Nghiên cứu hoàn thiện và ứng dụng kỹ thuật đánh giá tác động hoạt hóa in vitro tế bào lympho người của một số chế phẩm sinh học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - HOÀNG THỊ HUYỀN TRANG NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN VÀ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG HOẠT HÓA IN VITRO TẾ BÀO LYMPHO NGƢỜI CỦA MỘT SỐ CHẾ PHẨM SINH HỌC Chuyên ngành: Công nghệ sinh học LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Lê Văn Đông GS.TS Đặng Thị Thu Hà Nội – Năm 2012 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Hoàng Thị Huyền Trang LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn kết nghiên cứu thân thực với cộng tác đồng nghiệp Những số liệu kết trình bày luận văn hoàn toàn trung thực, khách quan không vi phạm quyền tác giả khác Học viên Hoàng Thị Huyền Trang Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Hoàng Thị Huyền Trang LỜI CẢM ƠN Trước tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.BS Lê Văn Đông, phó chủ nhiệm môn Miễn dịch, Học viện Quân Y, GS.TS Đặng Thị Thu – Giảng viên cao cấp - Viện Công Nghệ sinh học & Công Nghệ Thực Phẩm -Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội tận tình hướng dẫn, góp ý động viên tạo điều kiện thuận lợi sở vật chất, phòng thí nghiệm cho trình thực luận văn tốt nghiệp Trong trình thực tập thực đề tài phòng thí nghiệm, nhận hướng dẫn giúp đỡ nhiệt tình Ths Đỗ Minh Trung toàn thể cán nhân viên phòng thí nghiệm miễn dịch - Trung tâm nghiên cứu ứng dụng sinh y dược học, Học viện Quân Y, muốn gửi lời cảm ơn chân thành giúp đỡ quý báu Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến Viện Công nghệ sinh học & Công Nghệ Thực Phẩm, Viện đào tạo sau đại học – Đại học Bách Khoa Hà Nội, đặc biệt thầy, cô giáo dạy dỗ bảo nhiều kiến thức kinh nghiệm quý báu trình học tập giúp hoàn thành luận văn Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp quan công tác Khoa Vi sinh Y học, Bệnh viện 103 bên cạnh động viên, chia sẻ khó khăn tạo điều kiện thuận lợi giúp hoàn thành khóa học thực tốt luận văn tốt nghiệp Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2012 Học viên Hoàng Thị Huyền Trang Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Hoàng Thị Huyền Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN AIDS APC ARN Acid Deoxyribo Nucleic Acquired Immune Deficiency Syndrome Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải Antigen Prensenting Cell Tế bào trình diện kháng nguyên Acid Ribonucleic CMI Cell Mediated Immunity Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào CD Cluster of Differentiation Cụm biệt hóa CSF Colony stimulating factor Yếu tố kích thích tạo colony tế bào (bào lạc) CSIF DMSO ĐƯMD FCS FDA GM-CSF HIV Cytokine synthesis inhibitor factor Yếu tố ức chế tổng hợp cytokine Dimethyl Sulphoxide Đáp ứng miễn dịch Fetal bovine serum Huyết bê bào thai Food and Drug Administration Cục quản lý dược phẩm thực phẩm Mỹ Granulocyte monocyte colony stimulating factor Yếu tố kích thích tạo colony bạch cầu hạt đơn nhân Human immunodeficiency virus Virus gây suy giảm miễn dịch người IFN Human leukocyte antigen Kháng nguyên bạch cầu người (hay kháng nguyên hòa hợp mô người) Interferon IL IL-2 Interleukin Interleukin HLA Luận văn thạc sĩ kỹ thuật IL-2R Ig KN LGL LAK MHC MIF MAF M NK PBS PBMC PE PHA RBC SIg S Tc Th Hoàng Thị Huyền Trang Interleukin-2 receptor Thụ thể Interleukin-2 Immunoglobulin Kháng nguyên Large granular lymphocyte Tế bào lympho có hạt lớn Lymphokine-activated killer Tế bào giết hoạt hóa lymphokine Major Histocompatibility complex Phức hợp hòa hợp tổ chức chủ yếu Macrophage inhibition factor Yếu tố ức chế đại thực bào Macrophage activation factor Yếu tố hoạt hóa đại thực bào Mitosis Nguyên phân Natural killer cell Tế bào giết tự nhiên Phosphate Buffered Saline Peripheral blood mononuclear cells Tế bào đơn nhân máu ngoại vi Polyetylen Phytohaemagglutinin Red blood cell Tế bào hồng cầu Surface immunoglobulin Globulin miễn dịch bề mặt Synthesis Tổng hợp Cytotoxic T cell Tế bào T độc Helper T cell Tế bào T hỗ trợ Luận văn thạc sĩ kỹ thuật TDTH TCR TIL TNF Hoàng Thị Huyền Trang Delayed type hypersensitivity T cell Tế bào T mẫn muộn T cell receptor Thụ thể tế bào T Tumour Infitrating lymphocytes Tế bào lympho thâm nhiễm vào khối u Tumor necrosis factor Yếu tố hoại tử u Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Hoàng Thị Huyền Trang DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Thành phần môi trường nuôi tế bào 32 Bảng 3.1: Đáp ứng tế bào với nồng độ Interleukin-2 khác Việt Nam sản xuất 54 Bảng 3.2: Đáp ứng tế bào với nồng độ Interleukin-2 khác Trung Quốc sản xuất 55 Bảng 3.3: Nồng độ cytokine tạo thành dịch nuôi cấy tế bào thời điểm khác 60 Bảng 3.4: Biến đổi nồng độ cytokine tế bào lympho Th1 có nồng độ thay đổi 63 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Hoàng Thị Huyền Trang DANH MỤC CÁC HÌNH VỄ, ĐỒ THỊ Hình 1.1: Tế bào lympho tế bào máu khác Hình 1.2: Tế bào lympho nhuộm phương pháp Wright Hình 1.3: Các tế bào máu cấu trúc hệ miễn dịch Hình 1.4: Nguồn gốc trình tuần hoàn của tế bào lympho thể Hình 1.5: Sơ đồ Venn tóm tắt số đáp ứng miễn dịch điều chỉnh cytokin 13 Hình 1.6: Biểu đồ tổng quan chu kỳ tế bào 15 Hình 1.7: Cấu trúc tinh thể interleukin 21 Hình 1.8: Sơ đồ chuyển hóa MTT 29 Hình 2.1: Sơ đồ tổng quát quy trình đánh giá tác dụng hoạt hóa tế bào lympho người chế phẩm sinh học kỹ thuật MTT 38 Hình 3.1: Ảnh hưởng chất thị đỏ phenol 43 Hình 3.2: Hình thái tế bào sau thời điểm nuôi cấy 44 Hình 3.3: Sự thay đôi hình thái tế bào 45 Hình 3.4: Kết nhuộm Giemsa hình thái tế bào đáp ứng với Interleukin-2 (IL-2) chất kích thích phân bào PHA 46 Hình 3.5: Kết nghiên cứu so sánh IL-2 Trung Quốc bổ sung 2% PHA 49 Hình 3.6: Đáp ứng tế bào với nồng độ PHA khác 50 Hình 3.7: Sự tạo thành tinh thể formazan tế bào lympho 52 Hình 3.8: Hoạt tính gây đổi mầu chất MTT 52 Hình 3.9: Đáp ứng tế bào với nồng độ IL-2 khác 56 Hình 3.10: Đáp ứng tế bào theo thời gian bảo quản chế phẩm IL-2 58 Hình 3.11: Nồng độ cytokine tạo thành dịch nuôi cấy tế bào 61 Hình 3.12: Nồng độ cytokine tạo thành dịch nuôi cấy tế bào bổ sung IL-2 62 Hình 3.13: Biến đổi nồng độ cytokine tế bào lympho Th1 có nồng độ thay đổi 64 Hình 3.14: Biến đổi nồng độ cytokine tế bào lympho Th2 có thay đổi nồng độ 65 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Hoàng Thị Huyền Trang MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VỄ, ĐỒ THỊ MỞ ĐẦU CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 TẾ BÀO LYMPHO 1.2 ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI TẾ BÀO LYMPHO 1.3 CÁC LOẠI TẾ BÀO LYMPHO 1.3.1 Tế bào lympho B 1.3.2 Tế bào lympho T 1.3.2.1 Nguồn gốc, đặc điểm 1.3.2.2 Chức lympho bào T 1.3.3 Tế bào giết tự nhiên (Natural Killer: NK) 11 1.4 CYTOKINE 11 1.4.1 Tính chất chung 11 1.4.2 Chức sinh học 14 1.4.3 Cơ chế hoạt động 14 1.4.4 Vai trò hoạt hóa tế bào lympho cytokine 14 1.4.4.1 Sự hoạt hoá tế bào lympho T 15 1.4.4.2 Sự hoạt hoá tế bào lympho B 16 1.4.5 Phân loại cytokine 16 1.4.5.1 Phân loại theo cấu trúc 16 1.4.5.2 Phân loại theo chức 17 1.4.6 Một số cytokine 17 1.4.6.1 Interleukin (IL-1) 17 1.4.6.2 Interleukin 10 (IL-10) 18 1.4.6.3 Interleukin 13 (IL-13) 18 1.4.6.4 Các interferon (IFN) 19 1.4.6.5 Các yếu tố hoại tử u (TNF: Tumor necrosis factors) 20 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Hoàng Thị Huyền Trang 1.4.7 Ứng dụng cytokine điều trị 20 1.5 INTERLEUKIN 21 1.5.1 Sự tạo thành interleukin 21 1.5.2 Tính chất interleukin 22 1.5.3 Chức miễn dịch 23 1.5.4 Sử dụng interleukin (IL-2) điều trị lâm sàng 24 1.6 CÁC PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HOẠT HÓA TẾ BÀO LYMPHO NGƢỜI CỦA CHẾ PHẨM SINH HỌC 27 1.6.1 Kỹ thuật đánh giá khả tồn tế bào 27 1.6.2 Kỹ thuật đo hợp nucleotide phóng xạ 28 1.6.3 Kỹ thuật MTT 29 CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1 VẬT LIỆU 31 2.1.1 Đối tượng 31 2.1.2 Vật liệu 31 2.1.3 Hóa chất môi trường 31 2.1.4 Thiết bị máy móc 32 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.2.1 Phương pháp tách tế bào lympho 33 2.2.2 Phương pháp nhuộm đếm tế bào xanh trypan 34 2.2.3 Phương pháp nuôi cấy tế bào 35 2.2.4 Thử nghiệm tăng sinh tế bào lympho in vitro chế phẩm sinh học interleukin tái tổ hợp 35 2.2.5 Phương pháp nhuộm Giemsa 36 2.2.6 Kỹ thuật MTT 37 2.2.7 Thử nghiệm chế tiết cytokin thứ cấp 38 2.2.8 Phương pháp phân tích số liệu 41 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 42 3.1 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM TĂNG SINH TẾ BÀO LYMPHO IN VITRO 42 3.1.1 Xác định ảnh hưởng chất thị đỏ phenol 42 3.1.2 Kết thay đổi hình thái số lượng tế bào theo thời gian nuôi cấy 44 3.1.3 Kết tăng sinh tế bào số hoạt chất sinh học 45 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Hoàng Thị Huyền Trang Bảng 3.3: Nồng độ cytokine tạo thành dịch nuôi cấy tế bào thời điểm khác IL-2* IL-4 IL-5 IL-10 IL-12 IL- GM- * * * * 13* CSF* IFN-γ* TNF-α* 0h 20,27 0,2 2,43 1,65 2,56 2,49 0,83 0,25 6,33 Chứng 12h 13,067 0,2 2,43 1,65 2,56 2,49 2,107 4,54 15,9 âm 24h 16,67 0,2 2,43 1,65 2,56 2,49 1,38 0,25 8,2 48h 13,25 0,2 2,43 1,65 2,56 2,49 3,151 0,25 6,33 0h 9095,3 0,2 2,43 1,65 2,56 2,49 5,56 40,44 3,64 12h 10111 0,267 2,61 98,34 2,97 19,44 215,59 3682 24h 11200 5,04 92,71 427,34 69,56 30,14 2462,24 6535,6 48h 11922 0,42 16,43 265,16 31,88 41 604,46 430,63 0h 11130 0,2 2,43 1,65 2,56 2,49 6,68 33,04 2,54 12h 11005 0,59 3,36 88,98 2,56 4,12 16,05 127,53 4200,2 24h 12597 0,32 3,66 140,09 2,56 5,367 20,08 176,59 1126,58 48h 13583 0,82 17,22 171,67 2,56 31,22 31,78 608,57 432,56 0h 20,27 0,2 2,43 1,65 2,56 2,49 1,47 0,25 6,33 Chứng 12h 82,86 3,47 60,47 114,36 6,71 33,38 13,92 103,04 9363,17 dương 24h 74,38 2,32 38,7 143,06 10,19 45,28 14,69 363,6 2098,12 48h 69,036 2,76 151,8 241,18 6,91 330,9 66,2 1612,9 1831,67 IL-2 Việt Nam IL-2 7,57 Trung Quốc (*): pg/ml 60 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Hoàng Thị Huyền Trang (a) Chứng âm Nồng độ (pg/mL) 0h 12h 24h 48h 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 IL-2 IL-4 IL-5 IL-10 IL-12 IL-13 GM-CSF IL-13 GM-CSF IFN-g TNF-a Chứng PHA (b) Nồng độ (pg/mL) 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 IL-2 IL-4 IL-5 IL-10 IL-12 IFN-g TNF-a Hình 3.11: Nồng độ cytokine tạo thành dịch nuôi cấy tế bào (n=8) a) Chứng âm; b) Chứng dương (chứng PHA) Ở mẫu chứng âm, dịch nuôi cấy không thấy xuất cytokine số cytokine thời điểm khảo sát Trong suốt trình nuôi cấy, dịch nuôi cấy tế bào nhóm chứng dương có bổ sung PHA không xuất IL-2 Tuy nhiên PHA kích thích sinh cytokine thứ cấp TNF-α, IFN-γ, IL-10 IL-13 Bản thân PHA không kích thích sinh IL-2 thứ cấp chứng tỏ chế tác động PHA trực tiếp lên tế bào không thông qua IL-2 61 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Hoàng Thị Huyền Trang IL-2 Việt Nam Nồng độ (pg/mL) 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 IL-2 IL-4 IL-5 IL-10 IL-12 IL-13 GM-CSF IFN-g TNF-a IL-13 GM-CSF IFN-g TNF-a IL-2 Trung Quốc Nồng độ (pg/mL) 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 IL-2 IL-4 IL-5 IL-10 IL-12 Hình 3.12: Nồng độ cytokine tạo thành dịch nuôi cấy tế bào bổ sung IL-2 (n=8) Ở giếng bổ sung IL-2 vào môi trường nuôi cấy tế bào, IL-2 kích thích sinh IL-2 thứ cấp Cả hai chế phẩm IL-2 Việt Nam Trung Quốc kích thích tăng dần nồng độ IL-2 dịch nuôi cấy theo thời điểm từ đến 48 Kết cho thấy, IL-2 có tác động lên tế bào lympho tiết kích thích tế bào lympho tiết loại cytokine thứ cấp khác 62 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Hoàng Thị Huyền Trang Bảng 3.4: Biến đổi nồng độ cytokine tế bào lympho Th1 có nồng độ thay đổi (n = 8) Chứng âm IL-2 Việt Nam IL-2 Trung Quốc Chứng dương 0h 20,27 9095,3 11130 20,27 IL-2 12h 13,067 10111 11005 82,86 (pg/ml) 24h 16,67 11200 12597 74,38 48h 13,25 11922 13583 69,036 0h 1,65 1,65 1,65 1,65 IL-10 12h 1,65 98,34 88,98 114,36 (pg/ml) 24h 1,65 427,34 140,09 143,06 48h 1,65 265,16 171,67 241,18 0h 0,25 40,44 33,04 0,25 IFN-γ 12h 4,54 215,59 127,53 103,04 (pg/ml) 24h 0,25 2462,24 176,59 363,6 48h 0,25 604,46 608,57 1612,9 0h 6,33 3,64 2,54 6,33 TNF-α 12h 15,9 3682 4200,2 9363,17 (pg/ml) 24h 8,2 6535,6 1126,58 2098,12 48h 6,33 430,63 432,56 1831,67 0h 2,49 2,49 2,49 2,49 IL-13 12h 2,49 2,97 4,12 33,38 (pg/ml) 24h 2,49 69,56 5,367 45,28 48h 2,49 31,88 31,22 330,9 63 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Hoàng Thị Huyền Trang Biến động nồng độ TNF-a (a) Nồng độ (pg/mL) 10000 8000 Chứng âm 6000 IL-2 VN 4000 IL-2 TQ Chứng PHA 2000 0h 12h 24h 48h Biến động nồng độ IL-2 (b) Nồng độ (pg/mL) 16000 14000 12000 10000 Chứng âm IL-2 VN 8000 IL-2 TQ 6000 Chứng PHA 4000 2000 0h 12h 24h 48h Biến động nồng độ IFN-g (c) Nồng độ (pg/mL) 3000 2500 Chứng âm 2000 IL-2 VN 1500 IL-2 TQ 1000 Chứng PHA 500 0h 12h 24h 48h Hình 3.13: Biến đổi nồng độ cytokine tế bào lympho Th1 có nồng độ thay đổi (n = 8) 64 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Nồng độ (pg/mL) (d) Hoàng Thị Huyền Trang Biến động nồng độ IL-10 450 400 350 300 250 200 150 100 50 Chứng âm IL-2 VN IL-2 TQ Chứng PHA 0h 12h (e) 24h 48h Biến động nồng độ IL-13 Nồng độ (pg/mL) 350.00 300.00 250.00 Chứng âm 200.00 IL-2 VN 150.00 IL-2 TQ 100.00 Chứng PHA 50.00 0.00 0h 12h 24h 48h Hình 3.14: Biến đổi nồng độ cytokine tế bào lympho Th2 có thay đổi nồng độ (n = 8) Khi quan sát biến đổi nồng độ cytokine có nồng độ thay đổi hình 3.13 3.14, nhận thấy: Ở nhóm kích thích IL-2 Việt Nam, nồng độ IL-2 sản xuất tăng từ 9095 pg/ml lên 11923 pg/mL Nồng độ IL-2 nhóm kích thích IL-2 Trung Quốc sản xuất tăng từ 11130 pg/mL lên 13584 pg/mL Ngoài IL-2 kích thích sinh cytokine thứ cấp khác TNF-α, IFN-γ, IL-10 IL-13, động sinh cytokine tế bào lympho Th1 IL-2, TNF-α IFN-γ mạnh 65 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Hoàng Thị Huyền Trang so với hai cytokine tế bào Th2 IL-10 IL-13 Điều chứng tỏ tác dụng sinh lý từ IL-2 Ở nhóm chứng dương (PHA), số cytokine thứ cấp PHA kích thích sinh giống IL-2 kích thích sinh TFN- α mạnh (9363 pg/mL), cao hẳn so với tác động IL-2 Bên cạnh PHA kích thích sinh cytokine khác tế bào Th2 IL-13 mạnh so với kích thích IL-2 Điều giải thích PHA hoạt động siêu kháng nguyên có tác động lên tế bào Th1 Th2 Kết cho thấy: Sử dụng kít thương phẩm Bio-Rad với kháng thể đơn dòng đặc hiệu với IL-2 có phát IL-2 tái tổ hợp Việt Nam sản xuất IL-2 tái tổ hợp Trung Quốc sản xuất Điều cho phép tái khẳng định cấu trúc, sản phẩm IL-2 tái tổ hợp Việt Nam sản xuất có cấu trúc IL-2 Nồng độ khối lượng IL-2 tương ứng với nồng độ tính theo hoạt tính 2.500 IU/mL IL-2 Việt Nam sản xuất 9095 pg/mL (xấp xỉ pg/IU) IL-2 Trung Quốc sản xuất 11130 pg/mL (xấp xỉ 4,4 pg/IU) cho thấy mức hoạt tính/nồng độ hai chế phẩm gần tương đương nhau, IL-2 Việt Nam sản xuất có phần mạnh Điều có yếu tố trình sản xuất cách tính liều UI sở khác sử dụng dòng tế bào khác thực sản phẩm IL-2 Việt Nam sản xuất có hoạt tính mạnh Điều cần có nghiên cứu kỹ trước đưa kết luận khác biệt Hình ảnh định lượng cytokine cho kết rõ nét IL-2 Việt Nam Trung Quốc sản xuất cho hình ảnh giống nhau, chứng tỏ hai sản phẩm có hoạt tính phương thức tác dụng tương tự Những kết thu cho thấy việc nuôi cấy quần thể tế bào môi trường có IL-2 có khả làm tăng hoạt hóa tế bào làm giảm độ hoạt hóa chúng Đồng thời, tế bào thu nhận có khả sản xuất lượng lớn cytokine IL-2 thứ cấp, TNF-α IFN-γ, IL-10 IL-13 Điều cho thấy, khả sử dụng IL-2 có khả kích thích tế bào tạo cytokine có vai trò quan trọng chống viêm, ung thư 66 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Hoàng Thị Huyền Trang KẾT LUẬN 1) Đã xây dựng tối ưu hóa quy trình đánh giá hoạt động hoạt hóa, tăng sinh in vitro tế bào lympho người gồm kỹ thuật: - Nuôi cấy tế bào lympho - Đánh giá mức độ hoạt hóa tế bào thông qua khảo sát hoạt động chế tiết cytokine tế bào - Đánh giá mức độ chuyển dạng qua phân tích hình thái vi thể tế bào - Đánh giá mức độ tăng sinh tế bào thử nghiệm MTT 2) Kết ứng dụng đánh giá hoạt tính sinh học IL-2 tái tổ hợp người Việt Nam sản xuất lên tế bào lympho người in vitro cho thấy: - IL-2 tái tổ hợp sản xuất Việt Nam có tác dụng kích thích hoạt hoá tăng sinh tế bào lympho người in vitro Mức hoạt tính chế phẩm pg/IU - Dưới tác động kích thích IL-2 tái tổ hợp sản xuất Việt Nam, tế bào hoạt hoá tiết thêm IL-2 cytokine thứ cấp khác TNF-, IFN-, IL-10 IL-13 Tác động tăng cytokine IL-2, TNF- IFN- tế bào lympho Th1, chứng tỏ IL-2 tái tổ hợp có hoạt tính sinh học tương tự IL-2 tự nhiên - IL-2 tái tổ hợp sản xuất Việt Nam IL-2 tái tổ hợp thương phẩm Trung Quốc sản xuất có phương thức tác dụng kích thích hoạt hoá tăng sinh tế bào lympho người in vitro tương tự 67 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Hoàng Thị Huyền Trang TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Bộ môn Miễn dịch - Học viện Quân Y (20110, NXB Quân đội Nhân Dân, Hà Nội Đỗ Khắc Đại, Lê Văn Đông, CS (2007), Kết xét nghiệm đồng thời cytokine dịch màng phổi bệnh nhân ung thư lao phổi công nghệ flowcytometry-assisted immunoasay., Tạp chí y dược học quân sự, 5, 32, 17-23, 2007 Đặng Thị Hoàng Oanh, Đoàn Nhật Phương (2007), Giáo trình Miễn dịch học động vật thủy sản, Trường ĐH Cần Thơ, Khoa Thủy sản, p36 Đỗ Thị Thảo, Đỗ Thị Phương, Vũ Minh Đức, Đặng Trần Hoàn, Trương Nam Hải (2007), ‗Xác định hoạt tính sinh học Interleikin-2 (IL-2) tái tổ hợp phép thử sinh học tế bào CTLL2‖, Tạp chí Công nghệ Sinh học 5(2): 157-161, 2007 Phạm Văn Ty_Miễn dịch học_đại học quốc gia hà nội TIẾNG ANH Abbas AK and Lichtman AH (2003) Cellular and Molecular Immunology (5th ed.) Saunders, Philadelphia ISBN 0-7216-0008-5 Ahlberg R, MacNamara B, et al., (2003) Stimulation of T-cell cytokine production and NK-cell function by IL-2, IFN-alpha and histamine treatment during remission of non-Hodgkin's lymphoma Hematol J 2003;4(5):336-41 A.von Rohrt and N Thatcher ―CLINICAL APPLICATIONS OF INTERLEUKIN-2‖, Progress in Growth Facmr Research Vol 4, pp 229-246, 1992 68 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Hoàng Thị Huyền Trang Beadling C, Johnson KW, Smith KA (1993) "Isolation of interleukin 2induced immediate-early genes" Proc Nat Acad Sci U.S.A 90 (7): 2719–2723 doi:10.1073/pnas.90.7.2719.PMC 46167 PMID 7681987 10 Beadling CB, Smith KA (2002) "DNA array analysis of interleukin-2regulated immediate/early genes" Med Immunol (1): doi:10.1186/1476-9433-1-2 PMC 149405.PMID 12459040 11 Cantrell DA, Smith KA (1984) "The interleukin-2 T-cell system: a new cell growth model‖ Science 224 (4655): 1312–1316 doi:10.1126/science.6427923 PMID 6427923 12 Cell Proliferation and Viability Measurement, BIOCHEMICA, NO.3, 2003 13 Douglas D Richman, Richard J.Whitley, Frederick G Hayden, ―Clinical Virology‖ Secound edition 14 Entrez Gene: IL10 interleukin 10 15 Elias A Said et al 2009, PD-1 Induced IL10 Production by Monocytes Impairs T-cell Activation in a Reversible Fashion Nature Medicine 2010; 452-9 16 Eskdale J, Kube D, Tesch H, Gallagher G (1997) "Mapping of the human IL10 gene and further characterization of the 5' flanking sequence" Immunogenetics 46 (2): 120 - DOI : 10.1007 / s002510050250 PMID 9162098 17 Francois Denizot* and Rita Lang (1986) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Modiffications to the tetrazolium dye procedure giving improved sénitivity and reliability Journal of immunological methods 89 (1986): 271-277 18 Fransen L, Müller R, Marmenout A, Tavernier J, Van der Heyden J, Kawashima E, Chollet A, Tizard R, Van Heuverswyn H, Van Vliet A (June 1985) "Molecular cloning of mouse tumour necrosis factor cDNA and its eukaryotic expression" Nucleic Acids Res 13 (12): 4417 – 29 DOI:10.1093/nar/13.12.4417.PMC 321797 PMID 2989794 69 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Hoàng Thị Huyền Trang 19 Fan ChungCA ―Anti-ìnlammatory cytokines in asthma and allergy: interleukin-10, interleukin 12, interferon-γ‖ Mediators of Inflammation, 10, 51–59 (2001) 20 Gilman A, Goodman LS, Hardman JG, Limbird LE (2001) Goodman & Gilman's the pharmacological basis of therapeutics New York: McGrawHill ISBN 0-07-135469-7 21 Gillis S, Ferm M, Ou W, Smith KA (1978) "T cell growth factor: Parameters of production and a quantitative microassay for activity" J Immunol 120 (6): 2027–32 PMID 307029 22 Glenn J Lawlor Jr., M.D., E.Richard Stiehm, M.D., Michael S Kaplan, M.D.,Dharmendra P.S Sengar, Ph.D., Paul I Terasaki, Ph.D Phytohemagglutinin (PHA) skin test in the diagnosis of cellular immunodeficiency Journal of Allergy and Clinical Immunology Volume 52, Issue 1, July 1973, Pages 31–37 23 Gordon J, Maclean LD (1965) "A Lymphocyte-stimulating Factor produced in vitro" Nature – 208 (5012): 795 of lymphocytes 796 doi:10.1038/208795a0 PMID 4223737 24 G Ocklind (2011) phytohemagglutinin Stimulation (PHA) in a human new ultra-microtest by plate Immunobiology Volume 171, Issues 4–5, July 1986, Pages 339–344 25 Gray PW, Goeddel DV (August 1982) "Structure of the human immune interferon gene" Nature 298 (5877): 859 63 doi:10.1038/298859a0 PMID 6180322 26 Howard M.shapiro (2003) ―Practical flow cytometry- Fourth Edition‖ Nhà xuất John Wiley& son 27 Ishiyama, M., Y Miyazono, K Sasamoto, Y Ohkura, and K Ueno (1997) A highly water-soluble disulfonated tetrazolium salt as a chromogenic indicator for NADH as well as cell viability Talanta 44:1299–1305 70 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Hoàng Thị Huyền Trang 28 Kumar, Abbas, Fausto Pathologic Basis of Disease (7th ed.) 29 Kriegler M, Perez C, DeFay K, Albert I, Lu SD (April 1988) "A novel form of TNF/cachectin is a cell surface cytotoxic transmembrane protein: ramifications for the complex physiology of TNF" Cell 53 (1): 45– 53 DOI:10.1016/0092-8674(88)90486-2 PMID 3349526 30 Kasakura S, Lowenstein L (1965) "A factor stimulating DNA synthesis derived from the medium of leukocyte cultures" Nature 208 (5012): 794–795 doi:10.1038/208794a0 PMID 5868897 31 K ASADULLAH, W STERRY, AND H D VOLK ―Interleukin-10 Therapy—Review of a New Approach‖ Pharmacol Rev 55:241–269, 2003 32 Martin A Giedlin and Robert J Zimmerman ―The use of recombinant human interleukin -2 in treating infectious diseases‖, Curent opinion in biotectnology 1993, 4:722-726 33 Minty A, Chalon P, Derocq JM, Dumont X, Guillemot JC, Kaghad M, Labit C, Leplatois P, Liauzun P, Miloux B (March 1993) "Interleukin-13 is a new human lymphokine regulating inflammatory and immune responses" Nature 362 (6417): 248–50 doi:10.1038/362248a0 PMID 8096327 34 McKenzie AN, Culpepper JA, de Waal Malefyt R, Brière F, Punnonen J, Aversa G, Sato A, Dang W, Cocks BG, Menon S (April 1993) "Interleukin 13, a T-cell-derived cytokine that regulates human monocyte and B-cell function" Proc Natl Acad Sci U.S.A 90 (8): 3735-9 doi:10.1073/pnas.90.8.3735 PMC 46376 PMID 8097324 35 Morgan JG, Dolganov GM, Robbins SE, Hinton LM, Lovett M (October 1992) "The selective isolation of novel cDNAs encoded by the regions surrounding the human interleukin and genes".Nucleic Acids Res 20 (19): 5173–9 doi:10.1093/nar/20.19.5173 PMC 334302 PMID 1408833 71 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Hoàng Thị Huyền Trang 36 Mosmann T (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays Journal of immunological methods 65 (1-2): 55–63 37 Morgan MM, Clayton CC, Heinricher MM (2004) "Dissociation of hyperalgesia from fever following intracerebroventricular administration of interleukin-1beta in the rat" Brain Res 1022 (1-2): 96–100 DOI:10.1016/j.brainres.2004.06.063 PMID 15353218 38 Robb R, Smith KA (1981) "Heterogeneity of human T-cell growth factor(s) due to variable glycosylation" Mol Immunol 18 (12): 1087– 1094 doi:10.1016/0161-5890(81)90024-9.PMID 6977702 39 Robb RJ, Munck A, Smith KA (1981) "T cell growth factor receptors Quantitation, specificity, and biological relevance" J Exp Med 154 (5): 1455–1474 doi:10.1084/jem.154.5.1455.PMC 2186509 PMID 6975347 40 Sakaguchi S, Sakaguchi N, Asano M, Itoh M, Toda M (1995) "Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25) Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases" J Immunol 155(3): 1151–64 PMID 7636184 41 Smith KA, Favata MF, Oroszlan S (1983) "Production and characterization of monoclonal antibodies to human interleukin 2: strategy and tactics" J Immunol 131 (4): 1808–15.PMID 6352804 42 Smith KA(1988)."Interleukin-2: inception, impact, and implications".Science.240(4856):1169-1176.doi:10.1126/science 3131876.PMID 3131876 43 Smith KA, Lachman LB, Oppenheim JJ, Favata MF (1980) "The functional relationship of the interleukins" J Exp Med 151 (6): 1551– 1556 doi:10.1084/jem.151.6.1551.PMC 2185867 PMID 6770028 72 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Hoàng Thị Huyền Trang 44 Smith KA, Gilbride KJ, Favata MF (1980) "Lymphocyte activating factor promotes T-cell growth factor production by cloned murine lymphoma cells" Nature 287 (5785): 853 - 855 doi:10.1038/287853a0 PMID 6776414 45 Stern J, Smith KA (1986) "Interleukin-2 induction of T-cell G1 progression and c-myb expression" Science 233 (4760): 203– 206 doi:10.1126/science.3523754 PMID 3523754 46 Shil, Maurice E.; Shike, Moshe; Ross, A Catharine; Caballero, Benjamin; Cousins, Robert J (2006) Modern Nutrition in Health and Disease, 10th Lippincott Williams & Wilkins 47 Taniguchi T, Matsui H, Fujita T, Takaoka C, Kashima N, Yoshimoto R, Hamuro J (1983) "Structure and expression of a cloned cDNA for human interleukin-2" Nature 302 (5906): 305–310 doi:10.1038/302305a0 PMID 6403867 48 Thornton AM, Shevach EM (1998) "CD4+CD25+ immunoregulatory T cells suppress polyclonal T cell activation in vitro by inhibiting interleukin production" J.Exp Med 188 (2): 287–296 doi:10.1084/jem.188.2.287 PMC 2212461 PMID 9670041 49 Thornton AM, Donovan EE, Piccirillo CA, Shevach EM (2004) "Cutting edge: IL-2 is critically required for the in vitro activation of CD4+CD25+ T cell suppressor function" J Immunol 172(11): 6519–23 PMID 15153463 50 Waldmann TA (2006) "The biology of interleukin-2 and interleukin-15: implications for cancer therapy and vaccine design" Nature Rev Immun (8): 595–601 doi:10.1038/nri1901.PMID 16868550 51 Waldmann TA, Tagaya Y (1999) "The multifaceted regulation of interleukin15 expression and the role of this cytokine in NK cell differentiation and host response to intracellular pathogens".Annu Rev Immunol.17:19- 49 doi:10.1146/annurev.immunol.17.1.19.PMID 10358752 52 Wang H, Zhou M, Brand J, Huang L (2007) "Inflammation Activates the Interferon Signaling Pathways in Taste Bud Cells" Neurosci 27 (40): 10703– 73 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Hoàng Thị Huyền Trang 10713.DOI:10.1523/JNEUROSCI.310207.2007 PMC 2096741 PMID 17913 904 53 Waltenbaugh C, Doan T, Melvold R, Viselli S (2008) Immunology Philadelphia: Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins p 68 ISBN 0-7817-9543-5 54 Wynn TA (2003) "IL-13 effector functions" Annu Rev Immunol 21: 425–56 doi:10.1146/annurev.immunol.21.120601.141142 PMID 12615888 TRANG WEB 55 http://www.abbeycolor.com/phenol-red.php 56 http://media.wiley.com/CurrentProtocols/0471161314/0471161314sampleUnit.pdf 57 http://www.tudienykhoa.net/l/1462-lymphocyte.html 58 http://www.medfriendly.com/lymphocyte.html 59 http://www.benhhoc.com/content/1422-Cytokine.html 60 http://en.wikipedia.org/wiki/Cytokine 61 http://vi.wikipedia.org/wiki/Chukytebao 1-14,16-20,22-40,42-43,47-48,51,53-55,57,59-60,63,66- 74 ... trình đánh giá hoạt động hoạt hóa, tăng sinh in vitro tế bào lympho người - Ứng dụng quy trình sử dụng đánh giá hoạt tính sinh học Interleukin-2 tái tổ hợp người Việt Nam sản xuất lên tế bào lympho. .. sĩ kỹ thuật Hoàng Thị Huyền Trang Từ sở thực tiễn lý luận trên, tiến hành đề tài: Nghiên cứu hoàn thiện ứng dụng kỹ thuật đánh giá tác động hoạt hóa in vitro tế bào lympho người số chế phẩm sinh. .. tổ hợp người nghiên cứu sản xuất nghiên cứu xác định hoạt tính sinh học tế bào [4] Tuy nhiên chế phẩm mới, cần phải đánh hoạt tính sinh học sản phẩm tế bào lympho người trước đưa vào sử dụng Luận