuôi cấy khác nhau và làm cơ

sở cho các nghiên cứu khai thác ứng dụng tiếp theo sau này

Chương 2 - VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 2.1 Phương pháp thu mẫu

2.1.1 Vị trí thu mẫu

Mẫu tảo được thu ở các vùng ruộng muối và vùng biển các tỉnh Trung Nam Bộ, gồm tỉnh Quãng Ngãi, Bình Định, Khánh Hòa, Bình Thuận, Bà Rịa – Vũng Tàu, TP Hồ Chí Minh

2.1.2 Phương pháp thu mẫu

Mẫu tảo được thu bằng nhiều phương pháp khác nhau tại các ruộng muối và vùng biển các tỉnh Trung Nam Bộ

2.2 Phương pháp phân lập

Mẫu thu được phân lập trên môi trường thạch với độ muối tương ứng với độ muối tại nơi thu mẫu theo Chitlaru và Pick (1989) tại phòng thí nghiệm (hình 2.3)

2.3 Phương pháp chọn lọc và định danh Dunaliella

Các chủng tảo sau phân lập được nuôi cấy trên môi trường MD4, 1,5M đến cạn kiệt dinh dưỡng (khoảng 20 ngày), dịch nuôi và tế bào các chủng

có màu vàng, đỏ hoặc da cam cho thấy có khả năng tích lũy carotenoid

Xác định Dunaliella dựa trên đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa trong

điều kiện ức chế muối 3,5M NaCl (hình 2.5) Đồng thời kết hợp với phương pháp sinh học phân tử, giải trình tự ITS giúp cho quá trình định

danh chính xác Dunaliella (hình 2.6)

2.4 Các phương pháp phân tích

2.4.1 Quan sát hình thái và sự phát huỳnh quang tế bào

Hình thái tế bào Dunaliella và sự phát huỳnh quang lipid (nhuộm với

Nile Red sau 10 phút) được quan sát dưới KHV quang học Nikon ECLIPSE Ni-U (X40) ở bước sóng 595 nm

3

2.4.2 Xác định mật độ tế bào

Mật độ tế bào tảo được đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu Mật độ

tế bào trong 1 mL được tính theo công thức Guillard và Sieracki (2005)

2.4.3 Xác định tốc độ tăng trưởng đặc hiệu và năng suất tế bào

Mật độ hoặc sinh khối tế bào ở hai thời điểm khác nhau trong quá trình tăng trưởng của mẫu được dùng để tính tốc độ tăng trưởng đặc hiệu (G: tế bào/ngày) và năng suất tế bào (P: tế bào x 106/mL/ngày) trong khoảng thời

gian khảo sát (Levasseur và cs.,1993)

2.4.4 Xác định hàm lượng carotenoid tổng và diệp lục tố

Dịch nuôi được ly trích và xác định dựa theo phương pháp của Shaish

và cs (1992) và Prieto và cs (2011)

2.4.5 Xác định khả năng chống oxy hóa

Khả năng chống oxy hóa của dịch nuôi được xác định bằng phương

pháp DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) (Romeilah và cs., 2010; Das

và cs., 2011) Khả năng chống oxy hóa (I%) được tính dựa trên khả năng

ức chế của các bức xạ tự do của DPPH theo công thức sau (Yaltirak và cs., 2009; Albayrak và cs., 2010)

I% = (A Đối chứng – A Mẫu )/A Đối chứng x 100 2.4.6 Xác định hàm lượng phenolic tổng

Hàm lượng phenolic tổng được xác định bằng thuốc thử

Folin-Ciocalteau’s phenol (Lim và cs., 2002; Li và cs., 2007; Stankovic, 2011; Goiris và cs., 2012) Hàm lượng phenolic tương đương với lượng acid gallic/g (Hemalatha và cs., 2013)

2.4.7 Xác định sinh khối tế bào

Dịch nuôi cấy tảo được lọc qua màng sợi thủy tinh và sấy khô ở 103°C suốt 6 tiếng hoặc cho đến khi trọng lượng khô không đổi [A (g)] Trọng lượng khô này tiếp tục được đốt ở 550oC để tạo tro [B (g)] (khoáng chất)

Sinh khối [C (g)] là phần khác biệt giữa khối lượng khô và phần khoáng sau khi đốt (C=A-B) (Zhu và Lee, 1997; Lee và Shen, 2004)

2.4.8 Đánh giá khả năng tích lũy lipid tương đối

Tín hiệu lipid được đọc ở bước sóng kích thích 480/20 nm và bước sóng

lọc 590/35 nm (Cooksey và cs., 1987; Lee và cs., 1998; Chen và cs., 2009; Chen và cs., 2011; Kou và cs., 2013, Tran và cs., 2014)

2.5 Phương pháp bố trí thí nghiệm

2.5.1 Chọn lọc môi trường tự nhiên bổ sung dinh dưỡng cho tăng

trưởng Dunaliella

Chủng D bardawil ngoại nhập được sử dụng để nghiên cứu môi trường

Sáu môi trường MD1, MD2, MD3, MD4, MD5, MD6 với thành phần dinh dưỡng khác nhau, độ muối 1,5 M NaCl và ánh sáng 50 μmol photon/m2/s liên tục được sử dụng để tiến hành chọn lọc môi trường

2.5.2 Bổ sung dinh dưỡng cho môi trường MD4 khi nuôi Dunaliella

Để kéo dài giai đoạn tăng trưởng và tăng sinh khối của tảo, thí nghiệm

bổ sung thành phần dinh dưỡng được thực hiện trên môi trường MD4 được

lựa chọn D bardawil được nuôi trên môi trường MD4, 1,5M NaCl, sau 8

ngày nuôi cấy được bổ sung thành phần dinh dưỡng NPK, KNO3, KH2PO4

và kết hợp KNO3 với KH2PO4 với nồng độ khác nhau

2.5.3 Khảo sát độ muối và ánh sáng cho tăng trưởng của Dunaliella

16 chủng D salina nội địa, 2 chủng D salina CCAP 19/18 và D bardawil được khảo sát ảnh hưởng ở các độ muối khác nhau (1; 1,5 và 2M)

và cường độ ánh sáng khác nhau (50, 100, 150 µmol photon/m2/s)

2.5.4 Đánh giá sơ bộ hàm lượng carotenoid các chủng Dunaliella

salina nội địa

Thí nghiệm đánh giá sơ bộ hàm lượng carotenoid của 16 chủng D salina nội địa và 2 chủng D salina ngoại nhập được thực hiện theo 2 giai

đoạn: giai đoạn nuôi tăng trưởng và giai đoạn ức chế tích lũy carotenoid

5

2.5.5 Chọn lọc các chủng Dunaliella salina nội địa tích lũy carotenoid

cao, và đánh giá khả năng chống oxy hóa và hàm lượng phenolic

Để tiếp tục chọn lọc những chủng Dunaliella và điều kiện nuôi cấy tối

ưu cho sự tích lũy carotenoid cao, và các thành phần sinh hóa khác, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các điều kiện ức chế gồm dinh dưỡng, ánh sáng

cao và độ muối cao của 8 chủng Dunaliella nội địa được chọn lọc ở trên và

2 chủng Dunaliella ngoại nhập

2.5.6 Đo cường độ quang hợp và hô hấp tế bào các chủng Dunaliella

salina

Cường độ quang hợp và hô hấp của các chủng D salina được đo bằng

máy Hansatech trong giai đoạn tăng trưởng của tảo, với 1,5 mL mẫu cho mỗi lần đo, cường độ ánh sáng 50, 150, 300, 500 và 800 µmol photon/m2/s, tốc độ khuấy 5 vòng/phút

2.5.7 Ảnh hưởng của ánh sáng xanh dương lên sự tăng trưởng của

Dunaliella salina

D salina A9 và 2 chủng Dunaliella ngoại nhập được lựa chọn để khảo

sát ảnh hưởng của ánh sáng xanh dương lên sự tăng trưởng với các cường

độ 30, 50 và 100 µmol photon/m2/s liên tục, với đối chứng (ĐC) ánh sáng trắng 50 µmol photon/m2/s

2.5.8 Ảnh hưởng của ánh sáng UV

D salina A9 và 2 chủng D salina ngoại nhập được lựa chọn để khảo sát

ảnh hưởng của ánh sáng UV-A lên sự tăng trưởng, tích lũy carotenoid, khả năng chống oxy hóa, hàm lượng phenolic tổng và tín hiệu lipid tương đối

2.6 Phân tích dữ liệu

Tất cả dữ liệu được lưu trữ và xử lý với phần mềm Microsoft office

Excel 2010 Phần mềm SPSS (Statistical Program Scientific System) phiên

bản 11.5 dùng cho Windows được dùng để tính độ tin cậy của các giá trị khác biệt, với xác suất trên 95% (p < 0,05)

Chương 3 –KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 3.1 KẾT QUẢ

3.1.1 Chọn lọc môi trường tự nhiên bổ sung dinh dưỡng cho tăng

trưởng Dunaliella

3.1.1.1 Chọn lọc môi trường nuôi cấy

D bardawil tăng trưởng tốt nhất trên môi trường MD4 với mật độ, sinh

khối tế bào và tốc độ tăng trưởng cao hơn so với các môi trường còn lại (hình 3.1, 3.2)

7

3.1.1.2 Bổ sung dinh dưỡng cho MD4 khi nuôi Dunaliella

Môi trường MD4 cần tiếp tục tối ưu hóa sinh khối Do đó NPK, nitơ và phosphor được bổ sung theo 13 nghiệm thức Các nghiệm thức bổ sung

dinh dưỡng NPK (0,05 g/L, 0,1 g/L và 0,15 g/l) giúp Dunaliella tăng

trưởng tốt hơn các nghiệm thức còn lại và nghiệm thức 4 (NPK 0,15 g/L)

giúp Dunaliella tăng trưởng tốt nhất (hình 3.7)

3.1.2 Phân lập và chọn lọc vi tảo lục Dunaliella

Khoảng 200 chủng vi tảo thuần và sạch khuẩn được phân lập trên môi trường thạch Dựa trên sự thay đổi màu sắc của dịch nuôi và hình thái tế bào (màu vàng/cam) sau nuôi cấy cạn kiệt dinh dưỡng tế bào của các chủng

chuyển sang màu vàng/da cam được lựa chọn

3.1.3 Xác định một số chủng Dunaliella ở Việt Nam

3.1.3.1 Xác định Dunaliella dựa trên hình thái, sinh lý và sinh hóa

Các chủng Dunaliella có thể chia thành 2 nhóm dựa trên kích thước tế bào và sự tích lũy carotenoid, nhóm 1 (D sp1) gồm 7 chủng Dunaliella có

kích thước nhỏ từ 4-5 µm chiều rộng và 7-8 µm chiều dài (S, Y, F, H, A, L,

Kết hợp 2 Kết hợp 3

(b)

Hình 3.7 Tốc độ tăng trưởng sau (ngày 8-18) (b) của D bardawil trong 13

nghiệm thức bổ sung dinh dưỡng khác nhau

I) và nhóm 2 (D sp2) gồm 16 chủng có kích thước lớn hơn từ 10-15 µm

chiều rộng và 12-20 µm chiều dài (J, K, M, N, O, P, Q, R, D, E, G, A9,

A10, A11, A12, A13) và 2 chủng D salina ngoại nhập (CCAP và bardawil) (ảnh 3.3)

Ảnh 3.3 Hình thái và kích thước tế bào Dunaliella thuộc hai nhóm: nhóm

1, D sp1 (a); nhóm 2, D sp2 (b); D salina CCAP (c) và D bardawil (d)

Dựa trên hình thái, khả năng chống chịu với độ muối và tín hiệu lipid

tương đối có thể thấy có ít nhất 3 loài khác nhau: D salina có tế bào vàng, mật độ tế bào thấp và tín hiệu lipid trên tế bào cao (nhóm 2, D sp2 J, K, M,

N, O, P, Q, R, D, E, G, A9, A10, A11, A12, A13); loài có tế bào xanh, mật

độ tế bào cao và tín hiệu lipid trên tế bào thấp (nhóm 1, D sp1 S, Y, F, H,

A, L) và loài có tế bào xanh, mật độ tế bào cao và tín hiệu lipid trên tế bào

cao (nhóm 3, D sp1, I) (ảnh 3.4)

9

Ảnh 3.4 Hình thái tế bào của 23 chủng Dunaliella được phân lập và 2

chủng D salina ngoại nhập (CCAP19/18 và D bardawil) (a) và sự phát

quang của lipid được nhuộm với Nile Red (b), trước (I) và sau (II) khi ức chế muối 3,5M NaCl

3.1.3.2 Xác định Dunaliella dựa trên đoạn ADN ITS

Cấu trúc cây phát sinh dựa trên đoạn ITS từ các chủng Dunaliella được

phân lập và một số chủng được công bố trên NCBI cho thấy các chủng

Dunaliella phân chia theo 3 nhóm loài: nhóm A gồm tất cả 16 chủng vàng (nhóm 2, D sp2: J, K, M, N, O, P, Q, R, D, E, G, A9, A10, A11, A12, A13)

là Dunaliella salina, nhóm B gồm 1 chủng xanh (nhóm 3, D sp1: I) là Dunaliella tertiolecta, nhóm C gồm 6 chủng xanh (nhóm 1, D sp1: S, Y, F,

H, A, L) là Dunaliella viridis (hình 3.12) Sự phân các nhóm loài này phù

hợp với các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa

3.1.4 Khảo sát độ muối và ánh sáng cho tăng trưởng của các chủng

Dunaliella salina

Hầu hết các chủng D salina tăng trưởng tốt ở độ muối 1,5M và cường

độ ánh sáng 50 µmol photon/m2/với tốc độ tăng trưởng tế bào cao hơn ở độ muối và cường độ ánh sáng khác

3.1.5 Đánh giá sơ bộ hàm lượng carotenoid của các chủng Dunaliella

salina nội địa

Ức chế kết hợp muối 4M NaCl và ánh sáng 150 µmol photon/m2/s liên

tục sự tăng trưởng, hàm lượng diệp lục tố của hầu hết các chủng D salina

giảm và hàm lượng carotenoid (hình 3.18), khả năng chống oxy hóa, hàm lượng phenolic tổng và tín hiệu lipid tăng

11

3.1.6 Chọn lọc các chủng Dunaliella salina nội địa tích lũy carotenoid

cao

Các tế bào D salina ở các điều kiện ức chế ánh sáng cao chuyển sang

màu vàng/da cam (tích lũy carotenoid cao), trong khi đó các tế bào ở điều kiện ức chế N/P và muối 4M vẫn còn màu xanh (tích lũy carotenoid thấp)

Sự tích lũy carotenoid của các chủng D salina trong các điều kiện ức chế

ánh sáng cao AS500, AS800 và AS500+4M cao hơn so với các điều kiện

ức chế N/P, muối 4M và AS300 (hình 3.22) Ngoài ra, khả năng chống oxy

hóa và hàm lượng phenolic tổng của các chủng D salina trong điều kiện ức

chế ánh sáng cao AS500, AS800 và AS500+4M cũng cao hơn so với các điều kiện ức chế N/P, muối 4M và AS300

Hình 3.18 Hàm lượng carotenoid trên thể tích, 8 chủng được chọn (↓) và 2

chủng ngoại nhập trước và sau 24 ngày ức chế kết hợp muối 4M và ánh sáng 150 µmol photon/m2/s liên tục

3.1.7 Cường độ quang hợp và hô hấp tế bào các chủng Dunaliella

salina

Cường độ quang hợp của hầu hết D salina tăng khi tăng cường độ ánh

sáng từ 50 - 800 μmol photon/m2/s, tuy nhiên một số chủng D salina bị bão hòa (D salina A9, O và D bardawil) hoặc ức chế (các chủng còn lại trừ D salina P) khi tế bào tiếp xúc ở cường độ ánh sáng cao (hình 3.25) Cường độ hô hấp tế bào các chủng D salina A9, A10, E và P cường độ hô

hấp cao hơn so với các chủng còn lại

Hình 3.22 Hàm lượng carotenoid trên thể tích của các chủng D salina ở

các điều kiện ức chế khác nhau

13

3.1.8 Ảnh hưởng của ánh sáng xanh dương lên sự tăng trưởng của

Dunaliella salina

Sự tăng trưởng tối ưu ở các cường độ ánh sáng xanh phụ thuộc vào loài,

D salina A9 tăng trưởng tốt ở cường độ 50 μmol photon/m2/s, D salina

CCAP ở 100 μmol photon/m2/s và D bardawil ở 30 μmol photon/m2/s

3.1.9 Ảnh hưởng của ánh sáng UV

Tế bào 3 chủng D salina sau khi ức chế ánh sáng trắng 500 µmol

photon/m2/s riêng rẽ và kết hợp UV-A, tế bào chuyển sang màu vàng (hoặc

da cam), kích thước tế bào lớn hơn và hình dạng thay đổi Sự tăng trưởng

của D salina A9 và D bardawil giảm sau khi bị ức chế Ngược lại, D salina CCAP sự tăng trưởng tăng sau khi ức chế Hàm lượng carotenoid

(hình 3.32), khả năng chống oxy hóa, hàm lượng phenolic tổng và tín hiệu lipid tương đối tăng sau ức chế ánh sáng trắng 500 µmol photon/m2/s riêng

Hình 3.32 Hàm lượng carotenoid trên thể tích của D salina trước và sau

ức chế ánh sáng trắng 500 µmol photon/m2/s riêng rẽ và kết hợp UV 5 W/m2 liên tục