Hiệu quả của việc bổ sung các enzyme polysaccharide phi tinh bột đối với niêm mạc ruột non ở lợn đang phát triển

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỹ Thuật Môi trường CÔNG NGHỆ ENZYM Đề tài: ỨNG DỤNG ENZYM TRONG SẢN XUẤT THỨC ĂN GIA SÚC Hiệu Quả Của Việc Bổ Sung Các Enzyme Polysaccharide Phi Tinh Bột Đối Với Niêm Mạc Ruột Non Ở Lợn Đang Phát Triển GVHD: Đỗ Thị Hiền Nhóm: 12 Tp Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2017 MỤC LỤC Proteomic: tất sản phẩm gen (protein) tế bào, mô quan sinh vật giai đoạn sinh lý định I GIỚI THIỆU Trong loại ngũ cốc đậu nành, lúa mì,… chứa đến 15% polysaccharides phi tinh bột (NSPs) bên tế bào Việc phá hủy thành tế bào phân cắt phân tử NSP để làm thức ăn khó khăn động vật dày đơn chúng thiếu enzym phân hủy thành phần Điều ảnh hưởng đến việc tiêu hóa, hấp thu chất dinh dưỡng, làm tăng độ nhớt dịch thức ăn gia tăng vi khuẩn gây bệnh ruột non Việc bổ sung enzym xylanase β-glucanases vào phần ăn lợn tạo điều kiện thuận lợi cho việc thủy phân NSP, giúp cải thiện khả tiêu hóa tăng hiệu sử dụng nguồn nguyên liệu sẵn có Ngoài ra, việc bổ sung enzym NPSEs làm tăng hoạt động số enzym tiêu hóa thể protease, trypsine, α-amylase Các enzym làm giảm rữa trôi NSP ruột, làm giảm độ nhớt dịch thức ăn, hạn chế phát triển vi khuẩn có hại ruột Tuy nhiên, chế hoạt động NSPEs ruột non động vật chưa biết rõ số dấu hiệu cho thấy Các nghiên cứu trước báo cáo rằng, chế độ ăn uống ảnh hưởng đến mức độ biểu gen động vật Giả sử việc cải thiện môi trường ruột non nhờ bổ sung NSPEs ảnh hưởng đến mức độ biểu gen protein tế bào biểu mô dùng để vận chuyển chất dinh dưỡng niêm mạc ruột Tuy nhiên, cần phải tính toán đến việc chỉnh sữa RNA lựa chọn sữa đổi sau dịch mã Do đó, việc giải thích mức độ biểu enzym quan trọng Không thể đồng thời đo lường biểu tất protein niêm mạc ruột phương pháp truyền thống western blotting Nhiều nghiên cứu sử dụng công nghệ quang phổ proteomic phát hàng trăm protein Trước đó, phân tích proteomic ruột non chuột nhờ sủ dụng công nghệ giúp phát protein không nhận biết trước đó, protein liên quan đến việc hấp thu, vận chuyển chất dinh dưỡng trì cấu trúc tế bào Do đó, sử dụng nhãn iTRAQ (nhãn isobaric cho phương pháp định lượng tương đối tuyệt đối), LC-MS/MS để định lượng protein khác tạo niêm mạc ruột non lợn phát triển bổ sung NSPE chế độ ăn II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Chuẩn bị enzym Hỗn hợp enzym NSP cung cấp phòng Thí nghệm Động vật Thú Y Nhà nước, Viện Khoa học Động vật, Học viện Khoa học Nông nghiệp Trung Quốc (Bắc Kinh, Trung Quốc) Hỗn hợp chứa: enzym xylanase (EC 3.2.1.8) hoạt tính × 105 U/g, β-glucanase (EC 3.2.1.6) ≥ × 105 U/g, cellulase (EC 3.2.1.4) 9000 U/g Động vật phép nghiên cứu Chọn 48 lợn lai trưởng thành (Duroc × Landrace × Large White) có trọng lượng thể ban đầu tương đương (39.18 ± 0.98 kg) từ trang trại Shunliang (Bắc Kinh) Chúng chia ngẫu nhiên thành hai nhóm dựa vào gia phả, giới tính trọng lượng thể Mỗi nhóm chia thành bốn lần lặp lại lần lặp lại có (một đực) Trong đó, nhóm gọi nhóm đối chứng (CTRL, chế độ ăn bản) nhóm lại gọi nhóm thực nghiệm (NSPE, chế độ ăn + 0,6% enzym NSP) Lượng NSPE bổ sung nghiên cứu dựa kết nghiên cứu trước nhóm tác giả Thức ăn nước uống cung cấp tự suốt giai đoạn thử nghiệm 50 ngày Trọng lượng lợn lượng thức ăn tiêu thụ ghi nhận từ bắt đầu đến kết thúc thí nghiệm để đo mức tăng trưởng trung bình hàng ngày (ADG), lượng thức ăn trung bình hàng ngày (ADFI) tỷ lệ chuyển hóa thức ăn (FCR) Tất tiêu chí liên quan đến động vật đánh giá phê duyệt Ủy ban Đạo đức Động vật Viện Khoa học Động vật, Học viện Khoa học Nông nghiệp Trung Quốc Thu thập mẫu Kết thúc thí nghiệm (ngày thứ 50), tất lợn cân nặng sau 12h không cho ăn Tiến hành lấy máu lợn bị chết làm ngạt thở CO Mẫu máu lấy tĩnh mạch cổ xylanh sau chết Toàn máu ly tâm 2000 vòng 30 phút 4°C, sau tiếp tục ly tâm 400 vòng 10 phút ° C Thu nhận dịch phía (mẫu huyết thanh) lưu trữ -20°C Một phần mô (20 cm) cắt nhanh đoạn 50% chiều dài ruột non, rửa nước muối đệm phosphate lạnh làm khô giấy Niêm mạc từ phần ruột non lấy cẩn thận (dưới kính hiển vi) đông cứng nitơ lỏng, bảo quản -80°C để phân tích proteomic 4 Phân tích sinh hóa huyết Theo dõi thông số huyết như: alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), tổng protein (TP), alkaline phosphatase (ALP), glucose (GLU) creatine kinase (CK), hàm lượng tổng supperoxidase (T-SOD) IgG Tách protein có niêm mạc ruột non Các mẫu niêm mạc ruột non (500 μg) nghiền nitơ lỏng kết tủa 10% axit tricloroaxetic (TCA) (w/v) 90% axeton lạnh -20°C, Dung dịch mang ly tâm 20.000 vòng 30 phút 4°C tủa thu rửa acetone lạnh Sau đó, kết tủa lysed trích ly [8M urê, 30 mM - (2-hydroxyethyl) – - piperazineethane sulfonic acid (HEPES), 1mM phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF), mM ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) 10 mM dithiothreitol (DTT)] Các chiết xuất mô thô ly tâm để loại bỏ cặn lại Các tế bào mô lysates giảm 56°C bình nước sử dụng 10 mM DTT sau alkyl hóa với 55 mM iodoacetamide trong bóng tối Sau đó, lysates kết tủa cách thêm bốn khối acetone lạnh Các hạt nhỏ rửa ba lần với acetone lạnh tinh khiết ướp bể (50% TEAB 0.1% SDS) Ly tâm lặp lặp lại để loại bỏ hạt không tan Sau đó, định lượng protein xác định cách sử dụng BioRad Bradford Proteay Assay Kit (Hercules, CA, USA) Mỗi mẫu phản ứng với trypsin chuỗi trình tự (Promega Corporation, Madison, WI) với tỷ lệ 1: 30 3,3 μg trypsin: 100 μg ) qua đêm 37 oC Mỗi tag isobaric (113, 114, 115, 116, 117, 118, 119 121) hòa tan 70 μl isopropanol sau thêm vào mẫu tương ứng (4 mẫu cho nhóm) Ủ nhiệt độ phòng 6 Sắc ký trao đổi cation mạnh 800μg mẫu dán nhãn đưa lên cột trao đổi cation (Phenomenex Luna SCX 100A) cài đặt hệ thống Agilent 1100 (Santa Clara, CA) cân với chất đệm A (25% acetonitrile 10 mM KH2PO4, pH 3.0) Các peptide phân tách gradient tuyến tính đệm B (25% acetonitrile, M KCl 10 mM KH2PO4, pH 3.0) theo quy trình (tăng lên 5% sau 41 phút, 50% sau 66 phút 100% Sau 71 phút với tốc độ dòng chảy ml / phút Elution (kỹ thuật tách rửa) theo dõi cách thiết lập độ hấp thụ 214 nm Tổng cộng 10 phân số thu nhận, sau khử muối với cột Strata X C18 (Phenomenex) sấy khô chân không Các hạt giữ lại cách thêm 0.1% acid formic trước chạy LC-MS/MS Quang phổ khối LC-MS/MS tiến hành theo báo trước đây, quy trình chi tiết thông số trình bày Tập tin bổ sung - Xử lý liệu định lượng protein: Dữ liệu MS / MS cho việc xác định định lượng protein iTRAQ phân tích cách sử dụng Proteome Discover 1.3 (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Đức) phần mềm MASCOT (Matrix Science, London, UK, Version 2.3.0) ngược lại với sở liệu Uniprot_pig (11/4/2014) Tỷ lệ trung bình tiêu chuẩn thực mẫu mẫu protein Tỷ lệ lượng protein mẫu nhãn iTRAQ thu nhận, sử dụng mẫu nhóm đối chứng để làm mẫu số Tỷ lệ định lượng sau chuyển đổi sang dạng khác trình bày thay đổi so với mẫu số nhóm đối chứng để kiểm tra định lượng cuối Sự khác biệt protein xác định cách sử dụng Student’s t-test sửa chữa cho nhiều thử nghiệm phép chỉnh Benjamini and Hochberg Dựa vào số liệu thống kê, phân tích thống kê, số báo cáo trước thí nghiệm iTRAQ , tác giả thiết lập thay đổi 1,2 lần lớn để protein thể khác biệt - Phân tích tin sinh học nhận biết biểu protein: Các sở liệu phần mềm sử dụng phân tích tin sinh học trình bày tập tin bổ sung qPCR thời gian thực nghiệm sử dụng để nhận biết protein niêm mạc ruột non có khác biệt mức độ mRNA Tất phương pháp mô tả phần bổ sung Các chuỗi primer sử dụng nghiên cứu thể Tệp bổ sung (Bảng S1) - Phân tích thống kê: Các liệu tham số tăng trưởng, thông số huyết biểu gen phân tích phương pháp ANOVA chiều cách sử dụng khối biến số (SAS Version 9.2, SAS Institute Inc., Cary, NC) theo nghiên cứu trước [21,31] thí nghiệm sử dụng cho mẫu độc lập phân tích liệu MS Có ý nghĩa thống kê P