Nghiên cứu bệnh nấm do histoplasma trên bệnh nhân nhiễm trùng phổi tại một số bệnh viện ở hà nội

LỜI CAM ĐOAN T i i i g g Th Ng Th , h gh Si h h h h Phong M h h h g h Th g gh Thực phẩ , T i ựh g TS BS H ố hi ghi g g ố h h i ghi –h g gh Si h h , Vi g ih h h h h g g h hoa H N i h g Th Thu Hà PGS.TS.T ố i , g h gQ ố g ự g hự h T gi Dương Thị Ngọc Thúy i LỜI CẢM ƠN ut t T ị Thu Hà – Tr PGS TS Tr N t k o V k uẩ Quố P o – Tr Cứu V P át Tr ể Cô Nộ T ởv p t v ô u t qu ọ k ã ọ r t ô v tro u k ô Họ ỉ ảo k ệs Dị T í ệS dẫ t V ệ Vệ S p N ô ã tậ t s us ệ Tễ Tru Prot o Tr ọ ệ ệp phòng Vi k uẩ ặc b ệt - K o V K uẩ – V ệ Vệ s Cô N ệS ệt t Họ - p ọ r t ịv Họ ỉ ảo qu tro ệT E uậ v t ô N Tr ị v Dị tễ Tru Cứu V P át Tr ể k ã ệ ả k o uậ tạ p t ô ọ áo V ệ Cô K o H Nộ ệ ã ả ọ qu ả uô sát t ả suốt T o k cp ẩ K o H Nộ N suốt t Cuố o t ọ v Cô em tro tạ Tru pv Qu S v uộ số Từ v E Cả v uậ v áu k ô t K o H ộ t ả tro ả t suốt tr Ư s Trung Tâm Họ ã uô qu t ứ qu TS S Hoàng ộ v ột v tốt v t t qu t t ả N k k ể t ả Họ v D H Nộ – 2016 ii T ịN ọ T t ể MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ vii DANH MỤC HÌNH ẢNH viii MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NẤM 11 L h g Vi ấ h ấ Histoplasma capsulatum 1.2.1 M ố ặ i 1.2.2 i ấ 14 i ấ H.capsulatum .7 ễ ệ Histoplasma 10 h h â iề g 10 hò g h ễh h H h ấ 1.3.3 M h 1232 K ả 1.3.2 ặ hi g gâ Co 131 H.capsulatum Error! Bookmark not defined ề h g g Kh 13 Histoplasma capsulatum h ấ g h 1.4.1 hẩ hi h ấ Hi i 12 hổi (Hi i ) 13 g g hẩ Histoplasma capsulatum 14 lâm sàng 16 1.4.2 N i ấ 16 1.4.3 H h h h 17 1.4.4 Ph g h P R g (Ne e –PCR) 18 1.4.5 Ph g h gi i h ự ge 19 iii CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 ối 2.1 g ghi 211 h hẩ 21 h 2.1.2 g 2.2 Y 2.3 V g 21 ghi i 21 21 2.3.1 H hấ 2.3.2 T g hi 2.4 Ph 21 g h i g g ghi g g ghi g ghi 21 24 25 2.4.1 Thi ghi 25 2.4.2 Kỹ h ghi 26 2.4.2.1 L ẫu 2.4.2.2 X ệ 2.4.2.3 Nuô ảo v vậ u ể 26 p ẩ 27 28 2.4.2.4 N uộ Gr 29 2.4.2.5 P p áp tá 2.4.2.6 P p áp ELISA 30 2.4.2.7 P p áp PCR 2.4.2.8 T sạ t ADN 29 (N st d-PCR) 32 sả p ẩ PCR v ả tr t 34 CHƯƠNG 3: KẾT QỦA VÀ BÀN LUẬN 36 3.1 Th h h hẩ 36 3.2 N i ấ 3.3 K h g H.capsulatum ELISA hâ h h hẩ 38 h hâ hiễ ù g hổi i ố h i H N i 41 3.4 K g gi i g h g h P R g h h ẩ Hi i h ự ge 46 iv KẾT LUẬN 51 KIẾN NGHỊ 52 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC 58 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid Deoxyribonucleic ATP Adenosine Triphosphate AIDS Acquired Immunodeficiency Syndrome BSL3 Phòng thí nghi m an toàn sinh h c m bp e i ( i z ) BHI Brain Heart Infusion (d ch chi t não tim) Chl Chloramphenicol dNTP Deoxynucleoside Triphosphase ELISA Enzym-linked immunosorbent assay H.capsulatum Histoplasma capsulatum HT Huy t HIV Human immunodeficiency virus KN Kháng nguyên NIHE National Institute of Hygiene and Epidemiology (Vi n V sinh D ch tễ T NIID g g) National Institute of Infection Disease ( Vi n nghiên c u b nh nhiễm trùng Nh t B n) PCR Polymerase Chain Reaction PBS Phosphate buffered saline RPM Rounds per minute (Tố ly tâm vòng/ phút) vi DANH MỤC BẢNG Nội Dung Tên g 1: h gi , h g ghi i Trang ố h hằ h hi g h g g 15 g H capsulatum h hẩ g 1: ặ i g h h g P R ổ h hi 22 H.capsulatum g 1: ặ i i h hâ ghi hiễ H.capsulatum ố h 37 iH N i g 2: K hẩ â g h h ề h hâ 38 hiễ g 3: Thố g ố i h gi g 4: S h i g ầ 38 ghi ELISA i g 5: S h hi â h g g hó h hâ 43 g h g h g g g ghi 50 DANH MỤC SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ Nội Dung Tên Trang S 1: Q h h g h ghi h hâ S 2: Q h h g h ghi i S 3: Q h i 1: K hiễ i ề hâ ELISA hâ hA N h h ELISA hâ g h 25 h h h h ù g hổi ằ g Hi 25 h hâ 29 41 Se e ™ i i 2: K ố he i 3: Tỷ hiễ H.capsulatum hâ he i 3.4: Tỷ hiễ H.capsulatum hâ he gi i vii hó ghề ghi hó 44 ổi h 45 45 DANH MỤC HÌNH ẢNH Tên Nôi Dung Hình 1.1: S e Hình 1.2: H.capsulatum g ố g Hình 1.3: H.capsulatum g e Hình 1.4: H h h Hình 1.6: i g ấ Tổ h hiễ hi X- h h ó h g i h hi h ấ H.capsulatum â h hi i hổi i ẽ ằ g 370C hi g, T g ố ề Hình 1.7: i ấ H.capsulatum gâ g i H.capsulatum g hiễ Hình 1.5: Trang i hó ố ầ i 10 ắ g ố hâ 13 Á Hình 1.8: S h thống máy gi i trình tự tự ng trình tự c a gen 20 h ẩ 27 hi i n di mao qu n Hình 2.1: H h Hình 2.2: Q h Hình 3.1: M h hẩ h Hình 3.2: ghi h )N Hình 3.3: Kh ẩ Hình 3.4: K t qu he i h 32 hổi g VQ â h ố ELISA h i ấ ) Ả h hi h hẩ i g 36 103 g H.capsulatum i H.capsulatum 39 g H.capsulatum hâ ố h hâ AI S PCR l ng v i cặp m i g H.capsulatum 39 ặc hi u phát hi n h â g 46 i g Hình 3.5: Kh h h h g h h g h P R g i A N 47 g H.capsulatum Hình 3.6: Kh Hình 3.7: Mi h h ặ hi h h ự P R hâ viii h g i ge 48 h ẩ 49 MỞ ĐẦU Hi i h ấ i ấ (H capsulatum)-là hiề ỡ g h h, gâ h gi i hâ hi , ặ h h ầ ấ- i i h i ố g g h h g i ,h h , g h hổi hi i hẩ ắ ó ấ hiề h hi H capsulatum ự, h g h h g h h g h g g g ặ g Hi i Mỹ, h g ũ g i g hẩ hiề i h g 95% h i ố i h h h i ũ g iễ h ,I h g gh hi ghi hi g h i h h , h hâ [5,15,28] N i ấ nh.T g hi e ) ó h h g h i hh hâ kháng nguyên M H h gi i e i ,M â g, iề H capsulatum hi , ghi â i h Ohi [13,19,39] M [6,13,33,41] T h h g ấ i ấ , ù g gie i i g h ẩ vàng hẩ h hấ h h â gi H capsulatum Ph hâ Á h : Ấ Nh g h ( iễ g g Mi i i , hò g h h M g i ổ h i - ELISA, i h h i ặ hi i h h ố h h h h , h gi Ng i h h h HIV, hiễm AIDS) [8,29,33] ghi h g g h hi N hiễ histoplasmosis h h hh , h g h ó h ự g h i [22,23,24] Mắ h h i hữ g g hò g hấ , ó hiề ghi h i, vong [14,21,25] Hi i h hành hẩ Vi g, gẩ gh g iễ h g Hi ũ, h hi , hữ g i gự g h , ấ gh h g T h hiễ : i g g hó hẩ h hấ i i h h h g g h M g ấ hi h, h ig h h hổi ặ g, ( i ởi Histoplasma capsulatum h h ấ g h h hâ gâ g i h h hấ ố hâ gh i , Th i L , Si g pore, h ự h T i Vi N h ý , h iễ h hi , h g hâ , hi Vi N , h g h h hâ g i h h , hẩ h h gó hầ â V hiễ h ỷ h hẩ h h g h â g h ấ â i hiễ , ùng nhanh, ầ hi h g hẩ Histoplasma hẩ g y, i h ghi ấ ghi hẩ h g hỉ ối g , gi g g g, hặ h i h ù g h hữ g ý h giố g h g hỉ ằ g i g ự h gh g h ò â g hi ó i ó h, ũ g h , i g g hi hh ặ ự hh h h ghi H capsulatum ự i h 2008, h i i h hi t da [27].V h h h ù g hổi ấ g ố ề B h i n Ch ó h lâm sàng không coi H capsulatum h hiễ ó hiề g ố hấ g ó h histoplasmosis ấ i ầ h hấ , h , g hi hò g h i h ghi ghi , h g h h h hự , g i iề h h h i ghi h hẩ , ề i ghi h i i h h : “Nghiên cứu bệnh nấm Histoplasma bệnh nhân nhiễm trùng phổi số bệnh viện Hà Nội” M i ề i: X h ỉ i ố X h i h ự ó ( g g g h h N i h g ằ g hự g g h h i , h ự h hiễ ù g hổi h hh g H capsulatum g h hâ h hẩ h i g h hâ ố i h H N i) Ứ g h hổi ởH N i ằ g h ặ i g h ấ hành h ge h h g h i g h ghi i ấ i hh ực H capsulatum gâ hẩ iề ghi h i g h ấ h hi hổi, ó h :L h hâ h ghi h h ghi g ũ g 34 Rosely M.Z.O, Errol R., Timothy J Lott., el al (1999) Molecular Cloning, Characterization, and Expression of the M antigen of Histoplasma capsulatum Infect Immun, 67(4), pp 1947-1953 35 Ryosuke K., Fumihiko T., Atsusi A., et al (2009) First case report of histoplasmosis in a Cat in Japan J Vet Med Sci, 71(12), pp 1669-1672 36 Swartzentruber S., Rhodes L., Kurkjian K., et al (2010) Diagnosis of Acute Pulmonary Histoplasmosis by Antigen Detection CID, 49, pp 1879-1882 37 Stobierski M.G., et al (1996) Outbreak of histoplasmosis among Employees in a Paper Factory-Michigan, 1993 J Clin Microbiol, 34(5), pp 1220-1223 38 Vail G.M., et al (2002) Cellular immune response in HIV-infected patients with histoplasmosis J Acquir Immune Defic Syndr, 29, pp 49-53 39 Wheat L.J and Kauffman C.A (2003) Histoplasmosis Infect Dis Clin North Am, 17(1), pp 1-19, vii 40 Wheat L.J., Garringer T., Brizendine., Conolly E (2002) Diagnosis of histoplasmosis by antigen detection based upon experience at the histoplasmosis reference laboratory Diagn Microbiol Infect Dis, 43 41 Wang T.L, et al (1996).Histoplasmosis in some Asian countries Tropical Medicine and International Health, 1, pp 35-42 57 PHỤ LỤC Trình tự ADN trình tự axit amin háng nguyên M Chú thích: Cá u tố TATA CAAG T+ k ố C v Vị trí oạ I tro ờv oạ 318 p s ể t ị t odo k t t trá vị trí C uỗ p pt d k 58 o d ậ ể t ị u (1-40) p ả ậ PHỤ LỤC Quy trình tách chiết ADN từ mẫu dịch rửa phổi với sinh phẩm QIAamp® DNA mini kit (QIA gen, Đức) 1: M h hổi i h h h i hỉ h ằ g ổ ml ấ 20 µ (he i g ắ hẹ 4: H h 5: eK h ắ w 10 giâ e e v â 6: Ti h h ặ ỏ ổi, e eppendorf 1.5 gi i) e 56oC 1-3h ằ g hi ối (96%-100%) Dùng máy 70 oC/ 10 phút g 15 giâ i g h hở hầ 200µ 200 µ h h h ấ hẹ 350 ò g / h i h h g ổ g ei ), â ù g H g 200 µ AL ( 2: Nhỏ i 3: S i ý g e) ó g i e 8000 h e i e2 â ó g 8000 ( ẩ g1 h 500 µ AW1 ( g h 1) g3 h ổ hầ h i e Nhỏ 500 µ AW2 ( g h 2).Ly tâm 8000 rpm phút 7: ổ hầ 8: ỏ e e h hầ i e f 1,5 ỏ hầ i â h R i e e ( ó i 8000 hầ i Nhỏ h hò g h 9: e e 100 µ AE ( â 8000 g g1 ( ó g h g h ) gi i) e hi g1 h ), hầ h h A N h h gP R L 20 o ý: ADN nê hự hi giữ o hự hi 48 gi 59 h gP R g g ấ ở- PHỤ LỤC Quy trình tách chiết ADN từ mẫu ất với sinh phẩm PowerSoil™ DNA Isolation it (MOBIO) 1: i ) 600 hi (he i g 2:Lấ 0,25g ấ h ắ (High h (600 ) ee ) g 10 h 4: e e 5: h 400µ µ hi ắ g e â hầ ối hẹ g e ó ẵ ), ắ ee ấ h hẹ i ắ h ằ g e f2 ù g Th h 40 / h i e 250 S , g2 h hầ ổi g h i i ắ hẹ g o máy ly tâm 13000 rpm phút 600 µ g e g 10 giâ 13000 e h e ó ổi h 2, ắ â 6: h e (P we g 3:Nhỏ 60µ i h ee e f2 i Th g 10 giâ 200 µ h 40C/ e phút.Ly tâm 13000 rpm phút 7: h 750 µ g B 8:H hầ h 4, ắ 675 µ hỗ hi h e eppendorf2 g1 h h g i Th 1200 µ hẹ 10 giâ hở 13000 9: ổ ổi hầ ổ â e h h i fi e ( ó ẵ ), e hầ hở i e, i i â ặ i i tube Thêm 500 µl dung dich C5, ly tâm 13000 rpm/ 30 giây 10:S hi g L â i ), â 11: ỏ i h ẩ 100 µ h g g h h i e2 ( g ấ g â g 13000 rpm/ 30 giây , hầ A N ó h o g, hấ h h ấ 4o hự hi hự hi 48 gi 60 h e A N h gP R g g h gP R ấ -20 PHỤ LỤC THƯỜNG QUY VẬN CHUYỂN MẪU BỆNH PHẨM Mã số : SOP.VC-0309 N i thực : …………………… 42 Mục ích Thự hi g i h h h i hh g hi WHO, NIHE 43 Các dụng cụ vật liệu cần thiết - H h h ( he - Gi , h , h - Giấ Nh - h ẩ ự g h (ù g - i h ỡ ù NIHE WHO) h ố g, i ầ u hấ g - h hẩ h ẩ : h 70% h ặ i h ( hiề i h hẩ ), h h i h h h i e 10%; 5% (N LO) g ó ) 44 Tiến hành Vậ  u ể iề iề i - i h h hẩ , hò g ghi i, h ẩ p , i h ó g gói + M h 15 – 20oC g  Ti t u t ập hi N i ẫu từ h t í ệ (PTN) hổi h h hẩ h ề hò g h giữ g ố g ghi , ghi g h h PTN h h ầ g iề i h 15 – 20oC ó g gói h hẩ : h hẩ ằ g giấ ffi h ặ i i ghi 61 hự , ó ắ ó hó Ghi h Nắ g i ố g +L 1: H hự ó ắ ố N giấ LO 10%) h ẩ giấ ) Ghi h +L hấ gh ẩ ẩ g (L ý: N hấ g i 2: H , h 3: H g/ h ặ h hẩ , g h Phầ ầ ù G i g g g, ó ắ g h g i , h ặ i h h g h g hấ hù g hự , h g g h g h h g L h ự g ig i( /h ặ ó h g he 70% h ặ h g ò gh i h , g h h ẩ ( h hẩ ằ g giấ +L Ố g ghi h h i hấ h hự g hấ h , h i gi h hầ g i h Ghi h hi h ) hi h h hẩ : +S g h g i , e gi ( ó hữ ý), he : õi h h g i he i g h i gi , hi h g i Vi báo cáo Ghi h , +H ữ g i + h , ATSH h ặ g â ự hò g ỉ h ó ự ố 3.2 Vậ u ể ẫu tro h hẩ h ặ h hự k uv h i PTN: h ó ắ 62 ằ g gi / h , gh i PHỤ LỤC (Cá ẫu p ud o ứu) Biểu mẫu PHIẾU THU THẬP MẪU TRÊN NGƯỜI WS-BPH-H15 A Hành : H h hân : M ố h hâ : Gi i h: h : Nữ Nam Ngày sinh: hỉ: Ng i T h h ấ : Nghề ghi L u : ố v : ệ + Th i gi ởk uv i i + Th i gi i ô t ô : i/ ngày : g( g)/ g : B Tiền sử thông tin iều trị : Ng ắ Tiề h 11 Th ố iề 13 Th ố ó i h g h hi h h: 10 T i 12 T i ầ h iề g hi i hi g i h i i hi : i ấ : : i: 63 i : C Mẫu xét nghiệm 14 M : 15 M h hổi : 16 M 17 Ng : gi ấ ml M ố: ml M ố: ml M ố: : 18 Ghi : N Ng ời giao ý (Ghi õ h t 201 Ng ời nhận ý ) (Ghi õ h 64 ) Biểu mẫu PHIẾU THU THẬP MẪU Ở MÔI TRƯỜNG WS-BPE-H15 A Phần cho cán y tế Mã số nghiên cứu : Họ tên ng ời lấy mẫu: Ngày lấy mẫu: Địa iểm lấy mẫu B Phần thông tin mẫu Khu vực thu thập mẫu: Nh h g i gi Quanh h ự Kh h i ự ầ i gi ầ Khác Loại bệnh phẩm: ấ + phân gà ấ + hâ ấ + hâ i N hi h i Số l ợng mẫu: N Ng ời giao ý (Ghi õ h t 201 Ng ời nhận ý ) (Ghi õ h 65 ) Biểu mẫu PHIẾU VẬN CHUYỂN MẪU/BỆNH PHẨM WS-VC-H15 A Mã số nghiên cứu: Ngày chuyển: B Thông tin mẫu Lo i m u: Số ng: C Giấy cho phép chuyển mẫu: D N i chuyển mẫu a chỉ: Ng i chuy n: E Điều kiện vận chuyển Ph g i n: H p ch a: Nhi : F N i nhận mẫu a chỉ: Ng i nh n: G Ghi chú: * ối v i mẫu chuyể t o thêm th tục c u ệ u qu ệ tro c r u ển hàng N Ng ời giao ý (Ghi õ h c c n có t 201 Ng ời nhận ý ) (Ghi õ h 66 ) Biểu mẫu MẪU THỰC HIỆN KỸ THUẬT PCR WS-PCR-H15 A Phần thông tin M ố ghi M ố Ng ý Ng i hự hi Ngày h hẩ N i hự hi B Tiến hành Hóa chất sử dụng Số l ợng Tên Hãng sản xuất Lô/thời hạn sử dụng/ngày nhận/sử dụng 10X PCR buffer dNTPs M i i M i g H2O-RNA free ADN khuôn Th h g e TBE 0.5X Marker Loading dye SYBR® safe DNA stain Chuẩn bị hóa chất, sinh phẩm 2.1 Chuẩn bị Mix Thành phần Thể tích p/ứ (µl) 10X PCR buffer 67 Số p/ứ (n) Dụng cụ sử dụng dNTPs M i i M i g Taq H2O-RNA free ADN khuôn Tổng số S hi 25 i , hi ố g ghi , ỗi ố g ghi m 20 µ i thêm µ 2.2 Thạch chạy iện di, thuốc nhuộm, dung dịch chạy iện di Thành phần Th h i Thể tích Dụng cụ sử dụng i SYBR® safe DNA stain g h h i i Chu trình nhiệt Nhiệt ộ Thời gian Chạy PCR Các b ớc tiến hành Đánh giá Pha mix Chia mix T Spindown h ố g mix vào máy PCR h ẩ Nhỏ Chu ỳ ge hẩ P R ge 68 Dụng cụ sử dụng h Nh h i i ge ge Kết C h H h D ố□ Kh g ố □ h: Phân tích ết phản ứng: 69 Biểu mẫu MẪU THỰC HIỆN KỸ THUẬT ELISA WS-ELISA-H15 A Phần thông tin M ố ghi M ố Ng ý Ng i hự hi Ngày h hẩ N i hự hi B Tiến hành S mẫu A Blank M B Chứng âm M C Cut-off M D Cut-off E Chứng d F M G M H M 3 ng Hóa chất, sinh phẩm sử dụng Lô/thời hạn sử Số l ợng Tên Hãng sản xuất dụng/ngày nhận/sử dụng Phi gắ h g g g h h h g t g h gh 70 g h hấ g h hi g i h g h h gâ h g g h g -off g Chuẩn bị dung dịch ệm, hóa chất Thành phần g Thể tích Dụng cụ sử dụng h h gh g h nh h hi Thao tác Các b ớc tiến hành Ph g Đánh giá thao tác (1:101) Nhỏ h g Pipet, tube hi Pipet Ủ hi R T ấ hi Nhỏ (3 ầ ) gh Nhỏ e Pipet T ấ hi (3 ầ ) g h RT M hấ Pipet Ủ hi Nhỏ RT M Ủ hi R Dụng cu sử dụng T ấ g h g RT Pipet M C Ghi D Nhận inh ết 71 ELISA ... h h h hự , g i iề h h h i ghi h hẩ , ề i ghi h i i h h : Nghiên cứu bệnh nấm Histoplasma bệnh nhân nhiễm trùng phổi số bệnh viện Hà Nội M i ề i: X h ỉ i ố X h i h ự ó ( g g g h h N i h g ằ... marneffei doVi n nghiên c u b nh truyền nhiễm Quốc gia, Tokyo, Nh t B n cung cấp Y ức nghiên cứu 2.2 Nghi T h g g 2.3 H i g Y i h h Vi V i h h ễ g Vật liệu 2.3.1 Hoá chất môi tr ờng sử dụng nghiên cứu. .. h ó hiề i h g h giố g h Histoplasma capsulatum h ù g i hi Kỳ [13,19] i gh g hó, g ó h i h è , gự , h â sàng i [35] 1.2 Vi nấm Histoplasma capsulatum 1.2.1 Một số ặc iểm nấm H capsulatum  Hình