NUÔI cấy BAO PHẤN tạo cây đơn bội và đơn bội kép (2)

Khác với sự tạo phôi soma, cung cấp sự nhân giống dòng vô tính của kiểu gen trừ khi tế bào soma biến thể, kết quả phôi giao tử di truyền tạo cây đơn bội trừ khi nhiễm sắc thể tự phát hoặ

NUÔI CẤY BAO PHẤN TẠO CÂY ĐƠN BỘI VÀ ĐƠN BỘI KÉP

Tóm tắt

Cây đơn bội là cây có số lượng nhiễm sắc thể thể giao tử và các cây đơn bội kép

là các cây đơn bội đã bị trùng lặp nhiễm sắc thể Việc tạo ra cây đơn bội và đơn bội kép thông qua sự phát sinh phôi giao tử cho phép tạo ra các dòng đồng hợp tử hoàn toàn từ cha mẹ dị hợp tử, rút ngắn thời gian cần thiết để tạo ra các cây đồng hợp so với các phương pháp nhân giống thông thường sử dụng nhiều thế hệ tự thụ Việc sản xuất cây đơn bội và cây đơn bội kép (DHs) cung cấp một công cụ công nghệ sinh học hấp dẫn đặc biệt và việc phát triển các công nghệ và quy trình nhân giống để sản xuất các cây đồng hợp đã có tác động đáng kể đến các hệ thống nông nghiệp Ngày nay, công nghệ sinh học đại diện cho một phần của các chương trình nhân giống của nhiều cây trồng quan trọng trong nông nghiệp Có một số phương pháp có sẵn để có được cây đơn bội và đơn bội kép (DHs) trong đó nuôi cấy invitro hoặc là hiệu quả nhất và được sử dụng rộng rãi Bài báo này đề cập đến tình trạng hiện tại của kiến thức về sản xuất cây đơn bội và cây đơn bội kép (DHs) thông qua thụ phấn hoa, đặc biệt là nuôi cấy bao phấn

Từ khóa

Nuôi cấy bao phấn, cây đơn bội kép, cây đơn bội, đồng hợp tử, phôi hạt phấn (pollen embrygenis)

Giới thiệu

Cây đơn bội có số lượng NST đơn bội (n thay vì 2n) ,đó là một bộ NST ở thể bào

tử Khi sự phát sinh quá trình nhân đôi nhiễm sắc thể diễn ra, kết quả của quá trình gọi

là đơn bội kép (DH) Trong so sánh, cây đơn bội kép (2n = 2x) là những cây đơn bội thu được từ một thể nhị bội kép (4x) (Kasha và Maluszynsky 2003) Đơn bội xảy ra tự phát ở

tần suất thấp, chúng có thể được gây ra bởi một số phương pháp chẳng hạn như

phương pháp lai, xoá bỏ nhiễm sắc thể, thụ phấn với hạt phấn tia bức xạ ) và bằng nuôi cấy invitro thể giao tử Phát sinh phôi giao tử là một trong những sự khác biệt các

tuyến phôi có trong giới thực vật, và nó bao gồm mật độ của giao tử đực (tiểu bào tử hoặc hạt phấn non) hoặc giao tử cái (noãn) để chuyển đổi không thuận nghịch từ con đường phát triển thụ thể hướng tới một loại bào tử Khác với sự tạo phôi soma, cung cấp sự nhân giống dòng vô tính của kiểu gen (trừ khi tế bào soma biến thể), kết quả phôi giao tử di truyền tạo cây đơn bội (trừ khi nhiễm sắc thể tự phát hoặc gây ra sao chép xảy ra), bởi vì các loại thực vật này có nguồn gốc từ sự tái sinh của giao tử, sản phẩm của phân bào.

Hạt phấn hoặc phôi hạt phấn (hay còn gọi là cơ quan sinh sản đực ) được coi là một trong những tác động nổi bật nhất ví dụ về tế bào gốc (Reynolds 1997), nhưng cũng như một hình thức của lại giống Nó là một sự thích nghi sinh tồn quan trọng cơ chế trong giới thực vật chỉ được thể hiện trong những trường hợp nhất định và như là kết quả của An environmental stress (Bonet và cộng sự, 1998) So với các phương pháp nhân giống thông thường, phôi tạo mạch làm cho việc sản xuất các dòng đồng hợp tử khả thi và rút ngắn thời gian cần thiết để sản xuất dòng như vậy, cho phép sự phát triển đơn bước hoàn toàn đồng hợp tử từ dòng cha mẹ dị hợp tử Phương pháp thông thường thực hiện để đạt được sự đồng hợp tử bao gồm việc thực hiện một số phép lai ngược; Như vậy, chúng tốn nhiều thời gian và khó khăn trong việc thực hiện (Morrison và Evans 1987)

Việc sản xuất cây đơn bội thông qua sự phát sinh phôi giao tử cho mục đích sinh sản đã được nhiều người nghiên cứu nhóm nghiên cứu kể từ những năm 1970 Có

nhiều xuất bản đánh giá về việc sản xuất cây đơn bội và DHs, bao gồm nhóm của

Andersen (2005), Dunwell (2010), Germana`1997, 2006, 2007, 2009), Jain et al (Năm 1996-1997), Kasha1974), Magoon và Khanna (1963), Maluszynski et al.2003a, b), Palmer et al (2005), Seguı`-Simarro và Nuez2008a), Seguı'-Simarro (2010), Smykal (2000), Touraev et al (2009), Zhang et al (1990) và Xu et al (2007) Các kỹ thuật DH

đã được thiết lập tốt trong một các loài cây trồng quan trọng về mặt kinh tế,Ngũ cốc và cải bắp (Wedzony và cộng sự 2009) Sinh nở là kỹ thuật ít ỏi nhất vào thời điểm hiện

tại vì hiệu quả thấp của nó, nhưng nó đã được áp dụng cho các loài mà không đáp ứng với các phương pháp hiệu quả hơn (Forster et al.2007) Khả năng để có được cây đơn bội và DHs là một trong ứng dụng quan trọng nhất của công nghệ sinh học phấn hoa trong nhân giống cây trồng và di truyền, liên quan đến thao tác và lập trình lại sự phát triển của phấn hoa và chức năng(Testillano và cộng sự 2000) Tái tạo từ giao tử đực đã được báo cáo trong hơn 200 loài thuộc các họ Solanaceae, Cruciferae và

Gramineae(Dunwell 1986, Hu and Yang 1986), trong khi nhiều cây họ đậuvà cây thân

gỗ (Sangwan-Norreelet al 1986; Bajaj 1990; Raghavan 1990; Wenzel et al.1995;

Germana`2006, 2009)

Sự phát triển phôi trong phấn hoa thông thường được tạo ra thông qua bao phấn hoặc vi nuôi cấy hạt phấn Nuôi cấy bao phấn là thường là phương pháp được lựa chọn cho sản xuất DH ở nhiều cây trồng vì tính đơn giản của phương pháp tiếp cận cho phép thiết lập và áp dụng nuôi cấy bao phấn các kiểu gen (Sopory và Munshi 1996) Kỹ thuật vi nuôi cấy hạt phấn, được thực hiện bởi loại bỏ các mô mô sẹo, đòi hỏi thiết bị tốt hơn và nhiều kỹ năng hơn so với nuôi cấy huyền phù, mặc dù trước đây cung cấp phương pháp tốt hơn để điều tra tế bào,Sinh lý, sinh hóa và phân tử tham gia vào phôi phấn (Nitsch 1977; ReinertVà Bajaj năm 1977) Pelletier và Ilami (1972) giới

thiệuKhái niệm về "Factor Wall Factor", theo đó các soma các mô của bộ phận bảo vệ bao phấn đóng một vai trò quan trọng trong quá trình cảm ứng các tiểu bào tử trong hạt phấn, với sự khuếch tán của chất dinh dưỡng thông qua màng bao phấn thường được coi là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến sự sinhsản của phôi hạt phấn Số nghiên cứu về vai trò của màng bao phấn trong sự sinh sản của phôi hạt phấn đã chỉ ra rằng nó không chỉ hoạt động như một hàng rào đến dòng chất dinh dưỡng nhưng nó cũng cung cấp cả lợi ích và chất ức chế (Heberle-Bors 1985, 1989) Pulidoet al (2005), sử dụng

cả hai hệ thống nuôi (anther và cô lậpMicrospore) để tạo ra hạt phấn Sinh phôi ở lúa mạch, cho thấy rằng giai đoạn đầu của cả hai quá trình đều giống nhau Những nhà nghiên cứu này cũng chứng minh rằng thành bao phấn cũng được sử dụng như một bộ lọc bằng ngăn ngừa nồng độ Fe quá nhiều xung quanh hạt phấn trong bao phấn, ngay

cả khi nồng độ có trong môi trường nuôi cấy cao Vai trò bảo vệ của thành tế bào chống lại các yếu tố độc hại như Cd, ZnVà Ni cũng được Kra¨Mer et al (2000) và Kupperet

al (2000).Đánh giá này đề cập đến các khía cạnh chính của H và DH sản xuất thông qua nuôi cấy bao phấn invitro

Sơ lược lịch sử về nuôi cấy bao phấn tạo cây đơn bội và đơn bội kép

Các bào tử đơn bội tự nhiên đầu tiên đã được quan sát thấy trong năm 1921 của

Bergner trong một loài cỏ dại Datura stramonium L và được báo cáo bởi Blakeslee et

al (1922) Tầm quan trọng của cây đơn bội trong nhân giống cây trồng và nghiên cứu

di truyền đã ngay lập tức được công nhận Số lượng đơn bội tự phát được phát hiện đã phát triển đều đặn, và năm 1974 Kasha ghi nhận sự xuất hiện của hơn100 loài thựcvật hạt kín Danh sách các ví dụ đã chọn của các thỉnh thoảng trong một dải loài đã được báo cáo bởi Dunwell (2010) Tần số của đơn bội tự nhiên là, tuy nhiên, quá thấp cho ứng dụng thực tế trong sinh sản Khoảng 40 năm sau nhận dạng của tự nhiên đơn bội

sơ khai, Guha và Maheshwari (1964) phát hiện ra rằng có thể, bằng cách invitro các

bao phấn chưa trưởng thành của loài Solanaceous spe Datura innoxia, để thay đổi sự

phát triển giao tử bình thường của các hạt phấn nhỏ thành dạng bào tử và phôi và thực vật có số nhiễm sắc thể đơn bội sẽ được sản xuất Khám phá này đã mở ra cách để tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về nuôi cấy bao phấn đã được đặc biệt thành công trong

Solanaceae, Brassicaceae và Gramineae Tuy nhiên, không phải tất cả các thực vật hạt kín có hiệu quả đáp ứng với sự phát triển của phôi cảm ứng, và mặc dù lúa mạch

(Hordeum vulgare L.) cải xoăn (Brassica napus L.), thuốc lá (Nicotiana spp.) và Lúa

mì (Triticum aestivum L.) được coi là mô loài để nghiên cứu phôi bào tử nhỏ do hiệu

quả tái tạo cao (Forster và cộng sự, 2007), các nghiên cứu khác khoa học hoặc kinh tế

thú vị loài, chẳng hạn như Arabidopsis (chi thực vật có hoa trong họ cải, là loài cơ sở

để nghiên cứu gen của các thực vật bậc cao)), nhiều cây gỗ hoặc các họ hàng của cây

họ đậu, vẫn còn ngoan cố với loại in vitro này hình thái học (Sangwan-Norreel và cộng

sự 1986, Bajaj 1990; Raghavan 1990; Wenzel et al 1995; Germana 2006, 2009) Sinh phôi giao tử là một công cụ đặc biệt cần thiết để đạt được đồng hợp tử trong cây gỗ,

được đặc trưng bởi sự dị hợp tử gen cao, một chu kỳ thế hệ với thời gian dài chưa

trưởng thành, một kích thước lớn và, thường là, không tương thích với nhau, và nó không thể có được sự khép chặt bằng các phương pháp thông thường, nghĩa là, một vài thế hệ của sự tự nguyện (Germana ,2006, 2009)

Sự quan tâm lớn đến cây đơn bội rõ ràng là Tổ chức Hội nghị chuyên đề Quốc tế lần thứ nhất 'Haploids In Higher Plants ', diễn ra tại Guelph (Canada) vào năm 1974

(Kasha 1974) Vào đầu những năm 1970, cv Maris Haplona của hạt cải dầu (Brassica

napus) là cây đầu tiên DH cây trồng được thả (Thompson 1972), tiếp theo là cv giống

Mingo ở lúa mạch (Hordeum vulgare) vào năm 1980 (Hồ và Jones 1980) Kể từ đó, rất nhiều nghiên cứu đã được thực hiện với mục đích thiết lập hiệu quả kỹ thuật sản xuất haploid và DH với một tăng số lượng các kiểu gen Trong một thời gian dài, nhiều giả thuyết liên quan đến các giao thức phôi phôi đã được dựa trên kinh nghiệm thực tế Tuy nhiên, gần đây đổi mới khoa học và công nghệ, sự hiểu biết sâu sắc hơn các cơ chế kiểm soát bên dưới và một mô hình expan-ứng dụng người dùng cuối đã gây ra sự hồi sinh của quan tâm đến các haploids ở các cây cao hơn (Forster và cộng sự, 2007) Sự quan tâm này được thể hiện bằng cách thiết lập COST851, một mạng lưới nghiên cứu

do Liên minh Châu Âu tài trợ mang tựa đề "Các tế bào mầm và sự phân tử của Cải tiến cây trồng ', kéo dài từ năm 2001 đến năm 2006

Đến nay, gần 300 chủng loại mới thuộc Một số gia đình của vương quốc thực vật (đặc biệt là hàng năm Cây trồng) đã được sản xuất Một loạt các phương pháp đã được

sử dụng để có được các DHs, chẳng hạn như loại bỏ nhiễm sắc thể sau khi lai rộng, phương pháp '' bulbosum '' Bởi Kasha và Kao (1970), thụ phấn với phấn hoa bức xạ, lựa chọn cây con sinh đôi, thụ tinh trong cơ thể hoặc in vitro với hạt phấn từ cây bội ba

lá, sinh gynogenesis và phôi hạt phấn qua phôi trong ống nghiệm hoặc isolated

microspore culture (Forster và Thomas 2005)

Trang webHttp://www.scri.sari.ac.uk/assoc/COST851/Default.htm Cung cấp một danh sách các giống có nguồn gốc cây đơn bội, chủ yếu là măng tây Lúa mạch,

Brassica, cà tím, dưa, tiêu, cải dầu, Gạo, lương thực, thuốc lá, ngũ cốc và lúa mỳ Ứng

dụng của Bảo vệ sở hữu trí tuệ (IP) và hệ thống bằng sáng chế Của các cây đơn bội (trong đó các bằng sáng chế cũng bao gồm bao phấn và các kỹ thuật nuôi cấy hạt phấn)

đã được xem xét bởi Dunwell (2009), và sự quan tâm thương mại mạnh mẽ các

phương pháp sản xuất và khai thác các thực vật đơn bội được chứng minh bởi số lượng được cấp bằng sáng chế và đơn xin cấp bằng sáng chế từ Hoa Kỳ và ở nơi khác, cũng được báo cáo bởi Dunwell (2009, 2010)

Tổng quát về nuôi cấy bao phấn tạo cây đơn bội và cây đơn bội kép

Việc khai thác các cây đơn bội và DHs như là một sức mạnh công cụ nhân giống đòi hỏi sự sẵn có của các mô nuôi cấy có thể vượt qua một số phương pháp luận vấn

đề, chẳng hạn như các tần số thấp của cảm ứng phôi, nghiên cứu về bạch tạng ( thiếu sắc tố melanin), tái sinh thực vật, sự sống còn của cây trồng, gen và phản ứng phụ

thuộc theo mùa, để cải thiện hiệu quả tái tạo trong một phạm vi rộng hơn của các

kiểugen.Maluszynski và cộng sự (2003a) xuất bản một cuốn cẩm nang chi tiết mô tả 44 giao thức cho sản xuất DH, liên quan đến ít nhất 33 loài thực vật Mặc dù các loài khác nhau, cũng như các giống khác nhau trong một loài, cho thấy rất đa dạng yêu cầu và không có điều kiện tiêu chuẩn đơn hoặc hình thức để gây ra sự hình thành cây phấn hoa, đó là có thể cung cấp các hướng dẫn chung cho nuôi cấy bao phấn, như tóm tắt trong hình 1

Nhiều yếu tố bên ngoài và bên ngoài ảnh hưởng đến phản ứng phôi của các bao phấn trong nuôi cấy (Atanassov et al 1995; Datta 2005; Smykal 2000; Wang và cộng

sự 2000).Gen, trạng thái sinh lý và điều kiện tăng trưởng của donor plants, giai đoạn phát triển phấn hoa, tiền xử lý chồi non hoặc nấm men và môi trường nuôi cấy in vitro

và điều kiện, cùng với các tương tác của họ, là tất cả các yếu tố mà rất nhiều ảnh hưởng đến phản ứng của bao phấn để nuôi cấy invitro

Sưu tập tuyển chọn nụ hoa từ các cây bố

mẹ

Xác định giai đoạn phát triển của hạt

phấn:

-acetocarmine -schiffsreagent -DAPI staining

Hình 1 Sơ đồ mô tả các hướng dẫn chung về phương pháp nuôi cấy bao phấn

Gen

Trong số các yếu tố nội sinh, kiểu gen đóng một vai trò quan trọng, được công

nhận bởi hầu hết các nhà nghiên cứu phôi hạt phấn (pollen embryogenesis) Đã nhiều lần báo cáo rằng các giống khác nhau trong một loài thể hiện phản ứng đa dạng trong

nuôi cấy bao phấn Ví dụ, trong 21 giống Triticum Aestivum, các mô đơn bội có thể thu

được từ các bao phấn chỉ có của mười giống, trong khi ở lúa, phân loài japonica đã

được tìm thấy có năng suất cao hơn các phân loài indica (Bajaj 1990) Ngoài ra, nghiên

cứu thực hiện đồng thời trên các bao phấn của một số lượng lớn các kiểu gen Citrus (4

Nhiễm sắc thể tăng gấp đôi trong trường hợp đơn bội

Tách bao phấn Đặt bao phấn vào môi trường

Khử trùng bề mặt Tiền xử lý

Phát triển Morphogenic, phục hồi thực vật

Charactorization of regenertant Ploidy amalysis Detection of homozigority -Công nghệ tế bào học - Công nghệ Isozyme- based -Đo hàm lượng DNA bằng kỹ thuật dòng chảy - Chỉ thị phân tử DNA -Tế bào bảo vệ và kích thước platid

dòng thuộc 2 loại cam quýt, 4 quả cam ngọt, 4 loại chua cam, 5 chanh, 4 quả bưởi) sử dụng cùng một môi trường nuôi cấy điều kiện và tiền xử lý và 11 hóa chất khác nhau, thu được sản phẩm mô sẹo đơn bội trong một dòng cây của một giống cam và trong một giống chanh (Germana,2007).

Sự hình thành của các tiểu bào tử có khả năng trải qua sinh phôi ('' E-grains '', Sunderland 1978 hoặc '' P-grains '') Heberle-Bors 1982) được kiểm soát bởi sự tương tác giữa gen tế bào chất và hạt nhân và được cải tiến bởi môi trường (Heberle-Bors

1985) Các nghiên cứu được thực hiện trên Solanum tuberosum cho thấy khả năng trải

qua sinh phôi vi sinh là một đặc điểm lặn có thể di truyền được kiểm soát bởi nhiều hơn một gen và các gen đó Recessive (Chupeau và cộng sự, 1998, Rudolf và cộng sự,

1999 Smykal 2000) Foroughi-Wehr et al (1982) phân biệt 4 phương pháp và khác biệt đặc trưng, cụ thể là, "Kích thích callus", "ổn định callus", "tái sinh cây trồng" và sự hình thành cây bạch đàn so với sự hình thành cây xanh " Petolino và Thompson (1987)

đã chứng minh rằng việc nhân giống để đáp ứng tốt hơn về ngô là có thể Các tỷ lệ phần trăm các bao phấn sản sinh phôi vi sinh và số lượng các chất tái sinh được sản xuất cho mỗi bao phấn xuất hiện xác định một cách độc lập (Dunwell 2010)

Giai đoạn phát triển hạt phấn

Giai đoạn phát triển hạt phấn là một yếu tố phức tạp ảnh hưởng mạnh mẽ đến sự thành công của nuôi cấy bao phấn Sự phát triển cửa sổ thẩm mỹ phôi khác tùy thuộc vào loài đã được kiểm tra nhưng nhìn chung là giai đoạn độ nhạy cảm đối với các

phương pháp điều trị quy nạp là khoảng lần đầu tiên sự phân bào hạt phấn-nghĩa là, giữa các tiểu bào tử không trống (Hình 2a) đến phấn hoa giữa giai đoạn giữa, (Touraev

et al 2001) - có thể do trạng thái phiên mã tại thời gian vẫn còn tăng dần và chưa được phân biệt hoàn toàn (Malik và cộng sự, 2007) Sau khi hạt phấn bắt đầu tích tụ dự trữ trữ lượng, chúng thường mất sinh phôi năng lực và tuân theo sự phát triển về giai đoạn thụ phấn (Heberle-Bors 1989, Raghavan 1990) Ở Brassica Napus, Telmer et al (1992) báo cáo rằng các giai đoạn tốt nhất cho sự cảm ứng xung quanh sự phân bào phấn hoa đầu tiên, từ những hạt phấn hoa sớm muộn đến các hạt phấn bicellular sớm, nhưng

Binarova et al (1997), áp dụng thêm một đoạn ngắn và nhiệt độ stress (41 ° C), đã có thể có được sự phân chia các tế bào thực vật đã hình thành Trong hạt Nicotiana

tabacumpollen ở giai đoạn bicellular là đáp ứng tốt nhất khi starvation được sử dụng như tiền xử lý; Khi bị sốc nhiệt được áp dụng thay vào đó,có thể trẻ hơn thời kỳ đơn nhân bào tử (Touraev và cộng sự, 1996a, b) Sopory và Munshi (1996) báo cáo rằng giai đoạn bào tử sẽ xuất hiện ảnh hưởng đến mức ploidy của thực vật được tạo ra trong nuôi cấy bao phấn vì, trong nghiên cứu của họ, cây trồng thu được từ hạt phấn ở giai đoạn non-nucleate được tìm thấy chủ yếu đơn bội, trong khi thực vật có số nhiễm sắc thể cao hơn đã được tạo ra bởi các bao phấn ở giai đoạn sau

Giai đoạn phát triển phấn hoa thường được kiểm tra trong kích thước bao phấn /

nụ mầm bằng phương pháp acetic-carmine(Sharma và Sharma 1972) Các anther được thu thập từ nụ hoa ở các giai đoạn khác nhau của sự phát triển và nén trong dung dịch nhuộm acetocarmin (1% acetocarmine trong45% axit axetic) để quan sát dưới kính hiển vi quang học để xác định giai đoạn phát triển phấn hoa DAPI(40, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) nhuộm huỳnh quang cũng được sử dụng Tuy nhiên, khác giai đoạn phát triển và, do đó, không đồng nhất việc bắt đầu quần thể hạt phấn đã được quan sát thấy trong cùng một bao phấn khác cũng như giữa các bao phấn khác nhau của cùng một hoa (Hidaka và cộng sự, 1979, 1981, Chen 1985, VasilNăm 1967; Shull và Menzel năm 1977)

Trạng thái sinh lý và điều kiện tăng trưởng của donor plants

Các điều kiện sinh lý của các donor plants,ảnh hưởng đến số hạt P (Heberle-Bors 1985), mức nội tiết tố nội tiết và tình trạng dinh dưỡng của các tế bào biệt hóa (the tissues) của bao phấn (Sunderland và Dunwell 1977) tất cả xác định thành công của kỹ thuật Qua trình In vivo và / hoặc invitro phôi hạt phấn hoặc P-grains, có đặc trưng bởi cấu trúc màng ngoài mỏng hơn, yếu nhuộm với acetocarmin, sự hiện diện của một vòng bào thai và sự vắng mặt của tinh bột ngũ cốc, có vẻ như được kết nối với mộtHiện tượng thiếu nitơ (Heberle-Bors 1983, 1985,1989) Các biến đổi theo mùa đáng kể theo mùa đã được quan sát thấy ở nhiều kiểu gen Vasil (1980) quan sát thấy rằng các

loại bao phấn được lấy ra từ các cây trồng trong vườn đã cho một phản ứng tốt hơn so với những người được chọn từ nhà kính phát triển cây Ngoài ra, các bao phấn từ lần mọc đầu tiên của mùa được thấy là phản ứng nhanh hơn (Sunderland 1971) Trong thuốc lá, tác động của môi trường nuôi cấy là điều tra đầu tiên bởi Dunwell (1981), người đã chỉ ra rằng cả hai chu kỳ sáng và cường độ ánh sáng ảnh hưởng đến năng suất phôi bào tử và cây con Tần suất của hạt P cũng tăng theo điều kiện (ngắn ngày,

thấp,nhiệt độ) của quả mơ (Prunus Armeniaca L.) cv Hình 2 Ninfa tại thời điểm thành lập bao phấn nền văn hóa (phần màu với toluidine xanh; Ảnh chụp tại các phòng thí nghiệm của MC Risuen~o, CSIS Tây Ban Nha) b phôi phấn hoa có nguồn gốc từ mô sẹo bở và phôi ở giai đoạn khác nhau đang phát triển bên trong của Citrus Clementina Hort cựu Tân cv Monreal bao phấn, sau 4 tháng nuôi c microspore Direct phôi trong bao phấn Citrus sau 3 tháng nuôi d bộ phận đối xứng của hạt nhân trong một

microspore ô liu (Olea europaea L.) sau 3 tuần nuôi cấy bao phấn e hình trái tim phôi hạt phấn có nguồn gốc từ của C Clementina cv Nules F Microspore có nguồn gốc từ cây non của clementine thu được từ lúc nảy mầm phôi nhiệt độ) mà là không thuận lợi cho cây sinh trưởng (Heberle-Bors và Reinert 1981; Heberle-Bors 1989) Sự ảnh

hưởng trên phản ứng văn hóa của nhiệt độ theo đó các cây cho (donor plants) được trồng đã được chứng minh bởi các nghiên cứu về lúa mạch (Foroughi-Wehr và Mix 1976), hạt cải dầu (Keller và Stringham 1978; Dunwell và Cornish 1985), củ cải

(Keller et al 1983) và lúa mì (Lazar et al 1984), bất chấp những điều kiện phát triển tối ưu xuất hiện khác nhau giữa các loài Tình trạng nitơ của cây cũng ảnh hưởng đáng

kể năng suất của microspore – giải thích cho hình bên dưới phôi (Sunderland

1978; Tsay năm 1981), với '' nitơ-đói '' cây cung cấp các kết quả tốt hơn so với những người cung cấp phân bón

Mặc dù nhà nước sinh lý thực vật của nhà tài trợ đáng kể có thể ảnh hưởng đến phản ứng của các bao phấn nền văn hóa trong ống nghiệm, tham số này đã được nghiên cứu chỉ có ở cây do những khó khăn liên quan đến việc xác định nó thuộc dạng cây thân gỗ Trong thực tế, các điều kiện phát triển và các trạng thái sinh lý thực vật nhà tài

trợ có thể không được chuẩn hóa vào văn hóa bao phấn cây lâu năm được trồng ở ngoài trời và bị ảnh hưởng bởi khí hậu (nhiệt độ, photoperiod và cường độ ánh sáng), văn hóa (cắt tỉa, tưới tiêu, thụ tinh, vv) và các điều kiện pedological (đặc biệt là trong thời gian hoa cảm ứng và sự khác biệt) Điều này có thể giải thích tại sao các phản ứng với các nền văn hóa của các thực vật thân gỗ bao phấn rất mùa là phụ thuộc vào ngay cả khi cùng một giao thức được áp dụng (Germana' năm 2009).

Pretreatment- tiền xử lí

Nó đã được quan sát ở nhiều kiểu gen vật lý hay hóa học trước văn hóa phương pháp điều trị áp dụng cho sự cắt bỏ ( excised) nụ hoa, toàn bộ cụm hoa hoặc các cắt bỏ bao phấn (excised )trước hành động như là một kích hoạt cho cảm ứng ( inducing )đường sporophytic, do đó ngăn ngừa sự phát triển của phấn hoa màu mỡ (gametophytic

đường) Những tiền xử kí như lạnh, nhiệt độ cao, độ ẩm cao, nước căng thẳng, kỵ khí điều trị, số, sucrose và nitơ đói, ethanol, chiếu xạ c, microtubuli đại lý gây rối,

electrostimulation, pH trung bình cao, các kim loại nặng điều trị là phương pháp tiếp cận đặc biệt phổ biến ở bao phấn và tiểu bào tử (microspore), như gần đây được nhận xét bởi Shariatpanahi et al (2006), đã phân loại chúng thành ba loại: được sử dụng rộng rãi, bỏ rơi

Cú sốc nhiệt độ được coi là điều trị hiệu quả nhất để tạo ra phấn hoa

embryogenesis phát triển Nhiệt độ tối ưu và thời gian của tiền xử lí pretreatment khác nhau với kiểu gen Ví dụ, một trong ba giống cây trồng (tháp, Willi và Duplo)

(Brassica napus ssp oleifera), Dunwell et al (1983) thấy rằng năng suất cao nhất

(tương đương 1,1 phôi cho nuôi cấy bao phấn) nhận được từ bao phấn var Duplo sau khi điều trị 3 ngày một lúc 35C, trong khi sản lượng từ các giống cây trồng khác thấp hơn nhiều và tương đối không bị ảnh hưởng bởi điều trị 35C Tiền xử lí Lạnh (4C trong

2 – 3 tuần) được sử dụng thường xuyên trong các bao phấn nền văn hóa của nhiều loại cây trồng và hiệu quả của nó cũng phụ thuộc vào kiểu gen (Osolnik et al 1993; Powell năm 1988) Ở các loài Brassica, một điều trị ngắn, cao nhiệt độ (30-35C) trước khi thêm văn hóa tại 25C là cần thiết để hiệu quả chuyển đổi con đường phát triển Dinh

dưỡng đói, đặc biệt là cho đường và nitơ, đã được thường xuyên sử dụng để tạo ra phấn hoa embryogenesis trong thuốc lá (Kyo và Harada 1986) Touraev et al (1996b 1997)

đã cho thấy rằng nó đã có thể để thay thế cho tiền xử lí (pretreatment )đói bởi một điều trị sốc nhiệt Hóa học và vật lý mutagens (ví dụ như tia gamma) áp dụng để cây hoặc hạt giống từ đó M1 cây đã thu được kết quả là sự gia tăng trong các phản ứng nội tiết

tố của giống đực (androgenic), theo báo cáo của Aldemita và Zapata (1991) trong

giống ương ngạnh lúa, bởi Vagera et al (2004) ở lúa mạch và Kopecky và Vagera

(2005) Solanum nigrum Ngoài việc được sử dụng để tạo ra nhiễm sắc thể tăng gấp đôi, colchicine cũng đã được sử dụng để tạo ra bộ phận tiểu bào tử hay bào tử đực

(microspore) và để thúc đẩy sự phát sinh phôi giao tử (gametic embryogenesis) ở một vài loài, bao gồm củ cải đường (Levan 1945), Miến (Sanders và Franzke năm

1962; Simantel và Ross 1964), ngô (Hu et al 1991), Brassica (Mollers et al năm

1994), lúa mì (Barnabas et al 1991) và gạo (Alemano và Guiderdoni 1994) Tuy nhiên, tác dụng kích thích gây đột biến (mutagenic) trị bao phấn nền văn hóa hiệu quả trong ương ngạnh kiểu gen là cũng đánh giá cao kiểu gen và phụ thuộc liều Số và tiếp xúc với giảm áp suất không khí hoặc nước căng thẳng là các tiền xử lí (pretreatments )được

sử dụng trước khi bao phấn (Sopory và Munshi 1996

Mặc dù cơ chế tác động chưa bền vững phấn là cách phân biệt lập, nó dường như bằng cách thay đổi sự phân cực của liên quan bộ xương tế bào tái tổ hợp đầu tiên của phân bào Các tế bào đơn bội (Nitsch và norreel 1973; Reynolds 1997), đẩy lùi với phấn hoa có kích thước bằng nguyên phân (hai loại dinh dưỡng của thực vật hạt nhân không phải là một người tạo ra), ngăn chặn sản xuất tinh bột hoặc hòa tan vi ống

(Muar, 1977) hay giữ sống (đất huấn luyện p-grains Bos 1985)

Khử trùng bề mặt cắt, bao phấn

Cắt bỏ trong bao phấn, trước khi khử trùng bề mặt, phải thông qua loại bỏ chất thải (vi khuẩn và nấm).Nhiều giao thức được sử dụng để khử trùng không bị ô nhiễm bao phấn, chủ yếu có thể đơn bội được tìm thấy ở cây trồng sản xuất: một cuốn sổ tay, biên tập bởi Maluszynski et al.(2003a, B)

Nói chung, được xử lý sau khi khử trùng bề mặt, chồi ngâm anh khỏe (v/v) vài phút ethanol, sau đó ngâm trong dung dịch natri hypoclorit (khoảng 1.5% hoạt độ nước của clo) bao gồm 10 – 15 phút nhỏ vài giọt 20 và ba phút rửa nước tinh khiết vô

trùng.Ở bước cuối cùng trong cơ thể không có sợi nấm, bao phấn từ và đặt lên môi trường.Một ngoại lệ là cho lớn, đó là rượu chỉ qua sự phun khử trùng (cistue anh khỏe không et al.2003) hay ngâm 5 phút trong ethanol, anh khỏe, và sau đó ở vô trùng chưng cất nước tẩy trắng (dệt nổi chờ.2003)

Tổn thương cắt bỏ các ngăn bao phấn nên tổ chức tổ chức sản xuất antherwall ( và 1977).Khi bao phấn kích thước phân, như măng tây, cải bắp, Clover và dầu được chiết xuất được tiến hành dưới 3 chiều của kính hiển vi (Bhojwani và Razdan 1983; cistue

Sê et al.2003; người Đức là Et Al, unpublished)

Thành phần Medium

Medium tạo phôi với xảy ra gây tác dụng hết sức quan trọng Kiểu gen khác nhau thể hiện rất khác nhau trên cơ sở Medium đòi hỏi nguồn gốc thực vật, gây hạt phấn được hình thành Bao phấn với cách cơ thể dinh dưỡng hơn yêu cầu đơn giản hơn

nhiều ( và 1977; Ba - Jacques Jay, 1990)

Thường dùng nhất là bao phấn Medium N6 medium (đầu năm 1978), (sửa đổi)

ms medium (Murashige - 1962), Nitsch và Nitsch (1969) và phương tiện trung B5

(Gamborg et al.1968), nhưng vẫn còn nhiều người khác.Nói chung, đề nghị cho họ Cà nửa độ MS muối hỗn hợp, cho ngũ cốc N6 medium (Hồ 1978)

Nguồn carbonhydrate là không thể thiếu trong bao phấn phát triển sản xuất phôi, bởi vì chúng có tác dụng chống xâm nhập và dinh dưỡng (Powell 1990).Đường nồng

độ có thể là ảnh hưởng gây áp lực thẩm thấu trong giai đoạn điều chỉnh về (Sunderland

và 1977; Sangwan và Sangwan norreel 1990) sau thời kỳ , tập trung cao độ của nguồn carbon là có hại (Keller, et al.1975).Đường sucrose là tổ chức vận chuyển chính ở thực vật trong tinh bột (Powell 1990), nó là dùng để huấn luyện các bao phấn thường dùng nhất nguồn carbon, thông thường ở mức 2 – 4% ( và 1977).Mức độ cao của sucrose (6 –, là 17 phần trăm.) là một trong những yêu cầu của họ (ví dụ, Gramineae, Cruciferae)

chín phấn hoa là hạng ba điều kiện ( và 1985), trong khi những người trưởng thành cho hai trong phấn hoa (ví dụ, Solanaceae) cấp thấp hơn, chẳng hạn như 2-5%, thường có lợi (Dunwell 2010) Sucrose là nhiệt không ổn định, và phương tiện truyền thông hấp chứa một hỗn hợp sucrose, D-glucose và D-fructose (Powell, 1990) Maltose đã thành công được sử dụng để thay thế sucrose trong lúa mạch nuôi cấy bao phấn, thường là ở nồng độ 62 g / l trong môi trường cảm ứng và một nửa số tiền này trong môi trường tái sinh (Wedzony et al 2009) Maltose cũng đã được bổ sung vào môi trường nuôi cấy bao phấn lúa mì, lai lúa mì, lúa mạch đen và lúa ở nồng độ khác nhau, từ 60 đến 90 g /

l (Wedzony et al 2009) Fructose và glucose đều đã được chứng minh là ức chế để phôi phấn hoa trong Petunia nuôi cấy bao phấn (Raquin 1983) Lactose ở mức 18 g / l và galactose lúc 9 g / l thường xuyên được sử dụng trong clementine nuôi cấy bao phấn (Germana` 2003) Sucrose được tìm thấy là nguồn carbon tốt nhất, so với glucose, trong văn hóa bao phấn của hai clementine và hai cây quýt (Germana` et al 1994), trong khi glucose hơn là sucrose đã được chứng minh là kích thích trong lúa mạch đen (Wenzel et al 1977) Glycerol kết hợp với sucrose đã được tìm thấy để kích thích sản xuất mô sẹo trong clementine (Germana` et al 2000a)

Ảnh hưởng của điều hòa sinh trưởng thực vật đã được nghiên cứu rộng rãi trong nuôi cấy bao phấn Mặc dù một vài loài mô hình (ví dụ, hầu hết các thành viên của họ Solanaceae) không yêu cầu bổ sung một auxin vào môi trường cảm ứng, và cảm ứng không xảy ra trên các phương tiện đơn giản, sự hiện diện của điều hòa sinh trưởng (auxin, cytokinin hoặc kết hợp) là rất quan trọng phục vụ sản xuất phôi microspore có nguồn gốc từ trong phần lớn các loài thực vật, đặc biệt là những người ngoan cố

(Maheshwari et al 1982) Loại và nồng độ auxin dường như để xác định con đường phát triển microspore (Ball et al 1993), với 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) gây hình thành mô sẹo (Hình 2b) và indole-3 axit axetic (IAA) và một

naphthaleneacetic axit (NAA) thúc đẩy phôi trực tiếp (2c Hình.) (Armstrong et al

1987; Liang et al 1987) Giberellins và acid abscissic đã được thỉnh thoảng thêm vào phương tiện truyền thông