chuyển hóa sinh học và các sản phẩm trao đổi chất acid lipoic

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC – CÔNG NGHỆ SINH HỌC ACID LIPOIC Môn: CHUYỂN HÓA SINH HỌC VÀ CÁC SẢN PHẨM TRAO ĐỔI CHÁT GVHD: TS Nguyễn Thị Mỹ Lan TS Nguyễn Thị Thanh Kiều Ngày 24.10.2016 MỤC LỤC I GIỚI THIỆU Lipoate (Hình 18A) cofactor organosulfur (hợp chất hữu có ch ứa lưu huỳnh) bảo tồn cao cần thiết cho chức nhiều phức h ợp enzyme quan trọng trình oxy hóa chuy ển hóa carbon Ban đ ầu, lipoate đ ược biết nhân tố lạ có nguồn gốc từ dịch chiết sinh họ, kích thích tăng trưởng vi khuẩn diện nguồn carbon định Những hi ện tượng cuối giải thích việc sử dụng lipoate nh m ột cofactor phức hợp đa enzyme (multienzyme complexes) tham gia vào trình chuyển hóa trung gian Ngoài vai trò xúc tác, ho ạt đ ộng oxi hóa kh c lipoate cho phép có chức chất ch ống oxy hóa lo ại b ỏ gốc tự Việc thu nhận sử dụng lipoate nhiều mức độ vi sinh vật gây bệnh ảnh hưởng đến tính độc hại vi sinh vật b ệnh mà chúng gây Bài nghiên cứu chuyển hóa lipoate vi khuẩn, nấm, đ ộng v ật nguyên sinh tìm hiểu làm có chức chuy ển hóa vi sinh vật trình chuyển hóa sinh h ọc Hình 1: Các gốc Lipoyl (A) Hoạt tính sinh học đồng phân lập thể R lipoate (B) Sự oxy hóa cofactor lipoyl, lipoamide, liên kết với lượng lysine bảo tồn ti ểu đơn vị E2 c phức hợp lipoylated Lipoamide dihydrolipoamide gắn với protein H phức hợp glycine phân bào (C) Các dạng khử cofactor lipoyl, dihydrolipoamide, thể liên kết với lượng lysine bảo tồn tiểu đơn vị E2 phức hợp lipoylated Tổng quan lịch sử khám phá acid lipoic Trong năm 1930, Esmond Snell cộng quan sát thấy r ằng việc bổ sung acetate từ môi trường tổng hợp kích thích s ự tăng tr ưởng c vi khu ẩn axit lactic (212) Gần thập kỷ sau đó, Guirard c ộng s ự quan sát th số chế phẩm sinh học có th ể thay acetate m ột y ếu t ố tăng trưởng cho vi khuẩn axit lactic (70), chất g ọi y ếu t ố thay th ế acetate (ARF) Tương tự, O'Kane Gunsalus Streptococcus faecalis (ngày gọi Enterococcus faecalis) phát triển môi trường có tryptone cao nấm men môi trường tổng hợp; nhiên, có tế bào tăng trưởng cao nấm men có th ể oxy hóa pyruvate (160) Các chất môi trường cao nấm men giúp cho S faecalis oxy hóa pyruvate, chất thay loại vitamin cofactor đ ược g ọi nhân tố oxy hóa pyruvate (POF) (160) Về sau, POF cho th có ho ạt tính ARF, nh nhân tố tăng trưởng (221) phát Tetrahymena gelii (211) Vật liệu kết tinh chứa đặc tính POF ARF tạo từ vi ệc th ủy phân d ịch chiết từ gan xác định axit (R)-5-(1, 2-dithiolan-3-yl) pentanoic (184) Hợp chất đặt tên "acid lipoic" tan d ầu, có tính axit, tham gia vào trình đồng hóa axit béo Ngoài có ho ạt đ ộng c ARF POF, lipoic acid tinh khiết sớm phát để thay chất khác, gọi "nhân tố BR" (110), giúp cho Butyribacterium rettgeri sử dụng lactate làm chất (111) Vào thời điểm đó, lipoate (dưới dạng lipoic acid chi ếm ưu điều kiện pH 4.7) cho loại vitamin B m ới (184); nhiên, m ột bệnh liên quan đến thiếu hụt lipoate người chưa theo dõi Bên c ạnh đó, ngày có nhiều chứng cho thấy động vật có vú có th ể tổng h ợp lipoate (258) Các sinh vật tự tổng hợp lipoate, cofactor tổng h ợp t m ột tiền thân axit octanoic (168), với việc chèn đ ồng phân l ập th ể c nguyên t l ưu huỳnh vào carbon số sáu để tạo đồng phân đối hình R, dạng có hoạt tính sinh học (169) Cho đến nay, năm phức hợp đa enzyme phụ thuộc vào lipoate đ ược mô t ả Ba phức hợp α-ketoacid dehydrogenases: pyruvate dehydrogenase (PDH), αketoglutarate dehydrogenase (KDH), α-ketoacid dehydrogenase phân nhánh (BCDH) Những phức hợp tạo thành từ nhiều ba ti ểu đơn vị enzyme E1 (thường tạo thành hai protein), E2, E3 (171) M ột phức hợp thứ tư, acetoin dehydrogenase (AoDH), tương đồng cao với PDH có cấu tạo từ tiểu đơn vị protein tương tự ba phức α–ketoacid dehydrogenases (256) Phức hợp thứ năm, phức hợp glycine phân bào (GCV), có cấu trúc khác bao gồm bốn loại protein liên kết lỏng lẻo protein P, H, T L (39) Cofactor lipoate gắn thông qua liên kết amide với lượng lysine b ảo tồn tiểu đơn vị protein H GCV lượng lysine tương tự ti ểu đ ơn v ị E2 c phức khác Trong trình xúc tác, cầu n ối disulfide n ội phân t c lipoate chuyển hóa trình oxy hóa lipoamide (Hình 1B) trình kh dihydrolipoamide (Hình 1C) (171) Cấu trúc phức hợp Lipoylated Các α-ketoacid dehydrogenase acetoin dehydrogenase phức h ợp protein lớn chứa nhiều ti ểu đơn vị E1, E2 E3 (171) Nh ững phức hợp hình thành xung quanh lõi trimers E2 đ ể tạo ph ức hình khối mặt giống khung 24 ti ểu đơn vị (130) ph ức h ợp hình khối 20 mặt 60 tiểu đơn vị (97) Các vùng amino-terminal c m ỗi ti ểu đ ơn v ị E2 chứa (gần 80-amino-acid) vùng lipoyl hóa, m ỗi vùng ch ỉ có vị trí liên kết với lipoate Lõi E2 s ắp xếp cho vùng lipoyl hóa lộ mặt phức hợp, nơi mà chúng tương tác với ti ểu đơn v ị ngoại vi E1 E3 Các tiểu đơn vị E2 KDH BCDH chứa vùng lipoyl (12, 170, 187), tiểu đơn vị E2 AoDH có th ể chứa vùng th ứ hai (256) tiểu đơn vị E2 PDH có th ể chứa lên tới ba vùng lipoyl (171) Các tiểu đơn vị E1 PDHs hầu hết vi khuẩn Gram âm t ất KDHs homodimeric (α2) Ngược lại, tiểu đơn vị E1 PDHs vi khuẩn Gram dương tất BCDHS AoDHs cấu tạo từ protein, E1α E1β, đ ược s ắp xếp nh heterotetramers (α2β2) Trong hai trường hợp, multimer (chứa ho ặc nhiều monomer) E1 chứa hai cofactor thiamine pyrophosphate (TPP) đ ược cho để tương tác thông qua "dây proton" hoạt động cách thu ận ngh ịch xúc tác (51) Tiểu đơn vị dimeric E1 (hoặc heterotetrameric α2 β2 E1) dimeric E3 xếp xung quanh lõi E2 phức h ợp α-ketoacid dehydrogenase; tiểu đơn vị ngoại vi gắn với nhi ều stoichiometries, thường E1s nhiều E3s (171) Cấu trúc phức hợp α-ketoacid dehydrogenase ti ểu đ ơn v ị c nghiên cứu số kỹ thuật Tinh thể học tia X s dụng để xác định cấu trúc dimer PDH E1 từ Escherichia coli (9) dimer E3 từ nhiều nguồn, bao gồm cấu trúc xác định E3 từ Azotobacter vinelandii (201) Cấu trúc tinh thể ti ểu đơn vị E2 chưa xác định, tính linh động vốn có protein Đ ầu N c vùng lipoyl nối với 40-amino-acid vùng bám tiểu đơn vị ngoại vi (PSBD) vùng xúc tác có đầu C cầu nối linh hoạt Thí nghi ệm cộng hưởng từ hạt nhân xác định cấu trúc vùng lipoyl riêng bi ệt (36) PSBDs t ti ểu đơn vị E2 (196) Một số cấu trúc ti ểu đơn v ị E3 xác đ ịnh g ần ph ức hợp hình thành dimer E3 PSBD đơn có ngu ồn g ốc từ ti ểu đ ơn vị E2 tương ứng (126, 154) Các cấu trúc E2 vùng xúc tác đ ược xác đ ịnh tinh thể tia X việc hình thành octahedral 24-mers hay icosahedral 60-mers (97) tùy vào nguồn gốc Tính linh động vốn có ti ểu đơn vị E2 động h ọc tự nhiên c E1 E3 liên kết với lõi E2 ngăn cản kết dính phức b ậc cao Tuy nhiên, phức hợp tái tạo phức hợp gốc mô tả kính hiển vi điện tử Những cấu trúc cho thấy vỏ ti ểu đơn vị E1 E3 đ ược tách biệt với lõi E2 khoảng cách hình khuyên từ 30-50 A phức hợp hình khối mặt (239) từ 75-90 A phức hợp hình khối 20 mặt (136, 137) Tính linh động chuỗi bên lipoamide linh động vùng khớp n ối s ườn bên vùng lipoyl tiểu đơn vị E2 cho để thu ận ti ện cho s ự tương tác với tiểu đơn vị E1 E3 qua khoảng cách M ột loạt chuy ển động vùng lipoyl cho phép chuy ển nhóm acyl (và ph ản ứng oxi hóa khử) nhóm lipoyl protein E2 khác kh ắp lõi E2 (170, 187) Ngoài tiểu đơn vị lõi E1, E2 E3 đặc tr ưng ph ức h ợp chuy ển hóa lipoylated đơn vị phân loại, số loài có thêm protein có ch ức phức hợp lắp ráp sửa sai phức hợp lipoylated Nh mô t ả chi tiết đây, thành phần bao gồm kiểm soát kinase phosphatase Ngoài ra, hầu hết sinh vật nhân thực phức hợp PDH chứa ti ểu đơn vị gọi protein nối E3 (E3BP), cần thiết cho việc ển chọn ti ểu đơn v ị E3 cho phức hợp Ví dụ, PDH tim bò phức h ợp 9.5- tri ệu dalton g ồm 30 b ản heterotetrameric E1, 12 homodimeric E3, 12 b ản c monomeric protein nối E3 xếp xung quanh lõi hình kh ối 20 m ặt c 60 tiểu đơn vị E2 (186) Ngược lại, tiểu đơn vị protein GCV không hình thành phức hợp ổn định mà thay vào lại hoạt động protein đ ộc l ập (39, 156) II LIPOATE TRONG XÚC TÁC Cơ chế xúc tác Trong năm phức hợp enzyme lipoylated, lipoate vừa hoạt động m ột chất có lực điện tử gắn với trung tâm phản ứng (thông qua cầu nối thioester thioether) nhánh linh động rãnh gi ới hạn c chất gi ữa vị trí hoạt động tiểu đơn vị khác (xem tài li ệu tham khảo 171, 185, 187) a Các phức hợp α-Ketoacid dehydrogenase Cả ba phức hợp α-ketoacid dehydrogenase xúc tác cho phản ứng kh carboxyl α-ketoacids để tạo acyl coenzyme A (acyl CoA), NADH CO chế phản ứng tương tự (Hình 2A) Phản ứng bắt đầu với thiamine pyrophosphate (TPP) phụ thuộc vào khử carbon chất xúc tác ti ểu đơn vị E1 Carbon có tính axit vòng thiazole TPP tác động vào carbon cacbonyl c c chất (carbon 2), hình thành kết cộng hóa trị trung gian S ự bi ến đ ổi gi ải phóng lượng CO2 trung gian, lại gốc hoạt động Carbanion liên kết v ới TPP Dạng acylates dạng nguyên tử lưu huỳnh lipoamide, nguyên tử lưu huỳnh thứ hai bị khử thiol Các vị trí hoạt động E2 sau xúc tác chuyển phân nửa acyl từ dihydrolipoamide đến coenzyme A Đ ể tái t ạo cấu trúc lipoamide có lực điện tử cofactor, ti ểu đ ơn v ị E3, đ ược g ọi dehydrogenase dihydrolipoyl, oxy hóa dihydrolipoamide từ lipoamide m ột phản ứng phụ thuộc vào NAD (170) Khác với ti ểu đơn vị E1 E2, đặc tr ưng cho phức hợp α–ketoacid dehydrogenase, tiểu đơn vị E3 thường chia s ẻ phức hợp Ví dụ, E coli tiểu đơn vị E3 mã hóa operon PDH thể từ độc lập, cung cấp tiểu đơn vị E3 cho phức hợp KDH (216) Trong thực v ật (24 R39) ký sinh trùng apicomplexan (35), protein biệt hóa E3 hoạt động ty th ể l ạp thể b Phức hợp AoDH Các acetoin dehydrogenase (AoDH) tương đồng cao v ới PDH có t ất c ả đặc điểm mô tả cho α-ketoacid dehydrogenase (250), nh ưng chất α–ketoacid (Hình 2B) TPP liên kết với tiểu đơn vị E1 tác động vào cacbon cacbonyl acetoin (3-hydroxy-2-butanone) dẫn đến hình thành m ột liên kết cộng hóa trị TPP 2, 3-butanediol Khi cầu n ối trung gian b ị phá h ủy giải phóng acetaldehyde TPP lại nhóm hydroxyetyl ho ạt đ ộng, giữ cân acylate cofactor lipoamide ti ểu đ ơn v ị E2 Ngoài vi ệc gi ải phóng acetaldehyde (không phải CO2), phản ứng xúc tác AoDH giống với phản ứng xúc tác PDH dẫn đến hình thành acetyl-CoA c GCV Trong phức hợp lipoylated thay đổi khử carbon α-ketoacid để hình thành gốc acyl-CoA, phức hợp glycine phân bào (GCV) xúc tác phản ứng nghịch khử carboxyl glycine tạo CO2, NADH, amoniac nhóm methylene liên kết với tetrahydrofolate (THF) đ ể tạo thành carbon cho 5,10-CH2-THF (Hình 2C) Như vậy, chuỗi phản ứng GCV tương tự với phức hợp α-ketoacid dehydrogenase, chế khác so với phức hợp lipoylated khác theo cách tinh tế lại nh ững đường quan trọng Các tiểu đơn vị GCV biết protein P (protein chứa pyridoxal phosphat), protein H (protein vận chuyển hydrogen), protein T (protein chứa tetrahydrofolate), protein L (lipoamide dehydrogenase), với lipoate đồng hóa trị liên kết với protein H (Hình 2C) (39) Protein P tương tự v ới ti ểu đ ơn v ị E1 α-ketoacid dehydrogenases xúc tác phản ứng khử carboxyl glycine; nhiên, phụ thuộc vào cofactor pyridoxal phosphate thay TPP Sau phản ứng oxy hóa khử carboxyl glycine nhờ protein P, methyleneamine gắn đồng hóa trị với dihydrolipoamide protein H Khác với tiểu đơn vị E2, protein H hoạt tính xúc tác thay vào hoạt động m ột giá đỡ để bảo vệ chất trung gian không ổn định trình chuy ển đ ến protein T (69) Protein T xúc tác giải phóng amoniac từ methyleneamine chuyển đổi nhóm methylene từ THF, tạo thành 5,10-CH2-THF Protein L dihydrolipoamide dehydrogenase tương tự với tiểu đơn vị E3 phức hợp α– ketoacid dehydrogenase, xúc tác trình oxy hóa hai electron dihydrolipoamide để tạo lipoamide chuyển đổi NAD + thành NADH Hầu hết sinh vật sử dụng sản phẩm gen cho tiểu đơn vị E3 protein L (xem tài liệu tham khảo 31 39) Hình Sự phản ứng phức hợp lipoylated (A) phức hợp α-ketoacid dehydrogenase Trong bước phản ứng phức hợp pyruvate dehydrogenase, phức hợp α-ketoglutarate dehydrogenase, phức hợp α-ketoacid dehydrogenase phân nhánh, tiểu đơn vị E1 khử carboxyl c ch ất α-ketoacid, nhóm acyl sau chuyển cho corfactor lipoyl ti ểu đ ơn v ị E2 Ti ểu đ ơn v ị E2 có hoạt tính xúc tác có chứa thêm vùng lipoyl, chuy ển nhóm acyl đ ển coenzyme A (CoA) Cấu trúc lipoate cofactor tái tạo thông qua vi ệc kh NAD+ tiểu đơn vị E3 (B) phức hợp acetoin dehydrogenase AoDH tương đ ồng cao với PDH lại sử dụng acetoin (3-hydroxy-2-butanone) c ch ất thay pyruvate Phản ứng acetoin với ti ểu đơn vị E1 d ẫn đ ến vi ệc gi ải phóng acetaldehyde acetyl hóa lipoamide Ti ểu đơn vị E2 sau chuy ển nhóm acetyl đến CoA, lipoamide tái tạo ti ểu đơn vị E3 (C) ph ức h ợp lycine phân bào GCV xúc tác phản ứng oxy hóa khử carboxyl thuận ngh ịch glycine để tạo carbon dioxide, amoniac, nhóm methylene chuy ển từ cofactor tetrahydrofolate để sử dụng chuyển hóa carbon Protein H lipoylated hoạt động chất di động hệ th ống vận chuy ển gi ữa vị trí hoạt động protein P, T, L Lưu ý r ằng khác v ới ti ểu đ ơn v ị E2 c phức hợp α-ketoacid dehydrogenase, protein H hoạt tính xúc tác Protein P xúc tác phản ứng tương tự tiểu đơn vị E1, protein L tương tự v ới tiểu đơn vị E3 (Hình C chuyển từ tài liệu tham khảo 39 v ới s ự cho phép c Elsevier.) 10 b Toxoplasma gondii Các phức hợp protein lipoy tìm thấy P falciparum có mặt Toxoplasma Bộ gen T gondii mã hóa tất protein bao gồm phức hợp PDH, BCDH, KDH Cấu trúc phức α-ketoacid dehydrogenase tương tự tìm thấy ký sinh trùng sốt rét, với tiểu đơn vị E1 PDH BCDH gồm protein E1α E1 β; Tuy nhiên, có khác biệt đáng ý Tiểu đơn vị E2 T gondii PDH chứa ba vùng lipoyl hai tìm thấy P falciparum Một khác biệt có hai paralogs có quan hệ gần protein E1α ph ức BCDH c ả ba chủng T gondii giải trình tự (chủng VEG, GT1, ME) Các tác động trùng lặp không rõ ràng; Tuy nhiên, điều đáng ý h ệ gen T gondii mã hóa enzyme bao gồm hệ thống phân gi ải chu ỗi axit amin có nhánh hoàn chỉnh Ký sinh trùng sốt rét dường thi ếu đ ường này, bao gồm enzyme transaminase chuỗi amino acid có nhánh (BCATbranched-chain amino acid transaminase), thường cung cấp ch ất n ền kh amin cho BCDH Ký sinh trùng T gondii mã hóa protein H GCV protein T, chúng thiếu protein nhận dạng P Các protein H không đ ược ch ấp nhận phân tích anti-lipoate Western blot ấu trùng T gondii, m ặc dù tiểu đơn vị E2 ba α-ketoacid phát Th ất b ại vi ệc phát protein H protein H không bi ểu hi ện t ốt hay lipoylated tachyzoites Đây khởi hành từ s ự chuy ển hóa lipoate P falciparum, nơi mà bốn loại protein lipoylated th ể lipoylated giai đoạn nhân lên vật chủ vật có vú Theo quan sát ký sinh trùng s ốt rét, PDH n ằm apicoplast c T gondii, BCDH KDH định vị vào ty th ể Cả apicoplast ty th ể 49 T gondii ghi nhận thí nghiệm miễn dịch huỳnh quang s dụng kháng thể đặc hiệu cho protein lipoylated Vì v ậy, nh P falciparum, T gondii phức hợp lipoylated chế lipoyl hóa dường th ể hai bào quan c Cryptosporidium parvum Không giống P falciparum T gondii, C parvum không chứa bào quan apicoplast Đó chứng di truyền, nhiên, Cryptosporidium phát triển từ dòng chứa lạp thể sau bị bào quan nhiều đường sinh hóa liên quan Mặc dù vài gien dường bảo tồn hệ gen nhân sau chuyển gen ngang từ l ạp th ể, gen không mã hóa PDH protein tổng hợp lipoate ển hình tìm thấy apicoplast Theo quan sát vi khuẩn H pylori vi hiếu khí sinh vật nguyên sinh ty thể (xem "Metamonada Amoebozoa" đây), C parvum chứa enzyme kỵ khí tạo acetyl-CoA, pyruvate: NADP oxidoreductase, mà nằm bào tương Tương tự, C parvum ti thể thiếu nhiều đường sinh hóa thường tìm thấy bào quan Ký sinh trùng có chứa m ột khoang hai màng bị giảm nhỏ nhiều gọi mitosome mà cho có nguồn gốc từ tổ tiên ty thể apicomplexan chung Bào quan dường giữ lại để thực số giới hạn chức chuy ển hóa, chẳng hạn tổng hợp cụm sắt-lưu huỳnh Ph ức h ợp KDH đ ược tìm thấy ty thể P falciparum T gondii vắng mặt C parvum, ký sinh trùng dựa chuyển hóa kỵ khí Các gen mã hóa BCDH thành phần GCV dường vắng mặt gen C parvum, gen mã hóa enzym tham gia vào lipoylation (Bảng 6) Cơ chế Lipoy hóa (lipoylation) a Plasmodium falciparum Apicomplexan 50 Ký sinh trùng sốt rét mã hóa enzyme cần thi ết cho vi ệc thu l ượm tổng hợp lipoate, chúng gồm ortholog (đồng đẳng) đơn lipoate synthase E.coli (LipA) octanoyl transferase (LipB) ortholog lipoate ligase (bảng 6) Enzyme LipA LipB P falciparum (PfLipA PfLipB) bổ sung chức cho ortholog chúng chủng E.coli gene bị gián đoạn, nói ngắn gọn enzyme ký sinh trùng s ốt rét có kh ả tổng hợp lipoate Cả enzyme P falciparum mã hóa nhân chứa peptide mục tiêu đuôi amino (amino-terminal targeting peptides) v ới cấu trúc bắt buộc để nhập vào apicoplast Ở P falciparum, peptide mục tiêu PfLipA nhắm protein thị đến ngăn khác v ới ty th ể , cho thấy apicoplast vị trí trình tổng h ợp lipoate ký sinh trùng Các apicoplast chứa enzyme synthase axit béo lo ại II dự đoán sản xuất chất PfLipB octanoyl-ACP, đường chức tổng hợp lipoate đặt plastid Lipoate tổng hợp apicoplast khả có sẵn để sử dụng ty thể, lipoate tổng hợp dạng liên kết protein không nh acid tự Như vậy, chế khác lipoy hóa cần thi ết ty thể Lipoy hóa ty thể ký sinh trùng sốt rét di ễn thông qua thu nhặt lipoate Huyết người thường chứa lipoate 33-145 ng/ml mà liên kết cộng hóa với albumin với lipid khác; ngu ồn có lipoate thu nhặt cho ký sinh trùng sốt rét.Loài Plasmodium mang enzyme với hoạt tính liên kết lipoate (lipoate ligase activity) Tình gợi lại số vi khuẩn, chẳng hạn L monocytogenes, có chứa hai enzyme lygase lipoate nguồn (paralog: protein ngu ồn g ốc), hai thể đồng dạng với LplA E coli Tuy nhiên, P falciparum, hai ligases khác (15% đôi axit amin tương đồng), ch ỉ có m ột 51 số chúng tương đồng có ý nghĩa với LplA E.coli Vì enzyme ligase paralogs dường đại diện cho l ớp enzyme lipoate ligase khác nhau, chúng đặt tên PfLipL1 PfLipL2 C ả hai enzyme ligase lipoate P falciparum bổ sung chức cho LplA ch ủng E coli gene bị gián đoạn, tóm lại enzym ký sinh trùng s ốt rét có kh ả thu nhặt lipoate tự Phân tích chủng hoàn ch ỉnh cho th PfLipL1 th ực lipoyl ưu tiên KDH E coli, PfLipL2 gần thực lipoylates PDH E coli Như L monocytogenes, chất đặc trưng cho ta lời giải thích cho lý ký sinh trùng s ốt rét có ch ứa hai enzyme ligases Một lời giải thích khác có th ể liên quan v ị trí bào quan c enzyme ligase PfLipL1 gồm peptide vận chuy ển ti th ể mà h ướng protein thị vào ty thể ký sinh trùng Enzyme ligase th ứ 2, PfLipL2, thiếu peptide vận chuyển ti thể xác định; thí nghi ệm kháng th ể huỳnh quang đích protein thị hiệu enzyme nằm apicoplast ty th ể Do đó, ký sinh trùng sốt rét có đường chức tổng h ợp lipoate hai enzyme ligase chức lipoate Việc bố trí đường P falciparum khác nhiều so với quan sát thực v ật vi khu ẩn quang hợp Cyanidioschyzon merolae Thalassiosira pseudonana Những sinh vật có chứa đường tổng hợp lipoate ty thể l ạp th ể chúng; Ngược lại, ký sinh trùng sốt rét gi ữ l ại đường l ạp th ể Ngược lại, sinh vật giống thực vật chứa enzyme ligase lipoate đ ơn tìm thấy ty lạp thể, ký sinh trùng s ốt rét d ường nh chứa ligases bào quan Mặc dù có di ện enzyme ch ức ligase lipoate apicoplast ty th ể P falciparum, [35S]lipoate ngoại bào kết hợp vào ba phức hợp ty thể, nói ngắn gọn PDH lipoy ch ỉ thông qua đường tổng hợp Do đó, thể P falciparum có chế lipoy hóa không rắc rối PDH lạp thể lipoylated tổng 52 hợp lipoate, phức hợp ty thể lipoy qua thu nhặt lipoate ngoại bào (Hình 5A) Bằng chứng sinh hóa di truyền vi ệc thu nh ặt lipoate c ần thiết cho sống sót giai đoạn máu ký sinh trùng Đi ều tr ị ký sinh trùng với lipoate tương tự 8-bromooctanoic (8-BrO) cản liên kết [35S]lipoate thu nhặt dẫn đến ức chế tăng trưởng Những nỗ lực để phá vỡ gen mã hóa PfLipL1 P falciparum ký sinh trùng sốt rét Plasmodium berghei gặm nhấm không thành công, tiếp tục thu nhặt lipoate có th ể cần thi ết giai đo ạn máu (blood stage) Thất bại việc phá vỡ PfLipL1 gợi ý r ằng hai enzyme ligases ký sinh trùng có chức không cần thi ết, s ự đ ịnh vị thông thường chúng ty thể Tổng hợp lipoate cho thấy cần thiết cho phát tri ển bình thường ký sinh trùng giai đoạn máu Xóa gen mã hóa PfLipB gi ảm lipoy hóa PDH khoảng 90% dẫn đến chu trình sống tăng t ốc đáng k ể Các PDH lipoyl mà dư thừa chủng bị gián đoạn giống sản xuất hoạt động octanoyl transferase PfLipL2 apicoplast Những tác động việc cắt bỏ hoàn toàn lipoy hóa PDH, thông qua vi ệc b ỏ PfLipA tiểu đơn vị PDH E2, chưa biết rõ, gen mã hóa PfLipA cho khó để xóa bỏ Mặc dù kết qu ả cho th t h ợp lipoate điều cần thiết cho tăng trưởng P falciparum, gần làm rõ men khử enoyl enzyme synthase axit béo (FAS) lo ại II (FAS-fatty acid synthase) (the type II fatty acid synthase enzyme enoyl reductase) không quan trọng giai đoạn máu P falciparum Ở thực vật tảo, chức quan trọng FAS loại II sản xuất octanoyl-ACP chất cho sinh tổng hợp lipoate (xem l ại tài li ệu tham kh ảo 131) Như vậy, việc làm gián đoạn đường FAS loại II nên ngăn c ản s ự sinh t 53 hợp lipoate Điều có thể, nhiên, có chế chưa khám phá cho việc tạo lipoyl PDH hoạt động b Toxoplasma gondii Sự tổ chức đường lipoyl hóa T gondii gần phản ánh lại P falciparum Những ortholog đơn E coli LipB Lipa xuất với chức trình tổng hợp lipoate apicoplast Các peptide m ục tiêu có đuôi amino lipa LipA T gondii (TgLipA) hướng gen thị đến apicoplast, TgLipB dự đoán chuyên ch đ ến apicoplast TgLipA TgLipB dự đoán có chức kết hợp với đường FAS loại II apicoplast để lipoylate PDH Gi ống P falciparum, T gondii có ortholog enzyme ligase lipoate E coli LplA (TgLipL1) enzyme ligase thứ khác, TgLipL2 Mặc dù ligases chưa nghiên cứu thực nghiệm, TgLipL1 dự đoán định vị ti thể Vì định vị PfLipL2 ti thể apicoplast quan sát, quan tr ọng để xác định thực nghiệm vị trí tế bào TgLipL2 Nhìn chung, cho thấy dường ký sinh trùng T gondii có đường sinh tổng hợp lipoate có chức nằm apicoplast đường thu nhặt ty thể T gondii, giống P falciparum, khuyết dưỡng lipoate nhu cầu cho protein lipoyl ty thể ký sinh trùng Ký sinh trùng T gondii phát triển môi trường thiếu lipoate cho thấy suy giảm lipoyl hóa KDH BCDH cho thấy tăng trưởng chậm so v ới nuôi c môi trường tiêu chuẩn Lipoyl hóa PDH không bị ảnh hưởng tăng trưởng môi trường thiếu lipoate, có lẽ phụ thuộc vào tổng hợp lipoate apicoplast T gondii Giống P falciparum, T gondii chịu chất tương tự lipoate 8-BrO mà ngăn cản thu nhặt lipoate Điều thú vị là, ký sinh trùng T gondii khiết nuôi c 54 vắng mặt tế bào chủ không th ể thu nhặt lipoate Đi ều làm tăng khả tương tác chặt chẽ khoang không bào kí sinh trùng ty thể tế bào chủ tạo điều kiện thuận lợi thu nhặt lipoate từ tế bào chủ Một FAS loại II có dường ều cần thi ết T gondii cần thiết cho lipoyl hóa PDH Khi acyl carrier protein (ACP) FAS lo ại II bị phá vỡ T gondii xử lý triclosan thuốc ức chế FAS II, ký sinh trùng cho thấy ức chế tăng trưởng giảm lipoyl hóa PDH Lipoyl hóa phức KDH BCDH ty thể không bị ảnh hưởng hai ều ki ện, bổ sung cho giả thuyết lipoyl hóa apicoplast ti th ể đ ộc l ập Do đó, ký sinh trùng T gondii cần FAS có chức loại II cho sinh tổng hợp lipoate apicoplast lipoate ngoại sinh cho lipoyl hóa phức hợp ty thể Kinetoplastids Kinetoplastids nhóm nguyên sinh vật có roi đặt tên cho kinetoplastid, ngăn chứa DNA nằm gần thể gốc roi ty th ể đơn Ngành bao gồm tác nhân nhiều bệnh nhi ệt đới không ý, Trypanosoma brucei, tác nhân gây bệnh ngủ châu Phi; Trypanosoma cruzi, ký sinh trùng gây bệnh Chagas’; Leishmania major, đại diện yếu tố gây bệnh leishmaniasis da So sánh gen T brucei, T cruzi, L major cho thấy tất ba tác nhân gây bệnh có tương tự thành phần gen, thứ tự gen, trình sinh h ọc S ự tương đ ồng m rộng đến trao đổi chất lipoate Mỗi loài mã hóa enzyme ligase lipoate đơn enzyme synthase lipoate transferase octanoyl (Bảng 6) Các enzyme đường lipoyl hóa chưa định rõ đặc ểm kinetoplastids; Tuy nhiên, phức hợp protein lipoylated nghiên c ứu kỹ Tất loài mã hóa bốn phức hợp lipoylated, PDH, BCDH, KDH, GCV 55 Ngược lại với apicomplexans P falciparum T gondii metamonad Trichomonas vaginalis, chúng không mã hóa tất tiểu đơn v ị GCV c ổ điển, gen mã hóa toàn tổ hợp có mặt kinetoplastids Các phức hợp Lipoylated a Trypanosoma brucei Kinetoplastids Sự biểu củacác phức hợp lipoylated T brucei khác hai giai đoạn chu kỳ sống mà chúng ki ểm tra phòng thí nghiệm: dạng procyclic (PCF-procylic form) ký sinh trùng, th ường c trú ruột côn trùng, dạng bloodstream (BSF-bloodstream form), tìm thấy động vật chủ có vú Trong hai dạng, ty th ể cho địa điểm trao đổi chất lipoate, ty thể trao đ ổi ch ất khác rõ rệt hai giai đoạn chu kỳ s ống BSF ký sinh trùng dựa vào glucose máu nguồn lượng nó, ti ết pyruvate, thiếu chuỗi chức hô hấp Trong giai đo ạn này, ch ức trao đổi chất ty thể bị giảm, ATP từ glycol giải đưa FoF1-ATPase ngược lại để trì gradient proton ti thể Ngược lại, PCFs ăn chủ yếu proline threonine ruột vật chủ trung gian ty th ể phát tri ển t ốt chuỗi hô hấp trì gradient proton ti thể ATP tạo phosphoryl hóa oxy hóa Các hoạt động enzyme chu trình TCA, bao gồm KDH, làm tăng đáng kể trình chuy ển từ BSF đ ến PCF, ph ản ánh thay đổi chuyển hóa xảy giai đo ạn chu kỳ s ống suy giảm RNA giao thoa (RNAi) (RNA interference) E1 α ti ểu đ ơn v ị PDH làm chậm tăng trưởng trypanosomes PCF, nêu bật tầm quan trọng trình chuyển hóa pyruvate giai đoạn chu trình s ống Sự cấu tạo phức KDH PDH giai đoạn PCF T brucei kiểm tra phương pháp proteomic PDH kết tủa mi ễn dịch (immune precipitated) từ ty thể PCF phức hợp protein có ch ứa thành phần E1α, E1β, E2, E3, E3BP không gắn nhân t ố ều hòa 56 phosphatase kinase Các KDH phát hi ện có chứa ti ểu đ ơn v ị E3 giống quan sát phức hợp PDH, ti ểu đơn v ị E2 hai tiểu đơn vị E1 độc lập Cả hai ti ểu đơn vị E1 có th ể có ch ức cạnh tranh với tiểu đơn vị E3 để gắn kết với lõi E2 ph ức h ợp KDH Ý nghĩa xếp không rõ ràng; Tuy nhiên, ortholog c gen liên kết (syntenic orthologs) hai tiểu đơn vị KDH E1 xu ất hi ện đ ể đ ược bảo tồn gen loài kinetoplastid khác (Bảng 6) Mặc dù giảm sút vai trò dehydrogenases α-ketoacid ký sinh trùng BSF, giai đoạn chu kỳ sống có dihydrolipoamide dehydrogenase (DLDH) (tiểu đơn vị E3) hoạt động Ngược lại với DLDH procyclic, mà tìm thấy ty thể, DLDH liên kết riêng v ới t ấm bên màng plasma dạng bloodstream ký sinh trùng Trong S pneumoniae, việc đưa vào số loại đường cho phụ thuộc vào DLDH (xem "Vi khuẩn Gram dương" trên) DLDH dạng bloodstream đóng vai trò tương tự cho số lượng lớn glucose cần thiết để hỗ tr ợ tăng trưởng giai đoạn Mặc dù chức rõ ràng DLDH màng plasma T brucei không chắn, có khả quan tr ọng cho s ự tăng trưởng giai đoạn này, DLDH, với men khử trypanothione, mục tiêu số thuốc ức chế sử dụng ều trị trypanosomes châu Phi (xem xét tài liệu tham khảo 113) Mặc dù hoạt động PDH KDH không phát BSF T brucei, protein lipoylated thể giai đoạn chu trình sống Kháng huyết đặc hiệu đối v ới protein lipoylated chấp nhận protein đơn 40 kDa giai đoạn ký sinh trùng dạng procyclic Theo quan sát T gondii, protein ACP FAS loại II cần thiết cho lipoyl hóa cách thích hợp, ch ỉ tổng h ợp lipoate ch ịu trách nhiệm cho việc lipoyl protein 40 kDa Mặc dù m ột enzyme ligase lipoate 57 mã hóa hệ gen T brucei (bảng 6), bổ sung với octanoate ngoại sinh lipoate không khôi phục lại lipoyl hóa protein (Hình 5B) Điều gợi lại kết báo cáo cho S cerevisiae, có enzyme ligase lipoate (Lip3) thu nhặt lipoate Trong S cerevisiae, protein Lip3, kết hợp với synthase lipoate (Lip5), transferase lipoate (Lip2), protein H (Gcv3), cần thi ết cho lipoyl hóa thích h ợp protein ty thể, tình tương tự tồn T brucei b Leishmania major Giống T brucei T cruzi, L major mã hóa orthologs PDH, KDH, BCDH, protein GCV vi khuẩn (Bảng 6) Trong s ố này, ch ỉ có vai trò GCV sinh học Leishmania định rõ đặc ểm, phức hợp cần thiết cho nhân lên bình thường bệnh lý th ể gián đoạn di truyền gen mã hóa protein GCV P L.major làm giảm độc lực ký sinh trùng dẫn đến suy yếu nhiễm trùng chu ột Ngược l ại, GCV không cần thiết cho phát triển in vitro ký sinh trùng đ ại th ực bào, ký sinh trùng cho thấy tăng nhạy cảm với glycine cao ho ặc giảm mức serine Một lý cho in vivo khắc nghiệt, không ph ải in vitro, kiểu hình GCV cho phép L major thích ứng với nhiễu loạn trao đổi chất liên quan đến phản ứng viêm th ể (invivo) Đặc bi ệt, L major đòi hỏi 5,10- CH2-THF tạo GCV đ ể tổng h ợp serine b ởi serine hydroxymethyltransferase (SHMT) Tác nhân gây bệnh n ội bào khác, chẳng hạn Francisella tularensis, Brucella abortus, Mycobacterium tuberculosis, tương tự phụ thuộc vào GCV có chức cho tính độc Metamonada Amoebozoa Trichomonas vaginalis Trong số amitochondriate, sinh vật nguyên sinh kỵ khí có gen phân tích ( Trichomonas vaginalis, Giardia 58 lamblia Entamoeba histolytica), T vaginalis loài mã hóa enzym tham gia vào trình chuyển hóa lipoate T vaginalis mã hóa ligase lipoate đơn không dẫn đến có synthase lipoate ho ặc transferase octanoyl Phù hợp với kiểu sống kỵ khí nó, T vaginalis không chứa PDH KDH Như trường hợp với G lamblia E histolytica, T vaginalis dựa pyruvate: ferredoxin oxidoreductase để sản xu ất acetylCoA T vaginalis tách từ amitochondriate khác, sinh vật nguyên sinh k ỵ khí, nhiên, có chứa protein L hai paralogs protein H, m ột đ ặc tính mà độc T vaginalis (Bảng 6) Cả hai protein H lipoylated, hai phù hợp chất protein L, nói sơ qua chúng tham gia vào ph ản ứng oxi hóa kh liên quan đến lipoate gắn với protein Protein L dimer dihydrolipoamide dehydrogenase với tính tương đồng với tiểu đơn vị E3 protein L từ loài khác Protein P T chưa xác định T vaginalis, gỉa thuyết chúng khác ký sinh trùng không ch ứa protein Trong trường hợp sau, T vaginalis hệ thống cắt glycine, protein H L có chức thay Trường hợp tương tự tìm thấy số vi khuẩn Firmicutes, chẳng hạn Enterococcus faecalis, cho thấy thiếu protein P T (Bảng 6) Đi ều thú v ị protein L tìm thấy T vaginalis có liên quan chặt chẽ để loài Firmicutes dường có chuyển gen ngang thông qua tiền thân ty thể Ở T vaginalis, protein H protein L nằm bào quan hai màng gọi hydrogenosomes (Hình 5C), có liên quan đến ty th ể nh ưng điển hình không chứa vật liệu di truyền Nói chung, h ệ th ống GCV làm vi ệc kết hợp chặt chẽ với enzym serine hydroxymethyltransferase ty th ể (SHMT) (mitochondrial serine hydroxymethyltransferase) trình chuy ển hóa 59 axit amin Cả hai enzyme đảo ngược, đó, h ọ có th ể tạo ho ặc tiêu thụ 5,10-CH2-THF để phá vỡ tổng hợp serine glycine Các enzym SHMT đơn T vaginalis định rõ đặc điểm sinh hóa định vị bào quan hydrogenosome Mặc dù diện SHMT cho thấy hydrogenosomes tham gia vào trình chuy ển hóa axit amin, không ph ải rõ ràng cho dù GCV có chức có liên quan Nh v ậy, vai trò hai loại protein H lipoylated T vaginalis chưa biết Kết luận Sự trao đổi chất Lipoate tìm thấy hầu hết vi khuẩn, nấm ký sinh trùng gây bệnh Những sinh vật có lipoate thông qua tổng hợp de novo thu nhặt từ môi trường, nhiều tác nhân gây bệnh trì tổng hợp lipoate đường thu nhặt cách đ ộc l ập Trong ký sinh trùng apicomplexan, đường độc lập không d thừa phân vùng vật lý hai bào quan Ở n ấm, cho th r ằng enzyme liên kết đặc trưng với đường tổng hợp thu nh ặt độc lập, tất cần thiết cho tổng hợp lipoate Ngược l ại, bên tế bào mầm bệnh L monocytogenes dạng khuyết dưỡng lipoate có hai enzyme lipoate-thu nhặt có vai trò không th ừa trình nhi ễm in vivo Một trùng lặp tương tự tìm thấy gen vi khuẩn Gram dương khác vài ký sinh trùng đơn bào Nhìn chung, có nhiều bất ngờ chiến lược lipoyl hóa dùng mầm bệnh vi khuẩn đáp lại để thích ứng với môi trường thích hợp Các thành phần chức phức hợp protein lipoyl khác đáng kể vi khuẩn gây bệnh Ngay số loài có liên quan, protein nhân lên, loại bỏ, có chức thay th ế Có lẽ nguyên tắc chi phối thành phần chức ph ức 60 hợp protein lipoyl quy định Mặc dù có s ự thay đ ổi l ớn, m ột vài vấn đề lên i) Nhiều vi khuẩn mầm bệnh có nhiều tiểu đơn vị E3 dihydrolipoamide dehydrogenase Đây dùng để điều hòa hoạt động phức hợp protein riêng biệt, quan sát th m ột s ố loài vi khuẩn, chúng hoạt động khoang mức tế bào khác nhau, quan sát thấy ký sinh trùng apicomplexan Trong hai prokaryote eukaryote, E3 protein đ ược đ ịnh v ị vào màng plasma, nơi mà chúng có vai trò bổ sung việc vận ii) chuyển loại đường Các gen mã hóa cho enzyme lipoyl hóa LplA, LipB, LipA th ường tìm thấy bên cạnh gen chuyển hóa lipoate khác Đi ều đặc biệt vi khuẩn Gram dương gợi r ằng có ý nghĩa mặt chức cho xếp này, có lẽ liên kết s ự bi ểu iii) enzyme lipoyl hóa với phức hợp chúng họ lipoylate Nhiều vi khuẩn mầm bệnh chứa GCV không đầy đủ, sinh vật luôn giữ protein H Đó s ố vai trò khác mà protein H đóng prokaryote eukaryote "Orphan" protein H giữ lại dư lượng lysine sử dụng đ ể gắn lipoate luôn tìm thấy lien kết với dihydrolipoamide dehydrogenase (tiểu đơn vị L protein) enzyme đường lipoyl hóa Điều cho thấy orphan protein H lipoylated (như quan sát thấy số sinh vật) iv) có hoạt tính oxy hóa khử Gen nhân đôi, chẳng hạn gen paralog KDH E1 bảo tồn ký sinh trùng kinetoplastid, có th ể có ch ức có th ể ph ục v) vụ để điều chỉnh hoạt động phức hợp protein chia s ẻ Protein Lipoylated tới hạn cho phát tri ển tồn c vi khuẩn mầm bệnh in vivo, bỏ qua cho phát triển in 61 vitro Đây trường hợp L monocytogenes S pneumoniae, đòi hỏi trao đổi chất lipoate để tồn môi trường ều kiện bị hạn chế thấy in vivo Ở B pseudomallei M tuberculosis, enzym lipoyl hóa protein lipoylated có vai trò phòng chống oxy hóa cần thiết cho tính độc tác nhân gây bệnh Thành phần PDH cần cho biểu hệ ti ết loại III P aeruginosa cho hình thành bào tử vi khuẩn B anthracis Thông qua chế khác nhau, thành phần GCV s ố tác nhân gây bệnh, chẳng hạn F tularensis, B abortus, M tuberculosis, L major, cần thiết cho độc tính Nhìn chung, trao đổi chất lipoate chứng tỏ quan trọng tính độc nhiều sinh vật; Tuy nhiên, chế gây bệnh đa d ạng đường trao đổi chất lipoate chúng http://homepage.usask.ca/~ctl271/857/def_homolog.shtml 62 63 ... hại vi sinh vật b ệnh mà chúng gây Bài nghiên cứu chuyển hóa lipoate vi khuẩn, nấm, đ ộng v ật nguyên sinh tìm hiểu làm có chức chuy ển hóa vi sinh vật trình chuyển hóa sinh h ọc Hình 1: Các gốc... pentanoic (184) Hợp chất đặt tên "acid lipoic" tan d ầu, có tính axit, tham gia vào trình đồng hóa axit béo Ngoài có ho ạt đ ộng c ARF POF, lipoic acid tinh khiết sớm phát để thay chất khác, gọi "nhân... phosphatase (34) Sự tích lũy sản phẩm acyl-CoA phân nhánh NADH ức chế cạnh tranh với phức hợp (76) Ở sinh vật nhân thực, BCDH tìm thấy ty thể, nơi sản phẩm BC-CoA tiếp tục chuyển hóa vào chu trình TCA trung