Các dẫn xuất của furocoumarin từ rễ cây angelicae dahuricae (bạch chỉ) và ảnh hưởng của chúng tới sự điều hòa phiên mã gene RXRα

Abstract: dẫn xuất furcoumarin gọi oxyalloimperatorin (1), với 17 dạng dẫn suất furcoumarin khác phân lập từ rễ Angelica dahurica Cấu trúc hóa học hợp chất chuyển hóa xác định phân tích liệu quang phổ IR, NMR, HRESI-MS Trong số hợp chất biệt lập, 13, 16, 18 (mỗi chất 20µM) làm tăng đáng kể chức phiên mã gen nuclear receptor RXRα (một dạng protein thụ thể cảm nhận steroid hormones thyroid hormones giúp điều hòa gene xác định) Trong đó, 7-9, 13, 14 & cấu trúc – ( thứ 20 µM) giảm rõ rệt phiên mã RXRα kích thích 9-cis-retionid acid Nhiều nghiên cứu cho thấy dẫn xuất Furocoumarin giải bệnh khó chữa, ung thư, bệnh rối loạn chuyển hóa, khả điều hòa phiên mã gene RXRα 1 Giới thiệu Rễ Angelica Dahurica (Bạch Chỉ), sử dụng rộng rãi y học truyền thống Trung Quốc cho bệnh như: đau răng, đau đầu, ho, hen suyễn, sổ mũi … Các nghiên cứu trước hợp chất từ thực vật phát rễ Angelica Dahurica chứa nhiều hợp chất hóa học khác bao gồm dầu dễ bay hơi, coumarin & glycoside Trong đó, coumarin có vai trò quan trong hoạt động bật, kháng viêm, kháng khuẩn, ức chế lipogenetic Trong đó, nhiều nghiên cứu tập trung vào tác dụng chống ung thư coumarin từ gốc Angelicae Dahuricae X receptor-α(RXRα) Retinoid thành phần nhóm nuclear receptor nhân tố phiên mã ligand-ativated thành phần heterodimer (có nghĩa protein gồm chuỗi polypeptide) bắt buộc cho nuclear receptor khác thụ thể peroxisome proliferatoractivated (PPAR), thụ thể retinoid acid (RAR), thụ thể liver X (LXR) Nó đóng vai trò mấu chốt nhiều trình sinh học khác ung thư, tiểu đường, béo phì, xơ vữa động mạch, agonist (tạm gọi yếu tố xúc tác) & antagonist (yếu tố ức chế) RXRα có tác dụng tốt cho trường hợp bệnh Trong năm gần đây, nhiều nghiên cứu tập trung vào tìm kiếm phân tử từ thiên nhiên với tác dụng điều hòa phiên mã RXRα Mục đích nghiên cứu tìm hợp chất tự nhiên với vai trò Nhiều dạng Furocoumarin phân lập từ gốc Angelicae Dahuricae & hoạt động phiên mã chúng khảo sát 2 Kết thảo luận Sắc kí dịch chiết EtOAc-soluble rễ Angelicae Dahuricae cho Furocoumarin 1, với 17 Furocoumarin khác 2-18 Các hợp chất nhận dạng isoimperatorin (2) [16], cnidilin (3) [17], phellopterin (4) [18], bergapten (5) [18], imperatorin (6) [19], xanthotoxin (7) [5], alloimperatorin (8) [16], isooxypeucedanin (9) [20], isodemethylfuropinarine (10) [21], xanthotoxol (11) [16], 5-methoxy-8-hydroxypsoralen (12) [22], demethylfuropinarine (13) [23], apaensin (14) [24], pabulenol (15) [25], isobyakangelicin (16) [26], byakangelicol (17) [18] and oxypeucedanin hydrate (18) [17]Trong đó, 10 & 13 tìm thấy Hợp chất thu dc dạng bột trắng vô định hình, [α] 22D+5 (c0.4, MeOH) Công thức phân tử C17H6O5, thành lập HR – ESI – MS với khối lượng [M+Na] + Quang phổ IR biểu thị đặc tính hấp thu nhóm α,β-unsaturated lactone, & α,β-unsaturated carbonyl Quang phổ H-NMR cho thấy methyl, methoxyl, olefinic & methylene proton Quang phổ 13CNMR & DEPT cho thấy 18 carbon, bao gồm methyl, methoxyl, olefinic methane, ketone carbonyl & quarternary carbon (table 1) Dấu hiệu Proton nhận thấy quan sát tương quan HMQC từ δH 6.69 (1H, d, J = 9.6 Hz) to δC 120.2, δH 7.90 (1H, d, J = 9.6 Hz) to δC 140.7, δH 8.09 (1H, d, J = 2.0 Hz) to δC 149.6, δH 6.92 (1H, d, J = 2.0 Hz) to δC 110.0, δH 2.84 (2H, br d, J = 7.6 Hz) to δC 39.1, δH 4.78 (1H, tq, J = 7.6, 1.2 Hz) to δC 115.9, δH 1.53 (3H, d, J = 1.2 Hz) to δC 24.7, δH 1.42 (3H, d, J = 1.2 Hz) to δC 17.1, and δH 3.03 (3H, s) to δC 51.8 Dữ liệu 1H-NMR & 13C-NMR tương đương alloiperatorin (8), furocoumarin tiếp hợp với đơn vị prenyl Đầu tiên, dấu hiệu proton olefinic methine H 4.78 cho thấy cặp ổn định methyl proton & methylene proton H 2.84 quang phổ HMBC cho thấy tương quan ba olefinic & methy resorance, methylene proton, methy proton cộng hưởng Các số liệu với tương quan với 1H-1H COSY H4.78 & methylene proton h2.84 có mặt đơn vị prenyl Sau đó, phần lại vòng pyrone coumarin bao gồm cộng hưởng δC 158.7, 120.2, 140.7, 150.9, 126.6 δH 6.69, 7.90 Được xác định phân tích quang phổ 1H-, 13C-NMR & HMBC Trong đó, cặp tín hiệu proton 6.69 & 7.90 xem cặp proton liên kết pyrone vòng có cộng hưởng HMBC với… đó, cộng hưởng HMBC từ 8.09 & 6.92 tới 138.4 & 147.3 cho thấy có mặt vòng furan bao gồm cộng hưởng δH 8.09 (H-2′), 6.92 (H-3′), δC 149.6 (C-2 ′), 110.0 (C-3 ′), 138.4 (C-6), and 147.3 (C-7) Methylene proton prenyl có thay đổi so sánh với 8, thay đổi hóa học 3.72, prenyl không ảnh hưởng tới carbon không bão hòa nhóm chức furocoumarin Quan sát tương quan HMBC từ 2.84 tới carbon signal 76.4, 126.6, 138.4 cho thấy prenyl nằm carbon thứ 76.4, bên cạnh pyrone & furan ring Do đó, cộng hưởng 164.7 downfield shift quang phổ 13C-NMR cho thấy tiếp hợp keton carbon với rung động kéo căng α,β – carbonyl không bão hòa quang phổ IR Tương quan long-rang HMBS từ H-4 tới 164.7 cho thấy mối liên hệ gần pyrone ring & keton carbon Vị trí methoxyl nhóm xác định quan sát tương quan long-range từ methyl proton signal 3.03 tới cacbon thứ 76.4 từ đó, cấu trúc hóa học cuối sáng tỏ Figure 1, tên oxyalloimperatorin Hóa học lập thể C-5 xác định Tất hợp chất phân lập dẫn xuất furocoumarin Tác dụng chúng lên hoạt động phiên mã RXRα đánh giá thông qua hệ thống phân tích Dual – Luciferase reporter 9-cis-retinoid acid (9-cis-RA) biết đến rộng rãi yếu tố tăng cường phiên mã [27], Figure nói kết trước đây, xử lý tế bào với 9-cis-RA (0.1 µM) thúc đẩy phiên mã liên quan tới hoạt động luciferase 79% Tế bào chuyển gene 293T xử lý với hợp chất ( 20 µM) – cis – retinoid acid (RA) (0.1 µM) 12h Hoạt động Firefly luciferase Rellina luciferase đo đạc Mức độ ảnh hưởng từ hoạt động luciferase tính toán thông qua tỉ lệ hoạt động Firefly luciferase Rellina luciferase RA sử dụng yếu tố kiểm soát dương Dữ liệu thể có nghĩa với ± SD (n = 3) *p < 0.05; **p < 0.01 với thiết bị xử lý, # p < 0.01 với RA Trong hợp chất ly trích được, 18 (20 µM) tăng đáng kể (P < 0.01) kích hoạt phiên mã RXRα, 13 16 (20 µM) cho thấy ảnh hưởng yếu (P < 0.05) tăng cường phiên mã Ngoài ra, 18 với ảnh hưởng phụ thuộc nồng độ khoảng 10 – 40 µM trình bày figure Tất hợp chất ly trích kiểm tra khả ức chế hoạt động phiên mã RXRα sử dụng phương pháp phân tích giống với báo cáo trước đây, đồng thời sử dụng – cis – RA để kích hoạt trình phiên mã gene RXRα Trong số hợp chất thử nghiệm, – , 13, 14 hợp chất (mỗi loại 20 µM) cho thấy giảm đáng kể ảnh hưởng hoạt động luciferase kích thích – cis – RA Thêm vào đó, 1, 14 thử nghiệm them nồng độ khác 10, 20 40 µM Như trình bày figure 5, hợp chất chuyển hóa cho thấy tác dụng ức chế phụ thuộc nồng độ tốt Những phát kể cho thấy dẫn xuất furocoumarin hữu dụng nhiều bệnh nan y ung thư rối loạn chuyển hóa, khả kiểm soát trình kích hoạt phiên mã RXRα Rất thú vị rằng, hợp chất 13 không cho thấy có ảnh hưởng yếu lên trình kích hoạt phiên mã RXRα mà làm giảm hoạt động phiên mã RXRα kích thích – cis – RA Một lý hợp chất 13 – cis – RA cạnh tranh dính với RXRα chúng đồng thời sử dụng Vì tác dụng hợp chất 13 yếu – cis – RA nhiều, nên hoạt động phiên mã kích thích – cis – RA giảm Tuy nhiên giả thiết thực có việc tất hợp chất tương ứng dính với RXRα kiểm soát hoạt động biểu gene hay không cần phải nghiên cứu sâu Tế bào chuyển gene 293T xử lý với – cis – RA (0.1 µM) với có không hợp chất ( 20 µM) 12 Hoạt động Firefly luciferase Rellina luciferase đo đạc mức ảnh hưởng hoạt động Luciferase tính toán Dữ liệu thể có nghĩa ± SD (n = 3) *p < 0.05; **p < 0.01 Thực nghiệm 3.1 Tổng quan Dung môi sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) mua từ Merck KGaA (Darmstadt, Đức) Thuốc thử phân tích nhận từ Sinopharm Chemical Reagent co., Ltd (Thượng Hải, Trung Quốc) Silica gel (200-300 mesh) sử dụng sắc ký cột TLC mua từ Qingdao Haiyang Chemical Co., Ltd (Qingdao, China) YMC gel ODS-A mua từ YMC co., Ltd (Allentown, Hoa Kỳ) Quang phổ NMR thu lại quang phổ kế Bruker Avance 400 tetramethylsilane tài liệu tham khảo nội HR-ESI-MS ghi nhận Bruker FT-MS Phổ hồng ngoại thực IR200 Nicolet (Thermo Electron Corporation, USA).Dữ liệu luân chuyển thu thập từ phân cực kế 341 (PerkinElmer Co, LtD, Hoa Kỳ) Các giá trị luciferases đo 1420 VICTOR3 TM V (PerkinElmer, Boston, MA, USA) 3.2 Vật liệu Rễ khô Angelicae Dahuricae (Bạch chỉ) , mua từ cửa hàng Tongrentang Pharmacy (thành phố Hàng Châu, tỉnh Chiết Giang, Trung Quốc) xác định bà Xiuhong Zhou (Senior Engineer, Cục Lâm nghiệp Yongchun, thành phố Tuyền Châu,Trung Quốc) Một mẫu gửi Trường Khoa học dược phẩm Hạ Môn, Đại học Hạ Môn, Trung Quốc Plasmid (pBind RXRα LBD pG5 luc) cung cấp tiến sĩ Xiao-kun Zhang từ Viện Burnham, Medical Research, Trung tâm Ung thư, La Jolla, CA, USA Bộ kit thử nghiệm DualLuciferase Reporter mua từ Tổng công ty Promega Thuốc thử lipofectamine 2000 mua từ Invitrogen Co., Ltd 3.3 Ly trích cô lập Rễ khô A dahurica (3 kg) đun sôi hồi lưu với dung dịch ethanol 60% (5 L × lần) Sau lọc, dịch chiết xuất cô đặc bình chân không sau huyền phù H2O (5 L) phân vùng với EtOAc (5 L × lần) Các chất chiết xuất thu EtOAc cô lập làm bay chân không để thu đủ lượng chiết xuất hòa tan EtOAc (48,3 g) Dịch chiết hòa tan EtOAc (45,0 g) sắc ký cột silica gel cách sử dụng rửa giải theo gradient với CHCl3-MeOH (100:0 ~ 0:100) để có 11 phần (Fr 1-11) Fr.2 (12,1 g) sắc ký cột silica gel tẩy rửa với n-hexan-EtOAc (98:2 ~ 1:1) để có 10 phần nhỏ (Fr.2-1 ~ Fr.2-10) Fr.2-5 (1,9 g) áp dụng cho YMC sắc ký cột ODS tách rửa dung dịch acetonitrile (55 ~ 100%) để cấp cho hợp chất (257,0 mg) Fr.2-6 (1,3 g) sắc ký cột YMC gel ODS rửa với methanol dung dịch nước (40 ~ 100%) để có (14,0 mg) Fr.2-7 (2,0 g) sắc ký YMC gel ODS tách rửa với dung dịch methanol (50 ~ 100%) để cung cấp cho (300 mg) (Fr.2 7-2) tiếp tục tịnh hoá thông qua chuẩn bị HPLC (Restek Prinnacle DB C18, mm, 250 x 10 mm) tẩy rửa với 60% dung dịch nước methanol để đủ phần (40,0 mg, Rt 14,0 phút) phần (61,0 mg, Rt 17,5 phút) Fr.2-8 (782,0 mg) sắc ký cột gel YMC với methanol (30 ~ 100%) để thu (13,0 mg) Fr.2-9 (738,0 mg) áp dụng cho sắc ký cột gel YMC tách rửa với methanol (40 ~ 100%) để phần (58,0 mg) (Fr.2 9-2) tiếp tục tinh chế qua chuẩn bị HPLC tẩy rửa với MeOH-H2O (60:40) đủ phần (39,0 mg,Rt 6,5 min) 10 (23,0 mg, Rt 10,5 min) Fr.2-10 (883,0 mg) sắc ký cột YMC gel tách rửa dung dịch methanol (40 ~ 100%) 11 (44,0 mg), 12 (21,0 mg), (12,0 mg) Fr.2 10-4 (100 mg) sắc ký gel YMC để có 13 (14,0 mg) Fr.2-10-4-1được tiếp tục tinh chế qua chuẩn bị HPLC tẩy rửa với MeOH-H2O (70:30) đủ khả 14 (29,0 mg, Rt 6,5 phút) 15 (38,0 mg, Rt 7,5 phút) Fr.4 (2,5 g) áp dụng cho sắc ký cột gel YMC với methanol (40 ~ 100%) rửa giải để đủ 16 phần (256,0 mg) Fr.5 (2,0 g) xử lý tách rửa cột silica gel với EtOAc-MeOH (96:4 ~ 0:100) Fr.5-7 (155 mg) kết tinh chloroform để có 17 phần (50,0 mg) Fr.7 (5,18 g) bị sắc ký cột silica gel tách rửa CHCl3-MeOH (99:1 ~ 0:100) để đủ Fr.7-3 Các subfraction (0,8 g) áp dụng cho cột silica gel tách rửa CHCl3-Acetone (95:5 ~ 0:100) đủ 18 phần (131,0 mg) Oxyalloimperatorin (1): trắng, bột vô định hình, [α]22D +5 (c 0,4, MeOH) UV (MeOH) λmax 361 (Log ε 3,50) nm; IR (MeOH) νmax 2923, 1738, 1687, 1625, 1438, 1082 cm-1 ;H-NMR (400 MHz, acetone-d4) 13C-NMR (100 MHz, acetone-d4), xem Bảng 1; HR-ESI-MS m / z 323,0894 [M + Na]+ (Calcd cho C17H16O5, 323,0890), m / z 339,0643 [M + K] + (Calcd 339,0629) 3.4 Cấu trúc tế bào phương pháp phân tích Dual – Luciferase reporter Gene Tế bào phôi thận người 293T nuôi DMEM trung bình chứa 10% huyết bào thai bò (FBS) Phương pháp phân tích Dual-luciferase reporter gene trước với số sửa đổi sử dụng nghiên cứu [14,27] Tóm lại, khoảng X 104 tế bào / giếng 24 giếng Tế bào chuyển nạp với hai plasmid, 30 ng pBind RXRα LBD 60 ng pG5 luc sử dụng Lipofectamine 2000 (Invitrogen) Sau 24 giờ, tế bào tiếp xúc với hợp chất thử nghiệm 12 h Sau đó, tế bào rửa PBS phân giải với đệm passive lysis buffer (1 × PLB) máy rocking platform 15 phút Các hoạt động Firefly luciferase Rellina luciferase kiểm tra kit phân tích hệ thống DualLuciferase Reporter Các hoạt động tương đối luciferase đạt tính tỷ lệ hoạt động Firefly luciferase luciferase Rellina 3,5 Phân tích thống kê Các kết thể có nghĩa ± phân chia tiêu chuẩn (SD) từ ba thí nghiệm độc lập Thống kê có nghĩa so sánh hai nhóm Phân tích thống kê thực với Student t test Giá trị P