Phương pháp PCR – DGGE - Phương pháp nghiên cứu- 123docz.net

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.3. Phương pháp PCR – DGGE

Khuếch đại đoạn 16S rDNA (550 bp): Vùng V3 - V5 của gen 16S rDNA với độ dài 550 bp (Hình 2.1) đƣợc khuếch đại trong phản ứng PCR sử dụng cặp mồi GM5F và 907R (Muyzer và Stams, 2008). Để tạo tính ổn định cho việc phân tách các trình tự DNA trên gel điện di biến tính, kẹp GC gồm 40 bp (CGCCCGCCGCGCGCGGCGGCCGGGGCGGGGGCACGGGGGG) đƣợc gắn vào đầu 5’ của mồi GM5F.

Hình 2.1. Vị trí đoạn 16S rDNA (V3 – V5) đƣợc sử dụng trong phân tích DGGE ở Lactobacillus plantarum (Lopez và cs, 2003).

―Touch-down‖ PCR (Bảng 2.3) đƣợc sử dụng để tăng độ đặc hiệu và giảm sự hình thành các sản phẩm phụ trong phản ứng PCR.

Bảng 2. 3. Thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt của PCR-DGGE.

Thành phần phản ứng Thể tớch (àl) Chu kỳ nhiệt ―touch-down‖ PCR H2O MQ 27 Taq polymerase đƣợc đƣa vào phản

ứng sau bước biến tính đầu tiên ở 94○C trong 1 phút khi nhiệt độ đạt 80○C. Nhiệt độ gắn mồi đƣợc đặt cao hơn 10○C so với nhiệt độ lý thuyết (tức là 65○C). Sau mỗi chu kỳ, nhiệt độ gắn mồi giảm đi 0,5○C cho tới khi đạt tới 55○C, ở nhiệt độ này phản ứng tiến hành thêm 15 chu kỳ. Thời gian kéo dài chuỗi của mồi là 3 phút.

10x Taq buffer 5

BSA (3 mg/ml) 5

MgCl2 (20 mM) 4

dNTP (2,5 mM mỗi loại) 4 Mồi GM5F-GC (50 pmol/àl) 1 Mồi 907R (50 pmol/àl) 1

DNA khuôn 2

Taq polymerase (5 u/àl) 1 Tổng thể tích phản ứng 50

DGGE: Điện di đƣợc tiến hành trên gel polyacrylamide 6% với dải biến tính urea/formamid từ 30% đến 60%. Quá trình điện di đƣợc thực hiện bằng bộ điện di DcodeTM System (BioRad) trong đệm TAE, ở nhiệt độ 60C, tại 200 V, trong 3,5 giờ. Sau khi điện di, gel polyacrylamide đƣợc nhuộm trong dung dịch ethidium bromide (5 mg/ml) trong 30 phút, sau đó rửa nước và chụp ảnh dưới tia UV trên máy GelDoc (BioRad).

Cắt băng và thôi gel. Băng điện di được cắt, rửa và thôi trong nước qua đêm tại 4C. Dịch thôi DNA đƣợc dùng làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR theo chu trình nhiệt tại Bảng 2.3 sử dụng cặp mồi GM5F (không có kẹp GC) và 907R. Sản phẩm PCR tiếp theo đƣợc tinh sạch bằng kít (Bioneer, Hàn Quốc) và giải trình tự.

2.2.4. Giải trình tự 16S rDNA và dựng cây phát sinh chủng loại

16S rDNA (1500 bp) của các chủng FOB thuần khiết đƣợc khuếch đại trong phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 27F và 1492R (Weisburg và cs, 1991) với thành phần và chu trình phản ứng trình bày ở bảng 2.4.

Bảng 2.4. Phản ứng PCR khuyếch đại 16S rDNA

Thành phần phản ứng Thể tích (àl)

Nhiệt độ

(oC) Thời gian Số chu kỳ

H2O MQ 13,5 94 3 phút

10x buffer 2,5 94 30 giây 35

BSA (3 mg/ml) 2,5 55 45 giây

MgCl2 (20 mM) 2 72 1,5 phút

dNTP (2,5 mM) 2 72 7 phút

Mồi 27F (50 pmol/àl) 0,5

Mồi 1492R (50 pmol/àl) 0,5

Taq polymerase (5u/àl) 0,5

DNA Khuôn 1

Tổng thể tích phản ứng 25

16S rDNA của các chủng thuần khiết (1500 bp) và sản phẩm PCR từ các băng điện di biến tính (550 bp) sau khi tinh sạch bằng kít tinh sạch sản phẩm PCR (Bioneer - Hàn Quốc) đƣợc tiến hành phản ứng đọc trình tự với ABI Prism BigDye Terminator cycle sequencing kit và giải trình tự trên máy tự động 3110 Avant Appied Biosystems. Trình tự gen sau đó đƣợc phân tích, so sánh với trình tự 16S rDNA của các loài có liên quan hiện đã công bố trên Database DDBJ/EMBL/GenBank sử dụng phần mềm BLAST Search. Cây phân loại đƣợc dựng theo phương pháp neighbour-joining (Saitou và Nei, 1987) trong đó định dạng cây đƣợc tiến hành dựa trên 1000 phép so sánh đa chiều (Felsenstein, 1985).

2.2.5. Định lượng Fe(II) và Fe tổng số

Nguyên lý: O-phenanthrolin phản ứng với Fe2+ tạo phức có màu tím đỏ trong khoảng pH 3  9, đo được ở bước sóng 510 nm. Nồng độ Fe2+ cho phép đo là 0,01  5 mg/l. Khi nồng độ Fe2+ trong mẫu quá cao thì phải pha loãng mẫu trước khi đo.

Chuẩn bị:

- Dung dịch HCl 25% (rửa dụng cụ): Dụng cụ đƣợc rửa bằng HCl 25% và tráng bằng nước cất trước khi sử dụng.

- Dung dịch H2SO4 loãng (hạ pH): H2SO4 đặc : nước = 1 : 4 (thể tích).

- Dung dịch ammonium acetate 5,2 M (đệm):

CH3COONH4 40 g CH3COOH 50 ml

Nước cất đủ 100 ml

- Dung dịch hydroxyl ammonium chloride 1,4 M (khử Fe3+ thành Fe2+) NH2OH. HCl 10 g

Nước cất đủ 100 ml

- Dung dịch phenanthrolin 21 mM (tạo phức):

C12H9ClN2.H2O 0,5 g

Nước cất đủ 100 ml

(Bảo quản trong lọ tối, hạn sử dụng trong 1 tuần) - Dung dịch chuẩn:

FeSO4.7H2O 2,78 mg

HCl 25% 6,25 ml

Nước cất đủ 100 ml Tiến hành:

Xác định hàm lượng Fe2+ trong mẫu dịch:

- Sau khi thu mẫu, lập tức hạ pH tới 1 bằng dung dịch H2SO4 loãng (bổ sung 1%

thể tích).

- Thêm vào 50 ml mẫu 5 ml dung dịch ammonium acetate.

- Thêm 2 ml dung dịch phenanthrolin, trộn đều.

- Thêm nước cho tới 100 ml, trộn đều. Giữ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút.

- Đo OD tại bước sóng 510 nm.

- Đường chuẩn được tiến hành với nồng độ Fe2+ từ 5 - 50 àM..

Xác định hàm lượng Fe tổng số trong mẫu dịch:

Tương tự với xác định Fe2+ nhưng có bổ sung 2 ml hydroxyl ammonium chloride 1,4 M cùng với đệm trước khi bổ sung thuốc thử phenanthrolin.

2.2.6. Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (FISH)

Mẫu quặng từ các thí nghiệm hòa tách đƣợc rửa trong đệm 1 PBS, sau đó cố định trong dung dịch glutaraldehyde 4% qua đêm (16 h) tại 4C. Mẫu đƣợc lai với đầu dò đặc hiệu dành cho nhóm γ-Proteobacteria là GAM42a có gắn chất huỳnh quang cy3 ở đầu 5’- của trình tự oligo-nucleotide (Manz và cs,1992). Điều kiện lai phù hợp cho đầu dò là 35% formamide và 80% NaCl trong 3 h tại 46C (Manz và cs,1992). Sau khi lai, tế bào được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang Zeiss Axio Plus và hình ảnh đƣợc ghi lại bằng camera AxioCam ICc

2.2.7. Thiết lập thí nghiệm tuyển quặng sinh học

Quặng chalcopyrite (CuFeS2) thải sau khi hòa tách bằng biện pháp hóa học do Công ty Phú Điền cung cấp đƣợc sử dụng trong thí nghiệm. Quặng đã đƣợc nghiền nhỏ với kích thước hạt 0.2 – 0.3 mm. Các thí nghiệm được đặt trong chậu nhựa với cấu trúc hai đáy, đáy trên dạng lỗ (cho phép không khí đi qua) và đáy dưới kín để tích lũy dịch tách quặng (Hình 2.2). Đáy trên đƣợc lót một lớp màng nhựa bền với axit (kích thước lỗ  0.1 mm) để các hạt quặng không bị rơi xuống dưới.

Hình 2.2. Sơ đồ chậu thí nghiệm tuyển quặng sinh học trong phòng thí nghiệm Mỗi chậu thí nghiệm chứa 100 g quặng, ngập trong 500 ml môi trường 9K (pH5, không có Fe2+). Chủng vi khuẩn oxy hóa sắt (ở dạng dịch nuôi) đƣợc bổ sung vào khối quặng tới mật độ tế bào 106 TB/ml (theo thể tích môi trường sử dụng).

Oxy được cấp từ dàn thổi khí nằm dưới đáy, đảm bảo hàm lượng oxy trong khối

quặng đạt mức  3 mg/L. Các chậu thí nghiệm đƣợc đặt trong tối, ở nhiệt độ phòng và theo dõi định kỳ trong thời gian 1 tháng dựa trên hai yếu tố pH và tổng lƣợng sắt (Fe2+ và Fe3+) đƣợc hòa tách từ quặng vào trong dung dịch tuyển quặng. Sinh trưởng của vi khuẩn sẽ tạo ra axit sulfuric và làm giảm pH trong môi trường, vì vậy một phần dung dịch tuyển quặng được thay thế định kỳ bằng môi trường 9K mới (pH5, không có Fe2+) để đạt mức pH 3.5 – 4 mỗi khi pH trong môi trường giảm xuống dưới 2. Hàm lượng sắt tổng số có trong dung dịch tuyển quặng được xác định với thuốc thử phenanthrolin (phương pháp tiêu chuẩn DIN 38406-E1-1, Đức).

2.2.8. Phương pháp phân tích SEM và EDX

Mẫu để quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM) được chuẩn bị nhƣ sau: tế bào đƣợc thu từ dịch nuôi bằng ly tâm, rửa trong dung dịch cacodylate 100 mM trong 2 – 3 lần, sau đó xử lý trong dung dịch chứa 2.5%

glutaraldehyde, 100 mM cacodylate trong 1 h. Sau khi xử lý, mẫu đƣợc rửa 2 – 3 lần trong dung dịch cacodylate 100 mM, sau đó cố định trong dung dịch chứa 1%

OsO4 và 100 mM cacodylate trong 1 h tại nhiệt độ phòng. Sau khi cố định, mẫu được rửa trong dung dịch 100 mM cacodylate 2 lần, sau đó loại nước trong dung dịch cồn ở các nồng độ 50, 70, 80, 90 và 100%. Tế bào vi khuẩn sau quy trình xử lý đƣợc hòa trong 100% ethanol tới mật độ phù hợp, đƣa lên đế gắn mẫu có bọc màng nhôm và phủ màng Pt-Pd. Sau cùng mẫu đƣợc phân tích trên kính hiển vi điện tử quét (Hitachi, Nhật Bản) kết nối với đầu phân tích nguyên tố EDX.