phương pháp phát hiện gian lận trong sản phẩm thịt

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM  BÁO CÁO HỌC PHẦN KIỂM ĐỊNH VÀ TRUY XUẤT NGUỒN GỐC THỰC PHẨM Đề tài: PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN GIAN LẬN TRONG SẢN PHẨM THỊT Hà Nội, 04/2017 Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm MỤC LỤC pg Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm Danh mục bảng pg Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm PHẦN I: TỔNG QUAN 1.1 Sơ lược thịt thịt chế biến 1.1.1 Giới thiệu sơ lược thịt Thịt thực phẩm mô số loài động vật bò, lợn, gà, dùng làm thực phẩm cho người Thịt thực phẩm có nhiều dạng chế biến đưa tiêu thụ ướp lạnh, hun khói, đóng hộp, phổ biến thịt tươi Thịt thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, thịt động vật máu nóng thịt lợn , thịt bò ,thịt gia cầm …có chứa nhiều acid amin cần thiết ,các chất béo, chất khoáng , vitamin Thịt loại nói chung nghèo canxi , giàu photpho Các thành phần phụ thuộc vào loài thú, tuổi, giới tính, mục tiêu sử dụng, phần nuôi dưỡng, mức độ giai đoạn vỗ béo, phận súc thịt thể học Thịt bò chứa nhiều sắt, protein nhóm B, chủ yếu B1 tập trung phần thịt nạc Các vitamin tan chất béo có gan, thận Ngoài gan, thận có nhiều cholesterol photphatit Thịt lợn cung cấp vitamin B tổng hợp nhiều loại thịt khác, giàu kẽm photpho Thịt gia cầm thuộc loại thịt trắng có nhiều protein, lipit, chất khoáng vitamin so với thịt đỏ Do phù hợp cho người ăn kiêng sử dụng lượng chất béo gia cầm so với loại thịt khác cung cấp đủ lượng cho thể Trong công nghiệp thương nghiệp, dựa vào dấu hiệu chức giá trị sử dụng thịt thực phẩm mà người chia chia thành loại mô: Mô cơ, mô mỡ, mô liên kết, mô xương sụn, mô máu Các mô kể tách khỏi nhau, pg Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm không hoàn toàn sử dụng theo ý nghĩa thực phẩm chúng Thịt bò có tỉ lệ mô cao mô mỡ thấp thịt lợn nên thịt bò thường dai Thành phần cấu tạo tính chất mô khác nên đặc tính tỉ lệ số lượng chúng thành phần thịt định tính chất quan trọng, có giá trị thực phẩm thịt 1.1.2 Giới thiệu sơ lược thịt chế biến Thịt chế biến có hai nhóm lớn: thịt chế biến làm thức ăn cho người thịt chế biến làm thức ăn cho gia súc Thịt chế biến làm thức ăn cho người thường chế biến từ mô cơ, mô mỡ Thịt chế biến dùng làm thức ăn gia súc (thường bột thịt) chế biến từ nguồn vật liệu giàu protein khác phụ phế phẩm giết mổ gia súc da, lông, xương, móng nội quan Nguyên liệu chủ yếu để sản xuất thịt sản phẩm từ thịt gia súc ( bò, lợn, dê, cừu…) gia cầm ( gà, vịt, ngan, ngỗng…) Thịt gia súc, gia cầm nguồn nguyên liệu tốt để chế biến thực phẩm, nguyên liệu chủ yếu để sản xuất đồ hộp loại thực phẩm khác Để đa dạng hóa sản phẩm chế biến từ thịt nâng cao giá trị sử dụng thịt chúng phải chế biến thành nhiều dạng sản phẩm khác tùy theo mục tiêu sử dụng Chế biến làm tăng ngon miệng, tăng khả tiêu hóa hấp thụ chất dinh dưỡng từ thịt, hạn chế nhiễm vi sinh vật gây hư hỏng thực phẩm, kéo dài tuổi thọ sản phẩm tăng giá trị sử dụng thịt chế biến Có nhiều phương pháp chế biến thịt cung cấp thực phẩm cho người: phơi khô, ướp muối, lên men, xử lý nhiệt (nấu, hấp, sấy), hun khói Trong phương pháp sử dụng nhiệt độ phổ biến Tùy theo loại sản phẩm mục tiêu sử dụng mà người ta xử lý mức nhiệt độ khác 1.2 Tình hình gian lận thị trường thịt giới Việt Nam Sản phẩm thịt chế biến thường có nguồn gốc từ hay nhiều loại thịt khác Do đa dạng hình thức, chất lượng giá thành sản phẩm thịt chế biến gây vấn đề gian lận thương mại pg Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm Tình hình gian lận thị trường thịt giới Cơ quan tiêu chuẩn thực phẩm (FSA – Food standard Agency) tổ chức nhiều điều tra đối tượng thịt sản phẩm thịt chế biến, kết cho thấy có nhiều sai lệch thành phần thực tế với nhãn hiệu sản phẩm Đặc biệt sản phẩm thịt chế biến gồm nhiều loại thịt gia súc khác nhau, nhà sản xuất thường ghi nhãn sản phẩm loại thịt có giá trị cao tránh ghi loại thịt có giá trị thấp trộn vào sản phẩm Một số trường hợp lại ghi sai tỷ lệ loại thịt Trong đó, khả kiểm soát thành phần loài, độ an toàn chất lượng sản phẩm thịt chế biến thị trường tổ chức ban ngành có liên quan hạn chế Một điều tra khác môn Công Nghệ thực phẩm vệ sinh thực phẩm, trường Thú y, Đại học Ankara (Mỹ) (2006) loại thịt trộn vào sản phẩm thịt tươi thịt chế biến Trên 100 mẫu điều tra, kết 39,2% xúc xích lên men 35,7% xúc xích Ý, 27,2% xúc xích Đức, 22,2% thịt tươi, 6,2% thịt viên có chứa thịt loài động vật không công bố nhãn sản phẩm Cụ thể xúc xích lên men, xúc xích Ý, xúc xích Đức với thành phần ghi nhãn thịt bò kết kiểm tra lại có lẫn thịt gia cầm Các mẫu thịt bò tươi kiểm tra cho thấy dương tính với thịt hươu thịt ngựa Tình hình gian lận thị trường thịt tươi thịt chế biến Việt Nam Ở Việt Nam, tình hình gian lận thương mại sản xuất, tiêu thụ thịt sản phẩm chế biến từ thịt vấn đề nhức nhối nhà quản lý Các hành vi giai lận thể qua nhiều hình thức tinh vi, kể đến thịt trâu, thịt lợn “đội lốt” thịt bò, hay loại thịt chế biến sẵn xúc xích, lạp xưởng trộn lẫn với thành phần không bao bì Theo nhà chức trách, hàng năm có đến hàng trăm nghìn thịt trâu tuồn thị trường tiêu thụ với nhãn mác thịt bò Thịt trâu nhập từ nguồn khác nhau, sau biến thành thịt bò để đưa vào bếp ăn khu công nghiệp Các thùng pg Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm giấy bị bóc vỏ để đầu mối đến lấy hàng dán mác thịt bò vào Theo tờ khai hải quan, kg thịt trâu nhập với giá 40.000 đồng, giá thị trường cân thịt bò 200.000 đồng Mới đây, Viện Kiểm nghiêm An toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia lấy mẫu thịt bò tươi, giò bò, xúc xích bò, nạm bò thịt bò phở để tiến hành kiểm nghiệm Các mẫu lấy ngẫu nhiên chợ, siêu thị quận, huyện địa bàn Hà Nội Kết kiểm nghiệm khiến quan bất ngờ, tình trạng gian lận, dùng thịt lợn lại nói thịt bò phổ biến Cũng theo Viện Kiểm nghiêm An toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia, mẫu thịt bò sống chín vừa nêu dù không thấy nguyên liệu bò thật, lượng thịt bò thấp thấy mùi màu sắc đặc trưng thật, người tiêu dùng dễ nhầm lẫn, khó phân biệt mắt thường qua màu sắc, cảm quan Những năm gần đây, nhờ quân liệt quan quản lý ban ngành liên quan, nhiều hành vi gian lận thị trường thịt bị phát ngăn chặn Tuy nhiên giải pháp triệt để vấn đề khó khăn đặt pg Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm PHẦN II: PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN THỊT 2.1 Các phương pháp phát thịt Việc phát triển ứng dụng phương pháp phát xác nhanh chóng loại thịt sản phẩm chế biến từ thịt gia súc, gia cầm khác nhu cầu cần thiết thị trường xã hội Hiện có nhiều phương pháp khác để giúp nhận biết, phát loại thịt sản phẩm thịt sản phẩm từ thịt Có thể kể đến phương pháp phổ biến sau: 2.1.1 - Điện di : SDS-PAGE, IEF Sắc ký : Khí, lỏng, lỏng cao áp Miễn dịch : AGID, RIA, miễn dịch enzyme ( cạnh tranh, không cạnh tranh) 2.1.2 - Phương pháp dựa vào protein Phương pháp dựa vào DNA Lại DNA Dựa vào PCR + RAPD-PCR + Species-specific PCR : Standard-PCR, Multiplex PCR, Real time PCR, PCRRFLP, PCR-sequencing, PCR-SSCP pg Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm 2.2 Phương pháp phân tích PCR 2.2.1 Giới thiệu phương pháp PCR – polymerase chain reaction: phản ứng chuỗi trùng hợp, dựa đặc tính DNA khả tổng hợp chuỗi DNA polymerase chuỗi khuôn từ mồi bổ sung ban đầu PCR cho phép nhân nhanh gen mong muốn lên hàng triệu lần thời gian ngắn Các thành phần cần có phản ứng PCR:  DNA mẫu (đoạn DNA cần nhân lên) pg Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm  Các mồi xuôi ngược - Primer đoạn oligonucleotit mạch đon, có trình tự bổ sung với trình tự mở đầu hai đầu mạch khuôn để khởi đầu trình tổng hợp DNA Các primer chọn đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với trình tự lặp lại gen, bắt cặp bổ sung primer xuôi primer ngược cấu trúc kẹp tóc bắt cặp bổ sung primer Chiều dài primer tối thiểu cho hầu hết ứng dụng PCR 18 nucleotide (thường 18 – 24 nucleotide)  Enzyme DNA Polymerase: taq polymerase emzym chịu nhiệt sử dụng phổ biến, tách chiết từ vi khuẩn thermus aquticus suối nước nóng Chúng không bị phá hủy nhiệt độ cao xúc tác tổng hợp từ đầu đến cuối trình phản ứng diện Mg2+ Taq DNA polymerase tổng hợp DNA theo hướng 5’-3’ hoạt động tốt 70-72 độ C  Các nucleotit: hỗn hợp loại: A, T, G, C tự  Thiết bị luân nhiệt: máy PCR 2.2.2 Nguyên tắc phản ứng PCR Phản ứng PCR chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp Mỗi chu kỳ gồm giai đoạn: Giai đoạn 1: Giai đoạn biến tính (denaturation) Hai mạch phân tử DNA tách rời thành hai mạch đơn Phân tử DNA biến tính nhiệt độ cao nhiệt độ nóng chảy (Tm) phân tử, thường 94 -950C vòng phút Giai đoạn 2: Giai đoạn ủ bắt cặp (anealing) Nhiệt độ hạ thấp (thấp Tm primer) cho phép primer bắt cặp với khuôn, dao động khoảng 40 – 50 độ Cvà kéo dài từ 30 giây đến phút Giai đoạn 3: Giai đoạn kéo dài Nhiệt độ giai đoạn tăng lên 720C giúp DNA polymerase hoạt động tổng hợp DNA tốt pg 10 Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm Chu kì lặp lại nhiều lần, số chu kỳ phản ứng tùy thuộc số lượng mẫu ban đầu DNA mẫu ban đầu 105 cần khoảng 25 – 30 chu kỳ, DNA mẫu 102 – 103 số chu kỳ phải 35 – 40 2.2.3 Phân tích kết PCR Sản phẩm PCR( đoạn DNA cần khuếch đại) phát phương pháp điện di Nguyên tắc phương pháp điện di dựa vào đặc tính cấu trúc DNA DNA đại phân tử tích điện âm đồng rải khắp bề mặt nên chịu tác động điện trường, chúng dịch chuyển điện cực dương điện trường Sự di chuyển phân tử gel tác động điện trường phụ thuộc vào khối lượng phân tử ( tức nucleotide), nồng độ thành phần gel điện Điện di thực theo phương nằm ngang nằm thẳng đứng Các DNA gel agarose tia tử ngoại UV nhờ chất màu ethidium bromide Chất có khả phát huỳnh quang tác dụng tia UV bước song 300nm thành vạch màu đỏ da cam Để ước lượng kích thước DNA gel agarose, người ta sử dụng yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử, tập hợp nhiều trình tự DNA có kích thước biết pg 11 Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm PHẦN III: NỘI DUNG THÍ NGHIỆM PHÁT HIỆN THỊT 3.1 Vật liệu sử dụng phương pháp PCR phát loại thịt a) Nguồn mẫu tách chiết DNA: mẫu thịt cho thịt bò lấy chợ b) Thiết kế mồi:  Mồi xuôi: thiết kế dựa vào vùng bảo tồn DNA ty thể loại gà, lợn, dê, cừu, bò (matsunaga ctv, 1999), ký hiệu FSIM FSIM: 5’ – GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA – 3’  Các reverse primer: Các reverse primer thiết kế cho loài gia súc dê, gà, cừu, heo, bò dựa trình tự không bảo tồn DNA ty thể, ký hiệu RG (dê), RCh (gà), RS (cừu), RP (heo), RCB (bò) có trình tự sau (Matsunaga ctv, 1999): • RG: 5’ – CTCGACAAATGTGAGTTACAGAGGGA – 3’ • RCh: 5’ – AAGATACAGATGAAGAAGAATGAGGCG – 3’ • RS: 5’ – CTATGAATGCTGTGGCTATTGTCGCA – 3’ • RP: 5’ – GCTGATAGTAGATTTGTGATGACCGTA – 3’ • RCB: 5’ – CTAGAAAAGTGTAAGACCCGTAATATAAG – 3’ c) Hóa chất, thiết bị dụng cụ  Hóa chất tách chiết DNA: Tris HCl, NaCl, SDS, EDTA, protein K, sodium acetate, isoamyl alcohol, phenol, chloroform, ethanol, TE 1X  Hóa chất phản ứng PCR: Taq DNA polymerase 5UI/μl (Promega), dung dịch đệm 10X (Promega), dNTP 25mM (Promega), MgCl2 25 mM (Promega), primer (IDT), nước cất lần (khử ion, hấp vô trùng, chiếu UV, pH 6,8 – 7)  Hóa chất điện di: Agarose, TBE 0,5 X (Tris borate EDTA, pH 8,3), loading dye 6X, ladder 100bp, 200bp, ethidium bromide  Thiết bị dụng cụ: Tủ sấy (Jencons – PLS), water bath (Memmert), autoclave (Tommy), máy cất nước (khử ion) (Branstead), máy ly tâm (Mikro Z2K/Sigma 3K30C), tủ trữ mẫu hóa chất (Reetech, Brandt, Sanyo), máy nghiền mẫu (Model A11, IKA-Đức), máy chụp gel (Biorad), máy luân nhiệt, pg 12 Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm điện di (Biorad), máy đo OD (Hewlett Packard), micropipet, đầu tip, eppendorf, kéo, chày, kẹp 3.2 Phương pháp tiến hành 3.2.1 Lấy bảo quản mẫu • Mua khoảng 500g thịt bò chợ cho vào túi nilon kích thước x • 10 cm, trữ thùng đá, đem phòng thí nghiệm, trữ -70°C Tiến hành kiểm tra xem thịt có phải thịt bò thật không 3.2.2 Tách chiết DNA Để thu nhận DNA tinh sạch, người ta cần loại bỏ thành phần tạp nhiễm, mà quan trọng protein Sự tách chiết dựa nguyên tắc hòa tan khác phân tử khác (nucleic acid/protein) hai pha không hòa tan (phenol, chloroform/nước) • Sau rã đông nhiệt độ phòng, lấy khoảng 0,1g mẫu, dùng chày nghiền nhuyễn mẫu cho vào eppendorf 1,5ml • Cho thêm 60 μl dung dịch đệm tách chiết (50 mM Tris-HCl, 20 mM NaCl, mM EDTA 1% SDS, pH 8) μl dung dịch protease K (20 mg/ml); hỗn hợp ủ 55°C • Sau đó, thêm vào hỗn hợp 375μl nước cất khử ion vô trùng, lắc 30 giây • Cho vào hỗn hợp 200 μl dung dịch hỗn hợp phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1), lắc phút, ly tâm 12000vòng/phút phút 10°C • Lấy phần nước bên chuyển vào eppendorf có sẵn 1ml dung dịch cồn tuyệt đối; trộn đều; ủ -20°C • Ly tâm 12000vòng/phút phút 10°C, phần cặn để nhiệt độ phòng khô hoàn toàn • Rửa cặn 1ml ethanol 70% pg 13 Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm • Sau làm khô cặn tủ ấm 55°C,cho vào ống 200 μl dung dịch TE (Tris TE có vai trò ổn định pH EDTA bắt ion Mg2+ làm cho Dnase khả hoạt động) ủ 55°C để làm tan cặn Sản phẩm DNA sau tách chiết trữ -20°C sử dụng Độ tinh DNA kiểm tra cách đo mật độ quang (OD: optical density) bước sóng 260 nm 280 nm quang phổ kế (model HP 8453) Các mẫu DNA tách chiết có tỷ số OD260nm/OD280nm > 1,6 sử dụng cho PCR Hàm lượng DNA ước lượng theo công thức: DNA (ng/μl) = [62,9*OD260nm – 36*OD280nm]*độ pha loãng 3.2.3 Các yếu tố cần cho phản ứng m- PCR pg 14 Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm Tên hóa chất Nồng độ phản ứng Dung dịch đệm PCR 1X MgCl2 mM mồi xuôi (FSIM) 12 pmol mồi ngược RCB pmol/30μl dNTP 200 μM/mỗi loại Taq 1,25 UI DNA mẫu 100 ng H2O cất Vừa đủ 30μl Bảng 1: Thành phần hóa chất Tiền biến tính Biến tính 94°C phút 94°C phút Bắt cặp Kéo dài Kéo dài cuối 72°C phút 54°C 72°C 45 phút phút Lặp lại 35 chu kỳ Bảng 2: Chu kỳ nhiệt dự kiến phản ứng PCR thịt tươi pg 15 Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm 3.2.4 Kết thí nghiệm Kích thước sản phẩm PCR mẫu: 274 bp giống với kết nghiên cứu SHALLY JAIN công bố công nhận ngày 17 tháng năm 2007 → mẫu mua thịt bò Loài Kích thước sản phẩm PCR Heo 398 bp Cừu 331 bp Bò 274 bp Gà 227 bp Dê 157 bp Bảng 3: Kết nghiên cứu SHALLY JAIN pg 16 Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm PHẦN IV: • KẾT LUẬN Có thể xác định loài số mẫu thịt dựa vào phương pháp multiplex PCR • Đây phương pháp cho kết nhanh mà giá thành rẻ • Tránh gian lận thương mại pg 17 Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm PHẦN V: TÀI LIỆU THAM KHẢO • Trịnh Thị Thanh Huyền, 2007 Phân biệt loại thịt heo, bò, cừu phương pháp multiplex PCR - Khóa luận tốt nghiệp kỹ sư công nghệ sinh học Trường Đại học Nông Lâm TP HCM • Jain S., Brahmbhait M N., Rank D N., Joshi C G and Solank J V., 2007 Use of cytochrome b gene variability in detecting meat species by multiplex PCR assay Indian Journal of Animal Sciences 77 (9): 880-881 • Giáo trình Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm - Nguyễn Thị Minh Tú (chủ biên), Hoàng Quốc Tuấn, Nguyễn Thị Thảo … NXB Bách Khoa Hà Nội, 2016 pg 18 ... vi gian lận thị trường thịt bị phát ngăn chặn Tuy nhiên giải pháp triệt để vấn đề khó khăn đặt pg Kiểm định truy xuất nguồn gốc thực phẩm PHẦN II: PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN THỊT 2.1 Các phương pháp. .. pháp phát thịt Việc phát triển ứng dụng phương pháp phát xác nhanh chóng loại thịt sản phẩm chế biến từ thịt gia súc, gia cầm khác nhu cầu cần thiết thị trường xã hội Hiện có nhiều phương pháp. .. tính với thịt hươu thịt ngựa Tình hình gian lận thị trường thịt tươi thịt chế biến Việt Nam Ở Việt Nam, tình hình gian lận thương mại sản xuất, tiêu thụ thịt sản phẩm chế biến từ thịt vấn đề nhức