Phân lập vi khuẩn oxi hóa sắt ưa axit (FOB) phục vụ cho công nghệ tuyển khoáng sinh học

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN VĂN HƢNG PHÂN LẬP VI KHUẨN OXY HÓA SẮT ƢA AXIT (FOB) PHỤC VỤ CHO CÔNG NGHỆ TUYỂN KHOÁNG SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN VĂN HƢNG PHÂN LẬP VI KHUẨN OXY HÓA SẮT ƢA AXIT (FOB) PHỤC VỤ CHO CÔNG NGHỆ TUYỂN KHOÁNG SINH HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn Khoa học: TS Đinh Thúy Hằng PGS TS Ngô Tự Thành Hà Nội - 2017 LỜI CẢM ƠN Qua thời gian hai năm nghiên cứu phòng Sinh thái Vi sinh vật - Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội, đến hoàn thành luận án thạc sỹ với tiêu đề ―Phân lập vi khuẩn oxy hóa sắt ưa axit (FOB) để phục vụ cho công nghệ tuyển khoáng sinh học‖ Tôi nhận đƣợc giúp đỡ tận tình chu đáo thầy cô giáo, cán khoa học công tác Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học Trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên - ĐHQGHN Đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Đinh Thúy Hằng, trƣởng phòng Sinh thái Vi sinh vật, Viện Vi sinh vật CNSH – ĐHQGHN PGS.TS Ngô Tự Thành, cán công tác Bộ môn Vi sinh vật học, trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN ngƣời thầy trực tiếp hƣớng dẫn, động viên, giúp đỡ tạo điều kiện cho suốt trình học tập, nghiên cứu vừa qua Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện cán công tác viện Vi sinh vật CNSH tạo điều kiện cho hoàn thành tốt nghiên cứu Tôi vô biết ơn thầy cô Bộ môn Vi sinh vật học Khoa Sinh học – Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên nhiệt tình bảo, truyền đạt kiến thức quý báu giúp đỡ trình học tập Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn gia đình, bạn bè đồng nghiệp Phòng Sinh thái vi sinh vật khích lệ, giúp đỡ trình học tập sống Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Học viên Nguyễn Văn Hƣng DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT At ferridurans Acidithiobacillus ferridurans At ferrivorans Acidithiobacillus ferrivorans At ferrooxidans Acidithiobacillus ferrooxidans BacTech Bacterial Technology BIOX Biological Oxidation CI Chloroform Isoamyl Alcohol DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EDX Energy Dispersive X-Ray Analysis FEMS Federation of European Microbiological Societies FISH Fluorescence in situ hybridization FOB Ferrous Oxidizing Bacteria HIOX High Temperature Bacterial Oxidation IAEA International Atomic Energy Agency MIT Massachusetts Institute of Technology LE Leaching Experiment L ferriphylum Leptospirillum ferriphylum L ferrooxidans Leptospirillum ferrooxidans PBS Phosphate-Buffered Saline SEM Scanning Electron Microscope TAE Tris-Acetate-EDTA DANH MỤC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1 Ứng dụng công nghệ bioleaching giới Bảng Nồng độ oxy tới hạn cho phát triển At ferrooxidans 11 nhiệt độ khác Bảng Nồng độ giới hạn kim loại nặng cho phát triển 15 At ferrooxidans Bảng Sản lƣợng đồng Chile giới đƣợc khai thác 22 công nghệ tuyển khoáng sinh học Bảng Ảnh hƣởng bƣớc tiền xử lý quặng vàng bioleachig 23 tới hiệu suất khai thác số doanh nghiệp khai thác khoáng sản giới Bảng Mồi PCR khuyếch đại đoạn 16S rDNA dùng 25 nghiên cứu Bảng 2 Thành phần môi trƣờng 9K 26 Bảng Thành phần phản ứng chu kỳ nhiệt PCR-DGGE 30 Bảng Phản ứng PCR khuyếch đại 16S rDNA 31 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Số lƣợng vi khuẩn oxy hóa sắt ƣa axit đƣợc công bố .2 Hình 1.2 Chi phí đầu tƣ cho hệ thống vận hành lợi nhuận thu đƣợc từ trình khai khoáng theo công nghệ truyền thống công nghệ bioleaching Hình 1.3 Cây phát sinh loài dựa phân tích trình tự 16S rDNA Hình 1.4 Các mốc thời gian đánh dấu hoạt động nghiên cứu ứng dụng nhóm vi khuẩn oxy hóa sắt ƣa axit ƣa nhiệt Hình Sơ đồ phân bố hình ảnh SEM vi khuẩn bề mặt quặng pyrite Hình Sơ đồ mô tả chế phản ứng xảy trình bioleaching 10 Hình Tốc độ oxy hóa Fe2+ (IOR) giá trị pH khác (1.5 -2.5) nhiệt độ 30ºC vi khuẩn At ferrooxidans 12 Hình So sánh lƣợng đồng đƣợc thu hồi từ bioleaching điều kiện ƣa ấm (mesophile) ƣa nhiệt (thermophile) .13 Hình 1.9 Ảnh hƣởng kích thƣớc hạt quặng tới trình hòa tách kẽm vi khuẩn Sulfobacillus thermosulfidooxidans .14 Hình 1.10 Ảnh hƣởng hợp chất dung môi hữu tới khả oxy hóa chalcopyrite At ferrooxidans 16 Hình 1.11 Sơ đồ trình bioleaching sử dụng mô hình đống ủ (heap leaching) mô hình hòa tách chỗ (in situ leaching) 17 Hình 12 Sơ đồ quy trình công nghệ phƣơng pháp hòa tách quặng theo mô hình đống ủ .17 Hình 1.13 Khai thác khoáng sản sử dụng công nghệ hòa tách dạng đống ủ (heap leaching) giới từ năm 1980 – 2014 .19 Hình 1.14 Sơ đồ trình khai thác uranium công nghệ hòa tách chỗ (in situ leaching) 20 Hình 15 Bể khuấy tuyển quặng hệ thống tuyển quặng theo công nghệ bể khuấy 21 Hình 2.1 Vị trí đoạn 16S rDNA đƣợc sử dụng phân tích DGGE Lactobacillus plantarum 29 Hình 2.2 Sơ đồ chậu thí nghiệm tuyển quặng sinh học 33 Hình 3.1 Làm giàu vi khuẩn FOB phân lập FOB qua dãy pha loãng đĩa 96 giếng 36 Hình Hình thái tế bào hai chủng FOB1 FOB2 37 Hình 3.3 Vị trí phân loại hai chủng vi khuẩn FOB1 FOB2 so với loài vi khuẩn oxy hóa sắt công bố 38 Hình 3.4 Ảnh hƣởng pH môi trƣờng tới hoạt tính oxy hóa Fe2+của hai chủng FOB phân lập 39 Hình 3.5 Thay đổi pH tổng lƣợng sắt hòa tách từ quặng thí nghiệm hòa tách quặng chalcopyrite sử dụng chủng vi khuẩn FOB1và FOB2 nhƣ nguồn vi sinh vật bổ sung ban đầu .39 Hình 3.6 Ảnh chụp SEM bề mặt quặng chalcopyrite sau thí nghiệm hòa tách cho thấy hốc kênh ăn mòn vi khuẩn FOB tạo .41 Hình 3.7 Phân tích thành phần nguyên tố mẫu quặng chalcopyrite thí nghiệm hòa tách công cụ EDX 42 Hình 3.8 Hình ảnh FISH sử dụng đầu dò GAM42a mẫu quặng chalcopyrite từ thí nghiệm hòa tách có bổ sung chủng Acidithiobacillus sp FOB1 làm giống khởi động .43 Hình 3.9 Hình ảnh phân tích quần xã vi khuẩn mẫu làm giâu (E1, E2) mẫu thí nghiệm hòa tách quặng chalcopyrite (LE) so sánh với chủng khiết FOB1, FOB2 phân lập .44 MỤC LỤC MỞ ĐẦU .1 Chƣơng - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lịch sử phát triển công nghệ 1.2 Vi sinh vật tham gia chế sinh học trình bioleaching 1.2.1 Vi sinh vật tham gia trình bioleaching 1.2.1.1 Vi khuẩn oxy hóa sắt ƣa axit ƣa ấm (mesoacidophilic) .5 1.2.1.2 Vi sinh vật ƣa axit ƣa nhiệt (moderate thermoacidophilic) 1.2.1.3 Vi sinh vật ƣa axit ƣa nhiệt cực trị (extreme thermoacidophilic) 1.2.2 Cơ chế sinh học trình bioleaching .8 1.2.2.1 Cơ chế trực tiếp 1.2.2.2 Cơ chế gián tiếp 1.3 Các yếu tố ảnh hƣởng tới trình hòa tách quặng sinh học 11 1.3.1 Thành phần dƣỡng chất 11 1.3.2 Nhu cầu O2 CO2 11 1.3.3 pH .12 1.3.4 Nhiệt độ 13 1.3.5 Cấu trúc kích thƣớc hạt quặng .13 1.3.6 Kim loại nặng 14 1.3.7 Các chất có hoạt tính bề mặt hợp chất hữu .15 1.4 Các dạng công nghệ tuyển khoáng theo nguyên lý bioleaching 16 1.4.1 Công nghệ hòa tách dạng đống ủ (heap/dump leaching) 17 1.4.2 Công nghệ hòa tách chỗ (in situ leaching) 19 1.4.3 Mô hình hòa tách bể khuấy (tank leaching) 21 1.5 Tình hình nghiên cứu ứng dụng công nghệ bioleaching 22 1.5.1 Trên giới .22 1.5.2 Ở Việt Nam 24 Chƣơng - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 25 2.1 Nguyên vật liệu .25 2.1.1 Nguồn mẫu phân lập mẫu quặng thử nghiệm 25 2.1.2 Hóa chất 25 2.1.3 Thiết bị, dụng cụ .25 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 26 2.2.1 Làm giàu phân lập FOB 26 2.2.2 Tách DNA tổng số 27 2.2.2.1 Tách DNA từ dịch làm giàu mẫu môi trƣờng .27 2.2.2.2 Tách DNA từ chủng khiết 28 2.2.3 Phƣơng pháp PCR – DGGE .29 2.2.4 Giải trình tự 16S rDNA dựng phân loại 30 2.2.5 Định lƣợng Fe(II) Fe tổng số .31 2.2.6 Phƣơng pháp lai huỳnh quang chỗ (FISH) 33 2.2.7 Thiết lập thí nghiệm tuyển quặng sinh học 33 2.2.8 Phƣơng pháp phân tích SEM EDX 34 2.3 Sơ đồ bƣớc nghiên cứu .35 Chƣơng - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .36 3.1 Làm giàu phân lập vi khuẩn oxy hóa sắt ƣa axit 36 3.2 Xác định vị trí phân loại định danh chủng FOB phân lập 37 3.3 Nghiên cứu khả chịu pH chủng FOB phân lập 38 3.4 Nghiên cứu ứng dụng chủng FOB phân lập thí nghiệm hòa tách quặng chalcopyrite mô hình phòng thí nghiệm 40 3.5 Phân tích nguyên tố bề mặt quặng chalcopyrite công cụ EDX 41 3.6 Nghiên cứu thành phần vi khuẩn phát triển bề mặt quặng chalcopyrite thí nghiệm bioleaching 42 3.7 Nghiên cứu quần xã vi khuẩn mẫu làm giàu mẫu thí nghiệm hòa tách quặng chalcopyrite 43 Chƣơng - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 PHỤ LỤC 55 MỞ ĐẦU Bioleaching việc ứng dụng vi sinh vật để hòa tách kim loại khỏi quặng chúng Phƣơng pháp ngày đƣợc sử dụng rộng rãi giới ngành công nghiệp khai thác khoáng sản nhờ hiệu kinh tế cao tính thân thiện với môi trƣờng Nhiều quốc gia có ngành công nghiệp khai thác khoáng sản phát triển nhƣ Nam Phi, Chile, Đức, Anh áp dụng công nghệ tuyển khoáng sinh học để đảm bảo trì tính bền vững cho ngành công nghiệp nƣớc Tuy nhiên, Việt Nam công nghệ chƣa đƣợc quan tâm phát triển Số lƣợng nghiên cứu lý thuyết nhƣ ứng dụng lĩnh vực nƣớc nhỏ Ở Việt Nam, mỏ có trữ lƣợng trung bình, hàm lƣợng quặng thƣờng không cao phân bố thiếu tập trung khiến cho công nghệ hòa tách hóa học khó đạt hiệu cao Do bioleaching đƣợc nhìn nhận công nghệ hoàn toàn phù hợp với điều kiện mỏ thực tế Để phát triển công nghệ bioleaching nƣớc, vi khuẩn oxy hóa sắt ƣa axit địa cần đƣợc tìm kiếm nghiên cứu đặc điểm sinh học có liên quan tới trình hòa tách kim loại Trong khuôn khổ luận án thạc sỹ này, đề tài ―Phân lập vi khuẩn oxy hóa sắt ưa axit (FOB) phục vụ cho công nghệ tuyển khoáng sinh học‖ đƣợc thực với nội dung sau: - Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả oxy hóa sắt ƣa axit từ môi trƣờng khai thác khoáng sản nƣớc - Nghiên cứu sinh trƣởng môi trƣờng pH thấp chủng phân lập để đánh giá khả ứng dụng vào việc hòa tách quặng - Thử nghiệm ứng dụng vi khuẩn để hòa tách kim loại từ quặng chalcopyrite (CuFeS2) mô hình phòng thí nghiệm nghiệm sử dụng chủng Acidithiobacillus sp FOB1 (Hình 3.7B) đối chứng không bổ sung vi sinh vật (Hình 3.7A) (vị trí mũi tên chỉ) B A C Hình 3.7 Phân tích thành phần nguyên tố mẫu quặng chalcopyrite thí nghiệm hòa tách sử dụng chủng Acidithiobacillus sp FOB1 (B) hay Leptospirillum sp FOB2 (C) so với đối chứng không bổ sung vi khuẩn (A) công cụ EDX Một số nghiên cứu công bố trƣớc cho thấy loài ƣa axit thuộc chi Leptospirillum có khả sinh trƣởng điều kiện pH thấp, mức 1,5 thấp (Tuffin cs, 2006; Coram Rawling, 2002), đồng thời có khả chống chịu tốt môi trƣờng có tỷ lệ Fe3+/ Fe2+ cao (Coram Rawling, 2002) Với đặc tính sinh học này, loài Leptospirillum thích nghi tốt môi trƣờng bên khối quặng trình hòa tách Trong thực tế, loài thuộc chi Leptospirillum đƣợc tìm thấy nhóm chiếm ƣu bể tuyển quặng thƣơng mại với nhiều loại quặng khác (Kinnunen Puhakka, 2004; Coram Rawling, 2002) Mặc dù vậy, tổ hợp bao gồm Acidithiobacillus spp Leptospirillum spp đƣợc chứng minh cho hiệu hòa tách quặng tốt (Rawlings, 2005; Rowerder cs, 2003) Bên cạnh cần lƣu ý thí nghiệm hòa tách quặng đƣợc thực điều kiện không vô trùng, bên cạnh loài vi khuẩn đƣợc chủ động bổ sung vào công thức thí nghiệm có loài khác sinh trƣởng điều kiện thí nghiệm 3.6 Nghiên cứu thành phần vi khuẩn phát triển bề mặt quặng chalcopyrite thí nghiệm bioleaching 42 Việc sử dụng phƣơng pháp lai huỳnh quang trực tiếp (FISH) sử dụng đầu dò GAM42a đặc hiệu cho nhóm -Proteobacteria cho việc xác định diện đánh giá vai trò loài thuộc chi Acidithiobacillus mẫu thí nghiệm bioleaching đƣợc thực trƣớc số nghiên cứu (Alves cs, 2009) Trong nghiên cứu này, thí nghiệm lai huỳnh quang trực tiếp đƣợc thực với mẫu quặng chalcopyrite từ chậu thí nghiệm hòa tách có bổ sung chủng Acidithiobacillus sp.AFOB1 làm giống khởi động Kết cho thấy vi khuẩn thuộc nhóm (Hình 3.8B) chiếm khoảng 50% tổng số tế bào nhuộm DAPI (Hình 3.8A) A B Hình 3.8 Hình ảnh FISH sử dụng đầu dò GAM42a mẫu quặng chalcopyrite từ thí nghiệm hòa tách có bổ sung chủng Acidithiobacillus sp FOB1 làm giống khởi động Trong lô thí nghiệm đối chứng không bổ sung vi khuẩn có tín hiệu bắt cặp với đầu dò GAM42a đƣợc quan sát thấy (hình ảnh không trình bày đây), xác nhận cách gián tiếp vai trò khởi động chủng FOB1 thí nghiệm hòa tách quặng để đạt hiệu cao (Hình 3.5 3.7) 3.7 Nghiên cứu quần xã vi khuẩn mẫu làm giàu mẫu thí nghiệm hòa tách quặng chalcopyrite Đoạn 16S rDNA khuyếch đại từ DNA tổng số quần xã vi khuẩn mẫu làm giàu E1, E2 mẫu từ thí nghiệm hòa tách quặng chalcopyrite (LE) đƣợc phân tích gel điện di biến tính DGGE Đồng thời, đoạn 16S rDNA tƣơng 43 ứng từ chủng vi khuẩn phân lập FOB1 FOB2 đƣợc khuếch đại phân tích gel điện di biến tính Kết cho thấy hai chủng FOB1 FOB2 đại diện cho hai nhóm vi khuẩn chiếm ƣu mẫu làm giàu tƣơng ứng E1 E2 Đống thời, hai loại vi khuẩn nhóm đƣợc tìm thấy quần xã vi khuẩn thí nghiệm hòa tách quặng chalcopyrite LE (Hình 3.9) Chủng FOB1 FOB2 phân tích PCR-DGGE 16S rDNA thể 01 băng, chứng tỏ tính đồng di truyền chủng chúng đƣợc phân lập thông qua pha loãng tới hạn môi trƣờng 9K dịch thể thay tách khuẩn lạc riêng rẽ môi trƣờng rắn Hình 3.9 Hình ảnh gel điện di biến tính phân tích đoạn 16S rDNA từ quần xã vi khuẩn mẫu làm giâu (E1, E2) mẫu thí nghiệm hòa tách quặng chalcopyrite (LE) so sánh với chủng khiết FOB1, FOB2 phân lập Phân lập vi khuẩn oxy hóa sắt ƣa axit pha loãng tới hạn môi trƣờng dịch thể có ƣu so với phƣơng pháp truyền thống tách khuẩn lạc riêng rẽ môi trƣờng rắn hạ pH tới mức thấp để loại trừ loài vi khuẩn hội, nhiên lại đối mặt với chắn tính khiết chủng phân lập đƣợc Trong trƣờng hợp này, phân tích DGGE 16S rDNA biện pháp hiệu để đánh giá độ khiết chủng phân lập Môi trƣờng rắn sử dụng chất tạo đông nhƣ thạch, agarose tạo đƣợc pH mức 3, 44 loài vi khuẩn ƣa axit nhƣ FOB trình sinh trƣởng làm pH giảm tới mức < 2, khó tạo đƣợc khuẩn lạc Kết từ phân tích DGGE trình bày (Hình 3.9) cho thấy mẫu từ thí nghiệm hòa tách quặng chalcopyrite có bổ sung chủng Acidithiobacillus sp FOB1 làm nguồn vi sinh vật khởi động (LE) xuất loài Leptospirillum (Hình 3.9), minh chứng cho đồng hành hỗ trợ lẫn hai nhóm vi khuẩn trình bioleaching Theo nghiên cứu Osorio trình hoạt động bổ trợ hai nhóm vi khuẩn đƣợc thực nhƣ sau: ban đầu, vi khuẩn Acidithiobacillus sp FOB1 xuất phát triển mạnh thòi điểm đầu trinh tách chiết Sự phát triển chủng làm giảm pH môi trƣờng giải phóng vào môi trƣờng ion sắt tạo điều kiện thuận lợi cho chủng Leptospirillum sp FOB2 (một loài vi khuẩn có khả oxy hóa sắt phát triển môi trƣờng pH thấp (1-1.5) (Tuffin cs, 2006; Coram Rawling, 2002) 45 Chƣơng - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã phân lập đƣợc hai chủng vi khuẩn oxy hóa sắt ƣa axit FOB1 FOB2 từ môi trƣờng mỏ Việt Nam thông qua bƣớc làm giàu môi trƣờng khoáng 9K Dựa so sánh trình tự 16S rDNA hai chủng thể quan hệ gần gũi tƣơng ứng với loài Acidithiobacillus ferridurans (98% tƣơng đồng) loài Leptospirillum ferriphylum (98% tƣơng đồng) Cả hai chủng có khả sinh trƣởng phổ pH axit rộng, từ – 4, tối ƣu pH – có khả tăng 50% hiệu suất hòa tách quặng chalcopyrite nghèo thời gian tuần Hai chủng FOB1 FOB2 đại diện cho hai nhóm vi khuẩn đƣợc tích lũy mẫu làm giàu, đồng thời nhóm vi khuẩn chiếm ƣu môi trƣờng hòa tách quặng chalcopyrite Nhƣ hai chủng vi khuẩn phân lập FOB1 FOB2 có tiềm nguồn vi sinh vật để phát triển công nghệ tuyển quặng sinh học Việt Nam Kiến nghị Hƣớng nghiên cứu đƣợc tiếp tục với nội dung nhƣ sau: Nghiên cứu sâu đặc tính sinh lý chủng FOB phân lập (ngƣỡng nhu cầu oxy, mức chịu ion kim loại nặng, chịu mặn) để làm sở xác định điều kiện tối ƣu cho trình hòa tách quặng Tiếp tục phân lập thêm chủng vi khuẩn oxy hóa sắt ƣa axit từ nguồn khác Việt Nam Thử nghiệm công nghệ bioleaching quy mô phòng thí nghiệm sử dụng nguyên liệu quặng khác nhau, nhƣ quặng đa kim, quặng kim loại 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Kiều Hữu Ảnh (1999) Giáo trình vi sinh vật học công nghiệp NXB KHKT Hà Nội pp 202 Tiếng Anh Abhilash, Mehta KD, Kumar V, Pandey BD, Tamrakar PK (2011) Bioleaching - An alternate uranium ore processing technology for India Energy Procedia 7: 158-162 Alves1 L , Bernardelli C, Leão VA, Teixeira MC, Donati E (2009) Microbial diversity in a brazilian acid moderate drainage and experimental nickel bioleaching system Baker BJ, Banfield JF (2003) Microbial communities in acid mine drainage FEMS Microbiol Ecol 44: 139-52 Barron JL, Lueking D (1990) Growth and maintenance of Thiobacillus ferrooxidans cells Appl Environ Microbiol 56: 2801-2806 Bennett JC, Tributsch H (1978) Bacterial leaching patterns on pyrite crystal surfaces J Bacteriol 134: 310–317 Bosecker K (1997) Bioleaching: metal solubilization by microorganisms Microbiol Rev 20: 591- 604 Brierley JA (1978) Thermophilic iron-oxidizing bacteria found in copper leaching dumps Appl Environ Microbiol 36: 523-525 Cabrera G, Gómez JM, Cantero D (2005) Influence of heavy metals on growth and ferrous sulphate oxidation by Acidithiobacillus ferrooxidans in pure and mixed cultures Process Biochem 40: 2683–2687 47 10 Cecal A, Humelnicu D, Popa K, Rudic V, Gulea A, Palmaru I, Nemtoi G (2000) Bioleaching of UO22+ ions from poor uranium ores by means of cyanobacteria J Radioanalyt Nucl Chem 245: 427-429 11 Colmer AR, Hinkle ME (1947) The role of microorganisms in acid mine drainage Science 106: 253-256 12 Coram NJ, Rawling DE (2002) Molecular relationship between two groups of the genus Leptospirillum and the finding that Leptospirillum ferriphilum sp nov dominates South African commercial biooxidation tanks that operate at 40°C Appl Environ Microbiol 68: 838-845 13 Demergasso C, Galleguillos P, Escudero L, Zepeda V, Castillo D, Casamayor E (2005) Molecular characterization of microbial populations in a low-grade copper orebioleaching test heap Hydrometallurgy 80: 241–253 14 Eaton AD, Clesceri LS, Rice EW, Greenberg AW (2005) Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater 21st Ed, APHA: Washington, D.C 15 Edwards KJ, Bo Hu, Hamers RJ, Banfild JF (2001) A new look at microbial leaching patterns on sulfide minerals 34 pp 249-253 16 Ehrlich HL (1996) Geomicrobiology 3rd ed Marcel Dekker, New York 17 Felsenstein J (1985) Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap Evolutio 39: 783-791 18 Fowler TA, Crundwell FK (1999) Leaching of Zinc Sulfide by Thiobacillus ferrooxidans: Bacterial Oxidation of the Sulfur Product Layer Increases the Rate of Zinc Sulfide Dissolution at High Concentrations of Ferrous Ions Appl Environ Microbiol 65: 5285-5292 19 Gentina JA, Fernando (2016) Copper bioleaching in Chile Minerals 6: 23 20 Groza N, Olteanu AF, Panturu E, Radulescu R, Aurelian F (2008) Application of the BIOX process to the pretreatment of refractory sulphide gold ores and 48 concentrates in order to increase Au and Ag recovery rate in hydrometallurgical extraction process Chem Bull Ponitehnica Univ 53: 1-2 21 Hedrich S, Johnson DB (2013) Acidithiobacillus ferridurans sp nov., an acidophilic iron-, sulfur- and hydrogen-metabolizing chemolithotrophic gammaproteobacterium Int J Syst Evol Microbiol 63: 4018-4025 22 Huber H, Stetter KO (1990) Thiobacillus cuprinus sp.nov., a novel facultatively organotrophic metal-mobilizing bacterium Appl Environ Microbiol 56: 315-322 23 IAEA (2005) Environmental Impact Assessment for In Situ Leach Mining Projects IAEA-TECDOC-1428: 170 24 Karkhaneh M, Mohseni S, Marzban MA, Sepehr MS, Hosseinkhani S (2011) Investigation of some heavy metals toxicity for indigenous Acidithiobacillus ferrooxidans isolated from Sarcheshmeh copper mine Jundishapur J Microbiol 4: 159-166 25 Kelly DP, Wood AP (2000) Reclassification of some species of Thiobacillus to the newly designated genera Acidithiobacillus gen nov., Halothiobacillus gen nov and Thermithiobacillus gen nov Int J Syst Evol Microbiol 50: 511–516 26 Kim DJ, Pradhan D, Park KH, Ahn JG, Won S (2008) Effect of pH and temperature on iron oxidation by mesophilic mixed iron oxidizing microflora Materials Transac 49: 2389-2393 27 Kinnunen PH, Puhakka JA (2004) High-rate ferric sulfate generation by a Leptospirillum ferriphilum-dominated biofilm and the role of jarosite in biomass retention in a fluidized-bed reactor Biotechnol Bioeng 85: 697-705 28 Logan TC, Seal T, Brierley JA (2007) Whole-Ore Heap Biooxidation of Sulfidic Gold-Bearing Ores in Bioming Berlin: 113-138 29 Lopez IFR, Larrea L, Cocolin E, Orr T, Phister M, Marshall J, Gheynst V, Mills DA (2003) Design and evaluation of PCR primers for analysis of bacterial populations in wine by denaturing gradient gel electrophoresis Appl Environ Microbiol 69: 6801–6807 49 30 Macalady JL, Hamilton TL, Grettenberger CL, Jones DS, Tsao LE, Burgos WD (2013) Energy, ecology and the distribution of microbial life Phil Trans R Soc B: 368 31 Macgrego RA (1966) Recovery of U3O8 by underground leaching Trans Can Inst Min Met 69: 162-16629 32 Manz W, Amann R, Ludwig W, Wagner MK, Schleifer H (1992) Phylogenetic Oligodeoxynucleotide Probes for the Major Subclasses of Proteobacteria: Problems and Solutions Appl Microbiol 15: 593 33 Markosyan GE (1972) A new iron-oxidizing bacterium – Leptospirillum ferrooxidans nov gen nov sp Biol J Armenia 25: 26–29 34 Marmur J (1961) A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro-organisms J Mol Biol 3: 208-218 35 Morenci, Collahausi (2015) Bioleaching: Making Mining Sustainable, Massachusetts Institute of Technology 36 Mudd G (1998) The case against uranium solution mining An environmental critique of in situ leach mining Victoria University of Technology: 154 35 Mular AL, Halbe DN, Baratt DJ (2002) Mineral processing plant design, practice and control; Society for mining Metallugry and Exploration Inc 2: 1631-1643 37 Muyzer G, Stams AJM (2008) The ecology and biotechnology of sulphatereducing bacteria Nature 6: 441-454 38 Natarajan KA (2008) Microbial aspects of acid mine drainage and its bioremediation Trans Nonferrous Met Soc China 18: 1352-1360 39 Neale J (2006) Bioleaching technology in minerals processing Randburg, South Africa, 40 Norris PR, Parrott L (1986) High temperature, mineral concentrate dissolution with Sulfolobus In Lawrence RW, Branion RMR, Ebner HG (Ed) Fundamental and Applied Biohydrometallurgy pp 355-365 50 41 Ojumu TV, Petersen J (2011) The kinetics of ferrous ion oxidation by Leptospirillum ferriphilum in continuous culture: The effect of pH Hydrometallurgy 106: 5-11 42 Olson GJ, Brierley JA, Brierley CL (2003) Bioleaching review part B: progress in bioleaching: applications of microbial processes by the minerals industries Appl Microbiol Biotechnol 63: 249-57 43 Osorio H, Martínez V, Nieto PA, Holmes DS,Quatrini R (2008) Microbial iron management mechanisms in extremely acidic environments: comparative genomics evidence for diversity and versatility BMC Microbiol 8:203 44 Ortiz F (1985) El Movimiento Obrero en Chile 1891–1919: 27-34 45 Peng H (2006) Research on the phenotypic and genetic diversity of Acidithiobacillus ferrooxidans strains, China 46 Plumb JJ, Gibbs B, Stott MB, Robertson WJ, Gibson JAE, Nichols PD, Watling HR, Franzmann PD (2002) Enrichment and characterisation of thermophilic acidophiles for the bioleaching of mineral sulphides Miner Eng 15: 787–794 47 Plumb JJ, Haddad CM, Gibson JAE, Franzmann PD (2007) Acidianus sulfidivorans sp nov., an extremely acidophilic, thermophilic archaeon isolated from a solfatara on Lihir Island, Papua New Guinea, and emendation of the genus description Int J Syst Evol Microbiol 57: 1418-1423 48 Pradhan N, Nathsarma KC, Rao KS, Sukla LB, Mishra BK (2008) Heap bioleaching of chalcopyrite: A review Miner Engineer 21: 355-365 49 Qin W, Zhen S, Yan Z., Campbell M, Wang J, Liu L, Zhang Y (2009), Heap bioleaching of a low-grade nickel-bearing sulfide ore containing high levels of magnesium as olivine, chlorite and antigorite Hydrometallurgy 98: 58-65 50 Rao DV, Shivannavar C, Gaddad SM (2002) Bioleaching of copper from chalcopyrite ore by fungi Ind J Exp Biol 40: 319-324 51 Rawlings DE (2005) Characteristics and adaptability of iron- and sulfuroxidizing microorganisms used for the recovery of metals from minerals and their concentrates Microb Cell Factor 4: 13 51 52 Rawling DE, Johnson DB (2007) The microbiology of biomining: development and optimization of mineral-oxidizing microbial consortia Microbiology 153: 315 – 324 53 Reiji T, Naomi K, Kazuhito U, Tsutomu K, Masayuki S, Tatsuaki T (1992) Pure isolation of a new chemoautotrophic ammonia-oxidizing bacterium on gellan gum plate J Ferment Bioeng 74: 52 – 54 54 Rodriguez-Leiva M, Tributsch H (1988) Morphology of bacterial leaching patterns by Thiobacillus ferrooxidans on synthetic pyrite Arch Microbiol 149: 401–405 55 Rossi G (1990) Biohydrometallurgy McGraw-Hill pp 609 56 Rowerder T, Gehrke T, Kinzler K, Sand W (2003) Bioleaching review Appl Microbiol Biotechnol 63: 239−248 57 Saitou N, Nei M (1987) The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees Mol Biol Evol 4: 406-425 58 Sand W, Gehrke T, Jozsa PG, Schippers A (2001) Bio chemistry of bacterial leaching - direct vs indirect bioleaching Hydrometallurgy 59: 159-175 59 Segener A, Neuner A (1986) Acidianus infernus gen nov.? sp nov and Acidianus brierleyi comb nov facultatively aerobic, extremely acidophilic thermophilic sulfur-metabolizing archaebacteria Int J Syst Bacteriol 36: 559-564 60 Silverman MP, Ehrlich HL (1964) Microbial formation and degradation of minerals Appl Microbiol 6:153-206 61 Timmins MG (2001) Leaching of chalcopyrite concentrate using extreme thermophilic bacteria, Master science, Department of metals and Materials Engineering, Bishop University 52 62 Torma AE, Gabra GG, Guay R, Silver M (1976) Effects of surface active agents on the oxidation of chalcopyrite by Thiobacillus ferrooxidans Hydrometallurgy 1: 301-309 63 Torma AE, Walden CC, Branion RMR (1972) The effect of carbon dioxide and particle area on the microbiological leaching of zinc sulfide concentrate Biotechnol Bioeng 14: 777-786 64 Tuffin M, Hector SB, Deane SM, Rawlings DE (2006) Resistance determinants of a highly arsenic-resistant strain of Leptospirillum ferriphilum isolated from a commercial biooxidation tank Appl Environ Microbiol 72: 2247-2253 65 Wakeman KD, Honkavirta P, Puhakka JA (2011) Bioleaching of flotation byproducts of talc production permits the separation of nickel and cobalt from iron and arsenic Process Biochem 46: 1589-1598 66 Watling HR (2006) The bioleaching of sulphide minerals with emphasis on copper sulphides — A review Hydrometallurgy 84: 81-108 67 Weisburg WG, Barns SM, Pelletier DA, Lane DJ (1991) 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study J Bacteriol 173: 697-703 68 Wheaton G, Counts J, Mukherjee A, Kruh J, Kelly R (2015) The coinfluence of heavy metal biooxidation and heavy metal resistance: implications for bioleaching by extreme thermoacidophiles Minerals 5: 397-451 69 Willner J, Kaducova J, Fornalczyk A, Saternus A (2015) Biohydrometallurgical method for metals recovery from waste minerals Metabk 54: 255-259 70 Xie XY, Sun PD, Lou JQ, Guo MX, Ma WG (2013) Effect of simulated heavy metal leaching solution of electroplating sludge on the bioactivity of Acidithiobacillus ferrooxidans Chinese J Environ Sci 34: 209-216 71 Xiong XX, Gu GH, Ban JR, Li SK (2015) Bioleaching and electrochemical property of marmatite by Sulfobacillus thermosulfidooxidans Trans Nonferrous Met Soc China 25: 3103−3110 53 72 Yang Yu, Qian L, Shi W, Peng H, Qiu G (2008) Isolation and characterization of acidophilic bacterium from Gaofeng Mine in China Science Press 18: 1253-1257 73 Yin HQ (2007) Development and application of the microarray technology during the research on the structure and function of microbial communities for acid mine drainages from the copper mines J Microbiol Meth 70: 165–178 74 Zhang l, Wua j, Wang Y, Wana L, Mao F, Zhang W, Zhou XCH (2014) Influence of bioaugmentation with Ferroplasma thermophilumon chalcopyrite bioleaching and microbial community structure Hydrometallurgy 146: 15-23 75 Zhang YF (2006) Isolation and bioleaching characterization of autotrophic and heterotrophic bacterium Master thesis Central South University, China 76 Zhou J, Bruns MA, Tiedje JM (1996) DNA recovery from soils of diverse composition Appl Environ Microbiol 62: 316-322 54 PHỤ LỤC Trình tự 16S rDNA chủng FOB1 (1387 bp) CATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGCAGTCGAGTTGCAGAC TGCAATCCGAACTACGACGCGCTTTCTGGGGTCTGCTCCACCTCGCGGCTTGGC TTCCCTCTGTACGCGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTGGACATAAAGGCCAT GAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCCCTA GAGTGCCCGGCCGAACCGCTGGCAACTAAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGG GACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGNCACCTG TGTTCCGAATTCCCCGAAGGGCACTCCCGCATCTCTGCAAGAATTCCCGGACA TGTCAAGCCCCAGTGTAAGGGTTCTTTCGCNGTTGCATCGAAATTAAACCCAC ATGCCTCCACCGCTTTGTGCGGGGCCCCCCGTCAAATTCCTTTTGAGTTTTAAC CTTTGCGGCCGTACTTCCCAGGCGNGAATACTTATCGCGGTTAGCTACGACACT CAGGTACGCGGTGGCACCAAAACATCTAGTATTCATCGTTTTAGGGGCGTGGG ACTACCAGGGGTATCTAATCCTGTTTTGCTCCCCACGCTTTTCGTGCCTCAGCG TCAGTATTGGGGCCAGGTGGCCCGCCTTCGCCACTGATGTTCCTCCAGATCTCT TACGCATTTCACNCGCTACACCTGNGAATTCCACCACCCTCTCCCATACTCTAG TCCGCCGGTTTCCACCGCCATTCCCAGGTTGAGCCCGGGGATTTCACGACAGA CCTAACGTACCGCCTACGCACCCTTTACGCCCAGTGATTCCGATTAACGCTTGC ACCCCCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGTTAGCCGGTGCTTCTTCTTGG ATTCACGTCAACAGCAGATTGTATTAGAACCCGCCTTTTCGTCCTCCACGAAAG GACTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCATCCACGCGGCATTGCTTCGTCAGGGTT GCCCCCATTGCGAAAAATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGT GTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGGTCGTCCTCTCAGACCAGCTACTGATCGTCGCC TTGGTAGGCCTTTACCCTACCAACTAGCTAATCAGACGTAGGCTCCTCCCTTAG CGCGAGGTCCGAAGATCCCCCGCTTTCCCCCTCAGGGCTCATGCGGTATTAGC CCAAGTTTCCCTGGGTTGTCCCCCACTAAAAGACAGATTCCTACGCATTACTCA CCCGTCCGCCACTCGTCAGCATCCGAAGACCTGTTACCGTTCGACTTGCATGTG TTAGGCATGCCGCCAGCGTTCAATCTGAGCCAGGATCAAAACTCT Trình tự 16S rDNA chủng FOB2 (1378 bp) AACGTATTCACCGCGTCGTGCTGATACGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATG AGGTCGAGTTGCAGACCTCAATCCGAACTGGGACCGGCTTTCTCGGATTTGCTC CACCTCTCGGTCTCGCATCCGTCTGTACCGGCCATTGTTGCACGTGTGTGGCCC TGGGCATAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCTCTCCTTCCTCCAACTTGTC GCTGGCAGTCCCCTCAGAGTGCCCGGCATGACCCGGTGGCAACAGAGGGCGA GGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTGAACCCAACACCTCACGGCACGAGCTGACGA CAGCCATGCAGCACCTGTTCCGCTTCCGGACTGAACCGGTCGGTCCCCTTTCAG TTCCCTACTCGCGGTATGTCAAGCCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCGTCGAAT TAAACCACATGCACCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCA ACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGGTACTTACTGCGTTGGCTGCGGCACG GGAGGTTTAACCCTCCCACACTTAGTACCCATCGTTTAGGGCGTGGACTACCA GGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTCTCTCAGTGTCAGGCCTGTT CCAGGAAGCCGCCTTCGCCACCGGCCTTCCTTCTGATATCTACGCATTTCACCG CTACACCAGAAATTCCGCTTCCCTCTCCCAGCCTCCAGTCTGCCAGTCTCTTTG 55 GCATTCCCATGGTTAAGCCACGGCCTTTCACCAAAGACTTGACAAACCACCTA CAGACTCTTTACGCCCAGTAACTCCGAACAACGCTTGCCACCTCTGTCTTACCG CGGCTGCTGGCACAGAGTTAGCCGTGGCTTATTCTCCCGGTACCGTCATCGAA GCGCCGTATTCTGACGCCCCTTTTCGTCCCGGGCAAAAGTGGTTTACAACCCGA AAGCCTTCTTCCCACACGCGGCGTTGCTGCGTCAGGGTTGCCCCCATTGCGCAA TATTCCTCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGCCCGTGTCTCAGTGCCAGTGT GGCTGGTTGTCCTCTCAGACCAGCTACCCGTCGTCGCCTTGGTAGGCCTTTACC CTACCAACTAGCTGATGGGCCATGGGCTCATCCAGGAGCGGAAGCTTGTTCCA GAGGCCTCCCTTTCCCCGGTCCCCTTCACGGAACCGGACTCTATTCGGTATTGC CCCCCCTTTCGGAGGGATATCCCCATCTCCAGGGTAGATCACCCATGTCTTACT CACCCGTTTGCCACCCTACCGGGGGATTGCTCCCCTTTCACGTCGGACTTGCAT GTGTTAGGCACGCCGCCAGCGTTCGTTCTGAGCCA 56 ... - Vi n Vi sinh vật Công nghệ sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội, đến hoàn thành luận án thạc sỹ với tiêu đề Phân lập vi khuẩn oxy hóa sắt ưa axit (FOB) để phục vụ cho công nghệ tuyển khoáng sinh. ..ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN VĂN HƢNG PHÂN LẬP VI KHUẨN OXY HÓA SẮT ƢA AXIT (FOB) PHỤC VỤ CHO CÔNG NGHỆ TUYỂN KHOÁNG SINH HỌC Chuyên ngành: Vi sinh. .. Số lƣợng vi khuẩn oxy hóa sắt ƣa axit đƣợc công bố (HET – vi sinh vật dị dƣỡng; S OX – vi khuẩn oxy hóa lƣu huỳnh; Fe+S OX – vi khuẩn oxy hóa sắt lƣu huỳnh; Fe OX – vi khuẩn oxy hóa sắt (Watling,