Nghiên cứu quy trình bán tổng hợp vinblastin từ vindolin và catharanthin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI -*** - LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH BÁN TỔNG HỢP VINBLASTIN TỪ VINDOLIN VÀ CATHARANTHIN NGÀNH: CÔNG NGHỆ HÓA HỌC MÃ SỐ: ĐINH VĂN THỊNH Người hướng dẫn khoa học: TS VŨ ĐÌNH HOÀNG Hà Nội, 2009 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG, SƠ ĐỒ, HÌNH MỞ ĐẦU .Error! Bookmark not defined PHẦN TỔNG QUAN Error! Bookmark not defined 1.1 Vài nét Dừa cạn Catharanthus roseus (L.) G Donn Vinblastin .Error! Bookmark not defined 1.1.1 Giới thiệu Dừa cạn Error! Bookmark not defined 1.1.1.1 Mô tả Error! Bookmark not defined 1.1.1.2 Phân bố thu hái Error! Bookmark not defined 1.1.1.3 Công dụng Error! Bookmark not defined 1.1.1.4 Thành phần hoá học .Error! Bookmark not defined 1.1.2 Vinblastin Error! Bookmark not defined 1.1.2.1 Tên, công thức Error! Bookmark not defined 1.1.2.2 Tính chất vật lý .Error! Bookmark not defined 1.1.2.3 Tác dụng dược lý Error! Bookmark not defined 1.2 Các nghiên cứu công nghệ chiết xuất bán tổng hợp giới Error! Bookmark not defined 1.2.1 Một số vinca ancaloid Error! Bookmark not defined 1.2.2 Vài nét công nghệ phân lập Vinca ancaloidError! Bookmark not de 1.2.3 Vài nét bán tổng hợp Vinblastin Error! Bookmark not defined 1.2.4 Vài nét tình hình nghiên cứu triển khai nướcError! Bookmark PHẦN THỰC NGHIỆM .Error! Bookmark not defined 2.1 Đối tượng nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.2 Phương pháp nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.2.1 Mẫu thực vật .Error! Bookmark not defined 2.2.2 Phương pháp chiết xuất Error! Bookmark not defined 2.2.3 Phương pháp sắc ký để nhận biết phân lập hợp chấtError! Bookmar 2.2.3.1 Sắc ký lớp mỏng .Error! Bookmark not defined 2.2.3.2 Phương pháp sắc ký cột Error! Bookmark not defined 2.2.4 Các phương pháp xác định cấu trúc chất phân lập đượcError! Bookma 2.2.4.1 Điểm nóng chảy (mp) .Error! Bookmark not defined 2.2.4.2 Phổ hồng ngoại – IR .Error! Bookmark not defined 2.2.4.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân – NMRSError! Bookmark not defined 2.2.4.4 Phổ khối lượng – MS Error! Bookmark not defined 2.2.4.5 Một số phương pháp phân tích khác Error! Bookmark not defined 2.3 Quy trình thực nghiệm Error! Bookmark not defined 2.3.1 Dụng cụ phương pháp nghiên cứuError! Bookmark not defined 2.3.1.1 Dụng cụ thiết bị Error! Bookmark not defined 2.3.1.2 Phương pháp sắc ký Error! Bookmark not defined 2.3.1.3 Dung môi hóa chất Error! Bookmark not defined 2.3.2 Chiết tách tinh chế hợp chất từ Dừa cạnError! Bookmark not d 2.3.2.1 Quy trình chiết xuất tách Vinca ancaloid từ Dừa cạnError! Bookm 2.3.2.2 Chiết “ancaloid tổng số” từ Dừa cạnError! Bookmark not defined 2.3.2.3 Tách Vinca ancaloid từ “ancaloid tổng số”Error! Bookmark not defin 2.3.3 Bán tổng hợp vinblastin từ vindolin catharanthinError! Bookmark not d 2.3.3.1 Tiến hành Error! Bookmark not defined 2.3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng lượng H2O2 tới hiệu suất tạo vinblastinError! Boo 2.3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng tốc độ cung cấp H2O2 tới hiệu suất tạo vinblastin .Error! Bookmark not defined 2.3.4 Các đặc trưng hóa lý phổ hợp chất phân lập đượcError! Book 2.3.4.1 Hợp chất V2 Error! Bookmark not defined 2.3.4.2 Hợp chất V23 Error! Bookmark not defined 2.3.4.3 Hợp chất V37 Error! Bookmark not defined PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined 3.1 Hợp chất V2 Error! Bookmark not defined 3.2 Hợp chất V23 Error! Bookmark not defined 3.3 Hợp chất V37 Error! Bookmark not defined 3.4 Bán tổng hợp vinblastin Error! Bookmark not defined 3.4.1 Ảnh hưởng lượng H2O2 đến hiệu suất tạo vinblastinError! Bookmark n 3.4.2 Ảnh hưởng tốc độ cung cấp H2O2 đến hiệu suất tạo thành vinblastin .Error! Bookmark not defined KẾT LUẬN Error! Bookmark not defined TÀI LIỆU THAM KHẢO Error! Bookmark not defined MỞ ĐẦU Vinblastin ancaloid có Dừa cạn Catharanthus roseus (L.) G Donn Noble cộng (Canada) phát vào năm 1958 Và cấu trúc hoá học Neuss làm sáng tỏ năm 1962 Qua 50 năm nghiên cứu thử nghiệm, vinblastin chứng minh nhiều tác dụng ưu việt điều trị ung thư bệnh Hodgkin, u lympho không Hodgkin, u lympho mô bào, u sủi dạng nấm, ung thư tinh hoàn tiến triển, sarcooma Kaposi, bệnh mô bào huyết, ung thư nhau, ung thư vú Hiện nay, giới, tiên phong việc triển khai sản xuất thuốc chống ung thư từ ancaloid Dừa cạn phải kể đến công ty như: công ty Eli Lilly - Mỹ với sản phẩm thuốc tiêm VELBAN® từ vinblastin sunfat định điều trị bệnh Hodgkin, ung thư máu, ung thư biểu mô tinh hoàn, u Kaposi, ung thư con; công ty Pharmacia Corporation Kalamazoo Mỹ với sản phẩm thuốc tiêm VINCASAR PSF từ vinblastin sunfat vincristin sunfat định đặc hiệu điều trị bệnh bạch cầu ác tính; công ty Pierre Fabre - Cộng hòa Pháp với sản phẩm thuốc tiêm viên nén NAVELBINE® từ vinorelbin tartrat bán tổng hợp từ vindolin catharanthin, định đặc hiệu điều trị ung thư vú ung thư phổi, sử dụng độc lập phối hợp điều trị với cisplatin; v.v Các quốc gia vùng lãnh thổ trồng Dừa cạn chủ động nghiên cứu triển khai sản xuất vinblastin dẫn xuất Trung Quốc, Ấn Độ, Pakistan, Hàn Quốc, Nhật Bản nước Trung Á, Bắc Phi, v.v Có thể nêu vài số theo thống kê vào năm 2002 FAO làm ví dụ: Madagasca xuất 1000 (khô) hoa Dừa cạn hàng năm; Ở Hungari, suất hoa Dừa cạn đạt tới 1,5 - khô/ha/năm; Ở Ấn Độ, riêng tập đoàn Cipla hàng năm sản xuất khoảng 15 - 25 kg vinblastin sunfat vincristin sunfat Ở Việt Nam, Dừa cạn mọc tự nhiên suốt từ Bắc vào Nam trồng làm cảnh Đây giống có khả chịu hạn cao có thời gian canh tác ngắn Các kết thử nghiệm Trung tâm Nghiên cứu trồng chế biến thuốc Đà Lạt cho thấy Dừa cạn Catharanthus roseus L phát triển tốt đất cát khô hạn ven biển tỉnh miền Trung, sau tháng trưởng thành tích lũy đủ hàm lượng ancaloid đạt tiêu chuẩn xuất Từ kết khảo sát sơ trình nghiên cứu Viện Hóa học công nghiệp, kết hợp so sánh tham khảo công nghệ nước ngoài, nhận thấy với công nghệ chiết xuất đại, giống Dừa cạn tốt (có hàm lượng vinblastin 0,01 % khô - tương đương với Madagasca), chi phí tối thiểu để phân lập g vinblastin lớn 200 USD, đó, giá xuất xưởng Eli Lilly, Geoden Richer Cipla dao động khoảng 120 - 135 USD/1 g vinblastin (FAO/UNDP 2002) Như vậy, túy dựa vào chiết tách, thuốc chống ung thư máu từ hoa Dừa cạn Việt Nam không cạnh tranh thị trường nước Trong lại không tận dụng tiền chất có sẵn Dừa cạn để bán tổng hợp thuốc Với nguồn nguyên liệu Dừa cạn đạt vượt tiêu chuẩn châu Âu tổ chức canh tác quy mô, sản lượng xuất sang thị trường Pháp châu Âu đạt hàng trăm năm, mà bệnh nhân ung thư máu phải sử dụng vinblastin sunfat nhập từ hãng Eli Lilly - Mỹ, Geoden Richer - Hungari, Pierre Fabre - Cộng hòa Pháp với giá 1.080.000 VND lọ 10 mg Theo số liệu Vimedimex II BV Pharma, hàng năm công ty phải nhập khoảng triệu USD thuốc tiêm vinblastin sunfat, vincristin sunfat để cung cấp cho thị trường tỉnh phía Nam Với tính cấp thiết vấn đề chủ động nguồn nguyên liệu giá sản phẩm thuốc chứa vinblastin, việc nghiên cứu ứng dụng triển khai quy trình bán tổng hợp vinblastin từ vindolin catharanthin có Dừa cạn cần thiết Thực điều tận dụng hiệu hoạt chất, giảm giá thành thuốc ung thư máu chiết suất từ Dừa cạn mà góp phần thực mục tiêu chung chương trình Hóa Dược: “Nghiên cứu khai thác sử dụng có hiệu hoạt chất thiên nhiên chiết tách, tổng hợp bán tổng hợp từ nguồn dược liệu tài nguyên thiên nhiên quý giá mạnh nước ta, phục vụ tốt công nghiệp bào chế số loại thuốc đặc thù Việt Nam, đáp ứng nhu cầu chữa bệnh nước xuất khẩu” Nội dung luận văn bao gồm: - Chiết tách phân lập vindolin, catharanthin từ Dừa cạn Catharanthus roseus (L.) G Donn - Nghiên cứu bán tổng hợp vinblastin từ vindolin catharanthin PHẦN TỔNG QUAN 1.1 Vài nét Dừa cạn Catharanthus roseus (L.) G Donn Vinblastin 1.1.1 Giới thiệu Dừa cạn [1,2] Tên khoa học: Catharanthus roseus (L.) G Donn (còn gọi Vinca rosea L.; Lochera Rosea Reich.) Thuộc họ Trúc đào (Apocynaceae) Tên thường gọi: Trường xuân hoa, dừa, dương giác (sừng dê), hoa hải đăng, pervenche de Madayascar 1.1.1.1 Mô tả Cây nhỏ cao 0,4 – 0,8m, có rễ phát triển, thân gỗ phía gốc, mềm phần Mọc thành bụi dầy, có cành đứng, mọc đối, thuôn dài, đầu nhọn, phía cuống hẹp nhọn, dài – 8cm, rộng 1- 2,5cm Hoa mọc trắng hồng, mùi thơm, mọc riêng lẻ kẽ phía trên, gồm đại, dài – 4cm, rộng – 3mm, mọc thẳng đứng, ngả sang hai bên, vỏ có vạch dọc, đầu tù, chứa 12 – 20 hạt nhỏ màu nâu nhạt, hình trứng, mặt hạt có hột nổi, thành đường chạy dọc Mùa hoa gần quanh năm 1.1.1.2 Phân bố thu hái Cây Dừa cạn vốn có nguồn gốc xuất xứ từ đảo Madagasca (Châu phi) Mọc hoang dại trồng nhiều nước nhiệt đới Việt Nam, Ấn độ, Inđônêxia, Philipin, châu Phi, châu Úc, Braxin,… Tại châu Âu châu Mỹ vùng nóng trồng quanh năm, vùng lạnh trồng theo mùa không chịu lạnh Ở Việt Nam gặp nhiều tỉnh gần biển, khắp nơi trồng được, trước trồng làm cảnh, gần trồng để thu hoạch lấy cây, rễ chế thuốc 1.1.1.3 Công dụng Chưa thấy tài liệu cổ YHCTDT đề cập đến Theo kinh nhiệm sử dụng y học dân tộc số nước khác có Dừa cạn mọc hoang, rễ Dừa cạn có tác dụng tẩy giun, chữa sốt Thân có tính chất săn da (astringent), lọc máu (dépuratif) dùng chữa số bệnh da chữa đái tháo đường Kinh nhiệm dùng dừa cạn chữa bệnh đái tháo đường ghi nhận Ấn độ, châu Úc, nam châu Phi quần đảo Antilles chứng minh thực tế khoa học chưa có Những thí nghiệm thỏ (gây đường huyết thực nghiệm) chuột (diabète alloxan) cho kết luận không rõ Và nói, nhờ thực nghiệm chuột mà nhà khoa học phát tác dụng làm giảm bạch cầu số chất tách từ Dừa cạn dẫn tới việc phát chất vincaleucoblastin ancaloid khác có tác dụng chống u leurosin, leurocristin leurosidin Ngoài người ta phát tác dụng tẩy giun mạnh, tác dụng lợi tiểu catharanthin, vindolinin vindolidin, ajmalicin lại có tác dụng ngược lại Những thí nghiệm dùng người bệnh bắt đầu vào năm 1962 Mỹ, Pháp số nước khác Tuy nhiên nhiều ý kiến khác Hiện chưa có loại thuốc tốt nên nhu cầu Dừa cạn tăng lên Cũng mục đích dùng chữa khối u mua Dừa cạn người ta đăc biệt ý tới hàm lượng ancaloid toàn phần, số ancaloid toàn phần có hàm lượng vincaleucoblastin Trên thị trường thuốc giới thường có bán vincaleucoblastin (hay vinblastin) dạng muối sunfat Dung dịch nước 0,1% không bền vững, đựng ống tiêm gắn kín (mỗi ống 10mg) bảo quản tủ lạnh Dùng tiêm mạch máu với liều lượng 0,1 – 0,15mg/kg thể trọng Dùng chủ yếu chống bệnh Hodgkin Trong trình dùng thuốc phải theo dõi bạch cầu Thuốc dùng cho trẻ em Loại thuốc thứ hai leucocristin (hay vincristin) dạng muối sunfat, tiêm mạch máu với liều lượng 0,03 – 0,1mg/kg thể bệnh máu (hemopathie), bệnh bạch huyết leucemie limphoblistique Ở nước ta, nhân dân dùng dạng thuốc sắc làm thuốc lợi tiểu, chữa huyết áp, tiểu đường Ngày dùng 10-16g 1.1.1.4 Thành phần hoá học Từ Dừa cạn người ta chiết chất sau đây: Axit pyrocatechic, sắc tố flavonic (glucozit quercetol campferol) anthocyanic từ thân Dừa cạn hoa đỏ ( theo Forsyth Simmonds, 1957) Ngoài từ người ta chiết axit ursolic từ rễ chiết cholin Năm 1969, Battersby cộng chiết chất vicosid, glucoalcaloid tiền thân để sinh tổng hợp ancaloid Hiện người ta xác định hoạt chất Dừa cạn ancaloid có nhân indol có tất phận cây, nhiều rễ Tùy theo nơi thu hái, hàm lượng ancaloid thay đổi từ 0,2 – 1% Và có giống có hàm lượng cao 55 Hình 3.3.c: Phổ 13C-NMR phổ DEPT V37 Hình 3.3.d: Phổ HSQC V37 56 Hình 3.3.e: Phổ HMBC V37 2' N 17' 14' 15' 13' 19' 4' CH 21' 5' 8' 10' 20' 3' 16' 6' 7' 9' 12' OH 1' 18' N H 11' O H3 C 28 10 22' N 11 14 O 19 15 13 18 17 CH O O N 24 H CH 27 CH 20 H 16 O 21 12 23 O HO CH 25 22 O 26 CH Cấu trúc hợp chất V37 57 3.4 Bán tổng hợp vinblastin Công nghệ bán tổng hợp vinblastin nghiên cứu theo quy trình A Verma cộng hiệu chỉnh nguyên liệu vindolin catharanthin sản phẩm đề tài [35] Sơ đồ phản ứng xảy trình bán tổng hợp ghép đôi vindolin catharanthin sau: O N N H2O N H N H COOCH COOCH (II) Catharanthine N [O] H3 CO N HO CH OAc COOCH Vindoline N (III) N H COOCH R OH R=10-Vindolinyl N NaBH N H N COOCH3 H3 CO N Fe (IV) N H N HO Vinblastine 4' 3' 3+ R OAc COOCH3 COOCH3 3',4'-Anhydrovinblastine Có thể giải thích chế phản ứng sau: Ban đầu xảy phản ứng ôxy hóa để tạo tác nhân electrophyl SE (II) H2O2 với catharanthin 58 17 14 O 13 N 16 12 10 11 N H 21 CH3 COOMe 20 Trong phân tử vindolin, nhóm OCH3 nhân thơm có tính đẩy e nên chuyển dịch điện tử nhân thơm sau: N CH 15 H 27 17 H3 C O O O N H CH3 O HO CH O CH Hiệu ứng làm cho điện tích hai vị trí ortho, para nhân thơm (đối với nhóm OCH3) mang điện tích ‘âm phần’ tạo điều kiện dễ dàng electrophyl vào vị trí ortho, para Nhưng vị trí para bị chiếm, vị trí ortho 17 bị án ngữ không gian nên phản ứng ưu tiên vị trí ortho 15, tạo hợp chất (III) Sau khử hóa hợp chất NaBH4 thu AVLB (hợp chất IV) 17 14 O 13 N 16 12 11 10 N H 21 CH3 COOMe 20 N CH 15 H 27 17 H 3C O O O N H CH O HO O CH CH 59 Giai đoạn phản ứng ôxy hóa nối đôi (C3’=C4’) AVLB Fe3+ để tạo thành nhóm β OH, tức tạo vinblastin Như nói trên, thí nghiệm thăm dò, thấy yếu tố định đến hiệu suất tạo thành vinblastin nồng độ tác nhân oxi hóa Từ khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng lượng H2O2, tốc độ nhỏ giọt H2O2 Hàm lượng tương đối vinblastin sản phẩm phản ứng kiểm tra HPLC-MS 3.4.1 Ảnh hưởng lượng H2O2 đến hiệu suất tạo thành vinblastin Điều kiện phản ứng: - Chất phản ứng: + Vindolin: 456 mg (1mM); + Catharanthin: 336 mg (1mM); - Dung dịch đệm axít citric 0,1M/axít clohydric 0,1M: 100ml; - Tác nhân oxy hóa H2O2 30%: nhỏ giọt 30 phút; - Xúc tác oxy hóa: FeCl3 15%: 100ml nhỏ giọt 30 phút; - Nhiệt độ thực phản ứng oxy hóa ghép đôi: ÷ - 50C; - Tác nhân khử hóa NaBH4 0,1 % metanol: 100 ml; - Nhiệt độ thực phản ứng khử hóa: - 200C; - Thời gian phản ứng tổng cộng: Khi khảo sát ảnh hưởng lượng H2O2 đến hiệu suất tạo thành vinblastin thấy rằng: Khi tăng lượng tác nhân oxy hóa, hiệu suất tạo thành vinblastin tăng mạnh từ 14 % (lượng H2O2 30% 30 ml) đến 25 % (khi lượng H2O2 30 % ~ 100 ml) Tuy nhiên, tiếp tục tăng lượng tác nhân oxy hóa, hiệu suất giảm mạnh Khi sử dụng tới 200 ml H2O2 30 %, hỗn hợp sản phẩm hoàn toàn không phát thấy vinblastin (Sắc ký đồ LC-MS V32 phần phụ lục) Lượng H2O2 30% (ml) Hiệu suất tạo VLB (%) 30 14 60 15 90 23 120 22 150 60 Hiêu suât VLB (%) 30 25 20 15 10 0 30 60 90 120 150 Luong H2O2 30% (ml) Hình 3.4.a: Ảnh hưởng lượng H2O2 đến hiệu suất tạo vinblastin Chúng tách xác định cấu trúc sản phẩm hỗn hợp này, kết phân tích cho thấy chất leurosin (V34) cặp hợp chất trung gian 1’-Nb-Oxydvinblastin 2’-Oxovinblastin (V32E) [41 - 45] (kết phân tích cấu trúc phương pháp NMR hợp chất V32E V34 thể phần phụ lục) O CH3 N OH O N CH N H N H N O H3C N O O CH H3 C O CH H O N CH CH3 O O HO H O O N CH CH3 O O CH O HO CH O Leurosine O CH 2'-Oxovinblastin CH Các chất N-Oxydvinblastin, 2’-Oxovinblastin 3’, 4’-epoxyvinblastin (Leurosin) tạo thành từ hợp chất trung gian imnium có mặt dư lượng lớn tác nhân oxy hóa Đây nguyên nhân trực tiếp hạn chế khả nâng cao hiệu suất tới 30 % quy trình one-pot tổng hợp Vinblastin giới [22, 27 – 31, 35] 61 Tóm lại, lượng 100 ml H2O2 30 % tối ưu để sử dụng phản ứng ghép đôi mMol vindolin với mMol catharanthin, hiệu suất tạo thành vinblastin đạt 25% 3.4.2 Ảnh hưởng tốc độ cung cấp H2O2 đến hiệu suất tạo thành vinblastin Điều kiện phản ứng: - Chất phản ứng: + Vindolin: 456 mg (1mM); + Catharanthin: 336 mg (1mM); - Dung dịch đệm axít citric 0,1M/axít clohydric 0,1M: 100ml; - Tác nhân oxy hóa H2O2 30%: nhỏ giọt 30 phút; - Xúc tác oxy hóa: FeCl3 15%: 100ml nhỏ giọt 30 phút; - Nhiệt độ thực phản ứng oxy hóa ghép đôi: ÷ - 50C; - Tác nhân khử hóa NaBH4 0,1 % metanol: 100 ml; - Nhiệt độ thực phản ứng khử hóa: - 200C; - Thời gian phản ứng tổng cộng: Thời gian nhỏ giọt hết 100ml H2O2 30% (phút) Hiệu suất tạo VLB (%) Hiêu suât VLB (%) 10 20 20 30 25 45 23 60 18 30 25 20 15 10 0 10 20 30 40 50 60 Thoi gian câp H2O2 30% (phut) Hình 3.4.b: Ảnh hưởng thời gian cung cấp H2O2 đến hiệu suất tạo VLB 62 Khi khảo sát ảnh hưởng tốc độ cung cấp H2O2 đến hiệu suất tạo thành vinblastin, thấy hợp chất trung gian iminium tạo thành cần khử hóa với tác nhân khử NaBH4 để chuyển thành dạng trung gian 3’,4’-anhydrovinblastin bền vững hơn, sau hợp chất tiếp tục bị hydro hóa oxy hóa với có mặt đồng thời NaBH4, ion Fe3+ muối citrat để tạo thành vinblastin Khi cung cấp ạt tác nhân oxy hóa với thời gian ngắn, hiệu suất tạo vinblastin thấp xảy tượng oxy hóa hợp chất trung gian iminium (tương tự trường hợp dư tác nhân oxy hóa) Nếu kéo dài thời gian cung cấp H2O2, FeCl3 thể tính oxy hóa lúc hoàn toàn chưa bị kiềm chế tác nhân khử NaBH4, phản ứng thiên sang hướng tạo thành leurosin hợp chất 2’-oxovinblastin gây giảm hiệu suất Như vậy, hiệu suất tạo thành vinblastin đạt cực đại 25% nhỏ giọt hết 100 ml H2O2 30 % 30 phút 63 KẾT LUẬN Với mục đích nghiên cứu quy trình công nghệ bán tổng hợp vinblastin từ vindolin catharanthin Dừa cạn, tiến hành chiết vindolin, catharanthin từ nguyên liệu Dừa cạn tiến hành bán tổng hợp vinblastin Quá trình nghiên cứu cho phép rút số kết sau: Đã chiết xuất thu 49 g “ancaloid tổng” từ kg mẫu nguyên liệu Dừa cạn trồng Hà Nội Đã phân tách ba chất vindolin, catharanthin vinblastin từ “ancaloid tổng” phương sắc ký lỏng trung áp MPLC Đã nghiên cứu thử nghiệm thành công bán tổng hợp vinblastin từ vindolin catharanthin đạt hiệu suất 25% Cấu trúc hợp chất vindolin, catharanthin vinblastin phân tích phương pháp phổ Cộng hưởng từ hạt nhân, Một chiều, Hai chiều, Phổ khối so sánh với tài liệu tham khảo 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [1] Võ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt Nam, Nxb Y học, Hà Nội; [2] Đỗ Tất Lợi (1995), Cây thuốc vị thuốc Việt Nam, Nxb KHKT, Hà Nội; [3] Nguyễn Văn Đàn cộng (1970), Dược học, 1970 (4), 10; [4] Phạm Thanh Kỳ cộng (1995), Dược học, 1995 (5), 2; [5] Trần Nguyên Hữu cộng (1997), Dược học, 1997 (5), 22; [6] Trần Nguyên Hữu cộng (1999), Báo cáo kết Đề tài Khoa học Công nghệ Bộ Y tế KY 02-03¸ Xn Dược phẩm TW2; [7] Trần Bạch Dương cộng (2001), Tạp chí Hóa học, 39 (3), 83; 39 (4), 90; (2002), Tạp chí Hóa học, 40 (2), 53; [8] Mai Ngọc Chúc cộng (2005), Tạp chí Hóa học, 43 (5A), 112; [9] (1985), Các phương pháp sắc ký, NXB Khoa học Kỹ thuật; [10] Nguyễn Đình Triệu (1999), Các phương pháp vật lý ứng dụng hóa học, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội; [11] Nguyễn Văn Đàn (1985), Các phương pháp nghiên cứu hóa học thuốc, NXB Y học TPHCM; Tiếng Anh [12] R.L Noble et al (1959), Biochem Pharmacol., 1959, 347; [13] I.S Johnson et al (1959), J Lab Clin Med., 54, 830; [14] G.H Svoboda et al (1962), J Pharm Sci., 51, 707; [15] S Tatsuya et al (2006), Chem Pharm Bull., 54, 665; [16] J.M Pezzuto et al (1994), J Nat Prod., 57, 1517; [17] M.R Zaragoza et al (1995), Med Pediatr Onco., 24 (1), 61; [18] M.P Michelagnoli et al (1997), Br J Haematology, 99, 364; [19] A.S Baldwin et al (1997), Use of NF-κB inhibition in combination therapy for cancer, US Patent 6,831,057; 65 [20] A.D Kinghorn (1985), A phytochemical approach to bioscreening of natural products, in Drug Bioscreening: Fundamentals of Drug Evaluation Techniques in Pharmacology, [21] G.H Svoboda et al (1975), The phytochemistry and pharmacol of Catharanthus roseus (L.) G Don., in The catharanthus roseus Alkaloids, I.W Tayler and N.R Farnsworth eds., New York, Marcel Dekker; [22] N.R Farnsworth et al (1990), The role of ethnopharmacology in drug development, in Bioactive Compounds from Plants, D.J Chadwick and J Mars eds., Wiley, New York; [23] J.-H Renault et al (1999), J Chromatogr A, 849, 421; [24] W.E Jones (1976), Dimeric indole alkaloid purification process, US Patent 3,932,417; [25] K Jovanovics et al (1979), Process for the isolation of alkaloid components from the plant C roseus, US Patent 4,172,077; [26] A.E Goodbody et al (1989), Extraction of alkaloids of Catharanthus roseus tissue, US Patent 4,831,133; [27] P Mangeney et al (1979), Tetrahedron, 35, 2175; [28] P Mangeney et al (1979), J Chem Soc., 101, 2243; [29] J.P Kutney et al (1981), Method for producing dimer alkaloids, US Patent 4,279,817; [30] P Potier et al (1988), Process for the preparation of bis-indolic compounds, US Patent 4,737,586; [31] P Magnus et al (1992), J Am Chem Soc., 114, 10232; [32] N Sakamoto et al (1989): a/ Method for the preparation of 3’,4’-anhydroviblastine, EP 0569043; b/ Process for the preparation of binary indol alkaloids, US Patent 5,432,579; [33] M.E Kuehne et al (1991), J Org Chem., 1991 (56), 513; 66 [34] M.E Kuehne et al (2002), Biochemistry, 2002 (41), 14010; [35] A Verma et al (2007), Molecules, 2007 (12), 1307; [36] Phan Dinh Chau et al (1990), Heterocycles, 31 (7), 1183; [37] Mai Ngoc Tam et al (1994), J Org Chem., 1994 (59), 5810; [38] V.T.Jr DeVita et al (1970), Ann Intern Med., 73, 881; [39] Mai Ngoc Tam et al (1998), The Ninth ASIAN Symposium on Medicina plants, Spices and other Natural products, 24 - 28 September, Hanoi, Vietnam, 1998, MO5A, 127; PC8, 257; [40] Tran Bach Duong et al (1998), The Ninth ASIAN Symposium on Medicina plants, Spices and other Natural products, 24 - 28 September, Hanoi, Vietnam, 1998, PA2, 148; [41] J Am Chem Soc (1973),95, p.4990; [42] J Org Chem (1991), 56, p.1689; [43] Tetrahedron (1990), 46, p.1711; [44] a) Helv Chim Acta (1976), 59, p.2437; b) Helv Chim Acta (1976), 58, p.1560; [45] J Nat Prod (1970), 60, p.1125; 67 MỤC LỤC MỞ ĐẦU PHẦN TỔNG QUAN 1.1 Vài nét Dừa cạn Catharanthus roseus (L.) G Donn Vinblastin 1.1.1 Giới thiệu Dừa cạn 1.1.1.1 Mô tả 1.1.1.2 Phân bố thu hái 1.1.1.3 Công dụng 1.1.1.4 Thành phần hoá học 1.1.2 Vinblastin 1.1.2.1 Tên, công thức 1.1.2.2 Tính chất vật lý 1.1.2.3 Tác dụng dược lý 1.2 Các nghiên cứu công nghệ chiết xuất bán tổng hợp giới 12 1.2.1 Một số vinca ancaloid 12 1.2.2 Vài nét công nghệ phân lập Vinca ancaloid 14 1.2.3 Vài nét bán tổng hợp Vinblastin 17 1.2.4 Vài nét tình hình nghiên cứu triển khai nước 20 PHẦN THỰC NGHIỆM .23 2.1 Đối tượng nghiên cứu 23 2.2 Phương pháp nghiên cứu 23 2.2.1 Mẫu thực vật .23 2.2.2 Phương pháp chiết xuất 23 2.2.3 Phương pháp sắc ký để nhận biết phân lập hợp chất 24 2.2.3.1 Sắc ký lớp mỏng .24 68 2.2.3.2 Phương pháp sắc ký cột 26 2.2.4 Các phương pháp xác định cấu trúc chất phân lập .28 2.2.4.1 Điểm nóng chảy (mp) .28 2.2.4.2 Phổ hồng ngoại – IR .29 2.2.4.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân – NMRS .29 2.2.4.4 Phổ khối lượng – MS 31 2.2.4.5 Một số phương pháp phân tích khác 32 2.3 Quy trình thực nghiệm 33 2.3.1 Dụng cụ phương pháp nghiên cứu 33 2.3.1.1 Dụng cụ thiết bị 33 2.3.1.2 Phương pháp sắc ký 33 2.3.1.3 Dung môi hóa chất 34 2.3.2 Chiết tách tinh chế hợp chất từ Dừa cạn 34 2.3.2.1 Quy trình chiết xuất tách Vinca ancaloid từ Dừa cạn 34 2.3.2.2 Chiết “ancaloid tổng số” từ Dừa cạn 34 2.3.2.3 Tách Vinca ancaloid từ “ancaloid tổng số” .37 2.3.3 Bán tổng hợp vinblastin từ vindolin catharanthin 40 2.3.3.1 Tiến hành 40 2.3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng lượng H2O2 tới hiệu suất tạo vinblastin 41 2.3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng tốc độ cung cấp H2O2 tới hiệu suất tạo vinblastin .42 2.3.4 Các đặc trưng hóa lý phổ hợp chất phân lập 43 2.3.4.1 Hợp chất V2 43 2.3.4.2 Hợp chất V23 44 2.3.4.3 Hợp chất V37 45 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47 3.1 Hợp chất V2 47 3.2 Hợp chất V23 50 69 3.3 Hợp chất V37 52 3.4 Bán tổng hợp vinblastin 57 3.4.1 Ảnh hưởng lượng H2O2 đến hiệu suất tạo vinblastin .59 3.4.2 Ảnh hưởng tốc độ cung cấp H2O2 đến hiệu suất tạo thành vinblastin .61 KẾT LUẬN 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 ... Chiết tách phân lập vindolin, catharanthin từ Dừa cạn Catharanthus roseus (L.) G Donn - Nghiên cứu bán tổng hợp vinblastin từ vindolin catharanthin 4 PHẦN TỔNG QUAN 1.1 Vài nét Dừa cạn Catharanthus... thuốc, tận dụng phụ phẩm vindolin, catharanthin Vinca ancaloid khác, nghiên cứu bán tổng hợp vinblastin dẫn xuất từ vindolin catharanthin phát triển mạnh mẽ đưa vào áp dụng giới từ cuối năm 1970 [27... dụng triển khai quy trình bán tổng hợp vinblastin từ vindolin catharanthin có Dừa cạn cần thiết Thực điều tận dụng hiệu hoạt chất, giảm giá thành thuốc ung thư máu chiết suất từ Dừa cạn mà góp